JPH04225924A - ブタ肺疫アクチノバチルス菌のサブユニットワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ブタ肺疫アクチノバチルス菌（
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ）（Ａｐｐ）の感染防御用ワクチン組成
物、及び、かかるワクチンの投与によるブタの保護方法
に係る。

【０００２】ブタの主な呼吸器疾患であるブタ肺疫は世
界的にまん延し、過急性疾患動物の死亡、急性疾患動物
の治療、及び、慢性疾患動物の出荷の遅れ、などの理由
から深刻な経済的損失を与えている。この疾患の病因と
してＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｌｅｕｒｏｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）が同定された。主として、動物間の直接接触に
よって伝染し、感染すると過急性から慢性までの様々な
臨床状態を生じる。疾患は主として気道感染であり、高
熱、重い呼吸困難、せき、食欲不振などの臨床症状を示
す。発病は急激で、罹病率及び致死率も高い。病理的に
注目されるのは、肺の病巣の成長及び分布である。

【０００３】ブタのこのようなＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ感染をワクチン接種プログラムによって
抑制することは勿論試みられてきた。

【０００４】例えば、不活化Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ菌であるバクテリンがブタのワクチン接種
のために使用されたが、このワクチンには副作用が強い
という欠点がある。更に、バクテリンは、Ａ．ｐｌｅｕ
ｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１つの血清型にのみ特異的
な（リポ）多糖に対する抗体を主として誘発するので、
Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのその他の血清
型の感染を防御できない。また、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅのバクテリンは、フィールド感染に対
する防御効果がよくない。

【０００５】防御抗体としてＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅの莢膜抽出物も報告されている。しかしな
がら、かかる抽出物によってブタ及びマウスを免疫感作
した場合、部分免疫しか得られなかった。更に、莢膜を
ベースとするワクチンは、同種防御（ｈｏｍｏｌｏｇｏ
ｕｓ　　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）しか誘発しない、即ち
、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特定血清型
に由来の莢膜ワクチンを接種されたブタは、Ａ．ｐｌｅ
ｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの異なる血清型の攻撃を防
御できない。

【０００６】Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの
弱毒生ワクチンも多くの欠点を示す。例えば、弱毒が十
分でない病原体が動物に接種される危険があり、また、
弱毒菌が病原性状態に復帰し接種動物を発病させる可能
性及び病原体を他の動物に伝染させる可能性がある。

【０００７】従って、血清型に依存せず、ブタに強力な
防御免疫応答を誘発する安全なＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅワクチンが長年要望されている。

【０００８】本発明の目的は、本質的にＡ．ｐｌｅｕｒ
ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞非含有で、Ａ．ｐｌｅｕｒ
ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来の２種以上の異なるサブ
ユニット成分の組み合わせから実質的に構成され、ブタ
に高度なＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染防
御を誘発し、更に血清型非依存性のブタ肺疫用サブユニ
ットワクチンを提供することである。

【０００９】本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約
４２ｋＤの主要抗原性タンパク質成分を有するＡ．ｐｌ
ｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの外層膜タンパク質調製
物と、 １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１０５ｋＤのＡ．ｐｌｅｕｒ
ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの溶血素（Ｈｌｙ）と２．ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで約１２０ｋＤのＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅのマクロファージ毒素（Ｍａｔ）とから
成るグループから選択された少なくとも１つの毒素とか
ら得られることを特徴とする本質的にＡ．ｐｌｅｕｒｏ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞非含有のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅワクチンを提供する。

【００１０】本発明によれば、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅの溶血素及び／またはマクロファージ毒
素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約４２ｋＤの主要抗
原性タンパク質成分を有するＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅの外層膜タンパク質調製物（以後４２ｋＤ
　　ＯＭＰ調製物と呼ぶ）と組み合わせることによって
、ブタのＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染予
防ワクチンとして使用でき、従来のワクチンにない顕著
な防御特性を示すことが知見された。

【００１１】溶血素がブタにある程度の防御を誘発する
ことは公知である。しかしながら、溶血素及び／または
マクロファージ毒素と４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製物との双
方を含むワクチンは、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅのビルレント菌の攻撃に対して完全な異種防御を
誘発する（実施例３及び５）。ＨｌｙまたはＭａｔ成分
と４２ｋＤ　　ＯＭＰとの組み合わせは、ワクチンの防
御特性を予想外に強化した。

【００１２】溶血素（Ｈｌｙ）の特徴は、−Ａ．ｐｌｅ
ｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞培養上清から単離可能
なカルシウム誘導性タンパク質である、−ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（本文中に概説）で測定して分子量１０５±５ｋＤ
を有する、 −溶血素を単離した血清型に依存し、 −熱に感受性、及び、 −プロテイナーゼＫ処理に感受性の赤血球に対する溶血
活性を有する、ことである。

【００１３】溶血素の溶血活性は実施例２．１に概説し
た試験によって確認できる。

【００１４】溶血素の溶血活性は不安定であり、分子量
１０５ｋＤのタンパク質の減少に加えて貯蔵中に消失す
るが、免疫性は失活しない。

【００１５】従って、溶血活性を喪失した前記溶血素ま
たは免疫性を維持している溶血素の抗原性フラグメント
を、本発明のワクチンに組込むことができる。

【００１６】血清型１〜１２のうちで、１、５ａ、５ｂ
、９、１０及び１１型が産生する溶血素だけが溶血活性
を有する（実施例２．１）。その他の血清型は、溶血性
を有する１０５ｋＤタンパク質溶血素に血清学的に近縁
の非溶血性の等価の１０５ｋＤタンパク質を産生する（
実施例２．３）。本文中ではこの免疫学的等価物または
そのフラグメントも溶血素と呼ぶ。

【００１７】更に、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅの１つの溶血性血清型に由来の溶血素に対して誘発
された抗血清は、別の溶血性Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ血清型に由来の溶血素の溶血活性を交差中
和することが判明した（実施例２．３）。

【００１８】異なる血清型に由来の溶血素間の上記のご
とき密接な免疫学的関係から、４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製
物に加えて、入手可能な任意の溶血性Ａ．ｐｌｅｕｒｏ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型または菌株に由来の溶血素
を含有するＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染
防御ワクチンを調製できると予想される。

【００１９】本発明のワクチンに組込まれるべき溶血素
は、溶血素の発現を促進する条件下にＡ．ｐｌｅｕｒｏ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞を培養し、細胞から上清を分
離することによって容易に得られる。溶血素を更に、限
外濾過及び硫酸アンモニウム沈殿させ、次いで分子ふる
いクロマトグラフィーを行なうことによって精製し得る
。

【００２０】精製処理中に、実施例２．１に概説した試
験に従い、溶血性菌株から得られた溶血素に富む分画を
、赤血球に対する溶血活性によってモニターし得る。

【００２１】本発明のワクチンに組込まれるべき一連の
溶血素に属する溶血素は、以下に概説する手順によって
血清型１のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞
から単離され得る。

【００２２】ａ．０．０１％のＮＡＤ、１％のＩｓｏｖ
ｉｔａｌｅＸ及び２５ｍＭのＣａｃｌ２を補充したＣｏ
ｌｕｍｂｉａブイヨン中で前記細菌を６時間培養し、ｂ
．得られた培養物の無細胞上清をカットオフ分子量３０
０，０００Ｄのフィルターで濃縮し、ｃ．硫酸アンモニ
ウムを５５％飽和まで添加して濃縮上清から沈殿させ、
次いで沈殿物を１６，０００×ｇで１０分間遠心し、 ｄ．１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファに再溶解した
沈殿物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ−２００カラムで分
離し、 ｅ．最初の溶出ピークを収集する。

【００２３】この単離手順は、別のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型に由来の溶血素を得るために
も使用できる（血清型１の溶血素の精製及び部分キャラ
クタリゼーションは、Ｆｒｅｙ，Ｊ．＆　　Ｎｉｃｏｌ
ｅｔ，　　Ｊ．，　　ＦＥＭＳ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８８），５５，　　４１〜４６
にも記載されている）。

