KR20060118629A - 나이제리아 고노리아 또는 나이제리아 메닌지티디스에 대한재조합 필린을 함유한 백신 - Google Patents

나이제리아 고노리아 또는 나이제리아 메닌지티디스에 대한재조합 필린을 함유한 백신 Download PDF

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토마스 엔. 3세 메트카프
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Abstract

나이제리아 고노리아 및 나이제리아 메닌지티디스 각각의 pilE 유전자가 클로닝되고 이의 대응되는 재조합 필린 단백질이 발현되었다. 부가적으로, 키메라 pilE 유전자는 필린 단백질의 아미노-말단 영역을 암호화 하는 나이제리아 메닌지티디스 부류 I의 pilE 유전자 영역이 나이제리아 고노리아의 pilE 유전자의 대응 영역으로 대체되게끔 작제된다. 재조합 수막구균 키메라 부류 I 필린 단백질은 나이제리아 메닌지티디스의 충분한 길이의 pilE 유전자에 의해 발현된 필린 단백질보다 높은 수준으로 발현된다. 또한, 키메라 pilE 유전자는 필린 단백질의 카복시-말단 영역을 암호화하는 나이제리아 메닌지티디스 부류 II의 pilE 유전자 영역이 나이제리아 고노리아의 pilE 유전자의 대응 영역으로 대체되게끔 작제된다. 재조합 필린 단백질은 나이제리아 고노리아 또는 나이제리아 메닌지티디스에 의해 야기된 질환으로부터 보호하기 위한 백신에 사용된다.
나이제리아 고노리아 또는 나이제리아 메닌지티디스에 대항한 재조합 필린을 함유한 백신

Description

나이제리아 고노리아 또는 나이제리아 메닌지티디스에 대한 재조합 필린을 함유한 백신{VACCINES CONTAINING RECOMBINANT PILIN AGAINST NEISSERIA GONORRHOEAE OR NEISSERIA MENINGITIDIS}
도 1은 (균주 Pgh3-1)의 임균 r필린에 대한 기니아 피그 항혈청을 배양한데 이어(15분간 1:50 희석), 12 nm 콜로이드 골드에 접합된 보조 항-기니아 피그 IgG를 배양(30분간 1:5 희석)한 다음 NanoVan으로 염색된 엔.고노리아(균주 I756 recA-)의 필리 달린 세포의 투과 전자 현미경 사진을 도시한다. 도 1a는 항-r필린 기니아 피그 면역 혈청(주 6)을 나타내고; 도 1b는 정상 기니아 피그 혈청(주 0)을 나타내며; 도 1c는 무 1차 항체를 나타낸다.
도 2는 인간 경부 세포(ME180 세포주)로 필리 달린 엔.고노리아 세포(균주 I756 recA-)의 부착시 (균주 Pgh3-1의) 임균 r필린에 대한 기니아 피그 항혈청의 효과를 도시한다. 도 2a는 r필린에 대한 기니아 피그 항혈청에 의한 부착 저해를 도시하고(주 6); 도 2b는 경부 세포로 필리 달린 임균 세포의 부착을 막기위한 정상 기니아 피그 항혈청의 무능을 도시한다(주 0). 경부 세포로 부착된 대표적 크기의 박테리아 덩어리는 각 패널에서 동그라미 쳐져있다. 각 패널은 동일한 실험 조건의 4가지 상이한 관점을 보여준다. 기니아 피그 항혈청은 각 패널당 1:10,000으로 희석된다.
도 3은 (균주 H44/76)의 수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 기니아 피그 항혈청을 배양한데 이어(30분간 1:60 희석), 12 nm 콜로이드 골드에 접합된 보조 항-기니아 피그 IgG를 배양(30분간 1:5 희석)한 다음 NanoVan으로 염색된 엔.메닌지티디스(균주 H355)의 필리 달린 세포의 투과 전자 현미경 사진을 도시한다. 도 3a는 항-r필린 기니아 피그 면역 혈청(주 6)을 나타내고; 도 3b는 정상 기니아 피그 혈청(주 0)을 나타내며; 도 3c는 무 1차 항체를 나타낸다. 세포는 항혈청으로 배양하기 이전에 고정된다.
본 발명은 나이제리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae) 또는 나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)에 의해 야기된 질환으로부터 보호를 위한 백신내의 재조합 필린 단백질의 사용에 관한 것이다.
나이제리아 고노리아(엔. 고노리아) 및 나이제리아 메닌지티디스(엔. 메닌지티디스)는 그램-음성 구균이다. 엔. 고노리아 및 엔.메닌지티디스는 일반적으로 매우 밀접히 연관되지만, 이들이 야기하는 질환의 임상 징후는 매우 상이하다. 엔.고노리아는 임질을 야기하지만, 엔.메닌지티디스는 수막염을 야기한다. 이들 나이제리아 종 박테리아는 신체의 점막 표면에서 기생한다.
