CN1055024C - 胸膜肺炎放线杆菌亚单元疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能有效防止猪患猪胸膜肺炎的疫苗。所说的疫苗包括溶血素和/或巨噬细胞毒素以及从放线杆菌胸膜肺炎(App)细胞衍生得到的42KD OMP制剂，该疫苗对App感染可导致完全的和异种的保护。

Description

胸膜肺炎放线杆菌亚单元疫苗
本发明涉及一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌：(App)感染的疫苗组合物和一种施用这样一种疫苗来保护猪的方法。
猪胸膜肺炎(猪的一种主要呼吸道疾病)遍及全世界，由于高急性的死亡，对急性病猪的处理和慢性感染动物销售的延迟造成严重的经济损失。已经辨明这种疾病的病因学的动因是胸膜肺炎放线杆菌。
它主要是通过动物的直接接触传染的，造成的感染产生一个从高急性到慢性不尽相同的临床过程。这种疾病主要是呼吸道感染，其临诊症状是高烧、严重的呼吸道痛、咳嗽和厌食。该疾病发作快，发病率和死亡率高。具有病理学意义的是在肺中肺损坏的形成和散布。
自然，人们试图采用接种疫苗计划来控制在猪中这样的胸膜肺炎放线杆菌感染。
为此目的，猪已经被接种菌苗，失去活性的胸膜肺炎放线杆菌。这种疫苗的一个缺点是其伴随有严重的副反应。进一步说，菌苗接种主要导致对(脂肪)多糖类产生抗体，这种抗体仅仅对一定胸膜肺炎放线杆菌血清型是特异的，因而不能抵抗其它胸膜肺炎血清型。另外，胸膜肺炎放线杆菌菌苗对田间感染只能得到较小的保护。
胸膜肺炎放线杆菌的被膜提取物已被报道作为保护性抗原。然而，用这样的提取物对猪和鼠的免疫只提供了部分免疫性。另外，基于被膜的疫苗只产生同种的保护，即接种有从一种特定血清型的胸膜肺炎放线杆菌衍生的被膜疫苗的猪不能得到对一个不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌攻击的保护。
活的毒性减弱的胸膜肺炎放线杆菌疫苗也带有一系列的缺陷，包括用毒性没有充分减弱的病原体接种动物的危险，以及可能使毒性减弱的细菌转变为致病状态而导致被接种的动物产生疾病，并有可能将病原体传播给其他动物。
因此，长期以来一直需要一种安全的，不依赖血清型的并能在猪体内产生强大的保护性免疫反应的胸膜肺炎放线杆菌疫苗。
因此，本发明的一个目的是提供一个抵抗猪胸膜肺炎的亚单元疫苗，它基本上没有胸膜肺炎放线杆菌细胞，主要包括至少两种从胸膜肺炎放线杆菌衍生的不同的亚单元成分，所说的疫苗
—导致很好的保护以抵抗在猪中的胸膜肺炎放线杆菌的感染
—另外是不依赖血清型的
本发明提供了一种胸膜肺炎放线杆菌疫苗，基本上没有胸膜肺炎放线杆菌细胞，其特征在于：该疫苗由胸膜肺炎放线杆菌的外膜蛋白质制剂衍生得到，具有在SDS-PAGE测量下是42kD的一个主要优势抗原蛋白质成分，以及选自具有下列成分中的至少一种毒素；1.一种在SDS-PAGE测量中大约是105kD的胸膜肺炎放线杆菌的溶血素(Hly)，和2.一种在SDS-PAGE测量下大约是120kD的胸膜肺炎放线杆菌的巨噬细胞毒素(Mat)。
根据本发明，已经发现：胸膜肺炎放线杆菌的溶血素和/或巨噬细胞毒素与胸膜肺炎放线杆菌的外层膜蛋白质制剂(具有一个在SDS-PAGE测量下约为42kD的主要优势抗原蛋白质成分，该制剂以下称为42kD OMP制剂)相结合可以用作抵抗猪中胸膜肺炎放线杆菌感染的疫苗，具有已有技术疫苗没有显示出的突出的保护特性。
已知溶血素可在猪中诱导某些保护。然而，包括溶血素和/或巨噬细胞毒素以及42kD OMP制剂的疫苗对有病毒性的胸膜肺炎放线杆菌细菌的攻击产生完全和异种的保护作用(例3和例5)。这种Hly或Mat成分与42kD OMP的组合物出乎意料地增加了疫苗的保护特性。
溶血素(Hly)的特征在于它：——是一种可被钙诱导的蛋白质可以从胸膜肺炎放线杆菌细胞培养物的上清
液中分离得到——有一个在SDS-PAGE(如这里概述的)测量中为105±5
kD的分子量——与分离出溶血素的血清型是有关连的，它对红血球具有溶血活性，
该活性是：——热敏感的，并且——对蛋白酶K处理敏感。溶血素的溶血活性可以根据例2.1中概述的试验确定。
溶血素的溶血活性，在贮藏期间，除了并不导致免疫特性钝化的105kD蛋白质分子量的减少外，它还是不稳定的和衰减的。因而，所说的丧失了溶血活性的溶血素或仍具有免疫特性的溶血素抗原片段也可加到本发明的疫苗中。
在血清型1-12中，只有1、5a、5b、9、10和11型产生具有溶血活性的溶血素(例2.1)，而其它的血清型产生等同的具有105kD的非溶血性蛋白质，这些蛋白与具有溶血特性的105kD蛋白质溶血素有血清上的联系(见例2.3)。所说的它们的免疫等同物或片段在此也被称为溶血素。
另外，可以看出：用来抵抗从一种胸膜肺炎放线杆菌的溶血血清型衍生的溶血素得到的抗血清与从其他溶血的胸膜肺炎放线杆菌血清型衍生得到的溶血素的溶血活性是相互中和的(例2.3)。
鉴于上面提到的在从不同血清型衍生得到的溶血素之间的密切的免疫联系，预期可以制备一种抵抗胸膜肺炎放线杆菌感染的疫苗，该疫苗除包含42kD OMP制剂外，还包含一种可从任何一种可得到的溶血的胸膜肺炎放线杆菌血清型或菌株中衍生得到的溶血素。
根据本发明，加入到一个疫苗中的溶血素可很方便地如下得到，即在促进溶血素表达的条件下培养胸膜肺炎放线杆菌细胞，再将上层清液与细胞分离。溶血素可以通过超滤和硫酸铵沉淀法，接着通过分子筛色谱进一步纯化。
在纯化过程中，从溶血菌株衍生的富集溶血素的组分可以根据例2.1概述的试验，通过其对红血球的溶血活性进行监控。
一些类型的加入到本发明疫苗中的溶血素可以按下面概述的步骤从血清型i的胸膜肺炎放线杆菌细胞中分离：a.在补充以0.01％辅酶I(NAD)，1％Isovitalex，和25mM CaCl2的Columbia培养汁中培养所说的细菌6小时，b.用分子量极限值为300,000D的过滤器浓缩这样获得的培养物的无细胞的上清液；c.通过加硫酸铵至55％的饱和度以从浓缩的上层清液中进行沉淀并接着在16,000xg下离心分离沉淀物10分钟；d.在一个Sephacryl S-200柱上将重新溶解于10mMTris-HCl缓冲液中沉淀物进行分离；e.收集第一个提洗峰。
该分离步骤也可用于获得从其他血清型衍生的溶血素(血清型1溶血素的提纯和部分特性也曾被Frey.J.和Nicolet.T.，FEMS Microbiol.Letters(1988)，55，41-46报导过)。
巨噬细胞毒素(Mat)特征在于它：——是可以从胸膜肺炎放线杆菌细胞培养物上清液中得到的蛋白质，——在SDS-PAGE测量(如这里概述)中分子量是120±
10kD——有一个N-末端氨基酸序列：
Ser(？)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met，——对猪肺泡巨噬细胞是具有细胞毒性的，该毒性是：—热敏感的，并且—对蛋白酶K处理敏感。巨噬细胞的细胞毒性活性可根据例4.1中概述的试验确定。
在贮藏期间除了120kD蛋白质分子量减少(它对Mat的免疫特性不是本质的)以外，Mat的细胞毒性活性是不稳定和衰减的。