【００２４】マクロファージ毒素（Ｍａｔ）の特徴は、
−Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞培養上清
から得られるタンパク質である、 −ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（本文中に概説）で測定して分子量
１２０±１０ｋＤを有する、 −Ｎ末端アミノ酸配列がＳｅｒ（？）−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔである、 −熱に感受性、及び、プロテイナーゼＫ処理に感受性の
ブタ肺胞マクロファージに対して細胞障害性であること
である。

【００２５】Ｍａｔの細胞障害性活性は実施例４．１に
概説した試験によって確認できる。

【００２６】Ｍａｔの細胞障害性は不安定であり、分子
量１２０ｋＤのタンパク質の減少に加えて貯蔵中に消失
するが、この性質はＭａｔの免疫特性に必須ではない。

【００２７】従って、マクロファージ細胞障害性を喪失
した前記タンパク質または免疫特性をまだ維持している
そのフラグメントも本発明のワクチンに組込まれ得る。

【００２８】血清型１〜１２のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅのうちで血清型２、３、４、６及び８の
基準株がＭａｔを産生した。更に、特定血清型の細胞に
由来のＭａｔに対して誘発された抗体がＭａｔ調製物の
マクロファージ細胞障害性活性を中和することが証明さ
れた（実施例４）。

【００２９】異なる血清型に由来のＭａｔ間の密接な免
疫学的関係から判断して、本発明のワクチンは、入手可
能な任意のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清
型またはＭａｔ産生菌株から調製され得ると予想される
。

【００３０】本発明のワクチンに組込まれ得るＭａｔは
、Ｍａｔの発現を促進する条件下にＡ．ｐｌｅｕｒｏｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞を培養し、細胞から上清を分離
することによって容易に得られる。限外濾過、クロマト
グラフィー及び限外濾過による濃縮段階によってＭａｔ
を更に精製し得る。

【００３１】精製処理中に実施例４．１に概説した試験
に従って、Ｍａｔに富む分画のマクロファージ細胞障害
性活性をモニターし得る。

【００３２】本発明のワクチンに組込まれ得る一連のマ
クロファージ細胞毒素のキャラクタライゼーション及び
産生を以下の手順で行なう ａ．Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌の血清型
２の細胞を０．０１％のＮＡＤを補充したＣｏｌｕｍｂ
ｉａブイヨン中で３７℃で約６時間培養する、ｂ．カッ
トオフ分子量３００，０００Ｄのフィルターを用いた限
外濾過によって培養上清を濃縮する、ｃ．濃縮物をＣＬ
４Ｂカラムで溶出させる、ｄ．最初の溶出ピークを収集
する、 ｅ．０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターで毒素を
ろ過する。

【００３３】同じまたは異なる血清型の別の菌株からＭ
ａｔを得るためにもこの単離手順を使用できる。

【００３４】本発明のワクチンの無毒素成分は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（本文中に概説）で測定して４２±５ｋＤの
タンパク質またはその抗原性フラグメントを主要抗原性
タンパク質として含むＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ細胞の外層膜タンパク質調製物（４２ｋＤ　　Ｏ
ＭＰ調製物）であり、４２ｋＤ　　ＯＭＰは、−熱変性
可能、及び、 −プロテイナーゼＫ処理に感受性である。

【００３５】血清型１細胞に由来の４２ｋＤ　　ＯＭＰ
調製物に対して誘発された抗血清は、Ａ．ｐｌｅｕｒｏ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型１〜１２に由来の細胞溶
解物と強力に交差反応する。この抗血清は主としてウェ
スターン法で４２ｋＤ　　ＯＭＰを認識する抗体を含む
ので、４２ｋＤ　　ＯＭＰが精製ＯＭＰ調製物中の主要
抗原性タンパク質であると結論できる（実施例１．２）
。このことから、溶血素及び／またはＭａｔに加えて、
入手可能なＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの任
意の血清型に由来の４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製物を含有す
るＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染防御ワク
チンを調製し得ると予想される。

【００３６】この４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製物を得るため
には、４２ｋＤ　　ＯＭＰの発現を促進する条件下にＡ
．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌を培養し、音波
処理、磨砕またはフレンチプレスによってＡ．ｐｌｅｕ
ｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞を破壊した後で、細胞膜
分画を沈降させ、得られた分画を、密度勾配沈降させる
かまたはＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００もしくはサルコシ
ルのごとき界面活性剤により内膜を分画可溶化し、次い
で、遠心によって内膜及び外層膜に精製し、所望の場合
には、更に４２ｋＤ　　ＯＭＰに富むＯＭＰ調製物を調
製する。

【００３７】本発明のワクチンに組込まれ得る４２ｋＤ
のタンパク質に富む外層膜タンパク質調製物に属する調
製物の１つは、血清型１のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ細胞から以下の手順で単離され得る。

【００３８】ａ．０．０１％のＮＡＤを補充したブレイ
ンハートインフュージョンブロス中で細菌を一夜培養す
る、 ｂ．遠心によって細菌細胞を収集し、１０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳバッファに再懸濁させる、 ｃ．超音波処理によって細菌細胞を破壊する、ｄ．遠心
によって大きい細胞破片を除去し、１００，０００×ｇ
で１時間遠心することによって上清から膜フラグメント
を完全に回収し、ＨＥＰＥＳバッファに再懸濁させる、 ｅ．Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（サルコシ
ル）を最終濃度１％（ｗ／ｖ）まで添加して１時間攪拌
する、 ｆ．１００，０００×ｇで１時間遠心して外層膜タンパ
ク質を回収し、Ｈ２Ｏに再懸濁させる。

【００３９】入手可能なすべてのＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ血清型に由来の４２ｋＤ　　ＯＭＰ調
製物を得るために上記単離手順を使用し得る。

【００４０】所望の場合、当業界に公知の方法によって
４２ｋＤ　　ＯＭＰを均質になるまで精製できる。例え
ば、１種以上の界面活性剤で抽出して前記４２ｋＤＯＭ
Ｐ調製物から４２　　ｋＤ　　ＯＭＰを可溶化し、次い
で、４２ｋＤ　　ＯＭＰの感染防御特性を損なわない条
件下にイオン交換体または分子ふるいクロマトグラフィ
ーで更に精製する。

【００４１】本発明のワクチンに組込み可能な溶血素、
Ｍａｔ及び４２ｋＤ　　ＯＭＰは、化学的合成、Ａ．ｐ
ｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞培養物の精製、ま
たは、組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。

【００４２】組換えＤＮＡ技術を用いる場合、上記タン
パク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列を
、例えば該配列を含む個別クローンのゲノムＡ．ｐｌｅ
ｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　　ＤＮＡバンクのスクリ
ーニングによって同定する。スクリーニングには、溶血
素、Ｍａｔまたは４２ｋＤ　　ＯＭＰに対して誘発され
たポリクローナルまたはモノクローナル抗体との特異的
反応を利用する。核酸配列を種々の発現用ＤＮＡ配列に
結合して所謂組換え核酸分子を形成し、この分子を用い
て適当な宿主を形質転換する。かかるハイブリッドＤＮ
Ａ分子は、例えばプラスミドに由来してもよく、または
ウイルス中に存在する核酸配列に由来してもよい。宿主
細胞は細菌のごとき原核生物起原でもよくまたは哺乳類
細胞のごとき真核生物起原でもよい。形質転換された宿
主細胞を使用して溶血素または４２ｋＤ　　ＯＭＰを産
生させ、次いで、このタンパク質を単離し、本発明のワ
クチンに組込むことが可能である。

【００４３】別の実施態様によれば、溶血素及び／また
はＭａｔをコードする遺伝子を含む非病原性微生物、例
えばウイルスまたは細菌と、同じまたは異なる微生物に
クローニングされた４２ｋＤ　　ＯＭＰとを含むベクタ
ー生ワクチンを調製し得る。

【００４４】本発明のワクチンは、いずれもＡ．ｐｌｅ
ｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来の溶血素及び／また
はＭａｔ成分と４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製物成分とから得
られる。ワクチンは夫々の成分または免疫特性をまだ維
持している該成分の抗原性フラグメントを含んでもよく
、上記のごとき組換えＤＮＡワクチンの形態であっても
よい。