타입 IV 필리는 다수의 그램-음성 박테리아, 예를 들면 디켈로박터(예전에는 박테로이드) 노도우스(Dichelobacter nodous), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 킨겔라 데니트리피칸스(Kingella denitrificans), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 엠. 라쿠나타(M. lacunata), 엠. 논리쿼파시엔스(M. nonliquefaciens), 엔. 고노리아, 엔.메닌지티디스, 및 슈도모나스 에루지노자(Pseudomonas aeruginosa)(Bibliography Entries 1,2)의 표면상의 비-플라겔라성 털모양 구조이다. 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)의 독소 공-조절된 필리 및 장내병원균 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)의 다발 형성 필리는 타입 IV 필리와 제한된 수의 유사점을 나타내어 다소 먼 친척 관계로 간주된다 (1,2). 엔.고노리아 및 엔.메닌지티디스의 경우, 필리 달린 박테리아가 필리가 없는 세포보다 좀더 많이 인간 기원의 다양한 내피 세포로 부착되는 것으로 보아 필리는 유기체를 점막 감염 부위에 고정함으로써 독성 인자로 작용하는 것으로 여겨진다.
타입 IV 필리는 폭이 5-7 nM이고 길이는 5 μM 이하이다. 필린 단백질 서브유닛은 탠덤으로 연결되어 길고도 얇은 폴리머를 형성한다. 병원성 나이제리아의 경우, 필리는 분명 호모폴리머성으로, 이는 단일 구조 서브유닛, 즉 필린 단백질로 구성된다. 필린 단백질은 13,000 내지 22,000 달톤의 분자량을 가진다(1,2,3).
본래, 필린 단백질은 박테리아 외막에 대략 107 달톤의 분자량을 지닌 필러스(복수:필리)로 불리는 나선형 구조로 결집된다. 정제된 필리가 pH 12 포스페이트 완충액을 이용하여 투석될 때, 온전한 필리는 필린 올리고머로 불리는 필린 단백질 덩어리로 비가역적으로 해리된다 (4). 이들 필린 올리고머 덩어리(대략 600,000 달톤의 분자량)는 온전한 필러스보다 크기면에서 작다.
엔.고노리아는 Schoolnik와 그의 동료에 의해 최초 분리되어 서열분석된 단일 필린 단백질을 발현시킨다 (5). 임균 필린 단백질은 세 영역: (a) 고도로 보존된 아미노 말단 영역(잔기 1-53); (b) 제한된 양의 서열 변이를 나타내는 중간 1/3 영역(잔기 54-124) 및 (c) 고도로 다양한 디설파이드 루프를 함유한 단백질의 카복시 1/3 영역(잔기 125-160)으로 구성된다.
자연 감염과정 동안, 필리는 높은 빈도 상(high frequency phase)과 항원성 변이를 겪는다(3.6). 이들 변이의 유전학은 특이하게도 복잡하고 광범위하게 연구되어왔다. 나이제리아 고노리아의 각 균주는 필린 단백질의 1차 아미노산 서열을 변화시키는 능력, 및 이로인한 필리의 항원성을 가진다. 이러한 변이를 담당하는 분자 메카니즘은 발현 위치(pilE)와, 다수(17-19)의, 무프로모터, 침묵(pilS) 유전자간의 비상호 재조합을 수반한다(6). 필린 서열 (또는 이의 일부)은 pisS 위치에서 발현 위치로 이동하여 새로운 필린 변종을 일으킴에 따라, 임균이 극도의 다수의 필린 단백질을 발현시킬 수 있다.
엔.고노리아와는 달리, 엔.메닌지티디스는 부류 I과 부류 II로 불리는 두 개의 다른 필린 부류를 발현시킨다. 임균에서처럼, 수막구균 부류 I 필리는 항원성의 상 변이를 겪는다(3). 부류 I 필린은 분자량(17-20 kd) 및 임균 필린상의 고도로 보존된 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체(SM1)와의 반응성 측면에서 임균 필린과 유사한 것으로 나타났다(3). 다수의 부류 I 필린이 클로닝되었고 아미노산 서열은 임균 필린의 서열과 고도의 유사성을 가지는 것으로 나타났다(7). 반면, 부류 II 필린은 SM1 항체와 반응하지 않고 보다 낮은 분자량(13-16 kd)을 가진다. 부류 II 필린을 발현시키는 다수의 균주가 임균 필리에 대한 폴리클로날 항혈청과 반응하는 것으로 나타났다(3). Aho 등(7)은 최근에 부류 II 필린의 서열을 결정지었다. 나이제리아 필린의 초기 1/3 영역은 본질적으로 일치한다. 부류 II 필린 단백질은 다량의 결실이 발생된 단백질의 과가변 영역에서 부류 I 필린 및 임균 필린 단백질과 상이하다. Achtman 등(8)은 부류 I 또는 부류 II 필린에 특이한 모노클로날 항체를 이용하여 아프리카로부터의 몇몇 혈청그룹 A 분리균이 두 항체 모두와 결합함을 입증해 보였다. 부류 II 필리를 발현시키는 균주도 끝이 잘린, 침묵 부류 I 필린 유전자를 가짐을 입증했다(7). 또한, 이들 데이터는 단일 수막구균 세포가 두 필린 단백질을 동시에 발현시킬 가능성을 제시한다.
