CN1154655A - 博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素和类毒素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明目的在于提供一种制备皮肤坏死毒素的方法,由博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素的经过改良的类毒素以及含有该改良的由博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素的类毒素和由巴斯德氏菌所产皮肤坏死毒素的类毒素的类毒素混合制剂。本发明提供一种部分纯化皮肤坏死毒素的方法,包括使含皮肤坏死毒素的溶液与一种借助直接硫酸化反应而被硫酸化的色谱凝胶,或一种与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶相接触,从而使皮肤坏死毒素吸附到凝胶上,然后从凝胶上把吸附的皮肤坏死毒素洗脱下来。本发明还提供从博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素获得的类毒素,该皮肤坏死毒素用上述的部分纯化皮肤坏死毒素的方法制备,还提供将该毒素与产毒性巴斯德氏菌所产生的皮肤坏死毒素的类毒素相混合而制得的类毒素混合制剂,该类毒素混合制剂用于预防猪的萎缩性鼻炎是安全、有效的。
Description
本发明所属技术领域
本发明涉及预防猪传染病的药物。更具体地说,本发明涉及一种博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素的改良的类毒素,一种含有该类毒素和巴斯德氏菌所产皮肤坏死毒素的类毒素的类毒素混合物以及该类毒素的制备方法。
发明背景
萎缩性鼻炎(以下简称AR)是一种猪慢性呼吸道疾病,具有极强的传染性,其原发症状有鼻甲萎缩,鼻发育不全,鼻出血,鼻部弯斜,并引起其他呼吸道疾病等等。已知该病由产毒的支气管败血性博代氏杆菌(以下简称“Bb”)和产毒的出血败血性巴斯德氏菌(以下简称“Pm”)引起,这两种菌可使上呼吸道粘膜感染。Bb作为一种粘附因子,具有血红细胞凝集作用和积聚作用,因而容易附着于鼻粘膜,而Pm不具这样的粘附因子,因此不能由其自身定殖。所以,为了建立Pm感染,在鼻粘膜部位引起损害的一种易感因子是必须的,而这样一种有代表性的易感因子就是Bb。已知与引起鼻粘膜损害有关的病原学因子是一种气管细胞毒素和一种皮肤坏死毒素。在一个实验性感染试验中,先用Bb使猪感染,几天后接着用Pm进行鼻内感染,结果引发如在一个牧场里所观察到的那样严重的AR。
博代氏杆菌属包括百日咳博代氏杆菌、付百日咳博代氏杆菌、支气管败血性博代氏杆菌以及avium博代氏杆菌等。这些杆菌产生各种具有生物学活性的物质。Bb皮肤坏死毒素(以下简称“BbT”)就是这样的物质之一,可以由任一种博代氏杆菌产生。已经发现,具有诸如出血坏死活性,引起鼻甲萎缩的活性,引起鼻发育不全的活性,致死活性,平滑肌血管收缩活性,引起局部血循环阻断活性,引起脾萎缩活性,抑制抗体产生的活性等生物活性的BbT在博代氏杆菌病中起重要作用,而且还发现,BbT在小猪肺炎病灶形成过程中也起着重要作用(Roop II,R.M.et a1.,Infect.Immun.,55,p.217-222(1987))。
另一方面,一部分出血坏死性巴斯德氏菌,或一部分非典型巴斯德氏菌可产生Pm皮肤坏死毒素(以下简称“PmT”)。业已证实,具有诸如出血坏死活性,致鼻甲萎缩的活性,致发育不全的活性,致死活性,致局部血循环阻断的活性和致脾萎缩的活性等生物活性的PmT,在由产毒性Pm引起的疾病方面起重要作用。而且还发现,PmT与由产毒性Pm所致猪肺炎病灶的形成密切相关(Iwatsu,S.and Sawada,T.;Jpn.J.vet.Sci.,50,p.1200-1206(1988))。虽然BbT和PmT二者都不被分泌入培养基中,而是在菌细胞中积蓄起来,但它们在长期的培养后,由于溶菌作用,可以从菌细胞内释放出来,进入培养基上清液中。在体内过程中,由于溶菌作用从菌细胞中释放出来的皮肤坏死毒素可影响生命体。
在上面提及的情况下,皮肤坏死毒素在生命体中的保护作用尚不清楚,为了阐明这种保护作用的机理,需要开发一种大规模制备皮肤坏死毒素的方法和开发一种皮肤坏死毒素的类毒素,用于预防该病。但是,皮肤坏死毒素由于其自身的下述性质一直难于纯化:对热的不稳定性,在纯化操作进行过程中容易引起自身凝集,与菌细胞衍生的诸如脂质、酸性蛋白和疏水物质等这样一类物质形成复合物。而且,鉴于BbT和PmT尽管具有相似的生物活性但没有免疫学交叉反应性,从兽医和猪饲养业观点出发,人们一直热切希望开发一种安全、有效的BbT-PmT类毒素混合物。
迄今为止,用于从含细菌皮肤坏死毒素的溶液中,特别是从博代氏杆菌菌细胞提取物中部分纯化皮肤坏死毒素的已知方法包括采用离子交换色谱的纯化方法(Kume,K.et al.,Infect.Immun.,52(4),p.370-377(1986))。但是,这种方法的缺点是重复性差。我们也了解到一种利用透析、蔗糖梯度超速离心和凝胶过滤色谱部分纯化皮肤坏死毒素的方法(Endoh,M.et al.,Microbiol.Immunol.,30,(7),p.659-673(1986))。但这一方法同样显示重复性差的缺点,况且,尽管采用了多步纯化步骤,仍不能提供足够纯度的纯化。
另一个例子是采用以核酸去除剂、阴离子交换色谱和羟基磷灰石吸附色谱处理的纯化方法(Horiguchi,Y.et al.,Microbiol.Pathogen.,6,P.361-368(1989))。但是,这一纯化方法同样有其不足,在于它需要一种昂贵的试剂,即核酸去除剂,而且涉及多步纯化步骤。还有一种采用核酸去除试剂、透析和阳离子交换色谱的纯化方法(Horiguchi,Y.et al.,FEMS Microbiol.Letters,66,p.39-44(1990))。虽然这种纯化方法具有高重复性,并能提供较高纯度的皮肤坏死毒素,但像在上一个方法中指出的那样,它也需要一种昂贵的试剂。
还有一个实例是采用盐析和染料配体亲和色谱的纯化方法(ZhangY.L.and Sekura R.D.,Infect.Immun.,59(10),p.3754-3759(1991))。虽然这种纯化方法显示出高重复性,但其不足是提供的纯化纯度不充分。
迄今报告的灭活AR疫苗有三个类型,即灭活的Bb单价疫苗,灭活的Pm单价疫苗以及灭活的Bb/Pm双价疫苗,每一种疫苗都已加以研究,或已经投入实际应用。
灭活的Bb疫苗包括含有由经甲醛、戊二醛等灭活的无致病力的一种细菌,并添加铝凝胶或油佐剂的疫苗(Goodnow,R.A.Vet.Med.SmallAnim.Clin.,72,P.1210-1212(1977);Nakase,Y.et al.,Proc.Int.Pig Vet.Soc.Congr.,8,(1976);Giles,C.J.and Smith,I.M.,Vet.Bull.(London),53,p.327-338(1983))。还发现,存在于Bb外膜上并具有腺苷酸环化酶活性的一种68 KDa蛋白,显示预防萎缩性鼻炎的作用(Montaraz J.A.et al.,Infect.Immun.,47,p.744-755(1985))。还了解到一种组成疫苗,含一种Bb产生的纤维状血凝素作为主要成份(Hansen,G.R.et al.;In Atrophicrhinitis in pigs(Ed.Peterson,K.B.and Nielsen,N.C.)Communication of the European Communities,Luxembourg,p.89-97(1983),and Ohgitani,T.et al.,Vaccine,9,p.653-658(1991))另据报道,为了提供一种抗毒素而添加皮肤坏死毒素的一种疫苗并不是有效的(Soderlind,O.and Bergstrom,G.Int.pigVet.Sci.Congr.,p.175(1984);Marel,C.M.von der et al.,Int.pigVet.Sci.Congr.,p.170(1984))。