【００４５】（１つまたは複数の）エピトープを含む本
発明のワクチンのタンパク質成分の免疫化学的に活性の
適当なポリペプチドフラグメントは、特許出願ＷＯ８６
／０６４８７、Ｇｅｙｓｅｎ，　　Ｈ．Ｍ．他（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　　８１，　　３９
９８〜４００２，１９８４）、Ｇｅｙｓｅｎ，　　Ｈ．
Ｍ．他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５
９〜２７４，　　１９８７）に記載された方法で検出さ
れ得る。 これは、所謂ペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）法に基づ
いており、考察中の完全ポリペプチドの部分配列に対応
した部分的にオーバーラップする一連のポリペプチドを
合成し抗体との反応性を試験する方法である。

【００４６】更に、上記アミノ酸配列を有するポリペプ
チドのいくつかの領域は、理論的考察及び既知のエピト
ープとの構造的一致に基づいてエピトープであると同定
され得る。これらの領域は、Ｈｏｐｐ　　＆　　Ｗｏｏ
ｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８
，　　３８２４〜３８２８，１９８１）による親水性基
準と、Ｃｈｏｕ　　＆　　Ｆａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　４７，　　
４５〜１４８，　　１９８７）の二次構造アスペクトに
基づいて決定される。

【００４７】必要な場合にもＴ細胞エピトープも、Ｂｅ
ｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２
３５，１０５９〜６２，１９８７）を理論的根拠として
同様に得られる。免疫原性を強化するために小フラグメ
ントは担体分子に結合されるのが好ましい。このための
適当な担体は、高分子、例えば天然高分子（カサガイ（
ｋｅｙ　　ｈｏｌｅ　　ｌｉｍｐｅｔ）のヘモシアニン
、アルブミン、毒素のごときタンパク質）、ポリアミノ
酸（ポリリジン、ポリアラニン）のような合成高分子、
またはサポニンのごとき両親媒性化合物のミセルである
。またはこれらのフラグメントがその重合体、好ましく
は直鎖状重合体として提供されてもよい。

【００４８】特に、溶血素成分は、血清型１、５ａ、５
ｂ、９、１０または１１のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ菌株に由来する。

【００４９】本発明のワクチン中のＭａｔ成分は、好ま
しくは血清型２、３、４、６または８のＡ．ｐｌｅｕｒ
ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に由来する。

【００５０】本発明の最も好ましいワクチンは、Ａ．ｐ
ｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの４２ｋＤ　　ＯＭＰ
調製物、溶血素及びＭａｔに由来の三価（ｔｒｉｖａｌ
ｅｎｔ）ワクチンである。

【００５１】４２ｋＤ　　ＯＭＰが血清型１の細胞に由
来し、溶血素が血清型５ｂの細胞に由来し、Ｍａｔが血
清型２の細胞に由来するとき三価ワクチンによって極め
て有利な結果が得られる。

【００５２】本発明のワクチンは従来の活性免疫感作ス
キームで投与され得る。治療的に有効な免疫原性量を投
与用量に合うように１回投与または反復投与する。ワク
チンを例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内または鼻孔
内投与し得る。

【００５３】前記成分の基準用量は、ブタ一頭あたり約
１μｇ〜約１ｍｇの範囲である。好ましくはブタ一頭あ
たり約２５μｇ〜２００μｇの範囲である。

【００５４】本発明のワクチンは、溶血素及び／または
Ｍａｔ成分と４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製物成分とを免疫活
性組成物として混合することによって調製され得る。

【００５５】筋肉内注射のごとき非経口投与の場合には
、例えば免疫活性及び／または保存寿命を改良するため
に、前記成分を医薬として許容される適当な担体、例え
ば、任意に別の成分を添加した水性媒体または含水懸濁
液と混合する。これらの別の成分として、塩、ｐＨバッ
ファ、安定剤、乳化剤、免疫応答を増強するアジュバン
ト（例えばビタミンＥの水中油型エマルジョン、油中水
型エマルジョン、アルミニウム化合物、ムラミルジペプ
チド、サポニン、ポリアニオン、両親媒性化合物または
ブロック（コ）ポリマー）及び保存剤がある。

【００５６】また、ワクチンを別の疾患の免疫感作成分
と組み合わせて多価ワクチンを製造してもよく、または
その他の医薬、例えば抗生物質と組み合わせてもよい。 例えば１種以上のブタ病原体、例えば、偽狂犬病ウイル
ス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパーボウイルス、
ブタインフルエンザウイルス、肺炎マイコプラズマ（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ　　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
、大腸菌、ブタ丹毒菌、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ　　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）及びパス
ツレラ・マルトサイダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　　ｍ
ｕｌｔｏｃｉｄａ）などの抗原性物質を更に含む多価ワ
クチンを調製し得る。

【００５７】実施例１ １．４２ｋＤに富む外層膜タンパク質（ＯＭＰ）調製物
の精製及びキャラクタリゼーション 方法 ＯＭＰの精製は、本質的にＢａｒｅｎｋａｍｐ他（Ｊ．
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４３，　　６６８〜６７６；
１９８１）に記載の方法で行なった。

【００５８】Ａｐｐ血清型１基準株を、０．０１％のＮ
ＡＤを補充したブレインハートインフュージョンブロス
で一夜培養し、遠心によって細菌を収集し、１０ｍＭの
Ｈｅｐｅｓバッファ（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。細
菌細胞を氷水で冷却しながら、Ｂｒａｎｓｏｎ　　Ｓｏ
ｎｉｆｉｅｒ（Ｂ−１２型）で、大部分の細菌が破壊さ
れＯＤ６６０が少なくとも９０％減少するまで超音波処
理した。５，０００×ｇで２０分間遠心し次いで１０，
０００×ｇで１０分間遠心することによって大きい細胞
破片を除去した。１００，０００×ｇで１時間超遠心し
て上清から膜を収集し、Ｈｅｐｅｓバッファに再懸濁さ
せた。大きい不溶物を、遠心（１１，０００×ｇで２０
分間）及び５μｍフィルター濾過によって除去した。濾
液にＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（サルコシ
ル）を最終濃度１％（ｗ／ｖ）まで添加した。１時間攪
拌後に、サルコシル不溶のＯＭＰを１時間１００，００
０×ｇでペレット化し、Ｈ２Ｏに再懸濁させ、０．４５
μｍフィルターで濾過した。

【００５９】精製したＯＭＰ調製物をＬａｅｍｍｌｉの
方法（Ｎａｔｕｒｅ　　２２７，　　６８０〜６８４；
１９７０）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで流した。

【００６０】ＢＳＡを標準として用い修正Ｆｏｌｉｎ−
Ｃｉｏｃａｌｔｅｕアッセイ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．　　Ｃｈ
ｅｍ．　　７３，　　６２７；１９２７）によってタン
パク質含量を測定し、グルコースを標準として用いＤｕ
ｂｏｉｓ他（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８，　　３５０〜
３５６；１９５６）のフェノール硫酸アッセイによって
炭水化物含量を測定した。

【００６１】ゲルに加える前に、サンプルバッファ中の
サンプルを種々の温度（３０℃〜１００℃）で１０分間
処理することによってＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＯＭＰ
の熱変性度を試験した。

【００６２】プロテイナーゼＫ処理に対するＯＭＰの感
受性は以下の手順で試験した。５ｍＭのＥＤＴＡと０．
５％のＳＤＳとを補充した１００μｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含有する１０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．５）中に約０．
０５ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含むようにサンプルを調
整した。穏やかに攪拌しながら３７℃で３時間インキュ
ベートした後で、４℃で一夜保存し、プロテイナーゼＫ
処理サンプル及び偽処理サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで
流した。ゲルをＣＢＢまたは銀で染色するか（Ｗｒａｙ
他，Ａｎａｌ．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　　１１８，　　
１９７〜２０３；１９８１）、または回復期ブタ血清を
用いてウェスターン法で処理した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１２０，　　４６〜５１；１９８２）。使用し
たブタ抗血清はすべて、Ａｐｐ血清型２または９のフィ
ールド感染で生き残ったブタまたはＡｐｐ血清型１、２
、５ａまたは９の実験的抗原投与で生き残ったブタから
採取した回復期血清であった。