필리가 점막 세포와의 초기 접촉을 매개하는 것으로 여겨지기 때문에, 필리가 달린 박테리아에 의해 야기된 질환을 예방하기 위해 백신 항원으로서 이들 구조를 이용함이 상당한 관심사가 되고 있다. 여행자 설사 및 임질에 대한 필리 백신은 인간에게서 시험되어왔다(9). 그러나, 지금까지, 이는 상동 균주에 대해서만 효과가 있었다. 다수의 필리계 백신은 소에서 감염성 각결막염(홍안병)(1), 양에서 부제증(1,10) 및 피그레트(9) 또는 송아지(9)에서 설사와 같은 가금류를 감염시키는 질환의 경우에 보고되어왔다. 이들 각각의 수의 예에서, 필리 백신은 이질성 필리가 아닌 상동성 필리를 발현시키는 균주의 공격으로부터 보호를 제공한다.
최초의 임균 백신은 전체 유기체를 함유하고 보호를 거의 또는 전혀 제공하지 않았다(11). 임질에 대한 최근의 백신 개발은 정제된 표면 성분, 특히 필리(9,11) 및 포린 단백질(P.I. 또는 Por)(11)에 초점이 모아졌다. 그러나, 지금까 지 필리만이 공격으로부터 인간을 보호하는 것으로 나타났고, 이는 상동성 균주에 대한 보호에 한정되었다(12). 임균 필리의 변성된 형태(4)는 시험관내에서 이종성 필리와 결합하는 마우스 또는 기니아 피그에서 항체를 생성하는 것으로 나타났다. 그러나, 이는 공업적으로 실행 가능한 접근법으로 간주되지는 않는데 이는 액체 배지에서 필리 달린 임균을 생장시키기가 어렵기 때문이다(공업적 생산의 결여)(1). 초기 인간 공격 연구의 성과를 기초로, 임균 필러스 백신은 대규모, 플라시보-통제된 이중 맹님법 효능 시험에서 시험되었다(12). 이러한 시도에서, 백신은 임균 감염으로부터 남성 지원자를 보호하는 데 실패했다. 이에 대한 가장 가능성 있는 설명은 필러스의 이질성인 것으로 추측된다(12).
실제로, 임균 및 수막구균 필린 단백질의 항원 가변성은 필리계 백신 개발에 있어 주된 장애물로 여러 번 언급되었다(3,13,14,15,16,17). 결집된 온전한 필러스상의 주된 면역 에피토프는 최고의 서열 변이를 나타내는 디설파이드 루프임이 제안되었다(17,18). 이는 엔. 고노리아 균주 Pgh3-2로부터 포르말린-처리된 온전한 필리를 이용한 한국 필드 시험의 실패를 설명해 줄 수 있다(12). 부가적으로, 이 문헌은 정제된 필리, 또는 필린 분획에 대한 항혈청이 변성(웨스턴 블랏)되거나 분리된 나이제리아 필리에 부착되지만, 박테리아 표면상의 이종성 필리에는 부착되지 않는다는 다수의 언급을 포함하고 있다(16,17,19,20). 이것이 항원성 변이인지 결집된 필러스에서 에피토프의 은신인지는 완전히 해결되지 않고 있다. 이는 시험관내에서 기능 활성을 나타내는 모노클로날 항체만이 이종성 필리에 부착되지 않았던 것들이 설명된 다수의 보고서에 의해 강화된다(3). 엠. 보비스(21) 및 디.노도수스 의 온전한 필리의 경우 필리에 의해 유도된 보호 면역 반응이 가능함을 보여주었다(10). 그러나, 이들 백신은 단지 이종성 필리가 아닌 상동성 필리를 발현시키는 박테리아의 공격에 대해 보호할 수 있다(10,21). 과학계의 공통된 의견은 필리계 백신(가능한 경우)이 상동성 필리를 발현시키는 박테리아에 대해서만 보호를 제공하는 것으로 보고 있다.
결집된 필리의 재조합 발현은 다수의 유기체의 경우에 기술되어 있고, 적절한 운반 및 어셈블리 유전자의 존재에 좌우된다(22). 나이제리아에서, 필리 결집과 외부수송에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자가 단일 인접 오페론에서 발견되지 않아, 이러한 접근법은 어렵다. 유럽 특허 202,260 B1에서 선택된 또다른 대안은 여러 타입 IV 필러스의 결집에 필요한 단백질을 이미 보유한 박테리아 숙주; 예, 슈도모나스 에루지노자에서 타입 IV 필린 유전자를 발현시키는 데 있다(23). 그러나 Hoyne 등이 보고한 바에 따르면, 슈도모나스의 외막에서 임균 필리의 발현 및 결집이 불안정하다(24). 재조합 균주가 선택성 항생물질의 존재하에 액체 배지에서 증식하는 경우, 야생형의 필리 달린 슈도모나스가 과증식된다. 저자는:
"숙주 균주에서 외래 mePhe [N-메틸페닐알라닌] 필러스 생산의 적합성은 숙주 및 공여체 필러스 결집 시스템의 다양성 정도에 좌우될 것이다. 임균 필린을 발현시키는 PAK/2PfS[슈도모나스 에루지노자 균주 K/2PfS]의 관찰된 불안정성은 ... mePhe 필리의 종간 발현의 한계가 이러한 예에서 접근됨을 나타낼 수도 있다"(24)라 하였다.