另一方面,一种灭活的Pm单纯疫苗含有Pm类毒素(Pederson,K.B.and Barfod,K.Nord.Vet.Med.,31,p.293-302(1982);Foged,N.F.et al.,Vet.Rec.,125,p.7-11(1989)),这种疫苗业已得到研究,或已投入实际应用。
Bb/Pm联合灭活疫苗包括(1)、无致病力的Bb与无致病力的能产生PmT的PmD型细菌的混合物(该混合物还添加不能产生PmT的细菌),或Bb与PmT类毒素的混合物(Barford,K.and Pederson,K.B.,Nord.Vet.Med.,36,p.337-345(1984);Baalsrud,K.J.,ActaVet.Scand.,28,p.305-311(1987));de Jong,M.F.et al.,Vet.Quart.9,p.49-59(1987));Kobisch,M.and Pennings,A.Vet.Rec.,124,p.57-61(1989)),这种混合疫苗只是为了预防AR的目的;(2)、无致病力的Bb与无致病力的可产生PmT的PmD型细菌以及无致病力的PmA型细菌的混合物(Ostle,A.G.et al.,Vet.Med.p.722-775(1986)),这种混合疫苗的目的是预防AR和肺炎;(3)、无致病力的Bb与无致病力的PmA型细菌、无致病力的insidiosa丹毒丝菌以及PmT类毒素的混合物(Jayappa,H.et al.Int.Pig Vet.Soc.Congr.,p.44(1988))。这种混合疫苗的目的是预防其他疾病以及AR和肺炎。这三种疫苗都已投入实际应用。
鉴于BbT在Bb感染引起的鼻甲萎缩和肺炎病灶形成方面起着重要作用,Zoop II,R.M.等人指出需要一种BbT类毒素(Infect.Immun.,55,p.217-222(1987))。然而,他们从未提到将BbT和PmT类毒素联合使用。Chanter,N等人已经提出,由于BbT和PmT协同作用诱导的猪鼻粘膜损害可创造有利于Bb和Pm繁殖的环境,所以PmT类毒素与Bb的这种重要毒素的结合应用更为有效(Res.Vet.Sci.,47,p.48-53(1989))。
但是,含具有BbT活性组分的疫苗的应用至今尚未成功地增强BbT中和抗体的产生(Soderlind,O.and Bergstrom,G.,Proc.Int.Pig Vet.Sci.Congr.,p.175(1984);Marel,C.M.von der.et al.,Proc.Int.Pig Vet.Sci.Congr,p.170(1984))。另一方面,Nakai等人透露,在接受高纯度BbT类毒素的猪和小鼠中,中和抗体的产生得到增强(The 111thJapan Veterinary Society,lecture abstract,p.183(1991))。但是,他们也从未提到该BbT类毒素与PmT类毒素的联合应用。
本发明的公开内容
为了找到一种有效纯化皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin)的方法,本发明的发明人作了认真的研究,作为研究结果,已经发现:(1)、用下面的纯化方法能容易获得回收率较高、内毒素含量较低的部分纯化的皮肤坏死毒素:即采用一种以直接硫酸化法作硫酸化处理的色谱凝胶,或一种与硫酸化后的分子共价结合的色谱凝胶,例如,纤维素硫酸酯凝胶,肝素固定化的吸附凝胶或硫酸化的烷基固定化吸附凝胶,对含皮肤坏死毒素的溶液,例如博代氏杆菌(Bordetella)提取物作色谱分离;(2)、对上述用经直接硫酸化法作硫酸化处理的色谱凝胶或与硫酸化后的分子共价结合的色谱凝胶获得的部分纯化的皮肤坏死毒素,进一步作透析、阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱分离,能容易地获得回收率较高的高纯度的皮肤坏死毒素;(3)与未经纯化的博代氏菌细胞提取物中的皮肤坏死毒素相比,采用经直接硫酸化法作硫酸化处理的色谱凝胶或与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶作色谱分离所得的部分纯化的皮肤坏死毒素的免疫反应性大大改善。
而且,本发明人业已证实,用化学处理法所获得的皮肤坏死毒素级分的减毒产物能有效地和安全地用于预防猪的萎缩性鼻炎,该皮肤坏死毒素组分的制备方法是:将该博代氏杆菌菌细胞提取物与借助直接硫酸化法硫酸化的色谱凝胶或共价结合了硫酸化分子的色谱凝胶相接触,以便使该皮肤坏死毒素吸附到凝胶上,并与杂质分开,接着将这种皮肤坏死毒素从凝胶上洗脱下来。这样,本发明得以完成。
为了建立猪的Pm感染,Bb的预先感染作为引起猪鼻粘膜部位损伤的一种因素是必须的。凡是用BbT抗毒素免疫的猪,由Bb和Pm感染引起的鼻粘膜上的Pm克隆和鼻甲萎缩都得到减轻。然而,由于可以看到不同个体之间效果的明显波动,据透露,单用BbT类毒素对AR灭活疫苗来说,是不够的。
基于上面提到的研究结果,为了开发一种类毒素混合物,本发明人进行了认真的研究,结果,已经找到一种类毒素混合制剂能有效、安全地用于预防猪的萎缩性鼻炎,该类毒素混合制剂的制备方法是:将从用纤维素硫酸酯凝胶等分离方法自博代氏杆菌菌细胞提取物中,纯化至比活性达37,000 MND/mg蛋白或更高活性的毒素中分离得到的类毒素,与从由产毒的Pm所产生的PmT分离得到的类毒素相混合。这样就形成一种类毒素混合制剂,即本发明的第二实施方案。
本文所用的最小坏死剂量(MND)是指这样一个剂量单位:1MND规定为在1μg/ml的脂多糖(例如,从血清型O111:B4大肠杆菌衍生的一种脂多糖)存在下,给豚鼠皮内注射后一天,产生一个不小于5mm直径坏死斑所需要的最小剂量的皮肤坏死毒素。
附图的简要描述
图1显示本发明皮肤坏死毒素纯化方法的一个步骤中的色谱图。
图2显示本发明皮肤坏死毒素纯化方法的一个步骤中的色谱图。
图3显示本发明皮肤坏死毒素纯化方法的一个步骤中的色谱图。
图4显示本发明皮肤坏死毒素的纯化方法所得皮肤坏死毒素组分的分析结果。
图5显示根据本发明所获得的类毒素在小鼠模型上的药效试验结果。
图6显示根据本发明所获得的类毒素在怀孕母猪模型上的药效试验结果。
图7显示对BbT中和抗体保护作用方面的研究结果。
实施本发明的最佳方法
本发明提供一种部分纯化皮肤坏死毒素的方法,该方法包括以下步骤:将含皮肤坏死毒素的溶液与用直接硫酸化法硫酸化了的色谱凝胶,或共价结合了硫酸化分子的色谱凝胶相接触,以使该皮肤坏死毒素吸附到凝胶上,然后将其从凝胶上洗脱下来。本发明还提供一种从采用该部分纯化皮肤坏死毒素的方法纯化所得BbT衍生的BbT类毒素,以及一种用以下方法制备的类毒素混合制剂:将该BbT类毒素与从产毒性Pm所产生的PmT衍生的一种类毒素相混合。该类毒素混合制剂对预防猪的萎缩性鼻炎是安全、有效的。
本发明中用作起始材料的含皮肤坏死毒素的溶液包括从Bb、百日咳博代氏杆菌和付百日咳博代氏杆菌得到的菌细胞提取物。本发明的起始材料还包括从采用基因工程技术表达BbT的细胞所得的提取物。本发明中所用的优选提取物是从Bb得到的菌细胞提取物。以通常的方式,用下列方法培养Bb:用博-让二氏培养基(Bordet-Gengou)和麦康基氏培养基(Macconkey)等琼脂培养基培养,或用像蛋白胨培养基(Horiguchi,Y et al.,Microb.Pathogen.,6,p.361-368(1989))、Cohen-Willer培养基和Stenner-Scholte培养基等这样一类液体培养基作静止培养、摇床培养和充气旋转器培养。用Conradi棒等器具把琼脂培养基上的细菌培养物混悬于纤维素硫酸酯凝胶的起始缓冲液中。在用离心法回收菌细胞后,液体培养基中的细菌培养物,被混悬于纤维素硫酸酯凝胶的起始缓冲液中。