因此，所说的丧失了巨噬细胞细胞毒素活性的蛋白质或它们的仍具有免疫特性的抗原片段仍可加入到本发明的疫苗中。
在1-12血清型中，血清型2、3、4、6和8的胸膜肺炎放线杆菌参照菌株产生巨噬细胞毒素另外，已显证明：用来抵抗由特定血清型细胞衍生得到的Mat的抗体中和了Mat制剂的巨噬细胞细胞毒素活性(例4)。
鉴于由不同血清型产生的Mat之间的密切的免疫关系，可以预期本发明的疫苗可以由任何一种可得到的产生Mat.的胸膜肺炎放线杆菌血清型或菌株制备。
欲加入本发明疫苗中的Mat可方便地如下得到，即在促进Mat表达的条件下培养胸膜肺炎放线杆菌细胞，并将上清液与细胞分离。Mat可以通过超滤、色谱和超滤浓缩进一步提纯。
在提纯过程中，富集Mat的组分可以根据例4.1概述的试验通过其巨噬细胞细胞毒素活性来监控。
一些加入本发明疫苗中的巨噬细胞细胞毒素可由下列步骤确定特征并得到：a.在补充以0.01％辅酶I(NAD)的Columbia培养汁中，在37℃下，培养胸膜肺炎放线杆菌血清型2细胞6小时；
用一个分子量极限值为300.000D的过滤器通过超滤作用浓缩培养物上清液；c.在一个CL4B柱上提洗浓缩物；d.收集第一个提洗峰；e.通过一个0.45μm的醋酸纤维素过滤器过滤该毒素。
这种分离步骤也可用于从其他相同或不同血清型的菌株中获得Mat。
本发明的疫苗的非毒素成分是胸膜肺炎放线杆菌细胞的外层膜蛋白质制剂，该制剂包括一个在SDS-PAGE(如这里概述的)测量下为42±5kD的蛋白质或一个它的抗原片段，作为一个主要优势抗原蛋白质(42kD OMP制剂)，该42kD OMP是：——可热变性的——对蛋白酶K处理敏感。
诱发产生的抗由血清型1细胞产生的42kD OMP制剂的抗血清与由胸膜肺炎放线杆菌的血清型1-12衍生得到的细胞溶胞产物强烈地相互反应。由于所说的抗血清主要包括能在Western印迹试验中辨认42kD OMP的抗体；因而可以得出结论：42kDOMP是该提纯的OMP制剂中主要优势抗原蛋白质(例1.2)。由上，可以预期，能够制备一种抗胸膜肺炎放线杆菌感染的疫苗，它除了包含一种溶血素和/或Mat以外，还包含一种由任何可得的胸膜肺炎放线杆菌血清型衍生得到的42kD OMP制剂。
所说的42kD OMP制剂可以通过在促进该42kD OMP表达的条件下培养胸膜肺炎放线杆菌细菌通过例如超声处理、研磨或french压机来破坏胸膜肺炎放线杆菌细胞，接着沉淀细胞膜组分，用密度梯度沉淀或用如Triton X-100或Sarkosyl这样的洗涤剂通过内层膜的不均匀溶解，接着通过离心分离来进一步将组分提纯成内层膜和外层膜，并且如果需要可以制备更富集该42kD OMP的OMP制剂。
一些类型的欲加入本发明疫苗中的富集42kD蛋白质中的外层膜蛋白质制剂，可以按下列步骤从血清型1的胸膜肺炎放线杆菌细胞中分离：a.在补充以0.01％NAD的脑心浸汁(Brain HeartInfusion)中培养所说的细菌过夜；b.用离心分离采集细菌细胞并再悬浮在10mM HEPES缓冲剂中；c.用超声处理破坏细菌细胞；a.用离心分离去除大的细胞碎片并在10,000xg下离心分离1小时从上清液中收获全部膜片段以及再悬浮于HEPES缓冲剂中；e.加入N-十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)至最后浓度为1％(w/v)，并搅拌1小时。f.在100,000xg下离心分离1小时采集外层膜蛋白质并再悬浮于水中。
这一分离步骤可用于从所有可得到的胸膜肺炎血清型中获得42kD OMP制剂。
如果需要，42kD OMP可以采用该技术中已知的方法提纯至同种，例如，用一种或多种洗涤剂从所说的42kD OMP中提取增溶的42kD OMP，接着采用进一步提纯，包括在不影响42kD OMP的保护特性的条件下进行离子交换或分子筛色谱。
加入本发明疫苗中的溶血素、Mat和42kD OMP可以通过化学合成，从胸膜肺炎放线杆菌细胞培养物提纯获得，或通过重组DNA技术获得。
在后一种情形中，编码了上面提到的蛋白质或其片段的核酸序列，例如可以通过对包含所说序列的各个克隆筛选胸膜肺炎放线杆菌DNA基因库来鉴定，例如可以利用一个与诱导产生的抗溶血素、Mat或42kD OMP的多克隆或单克隆抗体特异的反应。核酸序列可以被连结到实现DNA序列的各种各样的表达中，导致一个所谓的重组核酸分子，该重组核酸分子用来转化一个合适的宿主。这样一些杂化的DNA分子可以例如由存在于病毒中的质粒或核酸序列衍生得到。宿主细胞可以是原核生物来源的，例如来源于细菌或真核生物象哺乳动物细胞。转化的宿主细胞可以用来产生溶血素或42kD OMP，在此之后所说蛋白质可以被分离并接着被加入本发明的疫苗中。
在另一个实施例中，可制备活的载体疫苗，其包含非致病的微生物，例如包含编码了溶血素和/或Mat的基因的病毒或细菌以及包含被克隆到同一个或不同的微生物中的42kDOMP。
本发明的疫苗是由溶血素和/或Mat成分，和42kD OMP制剂成分衍生得到的(它们都由胸膜肺炎放线杆菌得到的)。该疫苗可以由所说成分的仍具有免疫特性的各个组分或片段组成或者是如上所述的重组DNA细胞疫苗形式。
包含有抗原决定基的本发明疫苗的蛋白质成分的合适的免疫化学活性多肽片段可以采用专利申请WO 86/06487，Geysen，H.M.等人。(Proc.Natl.Acad.Sci.81，3998-4002，1984)，Geysen.H.M.等人。(J.Immunol.Meth.102，259-274，1987)的方法得到，其基于所谓的Pepscan方法，其中与所考虑的完整多肽的部分序列相对应的一系列部分重叠的多肽被合成，并且试验它们对抗体的反应能力。
另外，该多肽的一些具有指定氨基酸序列的区，基于理论上的考虑和其与已知抗原决定基结构上的一致性被指定为抗原决定基。决定这些区是基于亲水性准则(该准则是根据Hopp和Woods，Proc.Natl.Acad.Sci.78，3824-3828，1981)和二级结构状况(根据Chou和Fasman，AdvanceS inEnzymology 47，45-148，1987)的结合。
可能是不可缺少的T-细胞抗原决定基类似地是在Berzofsky亲水准则的理论基础上得到(见Science 235，1059-62，1987)。小的片段最好被连接到载体分子上以提高其免疫原性。为此目的，合适的载体是一些大分子，如天然聚合物(象钥穴形血清蛋白，白蛋白，毒素这样的蛋白质)、合成聚合物如多胺酸(多熔素、聚氨基丙酸)、或亲水化合物胶束如皂草苷。或者这些片段也可以以其聚合物、最好是线性聚合物的形式被提供。
具体地说，溶血素成分是由血清型1，5a，5b，9，10或11的胸膜肺炎放线杆菌菌株得到的。
在本发明疫苗中的Mat成分最好是由血清型2、3、4、6或8的胸膜肺炎放线杆菌细胞得到的。
本发明的最优疫苗是一种三元疫苗，由42kD OMP制剂，胸膜肺炎放线杆菌的溶血素和Mat得到的。
如果42kD OMP由血清型1细胞得到，溶血素由血清型5b细胞得到以及Mat由血清型2细胞得到，这样的三元疫苗可获得很好的效果。
本发明的疫苗可按常规主动免疫方案施用：以与方剂组成相容的方式一次或重复给药，并且药量是治疗有效的和致免疫的。疫苗的施用可以是例如皮内方式、皮下方式、肌肉方式、静脉方式或鼻饲方式。