이러한 결과, 슈도모나스에서 임균 필리의 발현은 공업적으로 실행 가능한 접근법으로는 비춰지지 않는다.
엘만, 에게르톤 및 그들의 동료는 디켈로박터 노도수스의 온전한 필리를 이용하여 양 부제증에 대한 백신 개발에 관해 기재하고 있다. 필드 시험은 온전한 필리가 상동성 필리를 발현시키는 디.노도수스 균주로부터 보호됨을 보여준다. 이는 공업용 백신이 포괄적인 보호를 달성하기 위해 8 또는 9개의 다른 필리를 함유할 필요가 있음을 의미한다. 이러한 실행 가능한 접근법의 시도에서, 디.노도수스의 필린 유전자가 클로닝되어 이.콜라이에서 발현되었다(25). 재조합 필린 단백질은 내막과 결합되는 것으로 밝혀졌다. 재조합 필린을 발현시키는 초음파 처리된 이.콜라이 세포로 구성된 백신을 투여 실험에서 시험할 경우, 재조합 이.콜라이 세포가 정제된 네이티브 필리의 경우에 보여진 것과 유사한 항체 역가를 생성시킨다(25). 그러나, 재조합 이.콜라이 세포 백신에 의해 유도된 응집 역가는 온전한 필리의 경우에 보여진 것보다 상당히 낮고(690 대 47,800) 보호와 상관된 역가보다 낮다(5,000-10,000)(25,26).
디.노도수스를 이용한 능동적인 공격 후, 재조합 필린 백신은 온전한 필리의 경우에 보여진 것과는 달리 상당한 보호 활성을 보이지 않았다. Emery 와 그의 동료는 온전한 필리의 변성이 동물에서 보호를 유도하기 위한 필린의 능력을 없애는 것을 입증했다(27). 부가적으로, 세제(옥틸-β-D-글루코시드) 또는 낮은 pH(2.2)를 이용하여 해리된 필리는 공격 후 심각한 상처가 생기지 못하도록 보호를 유도하는 단백질의 효능을 감소시킨다(28). 그럼에도 불구하고 항체 역가는 그룹간에 유의한 차이가 없다. 저자는 "치료에 의해 교란되는 사차 구조를 지닌 1 이상의 에피토프 가 존재할 수 있음"을 언급하였다. 이들은 추가로:
"백신으로서 이.콜라이 발현 산물의 실패는 숙주 세포막에서 물리적 차단으로 인한 것일 수 있지만, 예비 실험은 이것이 무능의 주된 원인이 아님을 지적했다(공개되지 않은 데이터). 백신으로서 이.콜라이 발현 산물의 실패에 대한 다른 설명은 발현되는 모노머성 프리필린 단위가 리더 서열의 존재로 인해 중요한 에피토프의 적절한 제시를 위한 네이티브 형태로 결합될 수 없다는 것이다"(28)라고 했다.
Elleman과 그의 동료들은 재조합 필린상의 형태적 에피토프의 존재의 중요성을 입증했고 이들은 항원의 보다 우수한 제시에 의한 면역 반응을 증가시킬 필요가 있다. 이들은 두가지 접근법을 제안했다: 세포 표면상의 필라멘트성 필리로 결집될 수 있도록 이.콜라이 막 단백질의 정제, 또는 피.에루지노자에서 단백질 발현. 후자의 접근법이 바람직한데 이는 "이 방법이 면역성을 굉장히 증진시키고 단백질의 정제를 단순화시키기" 때문이다 (25).
또한, Elleman과 그의 동료들은 또한 디.노도수스의 성숙 핌브리아(온전한 필리)에 대한 열세한 백신 후보자로서 필린(필리의 서브유닛 단백질)의 사용을 고려했다:
"성숙 핌브리아는 등량의 핌브리아 서브유닛 단백질보다 강하면서도 적절한(즉, K-응집) 면역 반응을 불러일으키는 것 같다. 약 5,000의 혈청학 K-응집 역가는 일반적으로 비. 노도수스 균주의 감염으로부터 적절한 보호 면역성과 동일한 최소 반응으로 간주된다. 이러한 반응 수준 (및 최대값까지)은 혈청 K-응집 항체의 약한 수준을 일으키는 분리된 서브유닛 단백질이 아닌 성숙 핌브리아를 이용한 백신 접종시 쉽게 달성된다" (23).
핌브리아(필러스) 서브유닛 단백질이 실행 가능한 백신 후보자가 아님을 나타내는 부가적인 데이터가 Alves 등에 의해 최근 보고되었다.(29). 이.콜라이 CFA/I 핌브리아 부착 단백질(예, 필린)을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드 백신을 이용해 마우스를 면역화시키면, 유도된 항체는 네이티브, 온전한 CFA/I 핌브리아에 의해 유도된 것과 구별된다. 또한, 재조합 단백질에 대한 이들 항체는 네이티브 단백질에 대한 항혈청과는 달리 응집 활성을 나타내지 않았다.
