HU211031B - Method for preparation of actinobacillus pleuropneumoniae vaccine - Google Patents
Method for preparation of actinobacillus pleuropneumoniae vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU211031B HU211031B HU911303A HU130391A HU211031B HU 211031 B HU211031 B HU 211031B HU 911303 A HU911303 A HU 911303A HU 130391 A HU130391 A HU 130391A HU 211031 B HU211031 B HU 211031B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- serotype
- hemolysin
- app
- pleuropneumoniae
- omp
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 73
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 title claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 34
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims description 108
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 claims description 99
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 86
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 41
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 31
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 18
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 10
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 2
- 241000122975 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1 Species 0.000 claims 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 claims 1
- 101150011585 MAT gene Proteins 0.000 description 47
- 101100099741 Mus musculus Tmprss11d gene Proteins 0.000 description 47
- 108700010762 mat Proteins 0.000 description 47
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 21
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 11
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 11
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 11
- 230000034994 death Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 7
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100046493 Mus musculus Tmem79 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002126 nonhaemolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001478285 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 2 Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710136705 Hemolysin-1 Proteins 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000009083 hemolysis by symbiont of host erythrocytes Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N (2r)-2-methyl-2-[(4r,8r)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound OC1=CC=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000636168 Grapevine leafroll-associated virus 3 (isolate United States/NY1) Movement protein p5 Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000213997 Melilotus albus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010057040 Temperature intolerance Diseases 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000753 anti-hemolysin Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000008543 heat sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940048098 sodium sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000019432 tissue death Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 208000021758 very high fever Diseases 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás sertések Actinobacillus pleuropneumoniae (App) elleni védelmére alkalmas vakcina előállítására.
A sertések egyik legfőbb légzőszervi megbetegedését okozó sertés pleuropneumonia világszerte elterjedt betegség, ami a gyors elpusztulás, a ténylegesen beteg állatok kezelése és a krónikusan megbetegedett állatok piacképtelensége miatt a sertéstenyésztés súlyos gazdasági veszteségeihez vezet. A betegség kórokozójaként az Actinobacillus pleuropneumoniae-t (A. pleuropneumoniae) azonosították. Elsődleges terjedése az állatok közvetlen érintkezésével történik, és a betegség lefolyása a gyors lezajlástól a krónikus megbetegedésig terjed. A betegség elsősorban a légzőszervekben jelentkezik, klinikai tünetei az igen magas láz, súlyos légzési nehézség, köhögés és oxigénhiány. A betegség kitörése gyors, a megbetegedési és elpusztulást arányszám magas. Patologikus tünet a tüdő kiterjedt tüdőgyulladásos károsodása.
A sertések A. pleuropneumoniae fertőzése elleni védelmére természetesen különböző oltási programokat hoztak létre.
Az egyik védelmi megoldás a sertések inaktivált A. pleuropneumoniae baktériumot tartalmazó bakterinnel való beoltása (Fedorka-Cray P. J. és munkatársai: Infect. Immun. 58, 358-565 (1990); Hunneman W.A.:Incidence, economic effects, and control of Haemophilus pleuropneumoniae infections in pigs. Thesis, University of Utrecht, Hollandia, 1983). A bakterin vakcina alkalmazásának hátránya azonban, hogy súlyos melléktünetek kísérik. A bakterines oltás további hátránya, hogy csak bizonyos A. pleuropneumoniae szerotípusokra specifikus (lipo)poliszacharidok elleni antitesteket indukál, és ezért más A. pleuromoniae szerotípusok ellen nem véd. Emellett az A. pleuropneumoniae bakterinek szabadon élő állatok tömeges fertőzése elleni védekezésre nem alkalmasak.
Védőanyagként A. pleuropneumoniae extraktumot tartalmazó kapszulát is alkalmaznak (Fenwick B. W. és Osbum Β. I.. Infect. Immun. 54, 575-582 (1986)). Azonban a sertések és egerek ilyen extraktummal való immunizálása csak részleges immunitást eredményez, emellett ezek a kapszulabázisú vakcinák csak homológ védelmet tesznek lehetővé, ami azt jelenti, hogy valamely specifikus A, pleuropneumoniae szerotípusból nyert vakcina kapszula az ettől eltérő A. pleuropneumoniae szerotípusok elleni védelemre nem alkalmazható.
Az EP 0 354 628 számú irat Actinobacillus pleuropneumoniae fertőzés ellen alkalmazható alegység vakcinát ismertet, amely különböző szerotípusokból származó citotoxint és/vagy haemolizint tartalmaz.
A gyengített, eleven A. pleuropneumoniae vakcinák alkalmazásának is számos hátránya van; az egyik ilyen hátrány az állatok nem megfelelően gyengített kórokozókkal való beoltása, és az a lehetőség; hogy a gyengített baktériumok az állatok megbetegedését eredményező patogén állapotba kerülhetnek, és a többi állatra is átterjednek.
Emiatt erőteljesen fennáll az olyan biztonságosan alkalmazható A. pleuropneumoniae vakcina kifejlesztése iránti igény, amely szerotípus független és sertésekben erőteljes immunválaszt idéz elő.
A találmány egyik célkitűzése olyan, sertés pleuropneumoniae ellen alkalmazható, lényegében A. pleuropneumoniae sejtektől mentes alegység vakcina előállítása, amely legalább két különböző, A. pleuropneumoniaeből származó alegység komponenst tartalmaz, sertés A. pleuropneumoniae elleni védekezést indukál, és emellett szerotípus független.
A találmány tárgya tehát eljárás vakcina készítmény előállítására, sertések Actinobacillus pleuropneumoniae fertőzés elleni védelmére, amely lényegében A. pleuropneumoniae sejtektől mentes, oly módon, hogy
- egy A. pleuropneumoniae külső membrán fehérje [outer membrán portéin = külső membrán fehérje (OMP)] készítményt, amely fő tömegében az SDS-PAGE vizsgálat szerint körülbelül 42 kD molekulatömegű antigén fehérje komponenst tartalmaz, és
- legalább egy A. pleuropneumoniae toxint, amely
1) egy, az SDS-PAGE vizsgálat szerint körülbelül 105 kD molekulatömegű hemolizin (Hly), és/vagy
2) egy, az SDS-PAGE vizsgálat szerint körülbelül 120 kD molekulatömegű makrofág toxin (Mát) lehet, farmakológiailag alkalmazható hordozó anyaggal keverünk.
Azt találtuk, hogy A. pleuropneumoniae hemolizin és/vagy makrofág toxin és az A. pleuropneumoniae külső membrán fehérje készítmény, amely többségében az SDS-PAGE-ben mérve körülbelül 42 kD molekulatömegű antigén fehérje komponenst (a továbbiakban 42 kD OMP) tartalmaz, kombinálásával előállított vakcina sertések A. pleuropneumoniae elleni védelmére alkalmazható, és a tapasztalatok szerint a korábban alkalmazott, ilyen vakcináknál sokkal jobb védelmet biztosít.
Ismeretes, hogy a hemolizin a sertésekben bizonyos védelmet indukál. Azonban a hemolizint és/vagy makrofág toxint, valamint a 42 kD OMP készítményt is tartalmazó vakcinák a virulens A. pleuropneumoniae baktériumok ellen teljes és heterogén védelmet biztosítanak (3. és 5. példa). A Hly vagy Mát 42 kD OMPvel való kombinálása rendkívüli mértékben megnövekedett védelmet tesz lehetővé, ami előre nem volt várható.
A hemolizin (Hly) jellemző tulajdonságai:
- kalcium indukáló fehéije, amely A. pleuropneumoniae sejttenyészet felülúszóból izolálható;
- az SDS-PAGE-ban mért molekulatömege, amint azt leírásunkban ismertetjük, 105 ± 5 kD;
- függ attól a szerotípustól, amelyből a hemolizint izoláljuk; és
- a hőre, valamint a
- K-proteináz kezelésre érzékeny eritrociták ellen hemolitikus aktivitású.
A hemolizin hemolitikus aktivitását a következőkben ismertetésre kerülő 2.1 példa szerint mérhetjük.
A hemolizin hemolitikus aktivitása nem állandó,
HU 211031 Β tárolás közben a 105 kD molekulatömegű fehérje molekulatömegével együtt csökken, ez azonban nem jár együtt az immunizációs tulajdonságok csökkenésével.
Emiatt a találmány szerint előállított vakcinában csökkent hemolitikus aktivitású, de immunizáló tulajdonságukat megtartó hemolizint vagy hemolizin fragmenst is alkalmazhatunk.
Az 1-12 szerotípusok közül csak az 1, 5a, 5b, 9, 10 és 11 típusok által termelt hemolizin hemolitikus aktivitású (2.1 példa), az egyéb szerotípusok olyan, 105 kD molekulatömegű, ekvivalens, nem hemolitikus fehérjét termelnek, amelyek a hemolitikus, 105 kD molekulatömegei fehérje hemolizinnel szerológiai rokonságban vannak (2.3 példa). Ezeket az immunológiai ekvivalenseket és fragmenseiket a továbbiakban a hemolizinek közé soroljuk.
A tapasztalatok szerint egy A. pleuropneumoniae hemolitikus szerotípusból származó hemolizin ellen létrejövő antiszérum ellentétesen semlegesíti az egyéb A. pleuropneumoniae hemolitikus szerotípusokból származó hemolizinek hemolitikus aktivitását (2.3 példa).
A különböző szerotípusokból származó hemolizinek fentiekben ismertetett szoros immunológiai rokonsága miatt az A. pleuropneumoniae fertőzés ellen olyan vakcina állítható elő, amely a 42 kD OMP készítményen kívül bármilyen, hozzáférhető hemolitikus A. pleuropneumoniae szerotípusból vagy törzsből származó hemolizint tartalmaz.
A találmány szerint előállított vakcinában alkalmazott hemolizint egyszerűen úgy állíthatjuk elő, hogy A. pleuropneumoniae sejteket hemolizin kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk, és a sejtekről a felülúszót elválasztjuk. A hemolizin további tisztítását ultraszűréssel, ammóniumszulfátos kicsapatással, majd molekulaszűrős kromatografálással végezhetjük.
A hemolitikus törzsekből előállított, hemolizinben dús frakció tisztítási eljárása alatt az eritrociták ellen kifejtett hemolitikus aktivitást a 2.1 példában ismertetett eljárással figyeljük
A találmány szerint előállított vakcinában alkalmazható hemolizin család A. pleuropneumoniae sejt 1 szerotípusból izolálható a következő eljárással:
a) A baktériumot 6 órán át 0,01 tömeg% NAD-dal, 1 tömeg% Isovitalex-szel és 25 mmól/1 kalcium-kloriddal kiegészített Columbia (Difco Láb., Detroit, USA) tenyészközegben tenyésztjük
b) A tenyészet sejtmentes felülúszóját a 300 000 D molekulatömegű részeket elkülönítő szűrőn koncentráljuk.
c) A koncentrált felülúszót 55%-os telítésig hozzáadott ammónium-szulfáttal kicsapatjuk, majd a csapadékot 16.000 g értéken 10 percen keresztül centrifugáljuk.
d) A10 mmól/1 Trisz-HCl pufferben újrafeloldott csapadékot egy Sephacryl S-200 oszlopon elválasztjuk.
e) Az először eluált komponenst összegyűjtjük.
Ez az elválasztó eljárás egyéb A. pleuropneumoniae szerotípusokból származó hemolizinek előállítására is alkalmazható [az 1 szerotípusú hemolizin tisztítási és részleges minősítési eljárást Frey, J. és Nicolet, J. ismertetik a FEMS Microbiol. Letters (1988), 55, 4146. irodalmi helyen],
Amakrofág toxin (Mát) jellemző tulajdonságai:
- fehérje, amely A. pleuropneumoniae sejttenyészet felülúszóból nyerhető;
- az SDS-PAGE-ban mérhető molekulatömege (a fentiekben ismertetettek szerint) 120 ± 10 kD;
- N-terminális aminosav szekvenciája: Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met; és a
- hőre és
- K-proteináz kezelésre érzékeny sertés alveoláris makrofágok ellen citotoxikus aktivitású.