可用下列方法纯化所获得的菌细胞悬液:Kume,K等的方法(Infect.Immun.52(4),p.370-377(1986));Endoh,M等的方法(Microbiol.Immul.,30(7),P.659-673(1986));Horiguchi,Y等的方法(Microbial.Pathogen.,6,p.361-368(1988)或FEMSMicrobiol.Letters,66,p.39-44(1990));Zhang Y.L和SekuraR.D.的方法(Infect.Immun.,59(10),p.3754-3759(1991));或用直接硫酸化法进行硫酸化后的色谱凝胶如纤维素硫酸酯凝胶或共价结合了硫酸化分子的凝胶,作吸附色谱分离。但是,根据本发明,最优选的实施方案是将这种菌细胞悬浮液用直接硫酸化法硫酸化后的凝胶或与硫酸化分子共价结合的凝胶作吸附色谱分离纯化。
菌细胞悬液经超声处理、酶处理、挤压和反复冻融等处理,以制备菌细胞匀浆,再用离心法或膜过滤法除去细胞碎片。可直接地,或进一步经使用核酸去除剂、脱盐和超速离心等作的纯化的预处理后,将如此所得的细菌提取物用于本发明的方法。根据本发明的方法,预处理并不总是必要的,而是菌细胞提取物可直接地用具有硫酸化分子作配体的吸附凝胶或经直接硫酸化法硫酸化了的吸附凝胶作吸附色谱分离,从而使该纯化操作过程十分简单和方便。
现就本发明所述的、以经直接硫酸化法硫酸化了的色谱凝胶或共价结合了硫酸化分子的色谱凝胶举例说明如下:
本发明所用的“经直接硫酸化法硫酸化 的色谱凝胶”是指其凝胶本身在如吡啶这样的有机溶剂存在下,经由例如酯键,与氯磺酸和硫酸酐这样的硫酸化剂直接反应而被硫酸化的一种色谱凝胶(例如纤维素),典型地包括硫酸酯被导入由晶纤维素或晶形区纤维素和非晶形区纤维素组成的球形纤维素中的纤维素硫酸酯凝胶。所得的纤维素硫酸酯保留了起始物的形状,在水性溶剂中不溶,而且具有优良的物理稳定性,因此而适于用作色谱凝胶。这些作为起始材料的纤维素,例如以Avicel(由Asahi Kasei Kogyo K.K.生产)和Cellulofine GC-15,GH-25,GC-100,GC-200(Chisso公司生产)等商品名,易于在市场上买到。这种作为起始材料的纤维素可用上面提及的方法作硫酸化处理,某些已经硫酸化了的纤维素,例如“Sulfated Cellulofine”(Chisso公司生产),是可从市场上买得到的。
本发明采用的“与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶”是指与肝素(一种高度硫酸化的葡糖胺多糖)或磺丙基(一种硫酸化的烷基)或具磺基(sulfone group)的蓝色染料通过CNBr法等共价结合的,含有诸如交联纤维素、交联葡聚糖或交联琼脂糖凝胶一类天然高分子量聚合物,或诸如亲水性乙烯基聚合物或苯乙烯二乙烯基苯共聚物一类的合成高分子量聚合物的色谱凝胶,其中包括许多可从市场上买得到的产品。与肝素共价结合的色谱凝胶包括“肝素琼脂糖凝胶CL-6B(“Heparin Sepharose CL-6B”)(Pharmacia公司),“Affigel Heparin Gel”(Bio-Rad公司),“Heparin Cellulofine”(Seikagaku Kogyo K.K.公司)等等。与蓝色染料共价结合的色谱凝胶包括“Affigel Blue Gel”(Bio-Rad公司),“AF-blue Toyopearl”(Toso K.K.公司),“BlueCellulofine”(Seikagaku Kogyo K.K.公司)等等。与磺丙基共价结合的色谱凝胶包括“SP-Sephadex”(Pharmacia公司),“SP-Toyopearl 650M”(Toso K.K.公司)等等。
按如下的方法,采用含硫酸基(sulfate group)作配基的吸附凝胶或经直接硫酸化法硫酸化的吸附凝胶,从含皮肤坏死毒素的溶液中,尤其是从博代氏杆菌菌细胞提取物中,进行皮肤坏死毒素的纯化和收集。虽然本发明以纤维素硫酸酯凝胶的应用作为优选实施方案加以说明,但在相似的条件下,也可使用其他的凝胶。
预先用中性范围pH(pH7-9)并具有适当比电导率(虽然因凝胶种类的不同,其数值在某种程度上可有所波动,但通常为20mS/cm或更低,一般为3-20mS/cm,较普通用的是5-20mS/cm)的缓冲液平衡纤维素硫酸酯凝胶,即为了有利于凝胶色谱的洗涤和洗脱,缓冲液的比电导率需要加以标化,例如,添加了浓度范围为0-0.2M氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液。接着做吸附操作,使皮肤坏死毒素吸附到纤维素硫酸酯凝胶上。以批式纯化或柱式纯化这种工业上常用的方式进行一系列纯化操作,如把皮肤坏死毒素吸附到纤维素硫酸酯凝胶上,洗涤凝胶,洗脱皮肤坏死毒素等等。采用批式纯化时,把纤维素硫酸酯放入博代氏杆菌菌细胞提取物中,在温度为0-30℃和pH范围约7.0-9.0的条件下,缓慢搅拌混合物10-60min,以便使皮肤坏死毒素吸附到纤维素硫酸酯上。在这种情况下,在吸附操作进行前,需要把纤维素硫酸酯作适当的浓缩或稀释,以便使博代氏杆菌菌细胞提取物的比电导率落在上面提到的范围内,通常为3-20mS/cm或更低些。
吸附操作完成后,把提取物和凝胶的混合物装入过滤器,并作负压抽滤,以将凝胶与滤液分开。将具有上述固定范围比电导率(通常为约3-20mS/cm,或更低)和pH约5-10的适宜缓冲液,例如添加0.1M氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液,倒入该分离的凝胶中,用负压抽滤洗涤凝胶。然后将pH约5-10,比电导率高于上述固定范围而一般低于130mS/cm(例如,优选范围约为22-46mS/cm)的适宜缓冲液,例如添加浓度为0.2-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液,倒入该凝胶中,以洗脱吸附的皮肤坏死毒素。
采用柱式纯化时,起始材料、洗涤用缓冲液和洗脱用缓冲液的条件可以与批式纯化的条件相似。本发明推荐把缓冲液的流速调整到约10ml/cm2/hr-500ml/cm2/hr。
本发明的这种纯化法使含皮肤坏死毒素溶液中的皮肤坏死毒素能够特异地吸附,其提供的皮肤坏死毒素纯度提高几十倍到110倍,且皮肤坏死毒素的回收率高(40-100%)。内毒素可引起发热或休克一类的副反应,在菌细胞匀浆提取物中,其与皮肤坏死毒素共存,含量很高,但它不能被吸附到纤维素硫酸酯凝胶上,因此内毒素的含量可降低到1/30-1/800。获得的纯化皮肤坏死毒素的比活性高达4×105至3×106MND/mg蛋白,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上形成一条主带。
正如上面所提到的,根据本发明的纯化方法,可以以高产率和高纯度,从含皮肤坏死毒素的起始溶液中提取所需要的皮肤坏死毒素。纯化操作十分简单,纯化所用的色谱吸附剂可以自己制备,也可以低成本从市场买到,从反复使用后没有变质的经济观点来看,该吸附剂也是极其令人满意的。因此,对皮肤坏死毒素的工业化生产来说,本发明的纯化方法是一种十分令人满意的方法。此外,本发明的纯化方法也可以与传统的阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱等纯化方法结合应用以进一步提高纯度,籍此提供比传统纯化方法所获得的更为出色的结果。
用本发明的方法纯化的皮肤坏死毒素经化学试剂处理后可转变成类毒素,后者失去毒素活性而保留免疫原性。用普通的方法,例如用甲醛(Nakai,T.et al.,Infect.Immun.,46,p.429-434(1984))或戊醛(Endoh,M.et al.,Microbiol.Immunol.,30,p.659-673(1986))等试剂能将皮肤坏死毒素转变成类毒素。为了在把该类毒素给予生命体后诱导体液免疫,佐剂与类毒素一同施用。所用佐剂的例子有铝凝胶、油佐剂和皂角苷等。该类毒素显示出比未纯化的皮肤坏死毒素组分更高的免疫原性,还十分安全,这些特点被下面阐述的诸实施例中的资料所证实。