앞서 기재된 모든 성과에도 불구하고, 효과적인 필러스형 임균 또는 수막구균 백신이 여전히 개발중이다. 수막구균 백신은 혈청형 A, C, Y, W135 캡슐을 가진 것에 한정된다.
이에 따라, 엔.고노리아 또는 엔.메닌지티디스의 모든 혈청형에 의해 야기된 질환으로부터 보호하기 위한 백신내에 포함되는 성분들을 확인할 필요가 있다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 엔.고노리아 및 엔.메닌지티디스 각각에서 유도된 적당한 항원 구조를 확인하는 데 있으며, 이들은 박테리아에 대한 유력한 백신 후보자를 구성할 수 있다. 이들 후보자는 개개 병원성 나이제리아 유기체의 다양한 분리물을 인식하고 이에 결합하는 항체를 유도해야 한다.
이하 논의될 본 발명의 이들 및 기타 목적은 엔.고노리아 및 엔.메닌지티디 스 각각의 재조합 필린 단백질(r필린)의 클로닝 및 발현에 의해 달성된다.
본 발명은 또한 부류 I 수막구균 필린 단백질의 아미노-말단 영역이 임균 필린 단백질의 상응하는 아미노-말단 영역으로 대체되는 재조합 수막구균 키메라 부류 I 필린 단백질을 발현시키는 플라스미드의 작제에 관한 것이다. 이 플라스미드는 완전한 길이의 수막구균 pilE 유전자로부터 발현된 부류 I 수막구균 r필린 단백질보다 상당히 높은 양의 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질을 발현시킨다.
수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질의 발현을 얻기 위해, 키메라 DNA 서열이 우선 적당한 플라스미드 벡터에 삽입된다. 적당한 숙주 세포는 플라스미드로 형질전환되거나 형질감염된다. 본 발명의 양태에서, 숙주 세포는 에쉐리키아 콜라이 균주이다. 숙주 세포는 숙주 세포에 의해 키메라 부류 I r필린 단백질의 발현을 가능케 하는 조건하에 배양된다.
본 발명은 추가로 부류 II 수막구균 필린 단백질의 카복시-말단 영역이 임균 필린 단백질의 상응하는 카복시-말단 영역으로 대체되는 재조합 수막구균 키메라 부류 II 필린 단백질을 발현시키는 플라스미드의 작제에 관한 것이다.
수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질의 발현을 얻기 위해, 키메라 DNA 서열이 우선 적당한 플라스미드 벡터로 삽입된다. 적당한 숙주 세포는 플라스미드로 형질전환되거나 형질감염된다. 본 발명의 양태에서, 숙주 세포는 에쉐리키아 콜라이 균주이다. 숙주 세포는 숙주 세포에 의해 키메라 부류 II r필린 단백질의 발현을 가능케 하는 조건하에 배양된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 분리되어 정제된 r필린 단백질 (임균, 수막구균 또는 키메라)을 사용하여 포유 동물 숙주에서 보호 면역 반응을 유발하는 백신 조성물을 제조한다. 백신 조성물은 보조제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 보조제의 예는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, MPLTM, StimulonTM QS-21, IL-12 및 콜레라 독소를 포함한다. 백신 조성물은 엔.고노리아 또는 엔.메닌지티디스에 의해 야기된 질환으로부터 숙주를 보호하기에 충분한 면역원 양으로 포유동물 숙주에 투여된다.
본 발명은 엔.고노리아 또는 엔.메닌지티디스의 재조합 필린 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 앞서 기재된 업계의 교시에도 불구하고, 이.콜라이에서 발현된 재조합 필린 단백질의 용도를 조사하기로 결정했다. 놀랍게도, 이들 재조합 필린 단백질은 백신 후보자의 특성을 나타내었다.
이.콜라이에서 임균 pilE 유전자의 클로닝을 기술한 최초 보고서는 1982년에 나왔다(30). 그 이후, pilE의 분자적 특성은 필린 단백질의 발현, 필린 단백질의 운반, 필린 서열의 변이 및 필리의 숙주 부착성을 제어하는 유전 인자를 조사하는 다수의 실험에서 수행되었다. 그러나, 어떠한 보고서도 재조합 필린 단백질의 정제와 재조합적으로 발현된 필린 단백질의 면역 반응에 관해서는 기재하고 있지않다.
임균 재조합 필린 단백질을 암호화 하는 pilE 유전자의 클로닝 및 발현은 하기 실시예 2에 기재되어 있다. pilE 유전자를 함유한 플라스미드를 이용하여 TOP10F'로 명명된 이.콜라이 균주를 형질전환시켜 발현을 수행했다. 성공적인 클로 닝 및 발현에 이어 pilE 유전자를 서열 분석하여 네이티브 서열을 지닌 존재를 확인했다. 클로닝을 보조하기 위해, 1 염기를 변형시키는데 필요한 NcoI 부위가 도입되었다. 그 결과, 7개 아미노산의 긴 시그널 펩티드에서 두번째 아미노산을 아스파라긴에서 아스파르트산으로 변화시켰다.
