ES2416154B1 - Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae - Google Patents

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Abstract

Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae.#La presente invención se refiere a una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII. Dicha cepa es inmunógena, no hemolítica y no citolítica. También se refiere a un procedimiento para obtenerla, a una vacuna contra la pleuroneumonía porcina que la contiene, y a un kit vacunal.

Description

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cepas HP3179 y HP3179ApxII/IIIH2-. Como control negativo, en algunos pocillos sólo se añadieron 100 µl de PBS. Después de incubar 2 horas a 37 qC, se añadieron a cada pocillo 5 µl de una solución de yoduro de propidio 1 mg/ml y después de unos minutos se examinó la placa mediante microscopia de contraste de fases y epifluorescencia. Dado que el yoduro de propidio es un fluorocromo que no puede atravesar la membrana celular, sólo las células con roturas en la membrana exhiben una intensa fluorescencia rojo-anaranjada en presencia de este fluorocromo. Para cuantificar la actividad citolítica de las diferentes toxinas se realizó un recuento de células fluorescentes. Como puede observarse en la figura 5, la incubación de los macrófagos alveolares con las toxinas procedentes de un cultivo de la cepa HP3179 da lugar un 59,6 % de células fluorescentes. En las misma condiciones, sólo se observó un 22,3 % de células fluorescentes después de incubar con la toxinas procedentes de la cepa HP3179ApxII/IIIH2-. Este último porcentaje es muy similar al que se obtuvo incubando los macrófagos solamente con PBS. Estos datos indican que la toxina ApxIIIAH2-producida por la cepa recombinante HP3179ApxII/IIIH2-carece de actividad citolítica, confirmando de esta manera que la eliminación del segundo dominio transmembrana H2 da lugar a una toxina atenuada incapaz de formar poros sobre las células diana.
De acuerdo con las condiciones del Tratado de Budapest y una vez comprobada la ausencia de actividad citolítica, la cepa recombinante HP3179ApxII/IIIH2-fue depositada por Laboratorios HIPRA, S.A. (17170, Girona, España) el día 4 de mayo de 2011 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (46980, Valencia, España) con el número de registro CECT 7903.
F.- Análisis de la producción de las exotoxinas ApxIIH2-imagen34y ApxIIIH2-por parte de las cepas recombinantes obtenidas
Para determinar si las cepas recombinantes obtenidas seguían produciendo las exotoxinas ApxH2-, se estudió la acumulación de las mismas en cultivo líquido con medio LB. Las exotoxinas producidas fueron detectadas mediante anticuerpos monoclonales específicos para la exotoxina ApxII y la exotoxina ApxIII mediante técnicas de inmunoensayo y Western blot.
Tal como se muestra en la figura 6A, el crecimiento de la cepa recombinante HP3179ApxII/IIIH2-no se vio alterado por la presencia de las modificaciones en las dos exotoxinas.
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