以每一个剂量为基础，上面所述这些成分的浓度每头猪大约从1μg到1mg。优选的范围是每头猪从25μg到200μg。
本发明疫苗的制备可以通过将溶血素和/或Mat成分与42kDOMP制剂成分混合成具有免疫作用的合成物。
对于非肠道用药，如肌肉注射，所说的成分可以与合适的药用载体结合，例如经常混合有例如为了增加免疫作用和/或贮藏期的其它组元的含水介质或含水的悬浮液。这些组元可以是盐、PH缓冲剂、稳定剂、乳化剂、用以改善免疫反应的辅：剂(如维生素E的水包油乳状液，油包水乳状液，铝化合物，胞壁酰二肽，皂草苷，聚阴离子，两亲化合物或篏断(共)聚合物)和防腐剂。
该疫苗也可与免疫其他疾病的免疫成分结合以产生多元疫苗或与其他药剂(例如抗菌素)结合。例如，可以制备还包括一种或多种猪病原体抗原物质的多元疫苗，例如，抗原材料可以是假狂犬病毒，可传染的胃肠炎病毒，猪细小病毒，猪流行性感冒病毒，支原体舌骨肺炎(hyopneumoniae)，大肠埃希氏杆菌，红斑丹毒丝菌，支气管败血性博代氏杆菌和出血败血性巴斯德氏菌。
实例1
1.42kD浓缩的外层膜蛋白质制剂的提纯及特征说明方法OMP制剂的提纯可以基本上按Barenkamp(J.Infect.Dis.143，668-676；1981)所描述的进行。
可在补充以0.01％NAD的脑心浸汁中培养App血清型1参考菌株过夜，以通过离心分离采集细菌并重新悬浮在10mMHepes缓冲剂(PH7.4)中。在冰水中冷却的同时，细菌细胞用一个Branson Sonifier(B-12型)作超声处理直到大部分细菌被破坏并且OD660减少至少90％。大细胞碎片通过在5000xg下离心分离20分钟被去除，接着在10,000xg下离心分离10分钟。膜可以通过在100,000xg下超速离心分离1小时从上清液中得到，并再悬浮于Hepes缓冲液中。大的不溶解物质通过离心分离(11,000xg下20分钟)和5μm的过滤被除去。将N-十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)加至滤出液中至最终浓缩度为1％(w/v)。搅拌1小时后，Sarkosyl不溶解的OMP在100,000xg 1小时下被沉淀出来，将其再悬浮于水中并进行0.45μm的过滤。
提纯的OMP制备用Laemmli方法(Nature 227，680-684；1970)在SDS-PAGE上测试。
蛋白质含量可以用改进的Folin-Ciocalteu检定法(J.Biol.Chem.73，627；1927)以BSA作为标准来测量，其碳水化合物含量可以用根据Dubois等人(Anal.Chem.28，350-356；1956)的苯酚-硫酸检定法以葡萄糖为标准来测量。
在加到凝胶上之前，用SDS-PAGE通过以不同的温度(30℃-100℃)对缓冲液中的样品预处理10分钟来检验OMP的热可变性能。
OMP′S的对蛋白酶K处理的敏感性可如下检验。样品在10mM Tris-HCl缓冲液中(PH7.5)被调整至大约含0.05mg/ml的蛋白质，该缓冲液中补充以5mM的EDTA和0.5％SDS，并包含100μg/ml的蛋白酶K(Boehringer)。伴随着轻微搅拌在37℃下保温3小时并在4℃下贮藏过夜，蛋白酶K处理过的和假处理的样品在SDS-PAGE上试验。凝胶体用CBB或银(Wrey等人，Anal.Biochem.118，197-203；1981)染色，或与恢复期的猪血清一起用于Western印迹试验中(Anal.Biochem.120，46-51；1982)。所用的猪抗血清都是猪的恢复期的血清，这些猪是具有App血清型2或9的田间感染后存活下来的猪，或是具有App血清型1、2、5a或9受到试验性攻击并存活下来的猪。结果
提纯的OMP制剂的蛋白质-碳水化合物之比是1∶0.8。提纯OMP制剂用CBB染色的SDS-PAGE试验显示一个作为主要蛋白质的42kD的双带，该蛋白质与总的细菌溶菌产物和总的膜粗制剂相比显然是浓缩的。图1显示了提纯OMP制剂的凝胶扫描的一个例子，是在一个Shimadzu Dual-Wavelength TLC扫描仪(CS-930)上进行，扫描仪连有一个Shimadzu数据记录仪(DR-2)。以蛋白质为基础，42kD蛋白质的纯度似乎是约60％。
在SDS-PAGE试验之前先以不同的温度预处理提纯的OMP制剂表明：在70℃或更高温度下的预处理后，42kD蛋白质是其主带。在低于60℃的预处理后，42kD的带完全消失，而另一个在200kD的主带出现。这个200kD带在经过70℃或更高的温度预处理后就不存在了。可以得出结论，42kD OMP是一种可热变性的蛋白质。
在SDS-PAGE之前用蛋白酶-K预处理提纯的OMP并接着用CBB对凝胶染色表明：在蛋白酶-K处理后没有剩下任何带，也没有主要的42kD蛋白质，同时假处理对凝胶体中的蛋白质模式没有影响。凝胶体的银染色表明：在蛋白酶-K处理后只有很少的低分子量的带(12-20kD)被剩下，而假处理的样品有包括主要42kD带在内的正常的带的模式。用恢复期猪血清的凝胶Western印迹试验显示出：在蛋白酶-K处理后不显现出任何带，而在假处理后显现出正常的图形(图2)。很明显，恢复期猪血清不含有可见于银着色凝胶中针对蛋白酶K有抗性的低分子量带的抗体。可以得出结论：42kD OMP对于蛋白酶-K的蛋白水解作用是敏感的。2.提纯42kD OMP的抗原性试验方法
用20ug如前所述纯化的提纯42kD OMP的油包水乳剂以皮下注射方式给荷兰猪接种，接种后四周，收集血清，并用Western印迹试验测试细菌溶胞产物。(可以从血清型1-10的App参考菌株中如下地制备细菌溶胞产物。细菌可以从每个菌株3个大的15cm的巧克力琼脂平皿上获得，悬浮在有0.3％福尔马林的大约10ml PBS(0.04M，PH7.2)中。细菌用一个BransonSonifier B-12作超声处理来溶解细胞，时间长到足以便OD660减少大约90％。细菌和大的细胞碎片可被离心除去，溶胞产物可通过0.45μm的过滤器过滤。溶胞产物被调整到蛋白质浓度为1mg/ml。)结果
如图3所示，疫苗反应主要是对42kD(双)带。尽管疫苗是由从App血清型1参考菌株提纯的42kD OMP制备的，抗体在血清型1至10的App参考菌株的溶胞产物中识别出一个类似的42kD(双)带。可以得出结论：42kD OMP是一种存在于所有试验的App血清型中通常的交叉反应的抗原。
例2
1.App菌株的溶血活性方法
菌株的溶血活性基本上如Frey和Nicolet(Infec.Immun56，2570-2575；1988)所描述的那样检验，细菌在补充以1％的Iso Vitalex(注册商标)(BBL)、0.01％β-NAD(Sigma)和25mM CaCl2(merck)的Columbia培养汁中在37℃下生长4-6小时直至对数期的中一末阶段。细菌细胞在12,000xg下旋转分离10分钟，并且制作一系列的该上清液在Tris-缓冲盐水(TBS；10mMTris-HCl在0.85％NaCl中，PH7.5)中的稀释液。相同体积的2％的在TBS中的马红血球悬浮液被加入这些上清液的稀释液中。混合物伴随着搅拌在37℃下保温2小时，接着将混合物在4℃下静止保温过夜使红血球沉淀。在540nm(A540)下测量所得上层清液的吸光率，在每个试验中至少包括4个100％的对照，这些对照包括一份蒸馏水和一份2％的马红血球。