실시예 2에서 pilE 유전자를 함유한 플라스미드(pPX2000으로 명명)는 앰피실린 내성 (AmpR) 마커를 함유한다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 또다른 플라스미드는 AmpR 대신 카나마이신 내성 (KanR) 마커를 함유하도록 작제되었다. pPX2002로 명명된 플라스미드는 이.콜라이 균주 TOP10F'를 형질전환시킨 후 AmpR 마커를 함유한 pPX2000에서 얻어진 것과 유사한 수준으로 임균 r필린을 발현시킨다.
실시예 4에 기재된 바와 같이, 유사한 과정을 이용하여 엔.메닌지티디스의 부류 I pilE 유전자를 함유한 pPX2003으로 명명된 플라스미드를 작제한다. NcoI 부위(CC ATG G)를 시그널 펩티드를 암호화 하는 유전자의 초기를 스패닝하면서 도입한다. 이는 시그널 펩티드의 두번째 아미노산 잔기를 아스파라긴에서 아스파르트산으로 변화시킨다(첫번째 잔기는 메티오닌으로 남음). AmpR 마커도 포함된다. 이 작제물은 이.콜라이 균주 TOP10F'를 형질전환시킨 후 엔.메닌지티디스의 부류 I r필린을 발현시킨다. 그러나, 발현 수준은 pPX2000 또는 pPX2002에서 얻어진 임균 r필린의 경우보다 상당히 낮다. 이론에 구애됨이 없이, 이러한 낮은 발현 수준은 재조합 부류 I pilE에 존재하는 다수의 역 반복부로 인한 것같다.
수막구균 필린의 발현을 증가시키기 위해, 실시예 5에 기재된 바와같이, 키메라 플라스미드를 작제한다. 수막구균 부류 I r필린의 초기 60 아미노산을 암호화 하는 pPX2003의 DNA는 pPX2002에서 임균 DNA의 동일한 영역으로 대체된다. pPX2004로 명명된 AmpR 플라스미드는 서열 번호:1로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진다. 플라스미드 pPX2004를 사용하여 TOP10F'로 명명된 이.콜라이 균주 K12를 형질전환시킨다. 유도 후, pPX2003으로부터 발현된 수막구균 r필린의 양에 필적할 만한 키메라 r필린의 발현이 상당히 증가된다. 키메라 작제물의 발현 수준은 pPX2002에서 발현된 임균 r필린의 양에 필적할 만하다. 키메라 부류 I r필린은 (시그널을 포함한) 길이 167 아미노산(서열 번호:2)으로, 예상된 크기에 따른 것이다.
재조합 플라스미드 pPX2004를 함유하는 TOP10F'로 명명된 이.콜라이 균주 K12의 샘플을 출원인이 미국 버지니아 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801의 아메리칸 타입 컬처 컬렉션에 1998년 1월 27일에 기탁했고 ATCC 기탁 번호 ATCC 98637을 부여 받았다.
실시예 6에 기재된 바와 같이, 엔.메닌지티디스의 부류 II pilE 유전자의 3' 말단이 엔.고노리아의 상응하는 영역으로 대체된 키메라 플라스미드를 작제한다. 구체적으로 말하면, 디설파이드 루프(엔.메닌지티디스 균주 FAM18의 수막구균 부류 II 필린의 마지막 22 아미노산)를 암호화 하는 pPX8001의 DNA는 유사한 (그러나 보다 큰) 영역 + pPX2000에서 엔.고노리아 균주 Pgh3-1의 임균 (pilE) DNA의 총 44 아미노산의 카복시-말단 영역의 추가 부위로 대체된다. pPX8017로 명명된 AmpR 플라 스미드는 서열 번호:3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가지고, 여기서 뉴클레오티드 1-378은 엔.메닌지티디스 부류 II에서 나온 것이고 뉴클레오티드 379-510은 엔.고노리아에서 나온 것이다. 플라스미드 pPX8017을 사용하여 TOP10F'로 명명된 이.콜라이 균주 K12를 형질전환시킨다. 유도 후, (7 아미노산의 긴 시그널을 포함한) 170 아미노산(서열 번호:4)인 키메라 부류 II r필린이 발현되며, 여기서 아미노산 1-126은 엔.메닌지티디스 부류 II에서 나온 것이고 아미노산 127-170은 엔.고노리아에서 나온 것이다. 이러한 키메라 부류 II r필린은 예상된 크기에 따른 것이다. NcoI 부위는 클로닝을 위해 도입되며, 시그널 서열에서 두번째 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 변화된다. 이러한 변화는 항원성 또는 면역원성에 영향을 미치는 것으로 기대되지는 않는다.
재조합 플라스미드 pPX8017를 함유하는 TOP10F'로 명명된 이.콜라이 균주 K12의 샘플을 출원인이 미국 버지니아 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801의 아메리칸 타입 컬처 컬렉션에 1999년 4월 15일자로 기탁했고 ATCC 기탁 번호 ATCC 207199를 부여 받았다.