A Mát citotoxikus aktivitását a következőkben ismertetésre kerülő 4.1 példa szerint mérhetjük.
A Mát citotoxikus aktivitása nem állandó, tárolás közben a 120 kD molekulatömegű fehérje molekulatömegével együtt csökken, ez azonban a Mát immunizációs tulajdonságait nem befolyásolja.
Emiatt a találmány szerint előállított vakcinában csökkent makrofág citotoxikus aktivitású, de immunizáló tulajdonságait megtartó fehérjék vagy antigén fragmenseik is alkalmazhatók.
Az 1-12 A. pleuropneumoniae referencia szerotípus törzsek közül csak a 2, 3, 4, 6 és 8 típusúak Mat-képzők. A tapasztalatok szerint valamely specifikus szerotípus sejtekből származó Mát ellen létrejövő antitestek semlegesítik a Mát készítmény makrofág citotoxikus aktivitását (4. példa).
A különböző szerotípusokból származó Mat-ok egymással szoros rokonságban lévő immunológiai tulajdonságai miatt a találmány szerinti vakcina bármelyik hozzáférhető Mat-képző A. pleuropneumoniae szerotípusból vagy törzsből előállítható.
A találmány szerint előállított vakcina Mát komponensét egyszerűen úgy állíthatjuk elő, hogy A. pleuropneumoniae sejteket Mát kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, és a sejtektől a felülúszót elválasztjuk. A Mát további tisztítását ultraszűréssel, kromatografálással és ultraszűréssel megvalósított koncentrálással végezzük.
A Mat-ban dús frakció a tisztítási eljárás alatt a makrofág citotoxikus aktivitása alapján azonosítható, amit a 4.1 példában ismertetett eljárással határozunk meg.
A találmány szerinti vakcinában alkalmazható makrofág citotoxinok a következő eljárással állíthatók elő;
a) 2 szerotípusú A. pleuropneumoniae sejt baktérium tenyészetet állítunk elő 0,01 tömeg% NAD-dal kiegészített Columbia tenyészközegben, 37 °C-on, 6 órán át végzett tenyésztéssel.
b) A tenyészet felülúszóját a 300.000 D molekulatömegű részek leválasztására alkalmas ultraszűrőn koncentráljuk.
c) A koncentrátumot CL4B oszlopon eluáljuk.
d) Az először eluált komponenst összegyűjtjük.
e) A toxint egy 0,45 μιτι-es cellulóz-acetát szűrőn leszűrjük.
Ez az elválasztó eljárás egyéb, azonos vagy eltérő
HU 211031 Β szerotípusú törzsekből származó Mát előállítására is alkalmazható.
A találmány szerinti vakcina nem toxikus komponense egy olyan A. pleuropneumoniae sejt külső membrán fehérje készítmény, amely domináns antigén fehérjeként az SDS-PAGE-ben mérve 42 ± 5 kD molekulatömegű (fentiekben ismertetett) fehérjét vagy ennek antigén fragmensét (42 kD OMP készítmény) tartalmazza, ahol a 42 kD OMP jellemző tulajdonsága, hogy
- hővel módosítható, és
- K-proteináz kezelésre érzékeny.
Az 1 szerotípusú sejtekből származó 42 kD OMP készítmény ellen képződő antiszérum erőteljes ellenreakcióba lép az 1-12 szerotípusú A. pleuropneumoniaeből származó sejtlizátumokkal. Mivel ez az antiszérum elsősorban olyan antitesteket tartalmaz, amely a Westem-folt vizsgálatban a 42 kD OMP felismerésére alkalmas, azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a tisztított OMP készítmény legfontosabb antigén fehérjekomponense a 42 kD OMP (1.2 példa). A fentiek szerint az A. pleuropneumoniae fertőzés ellen hatásosan alkalmazható vakcina a hemolizin és/vagy Mát komponensek mellett egy, bármilyen hozzáférhető A. pleuropneumoniae szerotípusból származó 42 kD OMP-t is tartalmaz.
A 42 kD OMP-t úgy állítjuk elő, hogy A, pleuropneumoniae baktériumot 42 kD OMP kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, az A. pleuropneumoniae sejteket összetörjük, például ultrahanggal besugározzuk, őröljük vagy franciaprésben sajtoljuk, a sejt membrán frakciót ülepítjük, ezt követően a frakciókat tisztítással, például sűrűség gradiens ülepítéssel vagy a belső membrán frakció detergenssel, mint például Triton Χ-100-zal vagy szarkozillal megvalósított szolubilizálásával belső és külső membránokra osztjuk, és kívánt esetben az OMP-készítményben a 42 kD OMP-t feldúsítjuk.
A találmány szerint előállított vakcinában alkalmazott, 42 kD fehérjében dús külső membrán fehérje készítményt 1 szerotípusú A. pleuropneumoniae sejtekből izolálhatunk a következő eljárással:
a) A baktériumot egy éjszakán át 0,01 tömeg%-os
NAD-dal kiegészített agy-szív infúziós közegben tenyésztjük.
b) A baktérium sejteket centrifugálással kinyetjük, és mmól/l-s HEPES pufferben újraszuszpendáljuk.
c) A baktérium sejteket ultrahangos kezeléssel összezúzzuk.
d) A nagyméretű sejt-törmelékeket centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszóból 1 órán át végzett 100.000 g-s centrifugálással kinyerjük a teljes membrán fragmenst, és HEPES pufferben újraszuszpendáljuk.
e) A szuszpenzióhoz annyi N-lauroil-nátrium-szarkozinátot (szarkozil) adunk, hogy a szarkozil koncentrációja 1 vegyes% legyen, majd 1 órán át keverj ük.
f) A külső membrán fehérjéket 1 órán át végzett 100.000 g-s centrifugálással kinyerjük, és vízben újraszuszpendáljuk.
Ezt az izolálási eljárást a 42 kD OMP összes hozzáférhető A. pleuropneumoniae szerotípusból való kinyerésére alkalmazhatjuk.
Kívánt esetben a 42 kD OMP-t a szakterületen ismert eljárásokkal tisztíthatjuk. A tisztítást végezhetjük például úgy, hogy a 42 kD OMP készítményből egy vagy több detergenssel a 42 kD OMP-t extrahálással kioldjuk, további tisztítást pedig úgy végezhetünk, hogy a készítményt a 42 kD OMP védő tulajdonságait nem befolyásoló körülmények között például ioncserélő vagy molekulaszűrős kromatografálásnak vetjük alá.
A találmány szerint előállított vakcina hemolizin, Mát és 42 kD OMP komponenseit kémiai szintézissel, A. pleuropneumoniae sejttenyészetből való tisztítással vagy rekombináns DNS eljárással állíthatjuk elő. Ez utóbbi esetben úgy járunk el, hogy a fentiekben ismertetett fehérjéket vagy fragmenseiket kódoló nukleinsav szekvenciák azonosításához vizsgáljuk az adott szekvenciákat tartalmazó kiónokat az A. pleuropneumoniae genom DNS bankban. Ezt például hemolizin, Mát vagy 42 kD OMP elleni poliklonális vagy monoklonális antitestekkel lefolytatott specifikus reakciókkal végezzük. A nukleinsav szekvenciák különböző kifejező hatású DNS szekvenciákkal ligálhatók, és így olyan úgynevezett rekombináns nukleinsav molekulát eredményeznek, amelyek megfelelő gazdaszervezetbe transzformálhatók. Ilyen hibrid DNS molekulák nyerhetők például plazmidokból vagy vírusok nukleinsav szekvenciáiból. A gazdaszervezet prokarióta, például baktérium vagy eukarióta, példa emlős eredetű sejt lehet. A transzformált gazdasejtek hemolizin vagy 42 kD OMP előállítására alkalmazhatók, és ezután a fehérjék elválaszthatók, és a találmány szerint előállított vakcinában alkalmazhatók.
A találmány szerint előállított vakcina egy másik változatában olyan, élő vektor vakcinát állítunk elő, amely nem patogén mikroorganizmusokat, például az adott vagy eltérő mikroorganizmusba klónozott hemolizin és/vagy Mát és a 42 kD OMP kódoló géneket tartalmazó vírusokat vagy baktériumokat tartalmaz.
A találmány szerint előállított vakcina A. pleuropneumoniaeből származó hemolizin és/vagy Mát és egy 42 kD OMP komponensekből áll, melyek A. pleuropneumoniaeból származnak. A vakcina fentiekben ismertetett komponensei vagy ezek antigén fragmensei lehetnek immunizáló tulajdonságaikat még megtartó formában vagy a fentiekben ismertetett rekombináns DNS vakcina formában.
A találmány szerint előállított vakcina fehérje komponenseként megfelelő; immunokémiailag aktív, epitóp tartalmú polipeptid fragmensek előállítási eljárását ismertetik a WO 86/06487 számon közrebocsátott PCT-beli bejelentés; Geyssen, Η. M. és munkatársai; Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002 (1984); és Geysen, H.M. és munkatársai: J. Immunoi. Meth. 102, 259-274 (1984) irodalmi helyek. Az előállítás az úgynevezett pepscan-eljárással történik, amelyben az adott teljes polipeptid részleges szekvenciáinak megfelelő részlegesen átfedő polipeptid sorokat szintetizálnak, és vizsgálják antitestekkel szembeni reakcióképességüket.
A fentieken túlmenően, az ismert elméleti össze4
HU 211031 Β függések és az epitópokkal való szerkezeti egyezőség alapján a fenti aminosav szekvenciákat tartalmazó polipeptid számos régióját jelölhetjük epitópokkal. Ezeknek a régióknak a meghatározását a Hopp és Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 3824-3828 (1981)) által ismertetett hidrofilicitási kritérium alapján, és a Chou és Fasman (Advances in Enzymology 47, 45-148 (1987)) által ismertetett másodlagos szerkezeti szempontok alapján végezzük.
Az adott esetben szükséges T-sejt epitópokat a Berzofsky-féle amfifilicitási kritérium (Science, 235, 1059-62, (1987)) elméleti alapjainak figyelembevételével állíthatjuk elő. A kis fragmens molekulák immugenicitásuk növelésére hordozó molekulákra konjugálhatók. Ilyen célú hordozóanyagként alkalmazhatunk makromolekulákat, mint például természetes polimereket (például tapadó kagyló hemocianin, albumin, toxin fehérjéket), szintetikus polimereket, például poliaminosavakat (polilizin, polialanin) vagy amfifil vegyületek, például szaponinok micelláit. Ezek a fragmensek polimerként, előnyösen lineáris polimerként is előállíthatók.
Ahemolizin komponenst elsősorban az 1, 5a, 5b, 9, 10 vagy 11 szerotípusú A. pleuropneumoniae törzsekből állítjuk elő.
A találmány szerint előállított vakcina Mát komponensét előnyösen a 2, 3, 4, 6 vagy 8 szerotípusú A. pleuropneumoniae törzsből állítjuk elő.
A találmány szerint előnyös az A. pleuropneumoniae 42 kD OMP-ből, hemolizinből és Mat-ból felépülő háromkomponensű vakcina.
Nagyon jó eredmények érhető el az olyan, háromkomponensű vakcina alkalmazásával, amelyben a 42 kD OMP komponens 1 szerotípusú sejtekből, a hemolizin 5.b szerotípusú sejtekből és a Mát a 2 szerotípusú sejtekből származik.
A találmány szerint előállított vakcina alkalmazása hagyományos aktív immunizáló eljárásokkal történhet. Az alkalmazást az egység készítménynek megfelelően egy vagy több, gyógyászatilag és immunológiailag hatásos mennyiségű vakcinával végezzük. Alkalmazhatunk intradermális, szubkután, intramuszkuláris, intravénás vagy intranazális kezelést.