阴性对照由一份TBS和一份2％的红血球组成。溶血活性是以该培养物上清液的稀释度表示的，在该稀释度下给出相对于该100％对照的平均值而言有25％的血细胞溶解。当未稀释样品相对于100％对照平均值显示出至少25％的红细胞溶解时，样品被认为是阳性的。阴性对照被用作红细胞悬浮液的质量控制，A540不超过0.100结果
在图表I中表示了App参考菌株的结果。采用所描述的方法的试验，App血清型1、5a、5b、9、10和11看来都是溶血的，而其它血清型则是阴性的。试验App田间分离种群，通常同样的血清型是溶血的。
表1胸膜肺炎放线杆菌参考菌株的溶血活性(在液体培养液中)
    血清型     参考菌株号码     溶血性
    12345a5b6789101112     407415361421M62K17120FemWF834051326113039591538329     +---++---+++-
2.溶血素的提纯和特征说明方法
为了提纯溶血素，App血清型1或血清型5b参考菌株在Columbia培养汁中(补充以1％的IsoVi+alex(商标)0.01％NAB和25mM CaCl2)中在37℃下生长大约6小时。所有接下来的步骤都在4℃下完成。通过离心分离(在16,000xg下30分钟)和用醋酸纤维膜过滤器(Sartorins)的0.45μm过滤作用来除去细菌。无细胞的上清液通过用具有一个PTMK过滤器(MW界限300,000；聚砜)的Minitan(注册商标)系统(Millipore)的超过滤作用进行浓缩。溶血素在55％的饱和硫酸铵中沉淀过夜，在16,000xg下离心分离10分钟，并重新溶解于10mM PH值为7.5的Tris-HCl缓冲液中。最后，溶血素在一个Sephaeryl S-200或一个CL4B柱(Pharmacia)上用10mMTris-HCl缓冲波(PH7.5)作为提洗缓冲液来提洗。第一个提洗峰包含有溶血素。提纯的溶血素制剂以Laemmli的方法(Nature227，680-684；1970)在SDS-PAGE上测试。
可以通过培养物上清液的硫酸铵沉淀法从所有的血清型制得溶血素粗制剂。所有制剂(除非另外说明)在-70℃下贮藏。
热敏性可通过在60℃下加热培养物上清液10分钟并接着测试溶血活性(见前面)来测试。对蛋白酶K处理的敏感性可以通过在37℃下保温含有0.02mg/ml蛋白酶-K(Boehringer；从T.album)的培养物上清液10分钟并接着测试溶血活性来测得。
对胰蛋白酶的敏感度可以通过在37℃下保温含0.02mg/ml胰蛋白酶(Sigma)的培养物上清液10分钟，接着加入0.03mg/ml胰蛋白酶-抑制物(Sigma)并在37℃下再保温10分钟来测验。提纯的溶血素(包含0.6mg/ml)在37℃下用0.1mg/ml的蛋白酶-K一起保温3小时，接着进行SDS-PAGE测试。提纯的溶血素的稳定性可以通过在不同的温度下贮存制剂不同长度的时间并接着进行SDS-PAGE分析来测试。结果
以这些方法中描述的步骤从血清型1和血清型5b参考菌株中提纯的溶血清，在CBB染色后在SDS-PAGE测试中在105kD处都显示出一个带。提纯的血清型5b溶血素的凝胶扫描被表示在图4中。尽管在SDS-PAGE测试中的表观分子量大约是105kD，在用一个界限分子量为300kD的过滤器过滤时留住了天然溶血素。另外，从凝胶过滤中得到的洗提曲线来看，可以得出结论：天然溶血素或其聚集物的分子量至少是10×106D(图5)。用一个Sephacryl S-1000(Pharamcia)柱以牛甲状腺球蛋白(分子量大约是669kD；Sigma)作为标记蛋白质，溶血素在空隙容积后被洗提，而甲状腺球蛋白被留保。
提纯的溶血素制剂的蛋白质-碳水化合物比率是大约10∶1。
从表1中所列的由参考菌株的培养物上清液制得的溶血素粗制剂，在SDS-PAGE测试中都在105kD显示出一个类似的带。以所描述的试验测试没有溶血活性的参考菌株，也都显示了一个类似于溶血菌株的105kD的蛋白质带。
只要提纯是在细菌培养后的2-3天内进行，提纯的溶血素仍具有溶血活性。当在-70℃下贮存时溶血活性是稳定的，但是在4℃或更高温度下贮存几天溶血活性丧失。
而且，在SDS-PAGE测试中，当在4℃或更高温度下贮存提纯的溶血素时，105kD蛋白质是不稳定的。在4℃、室温或37℃下贮存溶血素7天造成蛋白质带的表现分子量的逐步减少，直到在37℃贮存后的大约65kD。作为一个例子，图6显示了在-20℃和37℃下保存的提纯溶血素的凝胶扫描特性。
属于溶血血清型(见表1)菌株的培养物上清液的溶血活性，在60℃下加热10分钟，就全部丧失。培养物上清液的溶血活性也对蛋白酶-K处理或胰蛋白酶处理敏感。向培养物中加0.5％的甲醛并在室温或37℃下保温过夜也会破坏溶血活性。
3.提纯的溶血素的抗原性测试和抗血清的交叉反应方法
恢复期猪血清是从App血清型1、2、5a或9试验感染后存活下来但出现了严重的App感染典型肺损伤的猪上收集的。
高度免疫的血清可以通过间隔6周的两次肌肉注射在兔子体内产生，注射的提纯溶血素，如前所述，是从血清型1或血清型5b参考菌株中提纯的，一些兔子两次分别用在完全弗氏佐剂(FreundComplete)和不完全弗氏佐剂(Freund IncompleteAdjuvant)中的100μg提纯的血清型1溶血素进行免疫。一些兔子用两次在母育酚衍生的乳剂中的25μg提纯的血清型5b溶血素进行免疫。
对已经在不同温度下(-70℃、4℃和室温)存贮很长时间由App血清型5b提纯的溶血素，也会在兔体内产生高度免疫的血清。兔子以6周的间隔接受两次在油包水乳液中的25μg溶血素的肌肉注射。在不同温度下制剂保存的时间是在首次接种时是75天、在加强注射时是118天。在用免疫前的血清进行血清学方法(Elisa，Western印迹)试验时，所有的动物具有SPF质量或至少是无App的。抗血清在加强注射两周后收集。
产生杂化瘤系的单克隆抗体(MAb)是用标准方法制备的。Balb/C小鼠是用由App血清型1提纯的溶血素来免疫的，将脾细胞与Ag8骨髓瘤细胞融合，用极限稀释法克隆阳性杂化瘤细胞。可以从杂化瘤培养物上清液或从小鼠腹水中获得Mab。
用提纯的血清型1和血清型5b溶血素作为涂复抗原按标准步骤进行Elisa(酶-连结免疫吸附试验)。抗血清在作一系列稀释前预稀释到1∶100。本底吸附值可从1∶100被稀释的免疫前的血清中计算出。Elisa滴定度可定义为可给出至少为本底吸收值1.15倍吸收值的最高的血清稀释度。
如前所述地进行溶血素粗制剂和提纯溶血素的Western印迹试验。
抗血清对溶血活性的中和作用如下进行试验。如前所述地制取培养物上清液，抗血清被预稀释至1∶25并接着在TBS中制作一系列稀释度的溶液。相同体积的未稀释的培养物上清液被加入这些抗血清稀释液中，接着在37℃下保温30分钟。如前所述地测试这些混合物的溶血活性。中和滴定度被定义为相对于2倍稀释的培养物上清液能给出50％血细胞溶解的血清稀释度免疫前的血清用作每个试验的阴性对照。结果