각종 숙주 세포-벡터 시스템은 실시예 2-6에 기재된 것 이외에 본 발명의 백신에 사용된 임균, 수막구균 및 키메라 r필린을 발현시키는 용도로 적당하다. 벡터 시스템은 사용된 숙주 세포와 상용가능하다. 적당한 숙주 세포는 플라스미드 DNA, 코사미드 DNA 또는 박테리오파아지 DNA로 형질전환된 박테리아; 백시니아 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스; 피키아 세포와 같은 효모; Sf9 또는 Sf21 세포와 같은 곤충 세포; 또는 중국 햄스터 난세포와 같은 포유동물 세포주; 및 기타 일반적인 유기체를 포함한다.
각종 통상적인 전사 및 해독 인자가 숙주 세포-벡터 시스템에 사용될 수 있다. pilE DNA는 발현 시스템으로 삽입되고 프로모터 및 기타 조절 인자가 벡터내의 특정 부위로 연결되어, 플라스미드 벡터가 숙주 세포로 삽입될 때, pilE DNA가 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
플라스미드는 사용된 숙주 세포-벡터 시스템에 따라 형질전환, 형질도입, 형질감염 또는 감염에 의해 숙주 세포로 도입된다. 숙주 세포는 숙주 세포에 의한 r필린 단백질의 발현을 가능케하는 조건하에 배양된다.
본 발명은 추가로 아미노-말단 영역이 임균 pilE 유전자에서 나온 것이고 중앙 및 카복시-말단 영역이 수막구균 pilE 유전자(서열 번호:1)에서 나온 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질을 암호화 하는 DNA 서열을 포함하는 분리되어 정제된 DNA 서열에 관한 것이다. 서열 번호:1에서 뉴클레오티드 1-501은 프로세싱 이전에 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질을 암호화하고; 뉴클레오티드 22-501은 성숙 단백질로 프로세싱 후 수막구균 키메라 부류 I r필린을 암호화 한다. 본 발명은 부가적으로 프로세싱 이전에 서열 번호:2의 아미노산 1-167의 아미노산 서열 또는 성숙 단백질로 프로세싱 이후에 서열 번호:2의 아미노산 8-167의 아미노산 서열을 지닌 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 관한 것이다. 임균 r필린 또는 수막구균 키메라 부류 I r필린 작제물에 의해 생산된 총 단백질의 대략 10%는 프로세싱에 의해 제거된 시그널 서열이 결여되어있다.
본 발명은 추가로 카복시-말단 영역이 임균 pilE 유전자에서 나온 것이고 중 앙 및 아미노-말단 영역이 수막구균 pilE 유전자(서열 번호:3)에서 나온 수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질을 암호화 하는 DNA 서열을 포함하는 분리되어 정제된 DNA 서열에 관한 것이다. 서열 번호:3에서 뉴클레오티드 1-501은 프로세싱 이전에 수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질을 암호화하고; 뉴클레오티드 22-501은 성숙 단백질로 프로세싱 후 수막구균 키메라 부류 II r필린을 암호화 한다. 본 발명은 부가적으로 프로세싱 이전에 서열 번호:4의 아미노산 1-170의 아미노산 서열 및 성숙 단백질로 프로세싱 이후에 서열 번호:4의 아미노산 8-170의 아미노산 서열을 지닌 수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질에 관한 것이다.
수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질 및 수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질 각각을 암호화하는 pPX2004 및 pPX8017에 함유된 키메라 DNA 서열 이외에, 본 발명은 유전 코드의 중복에 의해 키메라 r필린 단백질을 암호화하는 서열과 생물학적으로 상동인 DNA 서열을 포함하는데, 즉, 이들 기타 DNA 서열은 본원에 기재된 것과 상이한 뉴클레오티드 서열이 특징적이지만, 서열 번호:1 또는 서열 번호:3의 DNA 서열에 의해 암호화된 것과 동일한 아미노산 서열을 지닌 단백질을 암호화 한다.
특히, 본 발명은 Sambrook 등이 기재한 바와 같이 표준 고 해상 서던 하이브리드화 조건하에 하이브리드를 가능케 하기 위해 서열 번호:1 또는 서열 번호:3의 서열과 충분히 중복되는 DNA 서열을 고려한다(31).
본 발명은 또한 수막구균 키메라 부류 I 또는 부류 II r필린 단백질의 것과 상이하지만, 이들 단백질 중 하나와 생물학적으로 대등한 아미노산 서열을 암호화 하는 DNA 서열(서열 번호:2 또는 서열 번호:4)을 포함한다. 이러한 아미노산 서열은 이들 서열이 단지 r필린 서열에서 약간의 결실, r필린 서열로 삽입 또는 r필린 서열로 치환에 의해 상이하다면 키메라 r필린 단백질의 것과 생물학적으로 동일하다고 말해질 수 있어, 서열의 3차 구조는 r필린 단백질의 것에서 본질적으로 변화되지 않는다.