【００６３】結果 精製ＯＭＰ調製物のタンパク質−炭水化物比は１：０．
８であった。精製ＯＭＰ調製物はＣＢＢ染色したＳＤＳ
−ＰＡＧＥ中で主要タンパク質として４２ｋＤのダブル
バンドを生じ、これは全細菌溶解物及び未精製の全膜調
製物に比較して明らかに濃度増加を示した。図１は、Ｓ
ｈｉｍａｄｚｕ　　Ｄａｔａ　　Ｒｅｃｏｒｄｅｒ（Ｄ
Ｒ−２）に接続したＳｈｉｍａｄｚｕ　　Ｄｕａｌ−Ｗ
ａｖｅｌｅｎｇｔｈ　　ＴＬＣ　　Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｃ
Ｓ−９３０）で行なった精製ＯＭＰ調製物のゲルスキャ
ンの一例を示す。４２ｋＤタンパク質の純度はタンパク
質ベースで約６０％であった。

【００６４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に精製ＯＭＰを種々
の温度で前処理すると、７０℃以上で前処理したときは
４２ｋＤが主要バンドであることが判明した。６０℃よ
り低温で前処理すると４２ｋＤのバンドが完全に消滅し
、約２００ｋＤの別の主要バンドが出現した。この２０
０ｋＤのバンドは７０℃以上の前処理では存在しなかっ
た。４２ｋＤ　　ＯＭＰが熱変性タンパク質であるとい
う結論が得られた。

【００６５】精製ＯＭＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥの前にプロ
テイナーゼＫで前処理し、次いでＣＢＢでゲルを染色す
ると、プロテイナーゼＫ処理後にバンドが全く残存しな
いこと、主要４２ｋＤバンドも残存しないこと、しかし
ながら偽処理ではゲルのタンパク質パターンが全く変化
しないことが判明した。ゲルを銀染色すると、プロテイ
ナーゼＫ処理後には極めて低い分子量のバンド（１２〜
２０ｋＤ）だけが残存したが、偽処理サンプルは主要４
２ｋＤバンドを含む正常バンドパターンを有することが
判明した。ゲルを回復期ブタ血清を用いてウェスターン
法で処理すると、プロテイナーゼＫ処理後にはいかなる
バンドも発生しないが、偽処理後には正常パターンが発
生することが判明した（図２）。回復期ブタ血清は、銀
染色ゲルで出現したプロテイナーゼＫ耐性低分子量バン
ドに対する抗体を明らかに含んでいなかった。４２ｋＤ
　　ＯＭＰはプロテイナーゼＫによるタンパク質分解作
用に感受性であるという結論が得られた。

【００６６】２．精製４２ｋＤ　　ＯＭＰの抗原性試験
方法 前記のごとく精製した２０μｇの精製４２ｋＤ　　ＯＭ
Ｐの油中水型エマルジョンの皮下注射によってモルモッ
トにワクチン接種した。ワクチン接種の４週間後に、血
清を採取し、細菌溶解物に対してウェスターン法で試験
した。

【００６７】（細菌溶解物は、血清型１〜１０のＡｐｐ
基準株から以下の手順で調製した。細菌を菌株毎に３つ
の１５ｃｍ大のチョコレート寒天プレートから採取し、
０．３％のホルマリンを含む約１０ｍｌのＰＢＳ（０．
０４Ｍ，　　ｐＨ７．２）に懸濁させた。Ｂｒａｎｓｏ
ｎ　　Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　　Ｂ−１２でＯＤ６６０が約
９０％減少するまで細菌を超音波処理によって溶菌した
。細菌及び大きい細胞破片を遠心して沈め、溶菌物を０
．４５μｍのフィルターで濾過した。溶菌物をタンパク
質濃度１ｍｇ／ｍｌに調整した）。

【００６８】結果 図３に示すように、ワクチン接種に対する応答は主とし
て４２ｋＤ（ダブル）バンドに対して生じた。ワクチン
をＡｐｐ血清型１の基準株から精製した４２ｋＤ　　Ｏ
ＭＰから調製したが、抗体は、血清型１〜１０のＡｐｐ
基準株の溶菌物中の同様の４２ｋＤ（ダブル）バンドを
認識した。従って、４２ｋＤ　　ＯＭＰは試験したすべ
てのＡｐｐ血清型に存在する共通の交差反応性抗原であ
るとの結論が得られた。

【００６９】実施例２ １．Ａｐｐ菌株の溶血活性 方法 本質的にＦｒｅｙ　　＆　　Ｎｉｃｏｌｅｔ（Ｉｎｆｅ
ｃ．Ｉｍｍｕｎ．５６，２５７０〜２５７５；１９８８
）に記載の手順で菌株の溶血活性を試験した。１％のＩ
ｓｏＶｉｔａｌｅＸ（商標）（ＢＢＬ）、０．０１％の
β−ＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）及び２５ｍＭのＣａＣｌ２（
Ｍｅｒｃｋ）を補充したＣｏｌｕｍｂｉａブイヨン（Ｄ
ｉｆｃｏ）中で細菌を３７℃で対数増殖期の後半期（ｍ
ｉｄ−ｅｎｄ）まで４〜６時間増殖させた。細菌細胞を
１２，０００×ｇで１０分間遠心して沈め、上清をＴｒ
ｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；０．８５％のＮａＣｌ中
に１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）中で系列
希釈した。等容のＴＢＳ中の２％ウマ赤血球懸濁液を上
清希釈物に添加した。混合物を攪拌しながら３７℃で２
時間インキュベートし、次いで４℃での静止インキュベ
ーションを一夜行なって赤血球を沈降させた。得られた
上清の吸光度を５４０ｎｍ（Ａ５４０）で測定した。各
アッセイで、１部の蒸留水と１部の２％ウマ赤血球とか
ら成る１００％対照を少なくとも４つ試験した。

【００７０】陰性対照は、１部のＴＢＳと１部の２％赤
血球とから構成した。溶血活性は、１００％対照の平均
に対して２５％の溶血を与える培養上清の希釈度として
示した。非希釈サンプルが１００％対照の平均に対して
２５％以上の溶血を示したときサンプルが陽性であると
判定する。陰性対照は、Ａ５４０が０．１００以下であ
るように、赤血球懸濁液に対する品質対照として使用し
た。

【００７１】結果 表１はＡｐｐ基準株の結果を示す。方法の項で記載した
アッセイを使用すると、Ａｐｐ血清型１、５ａ、５ｂ、
９、１０及び１１は溶血性であることが観察されたが、
その他の血清型は陰性であった。Ａｐｐのフィールド単
離物の試験でもほぼ同じ血清型が溶血性であった。

【００７２】 ２．溶血素の精製及びキャラクタリゼーション方法 溶血素を精製するために、Ａｐｐ血清型１または血清型
５ｂ基準株を、１％のＩｓｏＶｉｔａｌｅＸ（商標）、
０．０１％のＮＡＤ及び２５ｍＭのＣａＣｌ２を補充し
たＣｏｌｕｍｂｉａブイヨン中で３７℃で約６時間増殖
させた。その後の段階はすべて４℃で行なった。遠心（
１６，０００×ｇで３０分間）及び酢酸セルロース膜フ
ィルターを用いた０．４５μｍ濾過によって細菌を除去
した。無細胞上清を、ＰＴＭＫフィルター（分子量カッ
トオフ３００，０００；ポリスルホン）を備えたＭｉｎ
ｉｔａｎ（商標）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使
用した：限外濾過によって濃縮した。溶血素を５５％飽
和硫酸アンモニウムで一夜沈殿させ、１６，０００×ｇ
で１０分間遠心し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッフ
ァｐＨ７．５に再溶解させた。最後に、溶血素をＳｅｐ
ｈａｃｒｙｌ　　Ｓ−２００またはＣＬ４Ｂカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）で１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファ（ｐＨ７．５）を溶出バッファとして溶出させた。 最初の溶出ピークが溶血素を含有していた。

【００７３】精製した溶血素調製物をＬａｅｍｍｌｉの
方法（Ｎａｔｕｒｅ　　２２７，　　６８０〜６８４；
１９７０）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで流した。

【００７４】培養上清の硫酸アンモニウム沈殿によって
すべての血清型から粗溶血素調製物を調製した。特に注
釈がなければ全部の調製物を−７０℃で保存した。

【００７５】培養上清を６０℃で１０分間加熱し次いで
溶血活性を（前記のごとく）試験して熱感受性を試験し
た。プロテイナーゼＫ処理に対する感受性は、０．０２
ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
；Ｔ．ａｌｂｕｍ由来）と共に培養上清を３７℃で１０
分間インキュベートし次いで溶血活性を試験することに
よって測定した。