A fentiekben ismertetett komponensek egy sertésnél alkalmazandó egység adagokra számított koncentrációja 1 μg - 1 mg, előnyösen 25 pg - 200 pg.
A találmány szerint a vakcina előállítását úgy végezzük, hogy a hemolizin és/vagy Mát komponenseket és a 42 kD OMP készítmény komponenst farmakológiailag alkalmazható hordozó anyaggal keverve immunizáló hatású készítménnyé alakítjuk.
Parenterális alkalmazás, például intramuszkuláris injektálás esetén a fenti komponenseket megfelelő, gyógyászatilag elfogadható és gyakran, az immunizáló hatás és/vagy élettartam növelésére, egyéb alkotó elemekkel kevert hordozóanyaggal, például valamilyen vizes közeggel vagy víztartalmú szuszpenzióval kombináljuk. Ilyen, egyéb alkotóelemként alkalmazhatunk például sókat, pH-puffereket, stabilizátorokat, emulgeáló szereket, valamint az immun-válasz elősegítésére hatásjavító szereket (olaj-a-vízben emulziókat, például E vitamint, víz-az-olajban emulziókat, aluminium-vegyületeket, muramil-dipeptidet, szaponint, polianionokat, amfipatikus vegyületeket vagy blokk-(ko)polimereket) és tartósítószereket.
A vakcina egyéb betegségek elleni, egyéb immunizáló komponensekkel többértékű vakcinákká kombinálhatok vagy egyéb gyógyszerekkel, például antibiotikumokkal is társíthatok. Többértékű vakcinákat például úgy állíthatunk elő, hogy a vakcinához további, egy vagy több sertés kórokozó antigén anyagot, például pszeuorabies vírust, transzmittálható gastroentritis vírust, sertés parvovírust, sertés influenzavírust, Mycoplasma hyopneumoniaet, Escherichia colit, Erysipelothrix rhusiopathioet, Bordetella bronchisepticat és Pasteurella multocidát társítunk.
Az ábrák jelentése:
1. ábra: 42 kD-ben dús OMP készítmény SDSPAGE felvétele.
2. ábra: OMP készítmények K-proteináz Westemfolt vizsgálata túlélő sertésszérummal.
1. és 4. sáv: nyers OMP;
2, 3, 5 és 6.sáv: tisztított OMP;
1-3. sáv: szimulált kezelés;
4-6. sáv: K-proteinázzal való kezelés:
3. ábra: Bakteriális lizátumok Western-folt vizsgálata beoltás utáni szérummal.
4. ábra: SDS-PAGE gél tisztított hemolizinnel 1 B) és marker fehérjével (A) lefuttatott felvétele.
5. ábra: Hemolizin Sephacryl S-100 kolonnán kapott eluciós profilja.
6. ábra: -20 °C-on vagy 37 °C-on tárolt, tisztított hemolizin (B) és marker fehéije (A) gélfelvétele.
7. ábra: Nyers hemolizin készítmények és 5b szerotípusú App-ből nyert tisztított hemolizin (*) 1 szerotípusú App hemolizin elleni monoklonális antitestekkel lefolytatott Westemfolt felvétele.
8. ábra: Nyers Mát készítmények 2 szerotípusú App
Mát elleni monoklonális antitestekkel lefolytatott Westem-folt felvétele.
Az alábbi példákkal - az oltalmi kör korlátozása nélkül - részletesen ismertetjük a találmányt.
1. példa
1. 42 kD dúsított külső membrán fehérje (OMP) készítmény tisztítása és jellemzése Eljárások
Az OMP készítmény tisztítását lényegében a Barenkamp és munkatársai által a J. Infect. Dis. 143, 668-676 (1981) irodalmi helyen ismertetett eljárással végezzük.
szerotípusú App referencia törzset egy éjszakán át 0,01 tömeg% NAD-dal kiegészített agy-szív infúziós közegben (Brain Heart Infusion broth) tenyésztünk, a baktériumot centrifugálással kinyerjük, és 10 mmól/1 Hepes pufferben (pH = 7,4) újraszuszpendáljuk. A baktérium sejteket jeges-vizes hűtés közben egy B-12 típusú Branson Sonifier berendezéssel addig kezeljük ult5 rahanggal, amíg a sejtek többsége összetörik, és az ODggo legalább 90 %-kal csökken. A nagyméretű sejttörmeléket 20 percen át végzett 5000 g-s, majd 10 percen át végzett 10000 g-s centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszóból a membránt 1 órán át végzett 100000 g-s ultracentrifugálással kinyerjük, és Hepes pufferben újraszuszpendáljuk. A nagyméretű oldhatatlan anyagot centrifuálással (11.000 g, 20 perc) és 5 pm-es szűrőn való szűréssel eltávolítjuk. A szűrlethez annyi N-lauroil-szarkozinátot (szarkozil) adunk, hogy a szarkozil végső koncentrációja 1 vegyes % legyen. Az elegyet 1 órán át keverjük, a szarkozil-oldhatatlan OMP-t 1 órán át végzett 100.000 g-s centrifugálással pelletáljuk, vízben újraszuszpendáljuk, és 0,45 μιη-es szűrőn leszűrjük.
A tiszta OMP készítmény SDS-PAGE futtatását Laemmli-féle eljárással végezzük (Natúré, 227, 680684 (1970)). A fehérjetartalom meghatározást BSAstandard alkalmazásával a módosított Folin-Ciocalten eljárással (J. Bioi. Chem. 73, 627 (1972)) végezzük; a szénhidrát-tartalmat pedig a fenol-kénsav-eljárással glükóz standard alkalmazásával (Dubois és munkatársai: Anal. Chem. 28, 350-356 (1956)) mérjük.
Az OMP hő-módosithatóságát SDS-PAGE eljárással úgy mérjük, hogy mintákat minta pufferben különböző hőmérsékleten (30-100 °C), 10 percig előkezeljük, majd a gélre visszük.
Az OMP K-proteináz kezeléssel szembeni érzékenységét a következőképpen mérjük: 0,05 mg/ml koncentrációjú fehérje mintát készítünk 5 mmól/1 EDTA-val, és 0,5 tömeg% SDS-sel kiegészített és 10μg/ml K-proteinázt (Boehringer) tartalmazó 10 mmól/1 trisz-HCl pufferben. Az így kapott mintát 3 órán át, 37 0 C-on, enyhe keverés közben inkubáljuk, egy éjszakán át 4 °C-on tartjuk, majd a K-proteinázzal kezelt és a szimulált mintákat SDS-PAGE eljárással futtatjuk. A gélt CBB-vel vagy ezüsttel megfestjük (Wray és munkatársai: Anal. Biochem., 118, 197-203 (1981)) vagy lábadozó sertés szérummal Western-folt elemzést (Anal. Biochem. 120,46-51 (1982)) végzünk. A sertés antiszérumot olyan sertésekből nyeljük, amelyek 2 vagy 9 szerotípusú App tömegfertőzésen vagy 1, 2, 5a vagy 9 szerotípusú App kísérleti fertőzésen estek át, és a betegséget túlélték.
Eredmények
A tisztított OMP fehérje-szénhidrát tömegaránya 1:0,8. A tisztított OMP készítmény CBB-vel megfestett SDS-PAGE eredményei azt mutatják, hogy a fő fehérjekomponens egy 42 kD molekulatömegnek megfelelő kettős sávban jelentkezik, és ez a komponens sokkal dúsabb, mint az összes baktérium lizátum vagy a nyers összes membrán készítmény hasonló komponense.
Az 1. ábrán egy olyan, tisztított OMP készítmény gélfelvételt mutatunk be, amelyet egy Shimadzu DualWavelenght TLC Scanner (CS-930), és egy vele összekapcsolt Shimadzu Data Recorder (DR-2) berendezéssel készítettünk. A 42 kD fehérje fehérjebázison számolt tisztasága körülbelül 60 %.
A tisztított OMP SDS-PAGE előtti különböző hőmérsékleteken végzett elő kezelésének eredményeit értékelve azt láthatjuk, hogy a 70 °C-on végzett előkezelésnél a 42 kD fehéije a fő komponens. A 60 °C-on végzett elő kezelés eredményeként a 42 kD fehérje teljes egészében hiányzik, és ebben az esetben a fő komponensként a körülbelül 200 kD-os sáv jelentkezik. Ez a 200 kD-os sáv a 70 °C-os vagy ettől nagyobb hőmérsékleten végzett előkezeléskor nem jelentkezik Ebből az következik, hogy a 42 kD OMP hőmódosítható fehérje
A tisztított OMP SDS-PAGE vizsgálat előtt végzett, K-proteinázzal megvalósított előkezelése, majd a gél CBB-vel való megfestése eredményeként azt kapjuk, hogy a K-proteinázzal való kezelés után a fehérje sáv, ezzel együtt a 42 kD sáv is eltűnik, míg a szimulált kezelés nincs hatással a gélen lévő fehérje képre. A gél ezüsttel való megfestése azt mutatja, hogy a K-proteinázos kezelés után csak nagyon kevés, alacsony molekulatömegű sáv (12-20 kD) marad, míg a szimulált kezelés eredményeként a minták a normál sávmintát, benne a 42 kD sávot mutatják. A gél túlélő sertésszérummal végzett Western-folt vizsgálata azt mutatja, hogy a K-proteinázos kezelés után nem alakult ki fehérjesáv, míg a szimulált kezelés után a normál sávminta jön létre (2. ábra).
Nyilvánvaló, hogy a túlélő sertésszérum nem tartalmazott az ezüsttel megfestett gélen látható K-proteináz-rezisztens, kis molekulatömegű komponensek elleni antitesteket. Ebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a 42 kD OMP a K-proteináz proteolitikus hatására érzékeny fehérje.
2. A tisztított 42 kD OMP antigenicitás vizsgálata
Eljárások
A vizsgálatot úgy végezzük, hogy tengeri malacokat szubkután beoltunk 20 pg, fentiek szerint tisztított 42 kD OMP-vel. A készítményt víz-az-olajban emulzióban alkalmazzuk. 4 heti poszt-vakcinációs szérumot veszünk, és baktérium lizátumon Western-folt vizsgálatot végzünk.
A baktérium lizátumot 1-10 szerotípusú App referencia törzsekből a következőképpen készítjük:
A törzsenként 3 nagy 15 cm-es csokoládé agar lemezekről nyert baktériumot körülbelül 10 ml PBSben (0,04 mmól/1, pH = 7,2) szuszpendálunk, amely 0,3 tömeg formalint tartalmaz, majd ultrahangos kezeléssel lizáljuk. Az ultrahangos kezelést Branson Sonifier B-12 berendezéssel addig folytatjuk, amíg az OD660 érték mintegy 90 %-ra csökken. A baktériumot és a nagyméretű sejttörmeléket és a lizátumot 0,45 pm-os szűrőn leszűqük. A lizátum fehérjekoncentrációját 1 mg/ml értékre állítjuk be.
Eredmények
Amint azt a 3. ábrán láthatjuk, az oltás válasza elsősorban közvetlenül a 42 kD (kettős) sávra irányul. A vakcinát ugyan az 1 szerotípusú App referencia törzsből állítottuk elő, az antitestek az 1-10 szerotípusú App referencia törzs lizátumok hasonló 42 kD (kettős) sávját is felismerték. Ebből az következik, hogy a 42 kD OMP az összes vizsgált App szerotípusban jelenlévő keresztreakcióképes antigén.