由本发明的纯化方法获得的部分纯化的皮肤坏死毒素具有高纯度,并除去了大部分内毒素,因此可用于制备动物用疫苗。此外,在本发明的纯化方法与传统的纯化方法联合应用而使该部分纯化的皮肤坏死毒素的纯度进一步得到提高的情况下,该部分纯化的皮肤坏死毒素也可用于制备各种试剂或药剂,甚至可用于制备人用百日咳博代氏杆菌疫苗。
大多数自然感染的Bb病例不产生BbT中和抗体,但具有细菌凝集作用的抗体以高比率增加,后者已被用于该病的血清学诊断。根据本发明人的观测,在有AR出现的15个县的48个农场的327头猪中,只有一个农场(占2.1%)的2头猪(占0.6%)中查出BbT中和抗体阳性。传统的Bb灭活疫苗可使细菌凝集作用的抗体增加,从而干扰诊断。但是,本发明的纯化法与常规纯化法联合应用,进一步提高BbT的纯度后,可制备一种能产生中和抗体但不会增加具细菌凝集作用的抗体的类毒素。能够使疫苗诱导的抗体和感染诱导的抗体之间具有血清学差别的疫苗或类毒素谓之“标识疫苗”。例如,在无特殊病原体(SPF)的农场里,如果出现任何原因引起的Bb感染而使用本发明的类毒素以防止AR,则可借助测定具有细菌凝集作用的抗体,查出被感染的猪。
本发明的另一个方面是提供一种含有根据本发明的纯化方法制备的BbT类毒素以及由巴斯德氏菌所产皮肤坏死毒素的类毒素之类毒素混合制剂。
就本发明所用的PmT来说,作为起始材料的Pm菌细胞提取物包括从产毒性Pm或非典型巴斯德氏菌来源的菌细胞提取物(Kamp,E.M.I.E.et al.,Vet.Rec.,126,p.434-437(1990))。另外的选择是,本发明的起始材料也包括PmT由基因工程技术表达的菌细胞之提取物。本发明所用的优选提取物是来源于产毒性Pm的菌细胞提取物,产毒性Pm采用普通的方法加以培养,例如在心脏浸液培养基、酪蛋白胰酶大豆肉汤、Luria-Bertani培养基、肉浸液培养基等一类液体培养基中作静止培养、摇动培养或充气旋转器培养(de Jong,M.F.and Akkermans,J.P.W.M.,Vet.Quart.,8,p.294-314),或用右旋糖-淀粉培养基、血琼脂培养基和YPC培养基等一类琼脂培养基培养(Namioka,S.andMurata,M.,Cornell Vet.,51,p.498-507(1961))。用Conradi棒等器具,把琼脂培养基上的细菌培养物混悬于Tris缓冲液等中。用离心法回收菌细胞后,将液体培养基中的细菌培养物,混悬于供下面纯化步骤用的适宜缓冲液中。菌细胞混悬液经超声处理、酶处理、挤压和反复冻融等方式处理,以便制成菌细胞匀浆。用离心法或膜过滤法除去细胞碎片。
用离子交换色谱和以能识别PmT的抗体制备的亲和色谱等分离方法纯化菌细胞提取物。另外的选择是,产毒性Pm的培养物在液体培养基中培养24至65小时后所获得的上清液也可作为起始材料用于纯化,或者直接用于减毒处理。
如此制备的皮肤坏死毒素组分用甲醛、戊醛等作解毒处理。解毒处理完成后,采用透析等方法,以磷酸盐缓冲的生理盐水取代缓冲液,并往里面加入佐剂。可以加入的佐剂范例包括铝凝胶、油佐剂和皂角苷等。将浓度2倍于添加了佐剂的单价疫苗的一种抗原溶液,与另一种浓度2倍于添加了佐剂的单价疫苗的抗原溶液相混合,即可制成类毒素混合制剂。
根据本发明获得的类毒素混合制剂不但十分安全,而且还能诱导中和BbT和PmT的抗体,因此能保护猪免患因这二种毒素引起的鼻甲萎缩或发育不全。
在下小猪前至少一周,当以2-6周的间隔给妊娠母猪肌肉注射根据本发明得到的BbT类毒素和类毒素混合制剂两次时,即可通过初乳提供的母体抗体防止其后代受感染。对于后来的分娩,只要在临产前接种一针本发明的类毒素,即可足以建立免疫。就严重AR感染的农场的情况而言,以2至6周的间隔给出生不少于7天的仔猪肌内注射本发明的类毒素二次,也能够有效地建立直接的保护作用。
通过下面的制备方法和实例可对本发明进行更详细地说明,但是不应理解为本发明仅限于此。实施例制备方法1
在不高于0℃的温度下,把氯磺酸(117克)逐滴加到吡啶(600ml)中,搅拌混匀。在氯磺酸逐滴加入后,将混合物加热至65至70℃,往里面加入Cellulofine GC-15(80g,Chisso公司生产),在65-70℃条件下搅拌该混合物3小时,使其反应。反应完成后,将混合物冷却,加入10%氢氧化钠水溶液,以逐渐中和该混合物。将凝胶过滤分离出来,并用0.01M磷酸盐缓冲的生理盐水充分洗涤凝胶,以产生纤维素硫酸酯凝胶。制备方法2
在不高于0℃的温度下,把氯磺酸(117克)滴加到吡啶(600ml)中,将混合物搅拌混匀。在氯磺酸逐滴加入后,将混合物加热至65-70℃,往里面加入色谱用Avicel(80克,微晶纤维素,Asahi Kasei KogyoK.K.公司生产),搅拌期间混合物温度保持在65-70℃4小时。反应完成后,将混合物冷却,加入10%氢氧化钠水溶液,以中和该混合物。过滤分离出凝胶,并用0.01M磷酸盐缓冲的生理盐水充分洗涤凝胶,以产生结晶纤维素硫酸酯凝胶。制备方法3
在0-5℃温度下,将氯磺酸(82克)逐滴加到吡啶(500ml)中,将混合物搅拌混匀。在氯磺酸逐滴加入后,将混合物加热至65-70℃。往里加入80克Cellulofine GC-25(Chisso公司生产),将混合物在65-70℃条件下搅拌4小时,使发生反应。反应完全后,将混合物冷却,并缓慢加入10%氢氧化钠水溶液,以中和混合物。过滤分离出凝胶,并用0.01M磷酸盐缓冲的生理盐水(pH7.2)充分洗涤凝胶,以产生纤维素硫酸酯凝胶。实施例1(从色谱柱梯度洗脱)
将按制备方法1制备的Cellulofine GC-15硫酸酯凝胶填装色谱柱(50mm(内径)×200mm)中,并用0.02M磷酸盐缓冲液(pH8.0;比电导率约3mS/cm)平衡该柱。将Bb菌株S611的细胞提取液(200ml)加到柱中,然后用上述的缓冲液洗涤柱,以洗掉碎片。接着用添加0-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH8.0,比电导率约3-46mS/cm)作梯度洗脱,得到含总蛋白量9.1mg的皮肤坏死毒素的组分。皮肤坏死毒素的回收率为39.6%,纯度(纯化的皮肤坏死毒素组分的比活性/菌细胞匀浆提取物的比活性)高达32.1。实施例2(从色谱柱逐段洗脱)
将按制备方法1所制备的Cellulofine GC-15硫酸酯凝胶填装色谱柱(252mm(内径)×210mm)中,并用0.02M磷酸盐缓冲液(pH8.0;比电导率约3mS/cm)平衡该柱。将Bb菌株S611的细胞提取物(总蛋白量为29-35克)加到柱上,然后用添加0-0.15M氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.8-8.0,比电导率约3-17mS/cm)洗涤柱,以洗掉细菌碎片。接着用添加0.3-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.5-7.7;比电导率约30-46mS/cm)洗脱,得到含总蛋白量为0.2-1.1克的皮肤坏死毒素的组分。如表1所示,皮肤坏死毒素的回收率为76-100%,纯度(纯化的皮肤坏死毒素组分的比活性/菌细胞匀浆提取物的比活性)高达22-114,而内毒素含量降低到0.1-3%。表1
批次 方法 总BbT活性 总蛋白量(a) 总内毒素量(b) 比活性(MND 纯度(MND)(回收率) (g)(回收率) (mg)(回收率) /mg蛋白) |
1 菌细胞匀浆提取物 5.55×108(100) 34.3 (100) 59.6 (100) 1.62×104 1.0色谱纯化的组分 4.20×108(75.7) 1.12 (3.3) 1.80 (3.02) 3.75×105 23.22 菌细胞匀浆提取物 1.01×109(100) 34.1 (100) 58.1 (100) 2.95×104 1.0色谱纯化的组分 114×109(113.2) 0.54 (1.6) 1.02 (1.76) 2.11×106 71.53 菌细胞匀浆提取物 4.30×108(100) 35.3 (100) 86.7 (100) 1.22×104 1.0色谱纯化的组分 4.88×108(113.6) 0.35 (1.0) 0.21 (0.24) 1.40×106 114.54 菌细胞匀浆提取物 7.47×108(100) 29.3 (100) 42.9 (1 00) 2.55×104 1.0色谱纯化的组分 5.72×108(76.6) 0.20 (0.7) 0.05 (0.12) 2.86×106 112.2 |