【００７６】トリプシンに対する感受性は、０．０２ｍ
ｇ／ｍｌのトリプシン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で培養上
清を３７℃で１０分間インキュベートし、次いで０．０
３ｍｇ／ｍｌのトリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ）
を添加して３７℃で更に１０分間インキュベートするこ
とによって試験した。０．６ｍｇ／ｍｌを含有する精製
溶血素を０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと共に３
７℃で３時間インキュベートし、次いでＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで処理した。調製物を種々の温度で種々の期間保存し
次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行なうことによって精製
溶血素の安定性を測定した。

【００７７】結果 方法の項で記載の手順で血清型１及び血清型５ｂの基準
株から精製された２種類の溶血素は、ＣＢＢ染色後にＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで１０５ｋＤのバンドを生じた。精製血
清型５ｂの溶血素のゲルスキャンを図４に示す。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥでの見掛け分子量は約１０５ｋＤであったが
、天然型（ｎａｔｉｖｅ）溶血素は分子量カットオフ３
００，０００ｋＤのフィルターによる濾過中にも保持さ
れていた。更に、ゲル濾過で得られた溶出プロフィルに
よれば、天然型溶血素またはその集塊は少なくとも分子
量１０×１０６Ｄを有するという結論が得られた（図５
）。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ−１０００（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）カラムを用いマーカータンパク質としてウシ
のチログロブリン（分子量約６６９ｋＤ；Ｓｉｇｍａ）
を使用すると、ボイドボリューム（ｖｏｉｄ　　ｖｏｌ
ｕｍｅ）の直後に溶血素が溶出し、チログロブリンは保
持されていた。

【００７８】精製溶血素調製物のタンパク質−炭水化物
比は約１０：１であった。

【００７９】表１に示す基準株の培養上清からの粗溶血
素調製物はすべて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて同様の１
０５ｋＤのバンドを示した。記載のアッセイで試験した
溶血活性のない基準株も同様に、すべてが溶血性菌株と
同様の１０５ｋＤバンドを示した。

【００８０】細菌の培養後２〜３日以内に精製を行なう
限りは精製溶血素が溶血活性を維持していた。溶血素を
−７０℃で保存したときは溶血活性は安定であったが、
４℃以上の温度で保存した場合には溶血活性が数日で消
滅した。

【００８１】また、精製溶血素を４℃以上の温度で保存
したときにＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても１０５ｋＤのタ
ンパク質は安定でなかった。溶血素を４℃、室温または
３７℃で７日間保存したとき、タンパク質バンドの見掛
け分子量は逐次減少し、３７℃で保存後には約６５ｋＤ
になった。一例として図６は、−２０℃及び３７℃で保
存された精製溶血素のゲルスキャンを示す。

【００８２】溶血性血清型（表１参照）に属する菌株の
培養上清中の溶血活性は、６０℃で１０分間加熱すると
完全に消滅した。培養上清中の溶血活性はまた、プロテ
イナーゼＫまたはトリプシン処理にも感受性であった。 培養物に０．５％のホルマリンを添加し室温または３７
℃で一夜インキュベートしても溶血活性が消失した。

【００８３】３．精製溶血素の抗原性試験及び抗血清の
交差反応 方法 Ａｐｐ血清型１、２、５ａまたは９に実験感染させ生き
残ったがＡｐｐ感染の典型的な肺病巣がかなり発達した
ブタから回復期ブタ血清を採取した。

【００８４】前述のごとく血清型１または血清型５ｂの
基準株から精製した精製溶血素を６週間の間隔をあけて
２回筋肉内注射してウサギに超免疫血清を誘発した。１
００μｇの精製した血清型１の溶血素をフロインド完全
及びフロインド不完全アジュバントに夫々いれ、２回投
与してウサギを免疫感作した。２５μｇの精製した血清
型５ｂの溶血素をｔｏｃｏｌ誘導体エマルジョンに入れ
、２回投与してウサギを免疫感作した。

【００８５】また、ウサギで、種々の温度、即ち−７０
℃、４℃及び室温で長期間保存したＡｐｐ血清型５ｂか
ら得られた精製溶血素に対する超免疫血清を誘発した。 油中水型エマルジョンの形態で２５μｇの溶血素を６週
間の間隔をあけてウサギに２回筋肉内投与した。種々の
温度に維持した調製物の熟成期間は、プライミング注射
では７５日間であり、ブースター注射では１１８日間で
あった。プレ免疫血清による血清学的試験（Ｅｌｉｓａ
、ウェスターン法）によれば、全部の動物がＳＰＦ品質
であるかまたは少なくともＡｐｐ非感染であった。ブー
スター注射の２週間後に抗血清を収集した。

【００８６】モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生する
ハイブリドーマ系を標準法によって調製した。Ｂａｌｂ
／ｃマウスをＡｐｐ血清型１からの精製溶血素で免疫感
作し、脾臓細胞をＡｇ８ミエローマ細胞と融合させ、陽
性ハイブリドーマ細胞を限界希釈によってクローニング
した。ハイブリドーマ培養上清またはマウス腹水からＭ
Ａｂを採取した。

【００８７】精製した血清型１及び血清型５ｂの溶血素
をコーティング抗原として使用し、標準法でＥｌｉｓａ
（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ
ｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙ）を実施した。系列希釈の前に
抗血清を予め１：１００に希釈した。１：１００希釈の
プレ免疫血清からバックグラウンド吸収値を算出した。 バックグラウンド吸収値の１．１５倍以上の吸収値を与
える最大血清希釈度をＥｌｉｓａ力価と定義した。

【００８８】粗溶血素調製物及び精製溶血素調製物を前
述のごときウェスターン法で処理した。

【００８９】抗血清による溶血活性の中和を以下のごと
く試験した。培養上清を前述のごとく調製した。抗血清
を１：２５に予備希釈し、ＴＢＳ中で系列希釈した。希
釈した抗血清に等容の未希釈培養上清を添加し、次いで
３７℃で３０分間インキュベートした。これらの混合物
の溶血活性を前述のごとく試験した。中和力価は、２倍
希釈した培養上清に対して５０％の溶血性を与える血清
希釈度であると定義した。プレ免疫血清を各アッセイで
陰性対照として用いた。

【００９０】結果 表２に示すように、Ａｐｐ血清型１、５ａまたは９に感
染させた後に生き残った回復期ブタ血清は、血清型１及
び５ｂから精製された溶血素に対してＥｌｉｓａ中で高
い抗体価を有し、Ａｐｐ血清型１、５ｂ及び９の培養上
清の溶血活性を中和した。血清型２の回復期ブタ血清だ
けがＥｌｉｓａで血清型１及び５ｂに対して中程度の抗
体価を有していたが、溶血活性の中和は検出できなかっ
た。

【００９１】Ａｐｐ血清型１及び５ｂに由来の精製溶血
素に対して誘発された超免疫ウサギ抗血清は、血清型１
及び５ｂの溶血素に対してＥｌｉｓａで高い抗体価を示
し、双方の抗血清が血清型１、５ｂ及び９の溶血素の中
和を示した。

【００９２】Ａｐｐ血清型１の溶血素に対して調製され
た異なる４つのＭＡｂは、血清型１及び５ｂの溶血素の
双方に対してＥｌｉｓａで高い抗体価を示したが、溶血
活性の中和は全く観察されなかった。試験した全部のＡ
ｐｐ血清型１の抗血清（回復期ブタ血清、超免疫ウサギ
血清及びＭＡｂ）は、ウェスターン法で、精製血清型１
及び５ｂの溶血素中の１０５ｋＤのバンド及び全部のＡ
ｐｐ血清型（１〜１２）の粗溶血素調製物中の１０５ｋ
Ｄのバンドと反応した。例えば図７は、粗溶血素調製物
及び精製Ａｐｐ血清型５ｂ溶血素とＭＡｂの１つとのウ
ェスターンブロットを示す。