如表2所示，用App血清型1、5a或9感染后存活下来的猪的恢复期血清，在Elisa中对从血清型1和5b中提纯的溶血素具有高的抗体滴定度，并且中和App血清型1，5b和9的培养物上清液的溶血活性。恢复期血清型2的猪血清在Elisa中对血清型1和5b溶血素仅具有中等的抗体滴定度，面检测不到对溶血活度性的中和作用。对从App血清型1和5b中提纯的溶血素产生的高度免疫的兔子抗血清在Elisa中对血清型1和5b溶血素都显示出高的抗体滴定度，并且二种抗血清都对血清型1、5b和9溶血素显示中和作用。
对App血清型1溶血素制备的4种不同Mab在Elisa中对血清型1和5b溶血素都有高的滴定度，但对溶血活性没有显示出任何中和作用。所有试验的App血清型1抗血清(恢复期猪血清，高度免疫的兔血清和Mab)在Western印迹试验中，与提纯的血清型1和5b溶血素中的105kD带以及与所有App血清型(1-12)的溶血素粗制剂的105kD带都反应。作为例子，图7显示了溶血素粗制剂和具有一种Mab的提纯的App血清型5b溶血素制剂的Western印迹。
可以得出结论：1)105kD不稳定溶血素在主动感染以及在用提纯的溶血素免疫后都是抗原的；2)抗溶血素抗体显示出与由所有App血清型(1-12)产生的类似105kD抗原的交叉反应，包括在所述试验中试验时没有溶血活性的那些菌株；3)只要抗体是由从溶血血清型中的105kD抗原所诱发，诱发的抗体对各种血清型的溶血活性显示出交叉中和作用。显然，这些单克隆抗体(Mab)能识别一些不具有溶血活性的抗原决定基。
如前所示，在4℃或更高的温度下贮存提纯的溶血素导致在SDS-PAGE测试中表观分子量的减少，逐步地从105kD降到65kD。表2中所列的对105kD溶血素产生的抗血清，在Western印迹试验中仍与表观分子量减少的(数据没有显示)的陈的溶血素制剂反应。兔免疫后陈制剂的抗原特性如表3所示。可以得出结论：在SDS-PAGE中表观分子减少的陈的溶血素仍产生与App血清型1和5b原来的105kD溶血素反应的抗体。可观察到抗体滴定度的某些减少，而以65kD陈的溶血素制剂进行免疫还产生带很高抗体滴定度的抗血清。这些抗血清也对溶血活性显示出中和作用。
表2.抗血清与溶血素制剂的交叉反应
抗血清(血清型)a)     Elisab)1     5b     Blotc)   中和作用d)1    5b    9
  CPS168(1)CPS261H(2)CPS139(5a)CPS191(9)     ++    +++     +++    ++++    ++     +ntntnt   +    +    +-    -    -+    +    ++    +    +
  HRS3895(1)HRS4609(5b)     ++    ++++    ++     +nt   +    +    ++    +    +
MAbs(1)PPSPRS ++    ++-     --     - +-- -    -    --    -    --    -    -
a)CPS＝取自用指示的App血清型感染的猪的恢复期血清。HRS＝对从所指示的App血清型提纯的溶血素有高度免疫
   的兔血清。Mabs＝对App血清型1中的溶血素制备的4种不同的单克
    隆抗体。
PPS和PRS＝分别是免疫前的猪和兔的血清。b)在Elisa中抗体抵抗从App血清型1和5b中提纯的溶血素的检测
-＝滴定度＜100，
+＝100＜滴定度＜1000，
++＝滴定度＞1000。c)与所有App血清型(1-12)的溶血素粗制剂中的和从App血清型1和5b中提纯的溶血素中的105kD带的反应；
nt＝没有测试d)对App血清型1、5b和9的培养物上清液中的溶血活性的中和作用。
表3.陈的提纯的App血清型5b溶血素的抗原性能
    (对每种制剂采用3个兔抗血清的平均值)
抗原贮存在     在SDS-PAGE测试中优势带     Elisaa)1      5b
-70℃     105kD     6.0    6.9
4℃     80和70kD     5.8    6.55
室温     65kD     5.4    6.2
a)是在Elisa试验中对从App血清型1和5b中提纯的
  105kD溶血素的10log滴定度。
例3
用疫苗接种保护猪抵抗App的攻击方法
用App攻击猪是通过将猪暴露于用一个DeVilbiss 65(DeVilbiss公司，Pennsylvania，U.S.A)超音速喷雾器喷出的喷雾中进行的。采用此种喷雾器是由Sebunya等人建议的(Can.J.Comp.Med.47，48-53；1983)，用于进行App发病机理的研究，尤其是用于评价疫苗上。
对于血清型1和5a，攻击是用App参考菌株进行的(见表1)。细菌在补充以0.01％NAD的脑心浸汁(Brain HeartInfusion)中或在补充以1％IsoVitalex(注册商标)和0.01％NAD的Columbia培养汁中生长大约6小时，通过离心分离采集细菌并在盐水中重新悬浮至需要的浓度。活的细菌计数在巧克力琼脂平面上进行。
在负压力下攻击以后，动物在SPF条件下住在受控制的栅栏房中。
攻击时，大约50ml的细菌悬浮液在15分钟内被雾化喷出。喷雾器置于受攻击房之外，其喷雾腔通过墙与离地面大约1.50m高的一根多孔管相连。所有在一次试验中免疫的和对照动物都在同一攻击室中一起受到攻击。攻击后观察动物二周死亡的、以及在受攻击后2周时存活下来的猪，作解剖以检验其病理上的损伤。典型的App肺损伤，出血坏死的纤维蛋白胸膜肺炎，根据受侵袭的肺的百分比以按0-4等级记下：
0＝没有损伤；
1＝受损伤比率＜25％；
2＝25％＜受损伤比率＜50％；
3＝50％＜受损伤比率＜75％；
4＝      受损伤比率＞75％
试验用不同种的猪进行，这些猪在不同年龄以不同的疫苗和抗原剂量进行免疫，并用App血清型1和5a细菌攻击。所有疫苗在颈部以每次2ml剂量采用肌肉注射施用。第一次和第二次免疫接种间隔是6周，而猪受攻击是在第二次免疫后的第2周。包含在疫苗中的抗原剂量是根据提纯制剂的所有蛋白质含量为基础来计算的。抗原是如例1.1所描述提纯的42kD外层膜蛋白(OMP)制剂，溶血素(Hly)如例2.2所描述提纯，或者2种商业可得到的包含有不同血清型的失活App细菌的疫苗。这些菌苗根据生产部门的指示被施用。每个试验进一步的细节在结果中给出。结果
从实验1(表4)中可以得出结论：两个商业可得到的菌苗都没有有诱导出抵抗攻击的保护，尽管在两种菌苗中存在与攻击菌株(Appl)相同血清型的失活细菌。
在实验2中(表5)可以发现：在猪用溶血素和42kD OMP制剂(它们都是从App血清型1中提纯的)组合物免疫后，就死亡率以及App肺损伤而言，观察到对App 5a攻击几乎起完全的保护作用。平均肺损伤的记录是0.3，在本例中，意味着在解剖标本中只有一只猪有一个小的App肺小结。