HU 211031 Β
2. példa
1. App törzsek hemolitikus aktivitása
Eljárások
A törzsek hemolitikus aktivitását lényegében a Frey és Nicolet (Infec. Immun. 56, 2570-2575 (1988)) eljárással mérjük. A baktériumot 1 tömeg% Isovitalex TMmel (BBL), 0,01 tömeg% β-NAD-dal (Sigma) és 25 mmól/1 kalcium-kloriddal (Merck) kiegészített Columbia tápközegben (Difco) növesztjük 4-6 órán át a logaritmikus fázis közepéig, végéig. A baktérium sejteket 10 percig végzett 12.000 g-s centrifugálással elválasztjuk, majd a felülúszóból trisz-pufferolt sóoldatban (TBS, 10 mmól/1 trisz HC1 85 tömeg%-os nátriumklorid oldatban; pH = 7,5) hígítás sorozatot készítünk. A felülúszó hígításokhoz egyenlő térfogatú TBS-ben szuszpendált 2 tömeg% lóeritrocitát tartalmazó elegyet adunk. Az elegyeket keverés közben, 37 °C-on, 2 órán át inkubáljuk, majd az eritrociták leülepedésére egy éjszakán át, 4 °C-os statikus inkubálási körülmények között tartjuk. Meghatározzuk az így kapott felülúszó abszorpcióképességét 540 nm (A540) hullámhosszon. Minden esetben legalább négy olyan 100 %-os kontrollt alkalmazunk, amely 1 tömegrész vizet és 1 tömegrész 2 tömeg%-os lóeritrocitát tartalmaz.
A negatív kontroll 1 tömegrész TBS-t és 1 tömegrész 2 tömeg%-os eritrocitát tartalmaz. A hemolitikus aktivitást abban a felülúszó higitás értékben fejezzük ki, amely az átlagos 100 %-os kontrolihoz képest 25 % hemolízis aktivitást mutat. A mintákat akkor tekintjük pozitívnak, ha a nem hígított minta hemolízise az átlagos 100 %-os kontrolihoz képest legalább 25 %. Az a540 = 0,100 értékű negatív kontrollokat az eritrocita szuszpenzió minőségi kontrolljaként alkalmazzuk.
Eredmények
Az App referencia törzsekkel kapott eredményeket és a referencia törzseket ismertető irodalmi helyeket az 1. táblázatban mutatjuk be. A fentiekben ismertetett eljárással vizsgált App törzsek közül az 1, 5a, 5b, 9, 10 és 11 szerotípusok bizonyultak hemolitikus hatásúnak, a többi negatív.
A szabadon élő állatok App izolátumos vizsgálata ugyanazon szerotípusoknál mutat hemolitikus hatást.
1. táblázat
A. pleuroneumoniae referencia törzsek hemolitikus aktivitása (folyékony tenyészetben)
| Szero típus | Referencia törzs sz. | Hemolitikus | Irodalom |
| 1. | 4074 | + | 3 |
| 2. | 1536 | - | 3 |
| 3. | 1421 | - | 3 |
| 4. | M62 | - | 3 |
| 5a. | K17 | + | 3,6 |
| 5b. | L20 | • + | 3,6 |
| 6. | Fem0 | - | 9 |
| 7. | WF83 | - | 9 |
| 8. | 405 | - | 8 |
| Szerotípus | Referencia törzs sz. | Hemolitikus | Irodalom |
| 9. | 13261 | + | 4 |
| 10. | 13039 | + | 5 |
| 11. | 56153 | + | 1,2 |
| 12. | 8329 | - | 7 |
Irodalom
1: Frey J. és Nicolet J. J. Clin. Microbiol. 28, 232-236 (1990);
2: Kamp Ε. M., Pompa J. K. és van Leengoed L.A.M.G.. Vet. Microbiol. 13, 249-257 (1987);
3: Kilián M,. Nicolet J. és Biberstein E.L.. Int. J. Syst. Bacteriol. 28, 20-26 (1978);
4: Nielsen R.: Acta Vet. Scand. 26,501-512 (1985);
5: Nielsen R.: Acta Vet. Scand. 26,581-586 (1985);
6: Nielsen R.: Acta Vet. Scand. 27,49-58 (1986);
7: Nielsen R.: Acta Vet. Scand. 27, 453-455 (1986);
8: Nielsen R. és O’Connor P. J.: Acta Vet. Scand. 25,96-106(1984);
9: Rosendal S. és Boyd D.A.. J. Clin. Microbiol. 16, 840-843 (1982).
2. Hemolizin tisztítása és jellemzése
Eljárások
A hemolizin tisztításához 1 vagy 5b szerotípusú App referencia törzseket növesztünk 1 tömeg% Isovitalexszel 0,01 tömeg% NAD-dal és 25 mól/1 kalcium-kloriddal kiegészített Columbia tápközegben, 37 °C-on, körülbelül 6 órán át. Az összes ezt követő műveletet 4 °C-on végezzük. A baktériumot 30 percig végzett 16.000 g-s centrifugálással, és az ezt követő 0,45 μπι-es cellulózacetát membrán szűrőn (Sartorius) való művelettel eltávolítjuk. A sejtmentes felülúszót ultraszűréssel koncentráljuk. Az ultraszűrést ΡΓΜΚ szűrővel (molekulatömeg határ: 300.000; poliszulfon), Minitan rendszerrel (Milipore) végezzük. A hemolizint egy éjszakán át 55 tömeg%-os ammónium-szulfáttal kicsapatjuk, majd 10 percig tartó, 16.000 g-s centrifugálással elválasztjuk, és pH = 7,5-ös 10 mmól/1 trisz-HCl oldatban újraoldjuk. A hemolizint végül Sephacryl S-200 vagy CL4B kolonnán (Pharmacia); 10 mmól/1 trisz-HCl puffer (pH = 7,5) alkalmazásával eluáljuk. A hemolizint az első elúciós csúcs tartalmazza.
A tisztított hemolizin készítményeket SDS-PAGE futtatással, Laemmli-féle eljárással vizsgáljuk (Natúré 227, 680-684 (1970))
A nyers hemolizin készítményt mindegyik szerotípusból a tenyészet felülúszó ammónium-szulfátos kicsapatásával nyerjük ki. A készítményeket, kivéve, ha másként ismertetjük, -70 °C-on tároljuk.
A hőérzékenységet úgy vizsgáljuk, hogy a tenyészet-felülúszót 10 percig, 60 °C-on melegítjük, majd megmérjük hemolitikus aktivitását (a fentiekben ismertetettek szerint).
A K-proteináz-kezeléssel szembeni érzékenységet úgy vizsgáljuk, hogy a tenyészet-felülúszót 10 percig, 37 0 C-on, 0,02 mg/ml K-proteinázzal (Boehringer; T. album) kezeljük, majd megmérjük a hemolitikus aktivitást.
HU 211031 B2
A tripszin-érzékeny séget úgy vizsgáljuk, hogy a tenyészet-felülúszót 10 percig, 37 °C-on, 0,02 mg/ml tripszin (Sigma) jelenlétében inkubáljuk, majd 0,03 mg/ml tripszin-inhibitort (Sigma) adunk hozzá, és még egyszer 10 percig inkubáljuk 37 °C-on. A 0,6 mg/ml koncentrációjú, tisztított hemolizint 3 órán át 0,1 mg/ml K-proteinázzal inkubáljuk 37 °C-on, majd SDSPAGE vizsgálatnak vetjük alá.
A tisztított hemolizin stabilitását úgy vizsgáljuk, hogy a készítményeket különböző hőmérsékleten, különböző ideig tároljuk, majd SDS-PAGE vizsgálatnak vetjük alá.
Eredmények
Az 1 és 5b szerotípusú referencia törzsekből fentiekben ismertetett eljárással előállított mindkét tisztított hemolizin készítmény az SDS-PAGE vizsgálatban a CBB-vel való megfestés után 105 k D-os sávot mutat.
Az 5b szerotípusú tisztított hemolizin gélfelvételét a 4. ábrán mutatjuk be. Az SDS-PAGE felvételen látható, hogy a megjelenő komponens molekulatömege 105 k D, azonban a 300 kD levágású szűrővel való szűréskor natív hemolizin maradt vissza. Ezen túlmenően a gélszűréssel kapott elúciós profilból az is látható, hogy a natív hemolizin vagy aggregátja molekulatömege legalább 10 x 106 D (5. ábra). Sephacryl S-1000 (Pharmacia) kollonán, borjú tiroglobulin (molekulatömege mintegy 669 k D; Sigma) jelző fehérje alkalmazásával a hemolizin közvetlenül azután az üres térfogat után eluálódik, amelyben a tiroglobulin tartózkodott.
A tisztított hemolizin készítmények fehérje-szénhidrát tömegaránya körülbelül 10:1.
Az 1. táblázatban felsorolt referencia törzsekből származó tenyészetből előállított, mindegyik nyers hemolizin készítmény SDS-PAGE felvétele 105 kD sávot mutat. A hemolizin aktivitást nem mutató, fentiekben ismertetett eljárással vizsgált referencia törzsek felvétele a hemolitikus törzsekhez hasonló, 105 k D-os sávot mutat.
A tisztított hemolizin, abban az esetben, ha a tisztítást a baktérium tenyésztés utáni 2-3 napon belül végezzük, megtartja hemolitikus aktivitását. Ha a hemolizint -70 °C-on tároljuk, hemolitikus aktivitása stabil marad, azonban 4 °C-os vagy magasabb hőmérsékletű tároláskor néhány napon belül leromlik.
Ha a tisztított hemolizint 4 °C-on vagy magasabb hőmérsékleten tároljuk, az SDS-PAGE felvétel 105 kD sávja sem marad állandó. A hemolizin 7 napon át való 4 °C-os, szobahőmérsékletű vagy 37 °C-os tárolásakor a fehéqesáv fokozatosan a 37 °C-os tárolásnak megfelelő 65 kD értékre csökken. A 6. ábrán egy -20 °C-on és egy 37 °C-on tartott tisztított hemolizin gélfelvételét mutatjuk be.
A hemolitikus szerotípusokhoz (1. táblázat) tartozó törzsekből származó tenyészet-felülúszó hemolitikus aktivitása teljesen megszűnik, ha a készítményt 10 percig, 60 °C-on melegítjük. A tenyészet-felülúszók Kproteináz vagy tripszin kezelésre is érzékenyek. A tenyészethez adott 0,5 tömeg% formaiin, majd az ezt követő, szobahőmérsékleten vagy 37 C-on egy éjszakán keresztül megvalósított inkubálás szintén a hemolitikus aktivitás csökkenését eredményezi.
3. Tisztított hemolizin antigenicitás és antiszérummal adott keresztreakció vizsgálata Eljárások
1, 2, 5a vagy 9 szerotípusú App-vel kísérletileg fertőzött túlélő, de az App fertőzéseknél tipikus tüdőkárosodást szenvedett sertésekből nyert szérumot vizsgálunk.
Az 1 vagy 5b szerotípusú referencia törzsekből tisztított hemolizinnel 6 hetes intervallumonként nyulaknak beadott két intramuszkuláris injekcióval hiperimmun szérumot állítottunk elő. A nyulakat két adag, 100 μg mennyiségű, 1 szerotípusú hemolizin komplett Freund-adjuvánsban, illetőleg inkomplett Freund-adjuvánsban való beadásával, valamint két adag 25 μg mennyiségű 5b szerotípusú hemolizin tokolszármazék emulzióban való beadásával immunizálunk.
Nyulakban úgy is előállítunk hiperimmun szérumot, hogy hosszabb időn át, -70 °C-on, 4 °C-on és szobahőmérsékleten tárolt 5b szerotípusú App-ből nyert tisztított hemolizint alkalmazunk. A nyulaknak két adag, 25 μg mennyiségű hemolizint adunk víz-az-olajban emulzióban hat hetes intervallumokban. A különböző hőmérsékleten tárolt készítmények kora befecskendezéses injektálásnál 75 nap, belövéses injektálásnál 118 nap.
A preimmun szérumos szerológiai vizsgálat (Elisa, Westem-folt) az állatok mindegyikénél SPF minőséget vagy legalább App-mentességet mutatott. Az antiszérumot a belövéses injektálás után 2 héttel nyeljük ki.