(a)用BCA微量蛋白试验(Pierce)测定
(b)用Endospacy(Seikagaku Kogyo K.K.)测定实施例3(从肝素琼脂糖凝胶柱梯度洗脱)
将肝素琼脂糖CL-6B凝胶(Pharmacia公司生产)填装色谱柱(25mm(内径)×140mm),并用0.02M磷酸盐缓冲液(pH8.0;比电导率约3mS/cm)平衡该柱。Bb菌株S611的细胞提取液(总蛋白量为420mg)加到柱上,然后用上述缓冲液洗柱,以洗去菌细胞碎片。接着用添加0-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH8.0;比电导率约3-46mS/cm)作梯度洗脱,获得含24mg总蛋白的皮肤坏死毒素的组分。皮肤坏死毒素的回收率为40.8%,纯度(纯化皮肤坏死毒素的比活性/菌细胞匀浆提取物的比活性)高达7。分析结果见表2。实施例4(从SP-Toyopearl 650M柱上作梯度洗脱)
将SP-Toyopearl 650M柱(Toso.K.K.公司生产)填充色谱柱(50mm(内径)×140mm),并用0.02M磷酸盐缓冲液(pH8.0;比电导率约3mS/cm)平衡该柱。Bb菌株S 611的细胞提取液(总蛋白量631mg)加到柱上,然后用上述缓冲液洗涤柱,以洗除菌细胞碎片。接着用添加0-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH8.0;比电导率约3-46mS/cm)作梯度洗脱,获得含2mg总蛋白的皮肤坏死毒素组分。皮肤坏死毒素的回收率为11.5%,纯度(纯化的皮肤坏死毒素组分的比活性/菌细胞匀浆提取物的比活性)高达35.5。分析结果见表2。表2
(a)用BCA微量蛋白试验(Pierce)测定(b)用Endospacy(Seikagaku Kogyo K.K.公司)测定(c)未作测试实施例5(高纯度纯化方法)
序号 总BbT活性 总蛋白(a) 总内毒素(b) 比活性(MND 纯度(MND)(回收率) (mg)(回收率) (μg)(回收率) /mg蛋白) |
实施例3 菌细胞匀浆提取物 1.12×107 (100) 421.5 (100) 1,820 (100) 2.7×104 1.0Heparin Cepharose 4.57×106 (40.8) 24.0 (5.7) 8.9 (0.49) 1.9×105 7.2CL-6B纯化的组分实施例4 菌细胞匀浆提取物 1.98×107 (100) 631.0 (100) N.T.(c) 3.1×104 1.0SP-Toyopearl 2.27×106 (11.5) 2.0 (0.32) N.T. 1.1×106 35.5纯化的组分 |
将按实施例1制备的纤维素硫酸酯凝胶纯化组分,对33mM柠檬酸盐/66mM磷酸氢二钠/1M尿素(pH5.0)作透析。将透析液(9.1mg总蛋白)加到用相同缓冲液平衡过的SP-Toyopearl 650M(Toso K.K.公司生产;10mm(内径)×80mm)柱上,接着用相同缓冲液洗涤以洗掉碎片。然后用添加0-0.5M氯化钠的上述缓冲液作梯度洗脱,得到含皮肤坏死毒素(3.1mg总蛋白)的组分(SP组分)。该SP组分在用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.1)/0.3M硫酸钠/1M尿素平衡过的TSK-gel G3000 SW柱(21mm(内径)×600mm)上,用高效液相色谱(HPLC)作进一步纯化,得到含皮肤坏死毒素(1.3mg总蛋白)的组分(HPLC组分。图1至图3分别显示这些色谱分离结果。菌细胞匀浆提取物和皮肤坏死毒素各组分的分析结果列于表3和图4,纯化的毒素性质列于表4。表3
纯化步骤 BbT总活性 总蛋白(a) 比活性(MND 纯度(MND) (mg)(回收率) /mg蛋白)(回收率) |
菌细胞匀浆 1.7×107(100) 731(100) 1.9×104 1提取物纤维素硫酸酯 5.6×106(39.6) 9.1(1.2) 6.1×105 32SP Toyopearl 6.2×106(44.3) 3.1(0.4) 2.0×106 105TSK G3000SW 5.6×106(40.0) 1.3(0.2) 4.3×106 226 |
(a)根据BCA蛋白测定(Pierce公司生产)表4.
分子量 146kDa
最小皮肤坏死剂量 0.23ng
最小脾萎缩剂量 0.07ng
小鼠LD50 3.8ng实施例6(降低毒性)
将甲醛加入到按实施例1至5制备的各皮肤坏死毒素组分中,在37-40℃下使其反应3-14天,以使毒性降低。将10%甲醛的3%当量加到皮肤坏死毒素组分中,第2天的加入当量仍为3%,第3天加入2%当量。降低毒性的反应结束后,将皮肤坏死毒素组分对磷酸盐缓冲的生理盐水作透析处理。实施例7(加入佐剂)
把氢氧化铝凝胶和防腐剂(乙汞硫代水杨酸钠或甲醛)加到按实施例6制备的解毒皮肤坏死毒素中。实施例8(小鼠效价试验)
给5周龄ddy小鼠腹腔注射0.5ml按实施例7获得的类毒素,隔2周注射一次,共二次。在最后一次免疫后二周,给动物腹腔注射约50(25-100)个LD50的皮肤坏死毒素进行攻击,观察7天内的存活率。结果如图5显示。类毒素剂量与小鼠存活率之间呈正相关。实施例9(对繁殖猪的安全性试验)
如实施例6一样,将按实施例2制备的组分作去毒处理。按实施例7制备添加氢氧化铝凝胶的类毒素(2-50μg/2ml/一次剂量),并给10周龄的SPF猪作肌内注射,隔3周注射一次,共注射2次。在受试猪中,均未观察到由于注射引起的临床症状和体温异常。实施例10(对妊娠母猪的有效性试验)
如实施例5获得的HPLC组分按实施例6作降低毒性处理。按实施例7制备添加氢氧化铝凝胶的类毒素(25μg/ml)后,给妊娠母猪作肌内注射,于下小猪前3周和6周各肌注一次,每次注射体积为2ml。给对照母猪注射安慰剂疫苗。喂以充足母体初乳的新生仔猪于出生后3天,鼻内给予2×108 Bb菌株S 611活细胞作攻击,其中一半仔猪于2和3周龄时,各肌注一针2600 MND皮肤坏死毒素作进一步攻击。表5显示所获得的皮肤坏死毒素中和抗体滴度。产小猪的母猪血和初乳中BbT中和抗体滴度分别为32和256,而仔猪的母体抗体滴度为128。其母体抗体保持阳性达6周以上。注射安慰剂的对照母猪及其仔猪均为血清学阴性。攻击试验结果列于表6。12头对照猪中有9头查出鼻甲萎缩(评级为+-+++),而免疫组中均未查出鼻甲萎缩。两组动物之间回收的鼻内细菌无差别。至于体重增长,如图6所示,当除用Bb活菌攻击外还用皮肤坏死毒素作攻击后,二组之间有差别。2周龄时用皮肤坏死毒素作首次攻击后,对照组的体重增长率减少到免疫组的三分之一,3周龄时用皮肤坏死毒素作第二次攻击后,对照组的猪全部死亡。表5
(a)分娩时
组别 母猪抗体滴度(a) 不同周龄仔猪的母体抗体滴度血清 初乳 0 2 4 6 |
免疫组 32 256 128 128 128 64 64 32 16 32 32 16 16 32128 128 64 64 32 32 16 16对照组 <1 <1 <1 <1 <1 <1<1<1 <1<1<1 <1<1<1<1 <1 <1 <1<1<1 <1<1<1 <1<1<1 |
表6
攻击物 鼻甲 细菌组别 猪编号
Bb BbT 萎缩 回收 (a)备注
Y126 + - -/-b) ++++
Y127 + - -/- +
Y128 + - -/- ++++免疫 Y129 + - -/- ++++
Y130 + + -/- +
Y131 + + -/- ++++
Y132 + + -/- ++++
Y133 + + -/- +
Y134 + + -/- ++++