【００９３】（１）１０５ｋＤの不安定溶血素は、能動
感染においても抗原性であり、精製溶血素で免疫感作し
た後にも抗原性である、（２）抗溶血素抗体は、記載の
アッセイで試験したときに溶血活性を示さない菌株を含
むすべてのＡｐｐ血清型（１〜１２）によって産生され
た同様の１０５ｋＤ抗原と交差反応する、（３）誘発さ
れた抗体は、溶血性血清型に由来の１０５ｋＤ抗原によ
って誘発されたものである限りは、種々の血清型の溶血
活性の交差中和を示す、という結論が得られた。ＭＡｂ
が溶血活性に関与しないエピトープを認識することは明
らかである。

【００９４】前述のごとく、４℃以上の温度で精製溶血
素を保存すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの見掛け分子量が
１０５ｋＤから６５ｋＤまで逐次減少した。表２に示す
ように１０５ｋＤの溶血素に対して誘発された抗血清は
、ウェスターン法では、見掛け分子量の減少した（デー
タ示さず）熟成溶血素調製物と反応した。ウサギの免疫
感作後の熟成調製物の抗原性を表３に示す。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでの見掛け分子量が減少した熟成溶血素は、Ａｐ
ｐ血清型１及び５ｂのもとの１０５ｋＤ溶血素と反応性
の抗体を産生するという結論が得られた。抗体価がある
程度減少することは観察されたが、６５ｋＤの熟成溶血
素調製物で免疫感作すると極めて高い抗体価をもつ抗血
清が産生した。これらの抗血清はまた、溶血活性の中和
を示した。

【００９５】

【００９６】

【００９７】実施例３ ブタのワクチン接種によるＡｐｐ攻撃に対する防御方法 ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ　　６５超音波ネブライザー（Ｄｅ
Ｖｉｌｂｉｓｓ　　Ｃｏ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ
，　　Ｕ．Ｓ．Ａ．）でエアゾールを噴霧することによ
ってブタをＡｐｐで攻撃した。このネブライザーの使用
は、Ａｐｐの病原論の研究及びより詳細にはワクチンの
評価のために、Ｓｅｂｕｎｙａ他（Ｃａｎ．Ｊ．　　Ｃ
ｏｍｐ．　　Ｍｅｄ．　　４７，　　４８〜５３；１９
８３）によって推奨されている。

【００９８】血清型１及び５ａのＡｐｐ基準株で攻撃し
た（表１）。０．０１％のＮＡＤを補充したブレインハ
ートインフュージョンブロスまたは１％のＩｓｏＶｉｔ
ａｌｅＸ（商標）及び０．０１％のＮＡＤを補充したＣ
ｏ１ｕｍｂｉａブイヨン中で細菌を約６時間増殖させ、
遠心によって収集し、生理食塩水に所望濃度まで再懸濁
させた。チョコレート寒天プレートで生菌数をカウント
した。

【００９９】マイナス圧力下で動物を攻撃し、ＳＰＦ条
件下に空調室に収容した。

【０１００】攻撃のために、約５０ｍｌの細菌懸濁液を
１５分間噴霧した。抗原投与室の外部にネブライザーを
置き、そのエアゾール室を床上約１．５０ｍの多孔管に
壁を介して接続した。１つの実験では、ワクチン接種し
た全部の動物及び対照動物を同じ抗原投与室で一緒に攻
撃した。攻撃後に動物を２週間観察した。攻撃の２週間
後にブタの死亡数及び生存数を検査し、病巣を死後観察
した。Ａｐｐに罹患した典型的な肺病巣、出血性壊死線
維素性胸膜肺炎を肺の患部の％に基づいて０〜４の段階
で評価した。：０＝病巣無し；１＝患部＜２５％；２＝
２５％＜患部＜５０％；３＝５０％＜患部＜７５％；４
＝患部＞７５％。

【０１０１】種々の産地のブタを実験に用い、種々の齢
（ａｇｅ）に種々のワクチンを種々の抗原量でワクチン
接種し、血清型１及び５ａのＡｐｐ菌で攻撃した。どの
ワクチンも各２ｍｌの薬用量を頸部から筋肉内投与した
。１回目のワクチン接種と２回目のワクチン接種との間
を６週間あけ、２回目のワクチン接種の２週間後にブタ
を攻撃した。ワクチン中の抗原量は精製調製物の総タン
パク質含量に基づいて計算した。

【０１０２】抗原は実施例１．１に記載のごとく精製さ
れた４２ｋＤの外層膜タンパク質（ＯＭＰ）調製物、実
施例２．２に記載のごとく精製された溶血素（Ｈｌｙ）
、または、種々の血清型の不活化Ａｐｐ菌を含有する２
つの市販ワクチンであった。これらのバクテリンを製造
業者の指示通りに投与した。各実験の詳細は結果の項で
説明する。

【０１０３】結果 実験１（表４）から、２つの市販バクテリンは、攻撃菌
株（Ａｐｐ）と同じ血清型の不活化細菌を含有していた
が、攻撃に対する防御を誘発しなかったと結論できる。

【０１０４】実験２（表５）では、いずれもＡｐｐ血清
型１から精製した溶血素と４２ｋＤＯＭＰ調製物との組
み合わせワクチンでブタをワクチン接種すると、致死率
及びＡｐｐ肺病巣に双方に関してＡｐｐ　　５ａの攻撃
に対するほとんど完全な防御が観察されることが判明し
た。この場合の肺病巣の平均スコア０．３は、解剖所見
で１頭のブタに小さいＡｐｐ肺結節が観察されただけで
あることを意味する。

【０１０５】実験３（表６）では、極めて若いブタに、
Ａｐｐ血清型５ｂから精製された溶血素と血清型１から
精製された４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製物との組み合わせワ
クチンを種々の用量で接種し、次いでＡｐｐ血清型１で
攻撃した。対照動物に比較して、種々の抗原量でワクチ
ン接種したすべてのブタは、Ａｐｐ感染による死亡率に
関してもＡｐｐ肺病巣に関しても完全に防御した。

【０１０６】実験４（表７）は、ブタの産地及び状態が
違う以外は実験３と極めて類似している。実験３ではワ
クチン抗原に対する母系抗体をもたないＳＰＦブタを使
用したが、実験４ではワクチン成分に対して高い抗体価
をもつ母親から生まれたブタを使用した。５週齢でワク
チン接種する時点で、ブタは、双方のワクチン成分、即
ち溶血素及び４２ｋＤ　　ＯＭＰに対して１：１００〜
１：１，０００のＥｌｉｓａ抗体価を有していた。母系
抗体をもつブタを用いたこの実験でも、溶血素と４２ｋ
Ｄ　　ＯＭＰ調製物との組み合わせワクチンの接種は、
Ａｐｐ血清型１による攻撃を防御した。

【０１０７】これらのワクチン接種実験から、溶血素と
４２ｋＤ　　ＯＭＰ調製物との組み合わせでブタにワク
チン接種すると、Ａｐｐ攻撃の完全な防御を誘発すると
いう結論が得られた。防御は、同種Ａｐｐ血清型（攻撃
用Ａｐｐ血清型と同じ血清型から精製された抗原）だけ
でなく異種Ａｐｐ血清型（攻撃用Ａｐｐ血清型とは異な
るＡｐｐ血清型から精製された抗原）に対しても有効で
あった。

【０１０８】

【０１０９】Ａｐｐ血清型１、２、３、４、６及び８の
細菌を含むＰｌｅｕｒｏｖａｃ（Ｂｌｏｘｈａｍ　　Ｖ
ｅｔｅｒｉｎａｒｙ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｌｔｄ．
，　　Ｉｒｅｌａｎｄ）。

【０１１０】ｃ）攻撃用懸濁液中の生菌数：１×１０９
／ｍｌ ｄ）肺の患部％に基いて０〜４の段階で評価したＡｐｐ
肺病巣の程度：０＝病巣無し；１＝１〜２５％、２＝２
６〜５０％、３＝５１〜７５％、４＝＞７５％。