Monoklonális antitestet (MAb) termelő hibridoma vonalat állítunk elő szabvány eljárásokkal. 1 szerotípusú App-ből nyert, tisztított hemolizinnel Balb/c egereket immunizálunk, lépsejteket Ag8 mielomasejtekkel egyesítünk, és a pozitív hibridoma sejteket korlátozott hígítással klónozzuk. A Mab-t a hibridoma tenyészet-felülúszóból vagy az egér hasviz folyadékból (ascites) nyeljük.
Az ELISA-vizsgálatot (enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat) standard eljárásokkal végezzük úgy, hogy burkoló antigénként 1 és 5b szerotípusú tisztított hemolizint alkalmazunk. Az antiszérumot a hígítási sorozat készítése előtt 1:100 arányban előhígítjuk. A háttér abszorpciót 1:100 hígítású előhigitott szérum abszorpciós értékeiből számítjuk.
Az ELISA-számot az a legnagyobb szérum hígítás adja, amelynél az abszorpciós érték a háttér abszorpciós érték legalább 1,15-szöröse.
A nyers hemolizin és a tisztított hemolizin készítmények Western-folt vizsgálatát a fentiekben ismertetettek szerint végezzük.
A hemolitikus aktivitás antiszérummal való semlegesítését a következőképpen vizsgáljuk. A tenyészetfelülúszókat a fentiekben ismertetett eljárással állítjuk elő. Az antiszérumot 1:25 arányban eló hígítjuk, majd IBS-ben hígítási sorozatot készítünk. Az antiszérum hígításokhoz egyenlő térfogatú, nem hígított tenyészetfelülúszót adunk, majd 30 percig, 37 °C-on inkubáljuk. Az igy kapott elegyek hemolitikus aktivitását a fentiekben ismertetett eljárással vizsgáljuk.
A semlegesítési számot az a szérum hígítás adja, amelynek hemolízis értéke a kétszeresére hígított tenyészet-felülúszó hemolízis értékének 50 %-a. A vizsgálatokban negatív kontrollként előimmunizált szérumot alkalmazunk.
Eredmények
A 2. táblázatban bemutatott adatokból látható, hogy az 1, 5a vagy 9 szerotípusú App fertőzést túlélő sejtekből nyert szérum az 1 és 5b szerotípusokból nyert tisztított ELISA hemolizinnel szemben magas antitest titert mutat ELISA-ban, és az 1, 5b, és 9 szerotípusú App tenyészet hemolitikus aktivitását semlegesíti. A 2 szerotípusú túlélő sertésszérum az 1 és 5b szerotípusú hemolizin ellen csak mérsékelt antitest titert mutat ELISA-ban, a hemolitikus aktivitás semlegesítése pedig nem detektálható.
Az 1 és 5b szerotípusú App-ből származó tisztított hemolizin elleni, nyulakban létrehozott hiperimmun antiszérum mindkét hemolizin ellen magas antitest titert mutat ELISA-ban, és mindkét antiszérum semlegesíti az 1, 5b és 9 hemolizint.
Az 1 szerotípusú App ellen előállított, négy különböző Mab mindkét szerotípusú, azaz az 1 és 5b szerotípusú hemolizin ellen is magas titert mutat ELISA-ban, de semmilyen hemolitikus aktivitás semlegesítő hatása nincs. Az összes vizsgált 1 szerotípusú App antiszérum (túlélő sertés szérum, hiperimmun nyúlszérum és Mab) Westem-folt vizsgálatban az 1 és 5b szerotípusú tisztított hemolizin 105 kD sávjával, valamint az összes App szerotípus (1-12) hemolizin készítmény 105 kD sávjával reagál. A 7. ábrán a nyers hemolizin készítmények és az 5b szerotípusú App tisztított hemolizin készítmények egyik Mab-bal mutatott Western-folt felvételét láthatjuk.
Az eredményekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy
a) a 105 kD labilis hemolizin aktív fertőzés esetén és tisztított hemolizinnel való immunizálás után egyaránt antigén hatású;
2) az anti-hemolizin antitestek az összes App szerotípus (1-12), köztük a fentiekben ismertetett, hemolitikus aktivitás nélküli törzsek által termelt, hasonló 105 kD antigénnel keresztreakciót mutatnak;
3) a provokált antitestek, abban az esetben, ha az antitest indukálása egy hemolitikus szerotípusból származó 105 kD antigénnel történt, a különböző szerotípusok hemolitikus aktivitására semlegesítő hatást mutatnak.
A hemolitikus aktivitásban részt nem vevő epitópokat a Mab-ok nyilvánvalóan felismerik.
Amint azt a fentiekben ismertettük, a tisztított hemolizin 4 °C-on vagy ettől magasabb hőmérsékleten való tárolása az SDS-PAGE vizsgálattal kimutatható, 105 k Dról fokozatosan 65 kD-ra változó molekulatömeg csökkenést eredményez. A105 kD hemolizin ellen termelt, 2. táblázatban bemutatott, öregített antiszérum a csökkent molekulatömegű hemolizin készítményekkel a Westemfolt vizsgálatban még reakcióképesek (az adatokat nem tüntettük fel). Az öregített antigén készítmények nyúlimmunizálás utáni antigén tulajdonságait a 3. táblázatban mutatjuk be. Azt tapasztaltuk, hogy az SDS-PAGE-ban csökkent molekulatömegű, öregített hemolizin még mindig olyan antitesteket termel, amelyek az eredeti 1 és 5b szerotípusú App hemolizinnel reakcióképesek. Megfigyelhető ugyan az antitest-titer bizonyos csökkenése, de a 65 kD öregített hemolizin készítménnyel való immunizálás is nagyon magas antitest-titert eredményez. Ezek az antiszérumok hemolitikus aktivitást neutralizáló hatást is mutatnak
2. táblázat
Antiszérum hemolizin-készítményekkel mutatott keresztreakciói
| Antiszéruma) (szerotípus) | ELlSAb) | Foltc) | Semlegesítés6’ | |||
| 1 | 5b | 1 | 5b | 9 | ||
| CPS 168 (1) | + | + | + | + | + | + |
| CPS 261H (2) | + | + | nt | - | - | - |
| CPS 139 (5a) | + | + | nt | + | + | + |
| CPS 191 (9) | + | + | nt | + | + | + |
| HRS 3895 (1) | + | + | + | + | + | + |
| HRS 4609 (5b) | + | + | nt | + | + | + |
| MAbs (1) | + | + | + | - | - | - |
| PPS | - | - | - | - | - | - |
| PRS | - | - | - | - | - | - |
A táblázatban alkalmazott jelölések jelenléte:
a) CPS = covalescent sera from pigs = túlélő sertésszérum, amelyet a jelzett App szerotípussal fertőzött sertésből nyerünk:
HRS = hyperimmun rabbit sera = hiperimmun nyúlszérum, a jelzett App szerotípusból származó tisztított hemolizin ellen:
Mab-ok = négy különböző monoclonal antibodies = monoklonális antitest, amely az 1 szerotípusú App hemolizin ellen termelődik:
PPS és PRS = pre-immune pig és rabbit sero = azaz előimmunizált sertés- és nyúlszérum.
b) 1 és 5b szerotípusú App-ből származó tisztított hemolizin elleni antitest kimutatás Elisa-vizsgálatban; - = szám < 100, + = 100 < szám < 1000, ++ = szám < 1000.
c) Az összes szerotípus (1-12) nyers hemolizin készítmény és az 1 és 5b szerotípusú tisztított hemolizin 105 kD sávjával mutatott reakció;
nt = nem vizsgált.
d) 1, 5b és 9 szerotípusú App tenyészet-felülúszó hemolitikus aktivitás semlegesítés.
HU 211031 Β
3. táblázat
5b szerotípusú App-ből származó, tisztított, öregített készítmény mindegyik készítmény esetén 3 nyúl-antiszérum átlagai
| Antigén tárolási hőmérséklet | SDS-PAGEben mutatott fő sáv(ok) | ELISAa) | |
| 1 | 5b | ||
| -70 °C | 105 kD | 6,0 | 6,9 |
| 4°C | 80 és 70 kD | 5,8 | 6,55 |
| szobahőmér- séklet | 65 kD | 5,4 | 6,2 |
a) 1 és 5b szerotípusú App-ből származó tisztított 105 kD hemolizin elleni Elisa-ban kapott lOlog titerek.
3. példa
App fertőzés elleni, oltással megvalósított sertés védelem
Eljárások
A sertések App-vel való fertőzését DeVilbis 65 ultrahangos aeroszolos permetező berendezéssel (De Vilgiss, G., Pennsylvania, USA) végezzük. A permetező e célra való alkalmazását Sebunyo és munkatársai javasolták a Can. J. Comp. Med. 47, 48-53 (1983) irodalmi helyen az App patogenézis, elsősorban az oltóanyagok tanulmányozására.
A fertőzést 1 és 5a szerotípusú App referencia törzsekkel végezzük. Baktériumtenyészetet úgy állítjuk elő, hogy a baktériumokat 0,01 tömeg% NAD-dal kiegészített agy-szív infúziós közegben (Brain Heart Infusion broth) vagy 1,0 tömeg% IsoVitalex-szel és 0,01 tömeg% NAD-dal kiegészített Columbia közegben 6 órán át növeljük, a kapott tenyészetet centrifugálással kinyerjük, és sóoldatban a kívánt koncentrációra hígítjuk. Az életképesség számlálást csokoládé-agarlemezeken végezzük.
A vizsgálandó állatokat korlátokkal szabályozható helyen, SPF körülmények között tartjuk csökkentett nyomáson.
A fertőzést úgy végezzük, hogy 15 percig 50 ml baktérium szuszpenziót permetezünk be, úgy, hogy a porlasztót a fertőzendő állatok tartózkodási helyén kívül helyezzük el, és a berendezés aeroszol kamráját a falon keresztül egy, a padló felett 1,5 m-re lévő, perforált csőhöz csatlakoztatjuk. A beoltott és a kontroll állatokat ugyanabban a helyiségben fertőzzük. Az állatokat a fertőzés után 2 héttel megvizsgáljuk. A két heti fertőzést túlélő állatokat és az elpusztult állatokat egyaránt halál utáni károsodás vizsgálatnak vetjük alá.
A tipikus App tüdőkárosító, vérzéssel, szövetelhalással járó fibrin pleuropneumonia súlyossági fokozatait 0-4-ig számozott skála szerint osztályozzuk; az osztályozás alapja a tüdő károsodás százalékos értéke.
A skála fokozatainak jelentése:
= nincs károsodás = < 25% károsodás = > 25 %, de kisebb, mint 50% = > 50 %, de kisebb, mint 75% károsodás = > 75% károsodás.
A kísérleteket különböző eredetű és korú sertésekkel végezzük. A sertéseket különböző mennyiségű vakcinával és antigénnel oltjuk be, majd 1 és 5a szerotípusú App fertőzésnek vetjük alá. Mindegyik vakcinát a nyakon, intramuszkulárisan, 2 ml mennyiségben alkalmazzuk. Az első és második oltás közötti időtartam 6 hét, és az második oltás és a fertőzés között eltelt idő 2 hét. A vakcinák antigén koncentrációját a tisztított készítmények összes fehérjetartalmára számoljuk.
Antigénként az 1.1 példában ismertetett eljárással előállított 42 kD külső membrán fehérje készítményt (OMP), a 2.2 példában ismertetett eljárással előállított hemolizint (Hly) vagy két, kereskedelemben beszerezhető, különböző szerotípusú, inaktivált baktériumot tartalmazó vakcinát alkalmazunk. Ez utóbbi bakterineket a gyártó előírásainak megfelelően alkalmazzuk. A kísérletek eredményeit a következő részben ismertetjük.