Y151 + - +/+ +++
Y152 + - -/+ ++++
Y153 + - -/+ ++++
Y154 + - ++/+ ++++
Y155 + - +/+ +对照 Y156 + - -/- ++++
Y157 + + +++/++ NTc) 第2天死亡d)
Y158 + + +++/+++ NT 第2天死亡
Y159 + + +++/++ NT 第6天死亡
Y160 + + +++/++ NT 第5天死亡
Y161 + + ++/++ NT 第1天死亡
Y162 + + +/+ NT 第3天死亡(a).鼻内拭子涂抹的培养皿上出现的菌落数;
-:0,+:~50,++:~100,+++:~200,++++:>200(b).分成5级(-,+,++,+++,++++)作评定;左鼻甲骨/右鼻
甲骨的得分。(c).未作试验(d).第二次BbT攻击后算起的天数实施例11(对繁殖猪的效价试验)
将按实施例2获得的组分按实施例6作减毒处理。按实施例7制备添加氢氧化铝凝胶的类毒素(25μg/2ml/每次剂量)后,给10周龄的SPF猪作肌肉注射,以3周间隔注射二次。最后一次免疫后4周,经鼻内给予2×108活Bb菌攻击猪,检测皮肤坏死毒素中和抗体的滴度直至攻击后3周为止。如表7所示,对照猪即使在攻击后仍保持BbT中和抗体血清学阴性。另一方面,免疫组中的所有猪均转变成BbT中和抗体血清学阳性。注射2或6μg/2ml/每次剂量类毒素免疫的猪在攻击后中和抗体滴度呈现迅速的升高,而注射20或50μg/2ml/每次剂量类毒素免疫的猪在攻击后中和抗体滴度无明显升高。
据报道,皮肤坏死毒素具有抑制抗体产生的作用(Sekiya,K.Microbiol.Immunol.,27,p.905-915(1983))。攻击后对照猪中和抗体不见升高的原因,看来像是由于攻击细菌引起的BbT的免疫抑制作用。因此,鉴于免疫组猪中和抗体的急剧升高是由于不受BbT抑制抗体产生作用的影响,提示2μg BbT类毒素这一剂量对繁殖的猪是有效的。
表7BbT
鼻内类毒) 猪编) 首次免疫后各周的 首次免疫后各周的
细菌素剂 号b). BbT中和抗体滴度 Bb凝集抗体滴度 回收量a) 0 3 4 5 7 10 0 3 7 10 结果0 Y135 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <10 <10 <10 40 ++
Y136 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <10 <10 <10 80 ++++2 Y137 <1 <1 16 8 8 128 <10 <10 <10 640 +++
Y138 <1 <1 16 32 16 512 <10 <10 <10 1280 +++
Y139 <1 <1 8 16 16 1024 <10 <10 <10 80 ++++6 Y140 <1 <1 16 32 16 512 <10 <10 <10 640 +++
Y141 <1 <1 16 64 16 128 <10 <10 <10 320 -
Y142 <1 <1 64 64 32 64 <10 <10 <10 160 ++++20 Y143 <1 <1 32 64 64 32 <10 <10 <10 640 ++++
Y144 <1 <1 4 8 8 1 <10 <10 <10 40 +
Y145 <1 <1 16 32 8 8 <10 <10 <10 320 ++50 Y146 <1 <1 64 64 64 64 <10 <10 <10 1280 +++
Y147 <1 <1 128 128 64 32 <10 <10 <10 320 +
Y148 <1 <1 64 256 64 64 <10 <10 <10 640 ++a).μg/2ml/单次剂量b).于0周和3周给10周龄SPF猪肌肉注射BbT类毒素两次,7周
时鼻内给予活Bb菌作攻击。制备方法4(破碎的菌细胞提取物:BbT类毒素1)
将Bb菌S 611株置发酵罐蛋白胨培养基中在37℃通气培养24小时。用离心法浓缩菌细胞,然后用机械破碎法将菌细胞破碎。用离心法或微孔滤膜(孔径0.45μm)过滤法除去细菌碎片后,在获得的溶液(即BbT粗组分)中加入终浓度为0.8%的甲醛,在37-40℃条件下减毒处理7天。所得类毒素对磷酸盐缓冲的生理盐水进行透析。以1mg(以铝含量计)/ml的用量将氢氧化铝凝胶加到经过透析的产物中,形成BbT类毒素1。制备方法5(BbT类毒素2)
按制备方法4获得的BbT粗组分在纤维素硫酸酯凝胶柱上作色谱分离纯化。将该BbT粗组分加到用20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)经过平衡的纤维素硫酸酯凝胶柱上,然后用相同缓冲液洗涤凝胶。用添加了1.5M NaCl和1M尿素的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)将BbT从纤维素硫酸酯凝胶柱(7.8cm(内径)×45cm)上洗脱下来。按制备方法4将洗脱的组分(CS1组分)作解毒处理,经透析后加入氢氧化铝凝胶,形成BbT类毒素2。制备方法6(BbT类毒素3)
用TSK gel HW 65(2.64cm(内径)×69cm)和HW 75(2.64cm(内径)×64cm)柱相结合的色谱分离法将按制备方法5获得的CS1组分作进一步纯化。使CS1组分通过已用添加0.3M硫酸钠和1M尿素的0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.2)平衡过的该色谱柱,并用相同缓冲液作分级分离。然后合并含皮肤坏死毒素的诸级分(组分)。按制备方法4将合并的级分作解毒处理,经透析后加入氢氧化铝凝胶,形成BbT类毒素3。制备方法7(BbT类毒素4)
按制备方法4获得的粗提BbT组分在纤维素硫酸酯凝胶柱上作色谱分离纯化。将该粗提BbT加到已用添加0.1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)平衡过的纤维素硫酸酯凝胶上,并用相同缓冲液洗涤凝胶。用添加0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)将BbT从纤维素硫酸酯凝胶上洗脱下来。按制备方法4将洗脱的组分(CS2组分)作解毒处理,经透析后加入氢氧化铝凝胶,形成BbT类毒素4。制备方法8(BbT类毒素5)
按制备方法7获得的CS2组分用Affi-gel blue柱(Bio Rad公司生产;100-200目;5.0cm(内径)×17cm)作进一步纯化。将CS2组分对50mM Tris缓冲液(pH7.5)透析后,加到已用相同缓冲液平衡过的Affigel blue柱上,将柱用已添加1M磷酸氢二钠的50mMTris缓冲液(pH7.5)加以洗涤。在用50mM Tris缓冲液(pH7.5)将该柱作进一步洗涤后,用已添加2M氯化镁和1M尿素的50mM Tris缓冲液(pH7.5)将BbT洗脱下来。按制备方法4将此纯化组分作解毒处理,经透析后加入氢氧化铝凝胶,形成BbT类毒素5。制备方法9(BbT抗毒素)
将如实施例1和实施例5获得的高纯度BbT组分按制备方法4作解毒处理,经透析后加入氢氧化铝凝胶,形成BbT类毒素6。给27周龄的SPF猪接种该类毒素,在3个月中共接种8次,每次接种1ml,使产生BbT抗毒素(中和抗体滴度为4,096;凝集作用抗体的滴度<20)。制备方法10(PmT类毒素)
将产毒性Pm D型菌S 70株置含心脏浸液肉汤的发酵罐中37℃通气培养24小时。用离心法浓缩菌细胞后用机械破碎法加以破碎。用离心法或微孔滤膜(孔径0.45μm)过滤法除去碎片后所得的溶液(缩写为“粗制PmT”)通过阴离子交换色谱加以纯化。将粗制PmT加到已用添加0-0.3M NaCl或Tris缓冲液的中性磷酸盐缓冲液平衡过的阴离子交换器上,然后用相同缓冲液洗涤阴离子交换器。用添加0.4-0.5M NaCl的相同缓冲液将PmT从该交换器上洗脱下来。在该部分纯化的PmT组分中加入0.4%的甲醛,在37℃进行14天或更长时间的减毒。获得的类毒素对磷酸盐缓冲的生理盐水作透析。把氢氧化铝凝胶以1mg Al/ml的用量加到透析液中,形成PmT类毒素。实施例12(用各种纯化法所获得的BbT类毒素对豚鼠的免疫原性)