【０１１１】

【０１１２】

【０１１３】実施例４ １．Ａｐｐ菌株の細胞障害活性 方法 細胞障害性試験のために、Ａｐｐ培養上清をブタ肺胞マ
クロファージと共にインキュベートした。０．０１Ｍの
ＥＤＴＡと２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，　　ｐＨ７．４とを
補充したＨａｎｋの平衡塩溶液（Ｆｌｏｗ）でブタの肺
を洗って肺胞マクロファージを単離した。ＥＤＴＡを含
まない同じ溶液で細胞を３回洗浄し、最後に遠心した後
に、細胞を１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充
したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｆｌｏｗ）に懸濁させ、最
終濃度２×１０６／ｍｌに調整した。円形ガラスカバー
スリップ（直径１２ｍｍ；Ｔａｍｓｏｎ）を付けた組織
培養プレート（２４ウェル；Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェル
に最終細胞懸濁液を０．５ｍｌ／ウェルで接種し、５％
ＣＯ２雰囲気中で３７℃で２時間マクロファージを付着
させた。引き続いて、プレートを無血清ＲＰＭＩ１６４
０培地で３回洗浄した。０．０１％のβ−ＮＡＤ（Ｓｉ
ｇｍａ）を補充したＣｏｌｕｍｂｉａブイヨン（Ｄｉｆ
ｃｏ）中で、対数増殖期の後半期まで３７℃で４〜６時
間細菌を増殖させた。遠心によって細菌を除去し、マク
ロファージを付着させた組織培養プレートのウェルに上
清を０．５ｍｌ／ウェルで添加した。３７℃で２時間イ
ンキュベーション後に、マクロファージが付着したカバ
ースリップをＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し、上下を反
転させ、０．０５％のＴｒｙｐａｎ　　Ｂｌｕｅ（Ｍｅ
ｒｃｋ）を含む２０μｌのＰＢＳを滴下したガラススラ
イドに密着させた。トリパンブルーを吸収して青色に染
色された死細胞のパーセンテージを位相差顕微鏡で観察
した。陰性対照はＣｏｌｕｍｂｉａブイヨンでインキュ
ベートされたマクロファージから構成した。

【０１１４】結果 表８に示すように、全部のＡｐｐ基準株が肺胞マクロフ
ァージに対して細胞障害性であり、これは細菌によって
分泌された活性である。陰性対照はマクロファージに対
して１０％以下の細胞障害性を示した。

【０１１５】溶血性菌株の細胞障害性は、実施例２に記
載の溶血素に起因すると考えることができるが、非溶血
性菌株は別の毒性分子を産生しているのであろう。溶血
活性と対照的に、補充ＣａＣｌ２を存在させずに細菌を
増殖させるときにもマクロファージ毒性が発現した。

【０１１６】

【０１１７】２．Ａｐｐマクロファージ毒素（Ｍａｔ）
の精製及びキャラクタリゼーション 方法 マクロファージ毒性活性のＡｐｐ血清型２を精製するた
めに、実施例２の非溶血性菌株を、０．０１％のＮＡＤ
を補充したＣｏｌｕｍｂｉａブイヨン中で３７℃で約６
時間増殖させた。遠心によって細菌を除去し、分子量カ
ットオフ３００，０００のフィルターで限外濾過して培
養上清を濃縮し、濃縮物を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　Ｃ
Ｌ４Ｂカラムで溶出させる段階を含む実施例２．２の溶
血素精製とほぼ同じ手順で更に精製した。最初に溶出し
たピークは毒性活性を含んでいた。活性または抗原を損
失させずに０．４５μｍの酢酸セルロースフィルター（
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で毒素を濾過することが可能であ
った。

【０１１８】培養上清の硫酸アンモニウム沈殿によって
全部の血清型から粗Ｍａｔ調製物を調製した。特に注釈
がなければ全部の調製物を−７０℃または−２０℃で保
存した。

【０１１９】Ｍａｔの熱感受性、プロテイナーゼＫ感受
性及び安定性を実施例２．２の溶血素試験と同様に試験
した。Ｌａｅｍｍｌｉの方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行な
った。

【０１２０】上記のごとく調製したＭａｔ調製物を電気
泳動及びｅｌｅｃｔｏｂｌｏｔｔｉｎｇで処理して得ら
れたサンプルのＮ−末端アミノ酸を分析した。

【０１２１】簡単に説明すると、Ｌａｅｍｍｌｉ系（Ｎ
ａｔｕｒｅ　　２２７，　　前出）に使用されたランニ
ングゲルバッファによってＰＡＧＥゲルを調製した。電
気泳動後のタンパク質を、１０ｍＭのＣＡＰＳ，ｐＨ９
〜１１／１０％メタノールを転移バッファとして使用し
ＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（登録商標）、Ｗａ
ｔｅｒ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロットした。

【０１２２】ブロットに由来のタンパク質を、ＰＴＨ−
アミノ酸の逐次遊離を同定するＨＰＬＣ（Ｍｏｄｅｌ　
　１２０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）にオンライン接続された全自動シークエネータ（パル
ス−液体、Ｍｏｄｅｌ４７７Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたエドマン分解によって配
列解析した。

【０１２３】結果 上記手順で血清型２基準株から精製されたマクロファー
ジ毒素（Ｍａｔ）は、２〜３日以内に４℃で精製する限
り毒性活性を示した。血清型２基準株は実施例２に記載
のごとく不活性溶血素を産生するので、１２０ｋＤのバ
ンドはＭａｔを示すと考えられる。

【０１２４】粗Ｍａｔ調製物の評価によれば、血清型２
、３、４、６及び８の上清はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて
同様の１２０ｋＤのバンドを示した。血清型１０の培養
上清は、１２０ｋＤよりもやや高い場所にバンドを示し
た（表８）。いくつかの血清型２及び５のフィールド単
離物においても同様の１２０ｋＤのバンドが観察された
。

【０１２５】Ｍａｔ調製物を６０℃以上の温度で１５分
間処理するかまたはプロテイナーゼＫによって処理した
後にマクロファージ毒性は完全に消滅していた。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ中の１２０ｋＤのタンパク質は−２０℃での
保存に安定であるが、４℃で３箇月保存後にはＳＤＳ−
ＰＡＧＥの１２０ｋＤバンドが分解していた。

【０１２６】ＭａｔのＮ末端アミノ酸配列解析によって
、以下のアミノ酸配列：Ｓｅｒ（？）−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔが判明した。（？）は推定ア
ミノ酸を示す。

【０１２７】３．マクロファージ毒素（Ｍａｔ）の抗原
性及び抗血清の交差反応 方法 実施例２．３に記載のごとき回復期ブタ血清を使用した
。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するハイブリド
ーマ細胞系を標準法で調製した。ＥｌｉｓａにおいてＡ
ｐｐ血清型２に由来の精製Ｍａｔとの反応性を示すが血
清型１または５ｂの精製Ａｐｐ溶血素との反応性を示さ
ないＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングによっ
て選択した。

【０１２８】前述のごときウェスターン法を実施した。 ＭＡｔ活性の中和を試験するために、等容のＡｐｐ培養
上清を抗血清希釈物に添加し、次いで３７℃で３０分間
インキュベートした後に、実施例４．１に記載のごとく
毒性試験を行なった。

【０１２９】結果 Ａｐｐ血清型２に感染して生き残ったブタの回復期血清
はウェスターン法でＭａｔ調製物の１２０ｋＤのバンド
を認識したが、Ａｐｐ血清型１、５ａ及び９に感染した
ブタの血清は認識しなかった。回復期Ａｐｐ血清型２血
清はＭａｔ活性も中和した。

【０１３０】ＭＡｂ　　Ｉｎｔ　　３３−８はＭａｔ活
性を中和し、ウェスターン法で血清型２、３、４、６及
び８の粗Ｍａｔ調製物の１２０ｋＤのバンドと交差反応
したが、その他の（基準）血清型の粗Ｍａｔ調製物とは
交差反応しなかった（図８）。

【０１３１】血清型２のフィールド単離物及びいくつか
の血清型５のフィールド単離物の粗Ｍａｔ調製物も１２
０ｋＤバンドと反応することが観察された。　　ＭＡｂ
　　Ｉｎｔ　　３３−４はウェスターン法で、血清型２
の調製物の１２０ｋＤバンドとだけ反応しその他の血清
型に由来の調製物とは反応しなかった。