Eredmények
Az első kísérletből (4. táblázat) az a következtetés vonható le, hogy a két, kereskedelmi bakterin egyike sem indukál fertőzés elleni védelmet, pedig mindkét bakterin a fertőző törzsnek megfelelő szerotípusú (Appl) baktériumot tartalmazza inaktivált formában.
A második kísérletben (5. táblázat) azt tapasztaltuk, hogy a sertések 1 szerotípusú App-ből származó hemolizin és 42 kD OMP kombinált készítménnyel való beoltása mind az elpusztulás, mind az App tüdő károsodás tekintetében szinte teljes védelmet eredményez. Az ebben az esetben tapasztalt 0,3 átlagos tüdő károsodást érték azt jelenti, hogy egy sertés felboncolásakor csak egyetlen kis App tüdőcsomót találtunk.
A harmadik kísérletben (6. táblázat) nagyon fiatal sertéseket oltottunk be 5b szerotípusú App-ből nyert tisztított hemolizin és 1 szerotípusú App-ből nyert tisztított 42 kD OMP kombináció különböző dózisaival, majd ezt követően a sertéseket 1 szerotípusú App fertőzésnek vetettük alá. A különböző dózisú antigénnel beoltott állatok a kontrolihoz viszonyítva mind az App miatti pusztulás, mind az App tüdő károsodás ellen védettek voltak.
A negyedik kísérletet (7. táblázat) a harmadik kísérlethez hasonlóan végeztük, az egyetlen különbség a sertések eredete és állapota volt. A harmadik kísérletben a vakcina antigének elleni anyai antitestekkel nem rendelkező SPF sertéseket, a negyedik kísérletben pedig a vakcina komponensek ellen nagy antitest számmal rendelkező sertésektől született sertéseket alkalmaztunk. Az oltáskor öt hetes malacok Elisa antitest száma mindkét vakcina komponens, azaz a hemolizin és a 42 kD OMP ellen (1:100)-(1:1000) érték volt. Az anyai antitestekkel rendelkező malacok hemolizin és 42 kD OMP készítmény kombinációs oltása az 1 szerotípusú App törzs ellen védelmet nyújt.
Ezekből az oltási kísérletekből az a következtetés vonható le, hogy a malacok hemolizin és 42 kD OMP készítmény kombinációs oltása az App fertőzés ellen teljes védelmet nyújt. A sertések védelme nemcsak a homogén App szerotípusokkal (a fertőző App szerotípussal azonos szerotípusú App-ből nyert, tisztított anti10
HU 211031 Β gén) szemben, hanem a heterogén App szerotípusokkal (a fertőzés App szerotípustól eltérő szerotípusú App-től nyert, tisztított antigén) szemben is biztosítható.
4. táblázat Első oltási kísérlet3
| Vakcina^ Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzsc (szerotípus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat) | Átlagos tüdőkáro- sodás'1 |
| Delsuvac HP | bakterin | Appl | 1/3 | 2,0 |
| Pleurovac | bakterin | Appl | 2/3 | 3,3 |
| Kontroll | - | Appl | 1/4 | 2,3 |
a) SPF malacok;
első oltás: 12 hetes korban; csoportonként 3-4 malac;
b) Mycofarm, Hollandia gyártmányú Delsuvac HP, amely 1, 2, 3, 6, 8 és 9 szerotípusú App baktériumot tartalmaz.
Bloxham Veterinary Products Ltd., Írország, gyártmányú Pleurovac, amely 1, 2, 3,4, 6 és 8 szerotípusú baktériumot tartalmaz.
A fertőző szuszpenzió életképesség száma: 1 x lO’/ml. d) A tüdőkárosodás mértékét jelző skála, amelynek értékei a következőket jelentik:
= nincs károsodás = 1-25% károsodás = 26-50% károsodás = 51-75% károsodás = > 75% károsodás.
5. táblázat
Második oltási kísérlet3
| Vakcina1’1 Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzsc (szerotí- pus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat) | Átlagos tüdőkáro- sodás'1 |
| Hly (1)/OMP (1) | 50/200 | App5a | 0/3 | 0,3 |
| Kontroll | - | App5a | 3/3 | 4,0 |
a) App-mentes kereskedelmi malacok; első oltás: 8 hetes korban; csoportonként 3 malac.
b) Vakcina készítmény: viz-az-olajban emulzió.
c) A fertőző szuszpenzió életképesség száma:
x 106/ml
d) Azonos a 4. táblázatban ismertetett d) jelentésével
6. táblázat
Harmadik oltási kísérlet3
| Vakcinab) Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzsc (szerotí- pus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat) | Átlagos tüdőkáro- sodás'1 |
| Hly (5b) /OMP(l) | 50/200 | Appl | 0/3 | 0 |
| Hly(5b) /OMP(l) | 50/50 | Appl | l/3e | 0 |
| Hly (5b) /OMP(l) | 2,5/50 | Appl | l/3e | 0 |
| Kontroll | - | Appl | 2/3 | 3,0 |
a) SPF malacok;
első oltás: 4 hetes korban; csoportonként 3 malac.
b) Vakcina készítmény: tokolszármazék emulzió.
c) A fertőző szuszpenzió életképesség-száma:
7,4 x 108/ml.
d) Azonos a 4. táblázatban ismertetett d) jelentésével.
e) A jelzett csoportban egy állat ismeretlen okból elpusztult, tipikus App tünetek vagy kórjelenség nem volt tapasztalható.
7. táblázat
Negyedik oltási kísérlet3
| Vakcinaa) b) c) d) Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzsc (szerotí- pus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat) | Átlagos tüdőkáro- sodás'1 |
| Hly (5b) /OMP(l) | 50/200 | Appl | 0/3 | 0 |
| Hly(5b) /OMP(l) | 50/50 | Appl | 0/3 | 0,3 |
| Hly (5b) /OMP(l) | 2,5/50 | Appl | 0/3 | 0,7 |
| Kontroll | - | Appl | 1/3 | 3,0 |
a) Anyai antitestekkel rendelkező, kereskedelmi malacok;
első oltás: 5 hetes korban; csoportonként 3 malac.
b) Vakcina készítmény: tokolszármazék emulzió.
c) A fertőző szuszpenzió életképesség-száma:
7,4 x 108/ml.
d) Azonos a 4. táblázatban ismertetett d) jelentésével.
4. példa
1. A törzsek citotoxikus aktivitása
Eljárások
A citotoxicitás vizsgálatához App tenyészet-felülúszót sertés alveoláris makrofágokkal inkubálunk. Alveoláris makrofágokat sertéstüdő 0,01 mól/1 EDTAval és 20 mmól/1 Hepes-szel kiegészített, 7,4 pH-jú Hank-féle kiegyenlített sóoldattal (Hank’s Balanced
Salt Solution; Flow) való öblítésével izoláljuk. Az igy kapott sejteket háromszor ugyanezzel, de EDTA-t nem tartalmazó oldattal mossuk. Az utolsó centrifugálás után a sejteket 10 tömeg% magzati borjúszérummal (Gibco) kiegészített RPM 1640 közegben (Flow) szuszpendáljuk, és végül a koncentrációt 2 x 106/ml értékre állítjuk be. Köralakú üvegfedővel (átmérő: 12 mm, Tamson) ellátott szövettenyésztő lemez (24 lyuk, Costar) mindegyik lyukát 0,5 ml kész sejt szuszpenzióval oltjuk be, majd a makrofágokat 2 órán át, 37 0 C-on, széndioxid atmoszférában hagyjuk kötődni. A lemezeket ezt követően háromszor, szérummentes RPMI 1640-nel mossuk.
. A baktériumokat 0,01 tömeg% β-NAD-dal (Sigma) kiegészített Columbia tápközegben tenyésztjük 37 '’Con 4-6 órán keresztül a közeges-végső logaritmikus állapotig. A kapott baktériumokat centrifugálással kinyerjük, és a szővettenyésztő lemez makrofágokat tartalmazó lyukaiba egyenként 0,5 ml felűlúszót adunk. 37 °C-on végzett 2 órás inkubálás után a makrofágokat tartalmazó fedőket háromszor RPMI 1640-nel mossuk, majd üveglemezek felső oldalán lévő 20 1, 0,05 tömeg% Trypan Blue-t (Merck) tartalmazó PBS oldat cseppre tesszük. A Trypan Blue hatására kék elszíneződést mutató, elpusztult sejtek mennyiségét fázis-kontraszt mikroszkóppal határozzuk meg. A negatív kontrollok Columbia tápközeggel inkubált makrofágokat tartalmaznak.
Eredmények
Amint azt a 8. táblázatban láthatjuk, az alveoláris makrofágokra az összes App referencia törzs citotoxikus volt, azaz a baktérium egy aktív anyagot választott ki. A negatív kontrollok makrofágokra kifejtett toxicitása legfeljebb 10 % volt.
A hemolitikus törzsek citotoxicitása a 2. példában ismertetett hemolizinnek tudható be, a nem-hemolitikus törzseknek azonban más toxikus molekulákat kell termelniük. A hemolitikus aktivitással ellentétben a makrofág toxicitása akkor is kifejeződik, ha a baktériumokat CaCl2-t nem tartalmazó közegben tenyésztjük.
8. táblázat
Az App referencia törzs-tenyészetek felülúszóinak sertés alveoláris makrofággal szembeni toxicitása, hemolitikus aktivitása és SDS-PAGE vizsgálata
| Szerotípus (referencia törzs) | Makrofágra mutatott toxicitás | Hemolitikusb’ aktivitás | SDS-PAGE eredmény | |
| 105 kD | 120 kD | |||
| 1. | 75 | + | + | - |
| 2. | 100 | - | + | + |
| 3. | 100 | - | + | + |
| 4. | 85 | - | + | + |
| 5a. | 90 | + | + | - |
| 5b. | 90 | + | + | - |
| 6. | 90 | - | + | + |
| Szerotípus (referencia törzs) | Makrofágra mutatott toxicitás | Hemolitikusb) aktivitás | SDS-PAGE eredmény | |
| 105 kD | 120kD | |||
| 7. | 80 | - | + | - |
| 8. | 75 | - | + | + |
| 9. | 70 | + | + | - |
| 10. | 65 | + | + | +c) |
| 11. | 85 | + | + | - |
| 12. | 55 | - | + | - |
| Közeg | 10 | - | - | - |
a) A példában ismertetett módon meghatározott makrofág-pusztulás %.
b) A 2.1 példában bemutatott hemolitikus aktivitás.
c) A látható sáv valamivel nagyobb, mint a 120 kD helyzetben, de Int 33-8 monoklonális antitestekkel nem reakcióképes (lásd 4. 3 példát).
2. App makrofág toxin (Mát) tiszítása és jellemzése Eljárások
A makrofág toxikus aktivitás tisztításához a nem hemolitikus, 2. példa szerinti 2 szerotípusú App törzset 0,01 tömeg% NAD-dal kiegészített Columbia tápközegben növeljük 37 °C-on, körülbelül 6 órán át. A további tisztítást lényegében a 2.2 példában hemolizin tisztítása ismertetett módon végezzük, amelynek során a baktériumot kicentrifugáljuk, a tenyészet-felülúszót egy 300.000 molekulatömeg levágású szűrő alkalmazásával ultraszűréssel koncentráljuk, majd a koncentrátumot Sepharose CL4B kolonnán eluáljuk. A toxikus aktivitású komponenst az először eluálódó rész tartalmazza. A toxin 0,45 pm-es cellulóz-acetát szűrőn (Sartorius) a toxikus vagy antigén aktivitás csökkenése nélkül szűrhető.
A tenyészet-felülúszók ammónium-szulfátos kicsapásával az összes szerotípusból nyers Mát készítményt állítunk elő. A készítményeket, ha másképpen nem ismertetjük, -70 °C-on vagy -20 °C-on tároljuk.
A Mát hőérzékenységét, K-proteináz-érzékenységét és stabilitását a hemolizinnel kapcsolatban, a 2.2 példában ismertetett eljárások szerint végezzük. Az SDSPAGE vizsgálatot a Laemmli-eljárással folytatjuk le.