将按制备方法4-8获得的活性为3,000 MND/ml(解毒前的活性)的几种BbT类毒素给豚鼠(Hartely;雌性;5周龄)在大腿部作肌注,每种类毒素的注射体积为0.5ml。在注射后28天给动物放血,测定BbT中和抗体的滴度。用磷酸盐缓冲的生理盐水将灭活血清作双倍系列稀释,进行中和抗体测定。将等量BbT(滴度:4MND/0.1ml)加到稀释血清中,在冰冷条件下反应过夜。之后,取0.1ml混合物注入豚鼠皮下,注射后1天进行检测,中和抗体滴度以抑制皮肤坏死反应的血清最大稀释度(即血清的稀释倍数)表示。
如表8所示,注射具比活性为1.4×104MND/mg蛋白的BbT类毒素1和2的豚鼠保持中和抗体的血清学阴性。在注射具比活性3.7×104MND/mg蛋白的BbT类毒素3的情况下,3只豚鼠中有2只为血清学阳性,注射比活性大于7.8×104MND/mg蛋白的BbT类毒素的所有动物都转为血清学阳性。
在纯化期间BbT易于成为不溶性,并容易与像脂、酸性蛋白等一类细菌衍生的物质形成复合物(Wordlaw,A.C.and Parton,R.Pharmacol.Ther.,19,p.1-53(1983))。由此看来,减少这些细菌衍生物能够使解毒更充分,或可减少BbT分子上免疫原的抗原决定基的掩蔽,以增强抗原提呈的效果,从而提高BbT类毒素的免疫原性。表8BbT类毒素 比活性(MND/mg蛋白) 皮肤坏死毒素中和抗体滴度
1 14000 <2 <2 <2
2 14000 <2 <2 <2
3 37000 <2 2 4
4 76000 32 32 128
5 96000 8 32 32无致病力疫苗 - <2 <2 <2(由A生产)无致病力疫苗 - <2 <2 <2(由B生产)每种类毒素浓度调整到3000MND/ml,并以1mg Al/ml的用量加入氢氧化铝凝胶。实施例13(BbT中和抗体的保护作用方面)
给2日龄SPF猪腹腔注射按制备方法10所获得的BbT抗毒素,注射体积分别为0.2,1.0,2.0或20ml,使猪被动免疫。3日龄时鼻内给予108CFU的Bb菌S 611株作攻击。7日龄时肌注粗制BbT(1,940MND/每头猪)作进一步攻击。如图7所示,在BbT中和抗体滴度大于1时,可观察到对抗BbT致死活性的保护作用,而当其中和抗体滴度大于4时,还可能免遭皮肤坏死。实施例14(PmT中和抗体的保护作用方面)
按制备方法10所得粗制PmT类毒素与等量的福氏不完全佐剂混合,加以乳化。8头SPF妊娠母猪分成二组,免疫组6头,对照组二头。免疫组的猪在妊娠期间,肌肉注射类毒素(840MND/ml)2-5次,注射体积3ml/次/每头猪。分娩后仔猪喂以足量初乳,2日龄或9日龄时,肌注20-160MND粗制PmT作攻击。攻击后连续14天观察小猪,并检查鼻甲损伤。如表9所示,观察到在PmT中和抗体滴度大于2时,可保护小猪免患PmT所致鼻甲萎缩,即使中和抗体滴度小于2时也有可能保护小猪免遭死亡。表9试验类别 PmT中和抗体滴度a) 死亡数/总数b) 平均鼻甲萎缩得分c)免疫组 128 0/2 0
64 0/2 0
32 0/3 0
16 0/5 0
4 0/1 0
2 0/9 0对照组 <2 0/10 2.4
<2 3/14 2.3
a)攻击时用胚胎期牛肺细胞测得的母体抗体滴度。
b)给2日龄或9日龄小猪在大腿部位肌注20-160 MND PmT作
攻击。
c)鼻甲萎缩的平均得分值;0:正常,1:轻度,2:中度,3:
重度,4:极重度。实施例15(在用BbT抗毒素被动免疫的仔猪上所作的Bb和Pm攻击试验)
给2日龄SPF仔猪腹腔注射20ml按制备方法10所获BbT抗毒素,作被动免疫。在3和7日龄时分别给猪鼻内施用108CFU的Bb菌S 611株和108CFU的Pm菌D型S 70株,6周龄时进行尸体解剖。如表10所示,用BbT抗毒素免疫后,可从鼻粘膜回收大量Bb菌,而与对照相比,Pm菌的回收量则相当低。对照组的鼻甲损伤评定为重度(+-+)到极重度(++++),而免疫组中,一头猪为正常(-),其余猪为重度到极重度,表明个体与个体之间的差异很大。
表10
不同日龄时BbT 不同日龄时PmT 鼻内细菌组别 仔猪 中和抗体滴度 中和抗体滴度 鼻甲 回收量
猪号.性别 3 7 15 30 44 3 7 15 30 44 萎缩 Bb PmD
a) Y89 ♀ 256 NT 64 32 16 <2 NT <2 <2 <2 ++++ ++++ ++免疫组 Y100 ♀ 256 128 64 32 64 <2 <2 <2 <2 <2 - ++++ -
Y80
<1 NT <1 <1 <1 <2 NT <2 <2 <2 ++++ ++++ ++++对照组 Y83 ♀ <1 NT <1 <1 <1 <2 NT <2 <2 <2 +++ ++++ ++++
Y99 ♀ <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 <2 <2 ++++ ++++ ++++a)给2日龄仔猪腹腔注射猪抗BbT抗血清*小猪3日龄时鼻内给予Bb S611菌(188CFU/头),7日龄时鼻内给予PmD S70菌(108CFU/头),使其遭受攻击。
皮肤坏死毒素在菌细胞内产生,借助细菌溶解从菌细胞分泌出来。因此,BbT抗毒素不能阻断Bb在鼻粘膜上的繁殖。为了Pm的繁殖,Bb应预先在鼻粘膜部位已引起损害。作为由Bb所产生的可引起鼻粘膜损害的因子,BbT(Elias,B.et al.,Jpn.J.Vet.Sci.,52,p.677-688(1990))和气管细胞毒素(Cookson,B.T.and Goldman,W.E.,J.Cell.Biochem.,11B(Suppl.)p.124;Dugal,F.et al.,Can.J.Vet.Res.,56,p.260-264(1992))是最重要的。由于气管细胞毒素具有终止气管纤毛运动的作用,破坏纤毛上皮细胞的作用以及加速粘液分泌的作用,所有这些作用对于Pm的繁殖都是至关重要的,因此,用BbT抗血清免疫只能部分地阻断Pm的繁殖。
鉴于这些事实,应建立至少是抗BbT和气管细胞毒素的免疫,以阻断Pm在鼻粘膜上的繁殖。但是,气管细胞毒素类毒素离实际应用相差甚远,面临许多问题有待解决,例如,纯化方法的建立、免疫原性以及产率等。因此,为了防止萎缩性鼻炎的原发症状而避免经济损失,AR灭活疫苗应至少包含皮肤坏死毒素的类毒素混合制剂。实施例16(类毒素混合制剂的实施例)
将氢氧化铝凝胶加到按实施例2和6所得的解毒BbT中,其混合物加以搅拌。BbT类毒素贮存溶液的制备方法是:把BbT浓度调整到8,700-220,000 MND/ml(相当于解毒前2-50μg/ml BbT蛋白),把铝的浓度调整到0.5-2.5mg/ml,并加入防腐剂。
PmT贮存溶液的制备方法是:在按制备方法10所得的浓度为3,400MND/ml或更高(解毒前的毒素量)的解毒PmT中,加入氢氧化铝凝胶以及防腐剂。所用的防腐剂有0.01%乙基汞硫代水杨酸钠或0.1-0.4%甲醛。BbT贮存溶液与PmT类毒素贮存溶液等量混合,形成类毒素混合制剂。
给9周龄SPF猪颈部肌注接种该类毒素混合制剂2ml,接种二次,间隔3周。间隔一段时间后,制备血清,测定BbT中和抗体和PmT中和抗体的滴度。用胎牛肺细胞做中和试验,测定PmT中和抗体的滴度(Rutter,J.M.and Luther,P.D.,Vet.Rec.,114,p.393-396(1984))。表11显示猪的中和抗体滴度,而表12则是小鼠的滴度试验结果。未观察到给猪和小鼠接种后,BbT和PmT类毒素单用和类毒素混合制剂之间的免疫原性的明显差别。该类毒素混合制剂显现足以起保护作用的中和抗体反应,而且是十分安全的。表11
首次免疫后不同天数 首次免疫后不同天数试验组别a) 猪的 BbT中和抗体滴度 PmT中和抗体滴度