在实验3(表6)中年龄非常小的猪用各种不同剂量的由App血清型5b中提纯的溶血素与从血清型1中提纯的42kD OMP制剂的组合物来免疫，并接着用App血清型1来攻击。与对照动物相比，用不同抗原剂量免疫的所有猪就App感染的死亡率和App肺损伤而言都得到了完全的保护。
实验4(表7)非常类似于实验3，只是猪的来源和状态不同。在实验3中所使用的SPF猪不具有抵抗疫菌抗原的母本抗体，在实验4中的猪生自带有对疫苗成分具有高抗体滴定度的大母猪。在猪出生5周时进行免疫的猪对疫苗成分溶血素和42kD OMP的具有介于1∶100和1∶1000之间的ELISA抗体滴定度。还是在此实验中，使用具有母本抗体的猪，用溶血素和42kD OMP制剂的组合物进行免疫保护了猪抵抗App血清型1的进攻。
从这些免疫接种实验中可以得到结论：用溶血素和42kDOMP制剂一起对猪进行免疫接种将诱导对App攻击的完全保护。保护是不仅针对抵抗同种App血清型(由同样血清型提纯的抗原作为App攻击血清型)而且抵抗异种App血清型(由不同于App攻击血清型的App血清型提纯的抗原)。
表4.免疫接种实验No.1a)
疫苗b) 攻击菌株c)(血清型) 死亡率死亡数/总数 平均肺损伤d)
抗原(从血清型) 抗原剂量(μg)
Delsuvac HPPleurovac对照   (菌苗)(菌苗)-     App1App1App1   1/32/31/4   2.03.32.3
a)SFP猪；在出生12周第一次免疫接种；每组3或4头
猪b)Delsuvac HP来自Mycofarm，荷兰，包含App血
清型1、2、3、6、8和9菌苗。
Pleurovac来自Bloxham Veterinary制品有
限公司，爱尔兰，包含App血清型1、2、3、4、6
和8细菌。c)攻击悬浮液的存活计数：1×109/mld)根据受侵袭肺的百分比以0-4等级的App肺损伤计数：
0＝没有损伤，
1＝1-25％，
2＝26-50％，
3＝51-75％，
4＝＞75％
表5.免疫接种实验No.2a)
            疫  苗b)   攻击菌株c)(血清型)   死亡率(死亡数/总数)     平均肺损伤d)
抗原(从血清型)     抗原剂量  (μg)
Hly(1)/OMP(1)对照     50/200-     App 5aApp 5a     0/33/3     0.34.0
a)商售无App猪；在出生8周第一次免疫接种；每组3头猪
b)疫苗配制：油包水乳剂
c)攻击悬浮液的存活计数：6×106/ml
d)见表4插入的说明。
表6.免疫接种实验No.3a)
          疫  苗b) 攻击菌株c)(血清型)     死亡率死亡数/总数     平均肺损伤d)
抗原               抗原(从血清型)         剂量(μg)
 Hly(5b)/OMP(1)    50/200Hly(5b)/OMP(1)    50/50Hly(5b)/OMP(1)    12.5/50对  照            -  App1App1App1App1     0/31/3e1/3e2/3     0003.0
a)SPF猪；在出生后4周第一次免疫接种；每组3头猪
b)疫苗配制：母育酚衍生的乳剂
c)攻击悬浮液的存活计数：7.4×108/ml
d)见表4插入的说明
e)在所指示的组中一头猪由于不明原因死亡，没有任何典型App病症或病理。
表7.免疫接种实验No.4a)
             疫  苗b)     攻击菌株c)(血清型)   死亡率(死亡数/总数)     平均肺损伤d)
抗原(从血清型)     抗原剂量
Hly(5b)/OMP(1)Hly(5b)/OMP(1)Hly(5b)/OMP(1)对  照     50/20050/5012.5/50-     App1App1App1App1     0/30/30/31/3     00.30.73.0
a)带有母体抗体的商售猪；在出生5周后第一次免疫接种；每组3头猪
b)疫苗配制：母育酚衍生的乳剂
c)攻击悬浮液的存活计数：7.4×108/ml
d)见表4的插入说明
                     实验4
1.App菌株的细胞毒素活性方法
为了测试细胞毒素，App培养物上清液与猪肺泡巨噬细胞一起保温。肺泡巨噬细胞通过用补充以0.01M EDTA和20mMHepes，PH7.4的Hank氏的平衡盐溶液(流)冲洗猪肺来分离。细胞在没有EDTA的同样溶液中洗3次，最后离心分离后的细胞悬浮在补充有10％牛胎血清(Fetal Calf Serum)(Gibco)的RPMI 1640培养基(流)中，最后调节到2×106/ml的浓度。组织培养平皿(24个井；Costar)每个井有园形玻璃盖片(12mm；Tamson)在其每个井中接种0.5ml该最后的细胞悬浮液，在5％CO2气氛中、在37℃下使巨噬细胞加入2小时。接着平皿用不带血清的RPMI 1640冲洗3次。
细菌在37℃下在补充有0.01％β-NAD(Sigma)的Columbia培养汁中培养4-6小时直到对数期的中—末阶段。细菌通过离心分离去除并且在带有巨噬细胞的组织培养平皿的每个井中加入0.5ml的上清液。在37℃下保温2小时以后，带巨噬细胞的盖片用RPMI 1640冲洗3次，并在滴下20μl的在PBS中的0.05％Trysan Blue(Merck)后，倒置于玻璃板上，死亡细胞的百分比数，由于吸收Trypan Blue而染成兰色，可以用相衬显微镜来测定。阴性对照由用Columbia培养汁保温的巨噬细胞组成。结果
如表8所示，所有App参考菌株对肺泡巨噬细胞都是有细胞毒性的，一种由细菌分泌的活性。阴性对照对巨噬细胞显示出10％或更小的毒性。
而溶血菌株时细胞毒性可解释在例2中描述的溶血素，非溶血菌株应产生其它有毒分子。与溶血活性形成对照，当细菌在没有补充的CaCl2的情况下生长时也表现出巨噬细胞毒性。
               表8
    App参考菌株培养物上清液对猪肺泡巨噬细胞
      的毒性，溶血活性，和SDS-PAGE试验
血清型(参考菌株) 对巨噬细a)胞毒性 溶血性b) 在SDS-PAGE中存在105kD 120kD
    12345a5b67891011     75100100859090908075706585     +---++---+++   +    -+    ++    ++    ++    -+    -+    ++    -+    ++    -+   ±c)+    -
12培养汁     5510 --   +    --    -
a).如本例方法中描述的那样测定的死亡巨噬细胞的百分比。
b).如例2.1所描述的试验中测定的溶血性
c).一个多少高于120kD位置的可见带，其不与单克隆抗
体Int 33-8反应(见例4.3)。
2.App巨噬细胞毒素(Mat)的提纯的特征描述方法
为了提纯巨噬细胞毒素活性，App血清型2，例2的非溶血菌株在37℃下在补充以0.01％NAD的Columbia培养汁中生长大约6小时。进一步提纯基本上如例2.2中对溶血素的提纯那样进行，包括离心分离去除细菌，用分子量界限值为300,000的过滤器通过超滤作用浓缩该培养物上清液，并在一个SepharoseCL4B柱上提洗该浓缩液。第一个提洗峰含有该毒性活性。该毒素可通过一个0.45μm的醋酸纤维过滤器(Sartorius)过滤并不丧失活性或抗原。