Az N-terminális aminosav-elemzést a fentiekben ismertetett eljárással előállított Mát készítmény elektroforézisnek és elektrofolt vizsgálatnak alávetett mintájából végezzük.
Röviden, a PAGE gélt a Laemmli-rendszerben (Natúré, 227; lásd fent) használt áramló gél-pufferrel állítjuk elő. A fehérjéket az elektroforézis után PVDF-en (Immobilon-P, Water/Millipore) folt vizsgálatnak vetjük alá, úgy, hogy transzfer pufferként 10 mmól/1 CAPS, pH=911/10 tömeg% metanol elegyét alkalmazzuk.
A foltról nyert fehérjét szekvencia elemzésnek vetjük alá. Ezt a vizsgálatot a fokozatosan felszabadított PTH-aminosavak egy HPLC-vel (120A model, Applied Biosystems) on-line összekapcsolt automatikus szek12 venátorral (lüktető folyadék, 477A model, Applied Biosystems) Edman-degradálással végzett azonosításával folytatjuk le.
Eredmények
Ha a tisztítást 2-3 napig, 4 °C-on folytatjuk le, a 2 szerotípusú referencia törzsből a fentiekben ismertetett eljárással előállított tisztított makrofág toxin (Mát) még toxikus aktivitást mutat. Mivel a 2 szerotípusú referencia törzs egy 2. példában ismertetett, inaktív hemolizint termel, a 120 kD sávot tekintjük a Mát jellemző sávjának.
A nyers Mát készítmények elemzésekor azt tapasztaltuk, hogy a 2, 3, 4, 6 és 8 szerotípusú felülúszók SDS-PAGE elemzésben hasonló 120 k D sávot mutatnak. A 10 szerotípusú tenyészet-felülúszó valamivel nagyobb, mint 120 kD sávot mutat (8. táblázat). A szabadon élő állatokból nyert 2 és 5 szerotípusú törzsekből nyert Mát készítmények a fentiekben hasonló 120 kD sávot mutatnak.
A Mát készítmények 15 percig tartó, legalább 60 °C-os hőkezelése vagy K-proteinázzal való kezelése a toxicitás teljes megszűnését eredményezi. A fehérje -20 °C-os tárolásakor az SDS-PAGE-ban mutatott 120 kD sáv stabil marad, de ha három hónapig 4 °C-on tároljuk, a 120 kD lebomlik.
A Mát N-terminális aminosav szekvencia-elemzése a következő aminosav-szekvenciát mutatja:
Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met.
(?) az aminosav kísérleti kijelölését jelenti.
3. Makrofág toxin (Mát) antigenicitása és antiszérum keresztreakciója Eljárások
A 2.3 példában ismertetettek szerinti túlélő sertésszérumot alkalmazunk. A monoklonális antitestet (MAb) termelő hibridóma sejtvonalakat standard eljárásokkal állítjuk elő, a vizsgálat során a MAb termelő hibridómákat úgy szelektáljuk, hogy a 2 szerotípusú App-ből nyert, tisztított Mat-tal reakcióképesek legyenek, de az Elisa-vizsgálatban ne reagáljanak az 1 vagy 5 szerotípusú App-ből nyert, tisztított hemolizinnel.
A Westem-folt vizsgálatot a fentiekben ismertetettek szerint végezzük. A Mát aktivitás semlegesítését úgy vizsgáljuk, hogy az antiszérum hígításokhoz egyenlő térfogatú App tenyészet-felülúszót adunk, majd 30 percig, 370 C-on inkubáljuk, és ezt követően a 4.1 példában ismertetett toxicitás vizsgálatnak vetjük alá.
Eredmények
A Western-folt vizsgálatban a 2 szerotípusú Appvel való fertőzést túlélő sertésekből nyert sertésszérum felismeri, az 1, 5a és 9 szerotípusú App-vel fertőzött sertésekből nyert szérum nem ismeri fel a Mát készítmények 120 kD sávját. A túlélő App 2 szerotípus semlegesíti a Mát aktivitást.
A MAb Int 33-8 semlegesíti a Mát aktivitást és a Western-folt vizsgálatban a 2, 3,4, 6 és 8 szerotípusokból nyert, nyers Mát készítmények 120 k D sávjával keresztreakcióba lép, de az egyéb szerotípusokéval (referencia) nem reagál (8. ábra).
A 120 kD sávval mutatott reakció a szabadban élő állatokból nyert 2 és 5 szerotípusú izolátumból nyert, nyers Mát készítményeknél is megfigyelhető.
A MAb Int 33-4 a Western-folt vizsgálatban csak a 2 szerotípusú készítmények 120 kD sávjával reagál, az egyéb szerotípusokéval nem.
Amint azt a fentiekben ismertettük, a tisztított Mát 4 °C-on való 3 hónapos tárolása a CBB-vel végzett megfestéssel megvalósított SDS-PAGE vizsgálatban láthatóan a 120 kD sáv lebomlásához vezet. Azonban az ilyen, öregített készítmények Westem-folt vizsgálata azt mutatja, hogy a körülbelül 70-80 kD sáv MAb 33-8-cal reakcióképes.
5. példa
Sertések App fertőzéssel szembeni védelme háromkomponensű vakcinával való beoltással Eljárások
A fertőzést a 3. példában ismertetett eljárással végezzük. Az egyik kísérletben (8) a sertéseket 1 ml, 106 életképes baktériumot tartalmazó, 6 órás tenyészettel fertőzzük intranazálisan. A fertőzésre alkalmazott törzsek: 1 szerotípusú App referencia törzs vagy 2 vagy 9 szerotípusú szabadon élő állatból nyert izolátum.
Az oltást a 3. példában ismertetett eljárással végezzük. A vakcinák antigéntartalmát a tisztított készítmények összes fehéijetartalmára számoljuk. Antigénként az 1.1 példában ismertetett eljárással tisztított 42 kD külső membrán fehérjét (OMP), a 2.2 példában ismertetett eljárással tisztított 105 kD hemolizint (Hly) és a 4.2 példában ismertetett eljárással tisztított 120 kD makrofág toxint (Mát) alkalmazunk.
A kísérletek további részleteit az eredményekkel együtt ismertetjük.
Eredmények
Az ötödik kísérletben (9. táblázat) a 3. példában is alkalmazott, kétkomponensű, 105 kD hemolizin és 42 kD OMP 2 szerotípusú App fertőzéssel szembeni védő hatását vizsgáljuk. Látható, hogy a vakcina nyújt valamennyi védelmet a tüdő károsodás ellen, de nem biztosít teljes védelmet a 2 szerotípusú fertőzés ellen. Ebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a vakcinának, a 2 szerotípusú App fertőzés elleni teljes védelemhez egy külön komponenst, például a 4. példában ismertetett 120 kD makrofág toxint kell tartalmaznia.
A hatodik kísérletben (10. táblázat) a sertéseket vagy egy 120 kD makrofág toxint (Mát), amelyet a 2 szerotípusból tisztítottunk, és egy 42 kD OMP-t, amelyet az 1 szerotípusból tisztítottunk, tartalmazó vakcinával vagy egy 120 kD Mat-t, amelyet a 2 szerotípusból tisztítottunk, egy 42 kD OMP-t, amelyet 1 szerotípusból tisztítottunk, és egy 105 k D hemolizint (Hly), amelyet 5b szerotípusból tisztítottunk, tartalmazó vakcinával oltjuk be. Azt tapasztaltuk, hogy a 120 kD Mat-t és a 42 kD OMP-t tartalmazó, kétkomponensű vakcina nem véd az 1 szerotípusú App fertőzés ellen. Ez várható is volt, mert a 3. példában ismertetetteknek megfelelően, az 1 szerotípusú App ellen védelmet nyújtó vakcinának tartalmaznia kell a 105 kD hemolizint is, és a fertőzésre alkalmazott 1 szerotípusú App nem fejezi ki a 120 kD Mat-t.
Ha a kétkomponensű vakcinához az 5b szerotípusú
HU 211031 Β sejtekből tisztított 105 kD Hly-t adunk, az 1 szerotípusú App ellen teljes védelmet nyújt.
A hetedik kísérletben (11. táblázat) a hatodik kísérletben ismertetett, kétkomponensű és háromkomponensű vakcinák 2 szerotípusú App fertőzés elleni hatását vizsgáljuk. Látható, hogy mindkét vakcina mind a pusztulás, mind a tüdőkárosodás tekintetében nagyon jó védelmet nyújt a 2 szerotípusú App fertőzés ellen. Ez azt jelenti, hogy a 120 kD Mát kétértékű, 105 kD Hly/42 kD OMP kombinációs vakcinához való hozzáadása a vakcina 2 szerotípusú App elleni védőhatását is biztosítja.
A nyolcadik kísérletben (12. táblázat) a hetedik kísérletben alkalmazott, 120 kD Mat-t, 42 kD OMP-t és 105 kD Hly-t tartalmazó, háromkomponensű vakcina a sertések 9 szerotípusú törzs teljes heterogén fertőzésével szembeni védőhatását bizonyítjuk.
9. táblázat
Ötödik oltási kísérlet?
| Vakcina8) Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzs0 (szerotí- pus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat) | Átlagos tüdőkáro- sodásd |
| Hly(5b)/OMP (1) | 50/200 | HV 109 (2) | 0/3 | 1,7 |
| Kontroll | - | HV 109 (2) | 0/3 | 2,0 |
a) SPS sertés;
első oltás: 12 hetes korban; csoportonként 3 malac.
b) Vakcina készítmény: tokolszármazék emulzió.
c) A fertőző szuszpenzió életképesség-száma: l,9xl08/ml.
d) Azonos a 4. táblázatban ismertetett d) jelentésével.
10. táblázat Hatodik oltási kísérlet3
| Vakcina8) Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzs0 (szerotí- pus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat | Átlagos tüdőkáro- sodás'1 |
| Mát (2) /OMP(l) | 50/200 | Appl | 0/3 | 1,7 |
| Mát (2) /OMP(l) /Hly(5b) | 50/200/50 | Appl | 0/3 | 0,0 |
| Kontroll | - | Appl | 0/3 | 1,5 |
a) SPF sertés;
első oltás: 7 hetes korban; csoportonként 3 malac.
b) Vakcina készítmény: tokokszármazék emulzió.
c) A fertőző szuszpenzió életképesség-száma:
2,1 x KÉ/ml.
d) Azonos as 4. táblázatban ismertetett d) jelentésével.
11. táblázat Hetedik oltási kísérlet3
| Vakcina8) Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzs0 (szerotí- pus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat) | Átlagos tüdőkáro- sodásd |
| Mát (2) /OMP(l) | 65/50 | HV 111 (2) | 0/2* | 0,0 |
| Mát (2) /OMP (1)/Hly(5b) | 65/50/50 | HV 111 (2) | 0/3 | 0,3 |
| Kontroll | - | HV 111 (2) | 2/3 | 3,3 |
a) SPF sertés;
első oltás: 12 hetes korban;
csoportonként 3 malac, kivéve a *-gal jelzettet amelyből 1 malac a fertőzés előtt elpusztult.
b) Vakcina készítmény: tokolszármazék emulzió.
c) A fertőző szuszpenzió életképesség-száma:
x 108/ml.
d) Azonos a 4. táblázatban ismertetett d) jelentésével
72. táblázat
Nyolcadik oltási kísérlet3
| Vakcina8) Antigén (eredetű szerotípus) | Antigén mennyiség (pg) | Fertőző törzs0 (szerotí- pus) | Pusztulás (elpusztult állat/összes állat) | Átlagos tüdők árosodásd |
| Mát (2) /OMP(l) /Hly (5b) | 65/50/50 | 4915(9) | 0/8 | 0,3 |
| Kontroll | - | 4915(9) | 2/8 | 2,3 |
a) SPF sertés;
első oltás: 5 hetes korban; csoportonként 8 malac.
b) Vakcina készítmény: tokolszármazék emulzió.
c) Intranazális fertőzés 106 életképes baktériummal.
d) Azonos a 4. táblázatban ismertetett d) jelentésével.