编号 0 10 21 35 50 64 0 10 21 35 50 64BbT单用 Y117 <1 <1 <1 32 32 8 <2 <2 <2 <2 <2 <2
Y118 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 <2 <2 <2
Y119 <1 <1 <1 64 16 8 <2 <2 <2 <2 <2 <2类毒素 Y120 <1 <1 <1 64 32 16 <2 <2 <2 256 128 128混合制剂 Y121 <1 <1 <1 16 8 4 <2 <2 <2 64 32 16
Y122 <1 <1 <1 2 2 <1 <2 <2 <2 64 32 32PmT单用 Y123 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 64 32 16
Y124 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 128 128 64
Y125 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 128 128 64对照 Y114 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 <2 <2 <2
Y115 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 <2 <2 <2
Y116 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 <2 <2 <2a)于0天和21天,将每种类毒素在颈部作肌注。表12
BbT攻击 PmT攻击 |
BbT中和 PmT中和试验组别 抗体滴度 存活数/总数 抗体滴度 存活数/总数 |
BbT单用 256 10/10 N.T. N.T.PmT单用 N.T. N.T. 256 10/10BbT.PmT混合制剂 512 9/10 1024 10/10对照 <1 0/10 <2 0/10 |
表中所列中和抗体滴度系
指攻击时所测得的滴度。
Claims (14)
1.细菌所产生的皮肤坏死毒素的纯化方法,其特征在于使含皮肤坏死毒素的溶液与一种通过直接硫酸化反应硫酸化的色谱凝胶或一种与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶接触,从而使皮肤坏死毒素被吸附到凝胶上,然后从凝胶上把吸附的皮肤坏死毒素洗脱下来。
2.根据权利要求1的皮肤坏死毒素的纯化方法,其中吸附凝胶选自纤维素硫酸酯凝胶,后者是导入硫酸酯的纤维素,或选自含有与肝素、磺丙基或其分子内含磺基(sulfone group)的兰色染料单独结合或联合结合的天然高分子量聚合物或合成高分子量聚合物的色谱凝胶。
3.根据权利要求1的皮肤坏死毒素的纯化方法,其包含以下步骤:(1)、用pH为7-9,固定的比电导率范围为3-20mS/cm或更低的缓冲液将凝胶作预处理,使借助直接硫酸化反应而被硫酸化的色谱凝胶或与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶达到平衡,(2)、使含皮肤坏死毒素的溶液与具有硫酸基作为配基的吸附凝胶,或借助直接硫酸化作用而被硫酸化的吸附凝胶,在pH7-9,温度0-30℃以及固定的比电导率范围为3-20mS/cm或更低的条件下相接触,(3)、在从凝胶洗脱皮肤坏死毒素前,先用pH为5-10,固定的比电导率范围为3-20mS/cm或更低的缓冲液洗涤吸附凝胶,以及(4)、用pH为5-10,比电导率大于3-20mS/cm的固定范围直至达130mS/cm的缓冲液从凝胶上洗脱皮肤坏死毒素。
4.根据权利要求3的皮肤坏死毒素纯化方法,包括下列步骤:(1)、用pH为7-9,比电导率为20mS/cm或更低的缓冲液将凝胶作预处理,使纤维素硫酸酯凝胶达到平衡,(2)、在pH为7-9,温度为0-30℃以及比电导率为20mS/cm或更低的条件下,使含皮肤坏死毒素的溶液与纤维素硫酸酯凝胶接触,(3)、用pH为5-10以及比电导率为20mS/cm或更低的缓冲液在自凝胶洗脱皮肤坏死毒素前,先洗涤吸附凝胶,(4)、用pH为5-10以及比电导率范围为22-130mS/cm的缓冲液将皮肤坏死毒素从凝胶上洗脱下来。
5.根据权利要求3的皮肤坏死毒素纯化方法,包括下列步骤:(1)、用pH为7-9以及比电导率范围为3-5mS/cm的缓冲液将凝胶预先处理,使结合肝素的色谱凝胶平衡,(2)、用pH为7-9,温度为0-30℃以及比电导率范围为3-5mS/cm的条件下,使含皮肤坏死毒素的溶液与结合肝素的色谱凝胶相接触,(3)、在自凝胶洗脱皮肤坏死毒素前,先用pH为5-10以及比电导率范围为3-5mS/cm或更低的缓冲液洗涤吸附凝胶,(4)、用pH为5-10以及比电导率范围为3-130mS/cm的缓冲液将皮肤坏死毒素从凝胶上洗脱下来。
6.根据权利要求1或3的皮肤坏死毒素纯化方法,其中含皮肤坏死毒素的溶液是博代氏杆菌菌细胞提取物。
7.根据权利要求1或3的皮肤坏死毒素的纯化方法,其中含皮肤坏死毒素的溶液是采用基因工程技术使博代氏杆菌的皮肤坏死毒素在其内得到表达的微生物或细胞的培养物或提取物。
8.一种皮肤坏死毒素类毒素,其制备方法包括用化学方法处理部分纯化的皮肤坏死毒素或高度纯化的皮肤坏死毒素,以使该皮肤坏死毒素类毒素失去皮肤坏死毒素的活性而保留其免疫原性;该部分纯化的皮肤坏死毒素的制备方法是使含由博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素的溶液,与一种借助直接硫酸化反应得以硫酸化的色谱凝胶,或一种与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶相接触,从而使皮肤坏死毒素被吸附到凝胶上,接着再从该凝胶上把皮肤坏死毒素洗脱下来;而该高度纯化的皮肤坏死毒素是通过将该部分纯化的皮肤坏死毒素作进一步纯化而制备的。
9.根据权利要求8的皮肤坏死毒素类毒素,其中所述部分纯化的皮肤坏死毒素是由包含以下步骤的纯化方法所制备:(1)、用pH为7-9以及固定的比电导率范围为3-20mS/cm或更低的缓冲液预先处理凝胶的方法,使靠直接硫酸化反应而得以硫酸化的色谱凝胶,或与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶达到平衡,(2)、使含皮肤坏死毒素的溶液与靠直接硫酸化反应而得以硫酸化的色谱凝胶,或与硫酸化分子共价结合的色谱凝胶,在pH为7-9,温度为0-30℃以及固定的比电导率范围为3-20mS/cm或更低的条件下相接触,(3)、在从凝胶上洗脱皮肤坏死毒素之前,先用pH为5-10以及固定的比电导率范围为3-20mS/cm或更低的缓冲液洗涤吸附凝胶,以及(4)、用pH为5-10和比电导率大于3-20mS/cm的固定范围直到130mS/cm的缓冲液把皮肤坏死毒素从凝胶上洗脱下来。
10.根据权利要求要求8的皮肤坏死毒素类毒素,其比活性为3.75×105最小坏死剂量(下文中简称为MND)/mg蛋白或更高。
11.一种联合疫苗,含有由博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素的类毒素和由巴斯德氏菌所产皮肤坏死毒素的类毒素。
12.根据权利要求11的联合疫苗,含有权利要求8的由博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素的类毒素和由巴斯德氏菌所产皮肤坏死毒素的类毒素。
13.根据权利要求11的联合疫苗,含有权利要求9的由博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素的类毒素以及巴斯德氏菌所产皮肤坏死毒素的类毒素。
14.根据权利要求11的联合疫苗,其中所述由博代氏杆菌所产的皮肤坏死毒素的类毒素具有的比活性为37,000 MND/mg蛋白或更高。
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