Mat粗制剂可以从所有血清型中用培养物上清液的硫酸铵沉淀法制得。所有制剂在-70℃或-20℃下存贮(除非另外说明)。
Mat的热敏感性、蛋白酶K敏感性、和稳定性的测试是与对溶血素的例2.2所描述的一样。SDS-PAGE试验用Laemmli的方法进行。
N-末端氨基酸分析是在这样一个样品上进行的，该样品是将如上所描述制备的Mat制剂用于电泳和电印迹后而得到。
简单地说，PAGE凝胶是由用于Laemmli系统(Nature227，上述)中的流动的凝胶缓冲溶液制备的。在电泳之后，蛋白质在用10mM CAPS PH9-11/10％甲醇作为转换缓冲溶液的PVDF(Immobilon-P(R)，水/Millipore)上形成印迹。
由印迹得到的蛋白质被用作序列分析，分析是靠Edman降解，用一个在线连接于一个HPLC(Model 120A，AppliedBiosystems)上的自动序列分析仪(脉冲—液体，Model477A，Applied Biosystems)进行的以鉴定逐步释放的PTH-氨基酸。结果
按上面所描述的步骤从血清型2参考菌株中提纯的巨噬细胞毒素(Mat)，只要提纯是在4℃下在2-3天内进行的则Mat仍表现出毒素活性。由于血清型2参考菌株如例2所描述的那样产生一种无活性的溶血素，120kD带被认为是代表了Mat。
对Mat粗制剂的评定在血清型2、3、4、6和8的上清液的SDS-PAGE测试中显示出一个类似120kD带。血清型10培养物上清液显示出一个位置多少高于120kD(表8)的带。一个类似的120kD带也可在一些血清型2和5的田间分离菌中见到。
在至少60℃温度下处理Mat制剂15分钟，或用蛋白酶K处理以后巨噬细胞毒性完全消失。在-20℃下贮存的120kD蛋白质在SDS-PAGE测试中是稳定的，但在4℃下贮存3个月导致在SDS-PAGE测试中120kD带的分裂。
Mat的N-末端的氨基酸序列分析揭示出下列氨基酸序列：
Ser(？)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met
(？)表示一个临时假定的氨基酸
3.巨噬细胞(Mat)的抗原性和抗血清的交叉反应方法
采用例2.3所描述的恢复期猪血清。产生杂化瘤细胞系的单克隆抗体(Mab)用标准方法制备：在筛选杂化瘤时选择可与从App血清型2中提纯的Mat反应的、但在Elisa中不与提纯的App血清型1或5b溶血素反应的Mab。
Western印迹试验如前所述进行。Mat活性的中和可以在4.1所描述的毒性测试之前通过将相同体积的App培养物上清液加到抗血清稀释液中，接着在37℃下保温30分钟来测试。结果
用App血清型2感染后存活下来的猪的恢复期血清，(不是用App血清型1、5a和9感染的猪的血清)在Western印迹试验中辨认出Mat制剂中的120kD带。恢复期App血清型2血清也中和Mat活性。
MAb Int 33-8中和Mat活性并在Western印迹试验中与在血清型2、3、4、6和8(但不与其他(参考)血清型)的Mat粗制剂中的120kD带反应(图8)。
与120kD带的反应也可见于在血清型2田间分离菌的Mat粗制剂中和一些血清型5田间分离菌的粗制Mat制剂中。
在Western印迹试验中，Mab Int 33-4只与血清型2制剂的120kD带反应，不与其它血清型制剂反应。
如以前所描述，如在用CBB染色的SDS-PAGE试验中所见那样，在4℃下贮存提纯的Mat 3个月导致120kD常的分裂。然而，这样长时间制剂的Western印迹试验表明与Mab Int33-8反应的带大约在70-80kD。
实验5
用三元疫苗免疫接种保护猪抵抗App攻击方法
攻击如例3所述进行。在一个实验中(第8号)，用1ml含有106活细菌的6h培养物对猪进行鼻内方式攻击。所用的攻击菌株是App血清型1参考菌株，或带有血清型2或9的App田间分离菌。
免疫接种如例3所述那样进行。在疫苗中抗原的剂量是根据提纯的制剂总的蛋白质含量计算的。抗原是如例1.1所述提纯的42kD外层膜蛋白(OMP)，如例2.2所述提纯的105kD溶血素(Hly)，和如例4.2所述提纯的120kD巨噬细胞毒素(Mat)。每个实验的进一步细节在结果中给出。结果
在实验5(表9)中，也用二元的105kD溶血素和42kDOMP疫苗(也被用于例3)试验其保护抵抗App血清型2攻击的性能。如表所显示的那样，该疫苗确实诱导一些抵抗损伤的保护，但不能完全保护抵抗血清型2的攻击。因此，可以得出结论：为了还能对App血清型2提供完全的保护，疫苗必须包含一个额外成分，例如，例4中所描述的120kD的巨噬细胞毒素。
在实验6中(表10)用含有从血清型2提纯的120kD巨噬细胞毒素(Mat)和从血清型1提纯的42kD OMP的疫苗，或者用含有从血清型2提纯的120kD Mat、从血清型1提纯的42kD OMP和从血清型5b提纯的105kD溶血素(Hly)的疫苗，对猪进行免疫接种。可以发现：含有120kDMat和42kD OMP的二元疫苗不能对用App血清型1攻击后造成的损伤提供保护。没有这种保护是可以预料得到的，因为根据例3疫苗必须包含105kD溶血素才能对App血清型1起保护作用，并且用于攻击的App血清型1菌株不能表达120kD Mat。
令人惊奇的是，在二元疫苗中加入从血清型5b细胞中提纯的105kD Hly导致了对App血清型1攻击的全面保护。
在实验7中(表11)，与在实验6中相同的二元和三元疫苗被试验其保护猪抵抗App血清型2攻击的性能。如表所显示的那样，两种疫苗就死亡率和肺损伤而言均非常好地保护了猪抵抗App血清型2的攻击。因而，将120kD Mat加入到二元105kDHly/42kD OMP疫苗中可使疫苗对App血清型2提供保护作用。
在实验8中(表12)，可以发现：与用于实验7中相同的含有120kD Mat，42kD OMP和105kD Hly的三元疫苗还能保护猪抵抗用App血清型9菌株的完全异种的攻击。
表9.免疫接种实验No.5a)
    疫  苗b)   攻击菌株c)(血清型) 死亡率(死亡数/总数)   平均肺损伤d)
抗  原(来自血清型)     抗原剂量μg
Hly(5b)/OMP(1)对  照 50/200- HV 109(2)HV 109(2) 0/30/3 1.72.0
a)SPF猪；在出生12周后第一次免疫接种；每组3头猪
b)疫苗配制：母育酚衍生的乳剂。
c)攻击悬浮液的存活计数：1.9×108/ml
d)见表4插入的说明
表10.免疫接种实验No.6a)
                  疫苗b)   攻击菌株c)血清型 死亡率(死亡数/总数) 平均肺损伤d)
抗  原(来自血清型)     抗原剂量(μg)
Mat(2)/OMP(1)Mat(2)/OMP(1)//Hly(5b)对照     50/20050/200/50-     App1App1App1     0/30/30/3     1.70.01.5
a)SPF猪；在出生7周后第一次免疫接种；每组3头猪
b)疫苗配制：母育酚衍生的乳剂.