Claims (8)
1. Eljárás vakcina készítmény előállítására, sertések Actinobacillus pleuropneumoniae fertőzés elleni védelmére, amely lényegében A. pleuropneumoniae sejtektől mentes, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként
- egy A. pleuropneumoniae külső membrán fehérje készítményt, amely fő tömegében az SDSPAGE vizsgálat szerint egy, körülbelül 42 kD molekulatömegű antigén fehérje komponenst tartalmaz, és
- legalább egy A. pleuropneumoniae toxint, amely 1) egy, az SDS-PAGE vizsgálat szerint körülbelül
105 kD molekulatömegű hemolizin és/vagy
HU 211031 Β
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypontban megadott
- külső membrán fehérje készítményt,
- hemolizint és makrofág toxint alkalmazunk.
2) egy, az SDS-PAGE vizsgálat szerint körülbelül 120 kD molekulatömegű makrofág toxin lehet, farmakológiailag alkalmazható hordozó anyaggal öszszekeverünk.
3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A. pleuropneumoniae 1, 5a, 5b, 9, 10 vagy 11 szerotípusú sejtekből származó hemolizint alkalmazunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 15 azzal jellemezve, hogy A, pleuropneumoniae 2, 3, 4, 6 vagy 8 szerotípusú sejtekből származó makrofág toxint alkalmazunk.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként
- A. pleuropneumoniae (App) 1 szerotípusú sejtekből származó külső membrán fehéije készít5 ményt,
- App 5b szerotípusú sejtekből származó hemolizint és
- App 2 szerotípusú sejtekből származó makrofág toxint alkalmazunk.
10
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyéb sertés kórokozókból származó antigén anyagot is alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egyéb sertés kórokozó Pseudorabies vírus vagy sertés influenza vírus.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy hatásjavító szert is alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90200989 | 1990-04-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU911303D0 HU911303D0 (en) | 1991-10-28 |
| HUT61489A HUT61489A (en) | 1993-01-28 |
| HU211031B true HU211031B (en) | 1995-09-28 |
Family
ID=8204998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU911303A HU211031B (en) | 1990-04-20 | 1991-04-19 | Method for preparation of actinobacillus pleuropneumoniae vaccine |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5648081A (hu) |
| EP (1) | EP0453024B1 (hu) |
| JP (1) | JP3240063B2 (hu) |
| KR (1) | KR100196208B1 (hu) |
| CN (1) | CN1055024C (hu) |
| AU (1) | AU634879B2 (hu) |
| CA (1) | CA2040544C (hu) |
| DE (1) | DE69110082T2 (hu) |
| DK (1) | DK0453024T3 (hu) |
| ES (1) | ES2075325T3 (hu) |
| GR (1) | GR3017160T3 (hu) |
| HU (1) | HU211031B (hu) |
| NZ (1) | NZ237867A (hu) |
| ZA (1) | ZA912796B (hu) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0563288T3 (da) * | 1990-12-19 | 1999-09-27 | Pfizer | Immunopotentiering af vacciner, navnlig svinepleuropneumoniavacciner |
| US5994525A (en) | 1991-06-28 | 1999-11-30 | Kamp; Elbarte Margriet | Nucleic acid encoding Actinobacillus pleuropneumoniae cytolytic proteins |
| US5417971A (en) * | 1991-10-22 | 1995-05-23 | University Of Saskatchewan | Vaccines for Actinobacillus pleuropneumoniae |
| WO1993021951A1 (en) * | 1992-04-27 | 1993-11-11 | Michigan State University | Method for producing a bacterial vaccine and novel vaccines produced thereby |
| US6656477B1 (en) | 1992-07-28 | 2003-12-02 | Board Of Trustees Of Michigan State University | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof |
| CA2170839A1 (en) * | 1995-03-01 | 1996-09-02 | Janet Macinnes | Bacterial preparations, method for producing same, and their use as vaccines |
| US5925354A (en) | 1995-11-30 | 1999-07-20 | Michigan State University | Riboflavin mutants as vaccines against Actinobacillus pleuropneumoniae |
| US6342231B1 (en) | 1998-07-01 | 2002-01-29 | Akzo Nobel N.V. | Haemophilus parasuis vaccine and diagnostic |
| US6713071B1 (en) | 1998-10-22 | 2004-03-30 | Pfizer Inc. | Proteins from actinobacillus pleuropneumoniae |
| TWI224107B (en) * | 1998-10-22 | 2004-11-21 | Pfizer Prod Inc | Novel proteins from actinobacillus pleuropneumoniae |
| KR100372278B1 (ko) * | 2000-03-03 | 2003-02-17 | 주식회사 한국미생물연구소 | 돼지 호흡기용 혼합백신 |
| ATE373077T1 (de) * | 2002-02-25 | 2007-09-15 | Us Army Medical Res & Materiel | Verfahren zur herstellung von cs6- antigenimpfstoff zur behandlung, vorbeugung oder hemmung enterotoxigener escherichia coli- infektionen |
| TWI392737B (zh) * | 2008-11-27 | 2013-04-11 | Intervet Int Bv | 產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ或ＡｐｘIII 之方法 |
| TWI461529B (zh) * | 2008-11-27 | 2014-11-21 | Intervet Int Bv | 產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ之方法 |
| TWI548746B (zh) | 2009-08-06 | 2016-09-11 | 英特威特國際股份有限公司 | 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法 |
| CN102058880B (zh) * | 2010-10-13 | 2012-11-21 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法 |
| ES2416154B1 (es) | 2011-11-09 | 2015-04-01 | Laboratorios Hipra, S.A. | Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae |
| KR101491803B1 (ko) * | 2013-09-10 | 2015-02-16 | 대한민국 | 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 2번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물 |
| KR101491792B1 (ko) * | 2013-09-10 | 2015-02-13 | 대한민국 | 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 5번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물 |
| CN104502581B (zh) * | 2014-12-07 | 2016-05-04 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法 |
| KR101818901B1 (ko) | 2016-08-26 | 2018-01-16 | 우진 비앤지 주식회사 | 돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물 |
| EP3689373A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-08-05 | IDT Biologika GmbH | Inactivated apxia, apxiia and apxiiia toxins |
| GB202011902D0 (en) | 2020-07-30 | 2020-09-16 | Imperial College Innovations Ltd | Antinobacillus pleuropneumoniae vaccines |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK138379A (da) * | 1979-04-04 | 1980-10-05 | Nordisk Droge & Kemikalie | Vaccine imod pleuropneumonia (ondartet lungesyge) hos svin dens anvendelse samt fremgangsmaade og substat til dyrkning specielt aerob fermentering af mikroorganismen haemophilus pleuropneumoniae |
| US5047237A (en) * | 1985-09-06 | 1991-09-10 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus having a deletion of at least a portion of a gene encoding an antigenic, nonessential protein, vaccine containing same and methods of identifying animals vaccinated with the vaccine |
| NL8802007A (nl) * | 1988-08-12 | 1990-03-01 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Vaccin, geschikt voor de profylaxe respectievelijk de bestrijding van de door haemophilus pleuropneumoniae teweeggebrachte ziekte bij varkens alsmede werkwijze voor het winnen van extracellulair eiwitachtig materiaal van haemophilus pleuropneumonie, geschikt voor toepassing in dergelijke vaccins. |
| US5641653A (en) * | 1989-10-31 | 1997-06-24 | The Texas A&M University System | DNA encoding Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin |
-
1991
- 1991-04-11 EP EP91200849A patent/EP0453024B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-11 DE DE69110082T patent/DE69110082T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-11 ES ES91200849T patent/ES2075325T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-11 DK DK91200849.7T patent/DK0453024T3/da active
- 1991-04-15 ZA ZA912796A patent/ZA912796B/xx unknown
- 1991-04-16 CA CA002040544A patent/CA2040544C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 NZ NZ237867A patent/NZ237867A/xx unknown
- 1991-04-19 JP JP18061791A patent/JP3240063B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 KR KR1019910006414A patent/KR100196208B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 AU AU75192/91A patent/AU634879B2/en not_active Expired
- 1991-04-19 HU HU911303A patent/HU211031B/hu unknown
- 1991-04-19 CN CN91103236A patent/CN1055024C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-03 US US08/367,908 patent/US5648081A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-22 GR GR950402268T patent/GR3017160T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7519291A (en) | 1991-11-21 |
| CA2040544C (en) | 2002-10-22 |
| DK0453024T3 (da) | 1995-10-16 |
| HU911303D0 (en) | 1991-10-28 |
| KR910018033A (ko) | 1991-11-30 |
| CN1056428A (zh) | 1991-11-27 |
| KR100196208B1 (ko) | 1999-06-15 |
| AU634879B2 (en) | 1993-03-04 |
| JPH04225924A (ja) | 1992-08-14 |
| US5648081A (en) | 1997-07-15 |
| CN1055024C (zh) | 2000-08-02 |
| JP3240063B2 (ja) | 2001-12-17 |
| DE69110082D1 (de) | 1995-07-06 |
| CA2040544A1 (en) | 1991-10-21 |
| EP0453024A1 (en) | 1991-10-23 |
| ZA912796B (en) | 1992-01-29 |
| DE69110082T2 (de) | 1995-11-09 |
| ES2075325T3 (es) | 1995-10-01 |
| EP0453024B1 (en) | 1995-05-31 |
| HUT61489A (en) | 1993-01-28 |
| NZ237867A (en) | 1992-11-25 |
| GR3017160T3 (en) | 1995-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU211031B (en) | Method for preparation of actinobacillus pleuropneumoniae vaccine | |
| KR100361562B1 (ko) | 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 | |
| JP4005634B2 (ja) | モラクセラ属菌由来トランスフェリン受容体タンパク質 | |
| JP5566684B2 (ja) | Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン | |
| JP2002541808A (ja) | ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア | |
| JP4091112B2 (ja) | リポタンパク質の発現 | |
| JP2009515831A (ja) | ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ）抗原を含む組成物 | |
| US20050260225A1 (en) | Intranasal recombinant Salmonella vaccine encoding heterologous polysaccharide antigens | |
| US5750115A (en) | Escherichia coli vaccine | |
| PT1320542E (pt) | Ácidos nucleicos de estreptococo de grupo b, polipéptidos, composições terapêuticas e vacinas correspondentes | |
| US9597386B2 (en) | Outer membrane proteins of Histophilus somni and methods thereof | |
| CA1331445C (en) | Vaccine against e. coli septicaemia in poultry | |
| JPH08337598A (ja) | 非型性のヘモフイルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株用のワクチンとしての精製非型性ヘモフイルス インフルエンザＰ５蛋白質 | |
| JP2023503058A (ja) | ヘモフィルス・パラスイスに対する新規ワクチン | |
| EP2432500A2 (en) | Engineered type iv pilin of clostridium difficile | |
| Tagawa et al. | Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Haemophilus somnus | |
| US5911996A (en) | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof | |
| JP6401148B2 (ja) | 抗原および抗原の組み合わせ | |
| JP2001503602A (ja) | 非共通形態型好血菌属の高分子量表面タンパク質 | |
| KR20060118629A (ko) | 나이제리아 고노리아 또는 나이제리아 메닌지티디스에 대한재조합 필린을 함유한 백신 | |
| WO1993010815A1 (en) | Non-capsulated mutants of bacteria useful as vaccines | |
| EP1594561A2 (en) | Yersinia species compositions | |
| AU758555B2 (en) | Peptides | |
| RU2822516C1 (ru) | Новая вакцина против haemophilus parasuis | |
| EP0694560A2 (en) | Production of antigens of Pasteurella |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO N.V., NL |