【０１３２】前述のごとく、精製Ｍａｔを４℃で３箇月
保存すると、ＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１２０ｋＤ
バンドの分解が観察された。しかしながら、かかる熟成
調製物はウェスターン法で約７０〜８０ｋＤにＭＡｂ　
　Ｉｎｔ　　３３−８と反応性のバンドを示した。

【０１３３】実施例５ 三価ワクチンのワクチン接種によるＡｐｐ攻撃に対する
ブタの防御 方法 実施例３に記載の攻撃手順を用いた。１つの実験では（
ｎｏ．８）、１０６の生菌を含む１ｍｌの６時間培養物
をブタに鼻孔内投与して攻撃を行なった。使用した攻撃
菌株は、Ａｐｐ血清型１基準株または血清型２もしくは
９のＡｐｐフィールド単離物であった。

【０１３４】実施例３に記載の手順でワクチン接種した
。ワクチンに含ませる抗原量は、精製調製物の総タンパ
ク質含量に基づいて計算した。抗原は実施例１．１に記
載のごとく精製した４２ｋＤの外層膜タンパク質（ＯＭ
Ｐ）、実施例２．２に記載のごとく精製した１０５ｋＤ
の溶血素（Ｈｌｙ）及び実施例４．２に記載のごとく精
製した１２０ｋＤのマクロファージ毒素（Ｍａｔ）であ
った。

【０１３５】各実験の詳細は結果の項で説明する。

【０１３６】結果 実験５（表９）では、実施例３でも使用した１０５ｋＤ
溶血素と４２ｋＤ　　ＯＭＰとを含む二価ワクチンによ
るＡｐｐ血清型２の攻撃に対する防御を試験した。この
表に示すように、ワクチンは病変に対してある程度の防
御を誘発したが、血清型２の攻撃を完全には防御しなか
った。従って、Ａｐｐ血清型２に対する完全な防御を得
るためには、ワクチンが追加成分、例えば実施例４に記
載のごとき１２０ｋＤマクロファージ毒素を含んでいな
ければならないと結論できる。

【０１３７】実験６（表１０）において、血清型２から
精製された１２０ｋＤマクロファージ毒素（Ｍａｔ）と
血清型１から精製された４２ｋＤ　　ＯＭＰとを含むワ
クチン、または血清型２から精製された１２０ｋＤ　　
Ｍａｔと、血清型１から精製された４２ｋＤ　　ＯＭＰ
と血清型５ｂから精製された１０５ｋＤ溶血素（Ｈｌｙ
）とを含むワクチンをブタに接種した。１２０ｋＤのＭ
ａｔと４２ｋＤのＯＭＰとを含有する二価ワクチンは、
Ａｐｐ血清型１で攻撃後の病変を防御しなかった。ワク
チンがＡｐｐ血清型１の感染防御のために１０５ｋＤの
溶血素を含む必要があること、及び、攻撃に使用された
Ａｐｐ血清型１菌株が１２０ｋＤのＭａｔを発現しなか
ったことは実施例３から判明していたので、この防御の
欠如は予想されていた。

【０１３８】意外にも血清型５ｂ細胞から精製された１
０５ｋＤのＨｌｙを二価ワクチンに添加すると、Ａｐｐ
血清型１の攻撃に対する十分な防御が誘発された。

【０１３９】実験７（表１１）では、実験６と同じ二価
及び三価のワクチンによるＡｐｐ血清型２の攻撃に対す
る防御を試験した。表に示すように、双方のワクチンは
死亡率及び肺病変に関してはＡｐｐ血清型２の攻撃に対
して十分な防御を示した。従って、二価の１０５ｋＤ　
　Ｈｌｙ／４２ｋＤ　　ＯＭＰワクチンに１２０ｋＤ　
　Ｍａｔを添加すると、ワクチンがＡｐｐ血清型２も防
御し得ることが判明する。

【０１４０】実験８（表１２）では、１２０ｋＤ　　Ｍ
ａｔ、４２ｋＤ　　ＯＭＰ及び１０５ｋＤ　　Ｈｌｙを
含む実験７で使用したものと同じ三価ワクチンがＡｐｐ
血清型９の菌株による完全異種攻撃に対してもブタを防
御することが判明した。

【０１４１】

【０１４２】

【０１４３】

【０１４４】

【図面の簡単な説明】

【図１】４２ｋＤに富むＯＭＰ調製物を流したＳＤＳ／
ＰＡＧＥゲルのスキャン。

【図２】プロテイナーゼＫ処理したＯＭＰ調製物と回復
期ブタ血清とのウェスターンブロットである。レーン１
及び４：粗ＯＭＰ；レーン２，３，５及び６：精製ＯＭ
Ｐ；レーン１〜３：偽処理；レーン４〜６：プロテイナ
ーゼＫ処理。

【図３】細菌溶解物とワクチン接種後血清とのウェスタ
ーンブロット。

【図４】精製溶血素（Ｂ）及びマーカータンパク質を夫
々流したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャン。

【図５】Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ−１０００カラムを
用いた溶血素の溶出プロフィル。

【図６】マーカータンパク質（Ａ）及び−２０℃または
３７℃で保存した精製溶血素（Ｂ）のゲルスキャン。

【図７】粗溶血素調製物及び精製Ａｐｐ血清型５ｂ溶血
素（＊）とＡｐｐ血清型１溶血素に対して感作されたモ
ノクローナル抗体とのウェスターンブロット。

【図８】粗Ｍａｔ調製物とＡｐｐ血清型２のＭａｔに対
して感作されたモノクローナル抗体とのウェスターンブ
ロット。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約４２ｋ
   Ｄの主要抗原性タンパク質成分を有するブタ肺疫アクチ
   ノバチルス菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕ
   ｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の外層膜タンパク質調製物
   と、 １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１０５ｋＤのＡ．ｐｌｅｕｒ
   ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの溶血素と、 ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１２０ｋＤのＡ．ｐｌｅｕｒ
   ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのマクロファージ毒素とから成
   るグループから選択された少なくとも１種の毒素とから
   得られることを特徴とする本質的にＡ．ｐｌｅｕｒｏｐ
   ｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞非含有のブタ肺疫アクチノバチ
   ルス菌の感染防御用ワクチン組成物。
2. 【請求項２】　　ワクチンが外層膜タンパク質調製物、
   溶血素及びマクロファージ毒素から得られることを特徴
   とする請求項１に記載のワクチン。
3. 【請求項３】　　ワクチンが血清型１、５ａ、５ｂ、９
   、１０または１１の細胞の溶血素から得られることを特
   徴とする請求項１または２に記載のワクチン。
4. 【請求項４】　　ワクチンが血清型２、３、４、６また
   は８の細胞のマクロファージ毒素から得られることを特
   徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のワクチ
   ン。
5. 【請求項５】　　ワクチンが血清型１の細胞の外層膜タ
   ンパク質調製物、血清型５ｂの細胞の溶血素及び血清型
   ２の細胞のマクロファージ毒素から得られることを特徴
   とする請求項２に記載のワクチン。
6. 【請求項６】　　更に、その他のブタ病原体の抗原性物
   質を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一
   項に記載のワクチン。
7. 【請求項７】　　ブタ病原体が偽狂犬病ウイルスまたは
   ブタインフルエンザウイルスであることを特徴とする請
   求項６に記載のワクチン。
8. 【請求項８】　　ワクチンがアジュバントを含むことを
   特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のワク
   チン。
9. 【請求項９】　　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約４２ｋ
   Ｄの主要抗原性タンパク質成分を有するＡ．ｐｌｅｕｒ
   ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの外層膜タンパク質調製物と、
   １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１０５ｋＤのＡ．ｐｌｅｕｒ
   ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの溶血素と、 ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１２０ｋＤのＡ．ｐｌｅｕｒ
   ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのマクロファージ毒素とから成
   るグループから選択された少なくとも１種の毒素とに由
   来するＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原性
   物質を混合して免疫活性を有する組成物を得ることを特
   徴とする本質的にＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ
   ｅ細胞非含有のブタ肺疫アクチノバチルス菌の感染防御
   用ワクチン組成物の製造方法。
10. 【請求項１０】　　請求項１から８のいずれかに記載の
    ワクチンを動物に投与することを特徴とするブタ肺疫ア
    クチノバチルス菌の感染防御方法。