c)攻击悬浮液的存活计数：2.1×109
d)见表4插入的说明
表11.免疫接种实验No.7a)
    疫  苗b)   攻击菌苗c)(血清型)   死亡率(死亡数/总数)     平均肺损伤d)
抗原(来自血清型)   抗原剂量(μg)
Mat(2)/OMP(1)Mat(2)/OMP(1)//Hly(5b)对照 65/5065/50/50- HV 111(2)HV 111(2)HV 111(2) 0/2*0/32/3 0.00.33.3
a)SPF猪；在出生后12周第一次免疫接种；除了长的情况外，每组3头猪*表示在攻击
  前有1头猪死亡
b)疫苗配制：母育酚衍生的乳剂
c)攻击悬浮液的存活计数：5×108/ml
d)见表4插入的说明。
表12.免疫接种实验No.8a)
    疫苗b)   攻击菌株c)(血清型) 死亡率(死亡数/总数)     平均肺损伤d)
抗  原(来自血清型)   抗原剂量(μg)
Mat(2)/OMP(1)/Hly(5b)对  照 65/50/50- 4915(9)4915(9) 0/82/8 0.32.3
a)SPF猪；在出生5周第1次免疫接种；每组8头猪
b)疫苗配制：母育酚衍生的乳剂
c)用106活的细菌进行鼻饲方式攻击
d)见表4插入的说明。
附图说明图1.流动有42kD浓缩OMP制剂的SDS/PAGE凝胶
扫描图2.具有恢复期猪血清的蛋白酶-K OMP制剂的Western
印迹试验：
道1和4：OMP粗剂；
道2、3、5和6：提纯的OMP；
道1-3：假处理过的；
道4-6：蛋白酶K处理过的。图3.具有免疫接种后血清的细菌溶胞产物的Western印迹试验。图4.流动有提纯的溶血素(B)和标记蛋白质(A)的SDS
-PAGE凝胶扫描。图5.用Sephacryl S-1000柱的溶血素的洗提分布
图。图6.标记蛋白质(A)和在-20℃或37℃(B)下贮存的
提纯的溶血素(B)的凝胶扫描。图7.溶血素粗制剂和带有对App血清型1溶血素产生的单克
隆抗体的App血清5b溶血素(*)的
Western印迹试验。图8.与抵抗App血清型2的Mat产生的单克隆抗体一起的
Mat粗制剂的Western印迹试验。

Claims (8)

1.制备一种不含胸膜肺炎放线杆菌细胞的保护猪抵抗胸膜肺炎放线杆菌感染的疫苗的方法，其特征在于将含有通过SDS-PAGE测得具有约42KD的主要优势抗原蛋白质成分的胸膜肺炎放线杆菌的外膜蛋白质制剂与选自下面的一种或两种毒素混合：
a.一种在SDS-PAGE上约为105KD的胸膜肺炎放线杆菌的溶血素；
b.一种在SDS-PAGE上约为120KD的胸膜肺炎放线杆菌的巨噬细胞毒素。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于将外膜蛋白质制剂、溶血素和巨噬细胞毒素混合。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于溶血素是从血清型1、5a、5b、9、10或11的细菌得到的。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于巨噬细胞毒素是从血清型2、3、4、6或8的细菌得到的。
5.根据权利要求2的方法，其特征在于将血清型1细胞的外膜蛋白质制剂、血清型5b细胞的溶血素和血清型2细胞的巨噬细胞毒素混合。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于还混合了其他猪病原体的抗原物质。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于猪病原体是假狂犬病病毒或猪流感病毒。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于加入了一种辅剂。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100258772B1 (ko) * 1990-12-19 2000-08-01 피터씨.리챠드슨 돼지의 흉막폐염 백신 조성물
US5994525A (en) 1991-06-28 1999-11-30 Kamp; Elbarte Margriet Nucleic acid encoding Actinobacillus pleuropneumoniae cytolytic proteins
US5417971A (en) * 1991-10-22 1995-05-23 University Of Saskatchewan Vaccines for Actinobacillus pleuropneumoniae
WO1993021951A1 (en) * 1992-04-27 1993-11-11 Michigan State University Method for producing a bacterial vaccine and novel vaccines produced thereby
US6656477B1 (en) * 1992-07-28 2003-12-02 Board Of Trustees Of Michigan State University 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof
CA2170839A1 (en) * 1995-03-01 1996-09-02 Janet Macinnes Bacterial preparations, method for producing same, and their use as vaccines
US5925354A (en) 1995-11-30 1999-07-20 Michigan State University Riboflavin mutants as vaccines against Actinobacillus pleuropneumoniae
US6342231B1 (en) 1998-07-01 2002-01-29 Akzo Nobel N.V. Haemophilus parasuis vaccine and diagnostic
US6713071B1 (en) 1998-10-22 2004-03-30 Pfizer Inc. Proteins from actinobacillus pleuropneumoniae
TWI224107B (en) * 1998-10-22 2004-11-21 Pfizer Prod Inc Novel proteins from actinobacillus pleuropneumoniae
KR100372278B1 (ko) * 2000-03-03 2003-02-17 주식회사 한국미생물연구소 돼지 호흡기용 혼합백신
CA2477273A1 (en) * 2002-02-25 2003-09-18 U.S. Army Medical Research And Materiel Command Method of making cs6 antigen vaccine for treating, preventing, or inhibiting enterotoxigenic escherichia coli infections
TWI392737B (zh) * 2008-11-27 2013-04-11 Intervet Int Bv 產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ或ＡｐｘIII 之方法
TWI461529B (zh) 2008-11-27 2014-11-21 Intervet Int Bv 產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ之方法
TWI548746B (zh) 2009-08-06 2016-09-11 英特威特國際股份有限公司 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法
CN102058880B (zh) * 2010-10-13 2012-11-21 青岛易邦生物工程有限公司 猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法
ES2416154B1 (es) 2011-11-09 2015-04-01 Laboratorios Hipra, S.A. Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae
KR101491792B1 (ko) * 2013-09-10 2015-02-13 대한민국 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 5번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물
KR101491803B1 (ko) * 2013-09-10 2015-02-16 대한민국 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 2번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물
CN104502581B (zh) * 2014-12-07 2016-05-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法
KR101818901B1 (ko) 2016-08-26 2018-01-16 우진 비앤지 주식회사 돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물
EP3689373A1 (en) 2019-01-30 2020-08-05 IDT Biologika GmbH Inactivated apxia, apxiia and apxiiia toxins
GB202011902D0 (en) 2020-07-30 2020-09-16 Imperial College Innovations Ltd Antinobacillus pleuropneumoniae vaccines

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1980002113A1 (en) * 1979-04-04 1980-10-16 Nordisk Droge & Kemikalie As A vaccine for combatting pleuropneumonia in pigs,and a process and a substrate for the aerobic fermentation of haemophilus pleuropneumoniae
EP0354628A1 (en) * 1988-08-12 1990-02-14 Centraal Diergeneeskundig Instituut Vaccine suitable for prophylaxis and control, respectively, of the pig disease caused by Haemophilus pleuropneumoniae as well as a method for its production

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5047237A (en) * 1985-09-06 1991-09-10 Prutech Research And Development Partnership Attenuated pseudorabies virus having a deletion of at least a portion of a gene encoding an antigenic, nonessential protein, vaccine containing same and methods of identifying animals vaccinated with the vaccine
US5641653A (en) * 1989-10-31 1997-06-24 The Texas A&M University System DNA encoding Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1980002113A1 (en) * 1979-04-04 1980-10-16 Nordisk Droge & Kemikalie As A vaccine for combatting pleuropneumonia in pigs,and a process and a substrate for the aerobic fermentation of haemophilus pleuropneumoniae
EP0354628A1 (en) * 1988-08-12 1990-02-14 Centraal Diergeneeskundig Instituut Vaccine suitable for prophylaxis and control, respectively, of the pig disease caused by Haemophilus pleuropneumoniae as well as a method for its production

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INFECTION IMMUNLOGY VOL.55,NO.7 1987.1.1 J.I.MACINNES ET AL "ANALYSIS OF MAJOR ANTIGENS OF HACMOPLILUS PLEUROPNEUMO NIAL AND RELATEO OTGA NIS MS *

Also Published As

Publication number Publication date
HU211031B (en) 1995-09-28
GR3017160T3 (en) 1995-11-30
CN1056428A (zh) 1991-11-27
KR100196208B1 (ko) 1999-06-15
JP3240063B2 (ja) 2001-12-17
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EP0453024A1 (en) 1991-10-23
KR910018033A (ko) 1991-11-30
US5648081A (en) 1997-07-15
ES2075325T3 (es) 1995-10-01
DE69110082T2 (de) 1995-11-09
CA2040544C (en) 2002-10-22
ZA912796B (en) 1992-01-29
NZ237867A (en) 1992-11-25
HU911303D0 (en) 1991-10-28
EP0453024B1 (en) 1995-05-31
HUT61489A (en) 1993-01-28
DE69110082D1 (de) 1995-07-06
DK0453024T3 (da) 1995-10-16
CA2040544A1 (en) 1991-10-21
AU634879B2 (en) 1993-03-04

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