예를 들어, 아미노산 알라닌, 소수성 아미노산을 위한 코돈은 글라이신과 같은 또다른 덜 약한 소수성 잔기, 또는 발린, 루신, 또는 이소루신과 같은 보다 큰 소수성 잔기를 암호화 하는 코돈에 의해 치환될 수 있다. 마찬가지로, 일 음전하 잔기를 또다른 음전하 잔기로 치환, 예를 들면 아스파르트산에서 글루타민으로, 또는 일 양전하 잔기를 또다른 양전하 잔기로 치환, 예를 들어 라이신을 아르기닌으로의 치환을 야기하는 변화, 및 수치 요법 지수에서 잔기의 유사성에 기초한 변화도 또한 생물학적으로 동일한 산물을 생산하는 것으로 기대될 수 있다. 단백질 분자의 N-말단 또는 C-말단 부위의 변경을 야기하는 뉴클레오티드도 단백질의 활성을 변화시킬 것으로 기대되지 않는다.
*또한, 보존된 영역의 3차 구조가 r필린 단백질의 것에서 본질적으로 변화되지 않는 공지된 가변 영역의 변화는 생물학적으로 대등하다. 생물학적으로 대등한 서열의 또다른 정의는 크로스-반응성 면역 반응을 일으킬 수 있는 것이다. 특히, 수막구균 키메라 부류 I 및 II 재조합 필린은 변형된 키메라 재조합 필린이 크로스-반응성 면역 반응을 일으킬 수 있는 한, 임균 필린으로부터 상응하는 삽입을 길게 하거나 짧게함으로써 변형될 수 있다.
제안된 변형 각각은 암호화된 산물의 구조적 및 생물학적 활성의 보유의 결정 인자로서 업계의 숙련인에게 익히 알려져 있다. 따라서, 용어 "수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질" 또는 "수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질"이 명세서 또는 청구항에서 사용되는 경우, 생물학적으로 대등한 단백질을 생산하는 모든 변형 및 변이를 포함하는 것으로 해석한다.
실시예 7에 기재된 바와같이, 임균 r필린 단백질은 사용된 이.콜라이의 세포막과 결부되어 이를 발현시킨다. EmpigenTM BB, TritonTM X-100, 환원 TritonTM X-100, 옥틸-β-D-글루코피라노시드(OG), ZwittergentTM 3-10 또는 3-14를 포함한 각종 세제가 이.콜라이의 r필린 단백질을 선택적으로 용해시킬 수 있다. 원심 분리, 투석 및 컬럼상 분획화 이후, 정제된 r필린이 얻어진다.
실시예 8에 기재된 바와같이, 키메라 부류 I r필린을 분리하고 이.콜라이 세포의 붕괴, 원심 분리에 의한 정화, 여과,및 두 컬럼상에서의 분획화에 의해 정제한다.
실시예 9에 기재된 바와 같이, 수막구균 키메라 부류 II r필린을 분리하고 이.콜라이 세포의 파괴, 원심분리에 의한 정화, 투석 및 두 컬럼상에서의 분획화에 의해 정제한다.
정제된 임균 r필린을 실시예 10에 기재된 반복된 N-말단 서열 분석한다. 20-40 아미노-말단 잔기의 서열분석은 DNA 서열에서 빠진 아미노산 서열과 일치하는 결과를 제공한다. (시그널과 함께) r필린의 분자량은 아미노산 함량을 기준으로 17,981 달톤의 예상 질량과 비교시 질량 스펙트럼 분석에 의하면 18,006 달톤으로 나타났다. 반면에, r필린이 세제를 이용하여 크기 배제 컬럼 크로마토그래피를 행하면 68,899 달톤의 겉보기 분자량이 얻어진다. 이는 r필린이 응집되었음을 암시한다. 세제를 제거하는 노력에서 PBS를 이용한 r필린의 투석은 겔 여과로 측정시 452,349 달톤의 겉보기 분자량을 지닌 물질을 생성한다. 이는 추가적인 응집이 일어났음을 암시한다.
실시예 11에 기재된 바와같이, 면역 혈청은 정제된 임균 r필린으로 기니아 피그 또는 마우스를 면역화시켜 얻어진다. 실시예 12에 기재된 바와 같이, 웨스턴 블랏 분석은 완전 세포에 부착된 r필린에 대한 항혈청이 필리 달린 임균 세포로부터 용해되지만, 필리가 없는 세포 용해물에는 결합이 관찰되지 않음을 보여준다. 반면, 필린 올리고머에 대한 항혈청은 필리 달린 세포 용해물과 필리가 없는 세포 용해물 모두에 결합한다.
실시예 13에 기재된 바와 같이, ELISA로 분석시, 임균 r필린에 대한 이러한 풀링된 항혈청은 정제된 임균 r필린 단백질에 부착하기 위해 높은 종점 역가를 가진다. 실시예 13은 각종 보조제의 효능을 상세히 설명해 준다. r필린을 MPLTM 단독, MPLTM + 알루미늄 포스페이트, 또는 StimulonTM QS-21로 보조화시키면, 마우스에서 우수한 체액 면역 반응이 얻어진다.
실시예 14에 기재된 바와 같이, 완전 세포 ELISA는 r필린에 대한 항혈청이 필리 달린 세포에는 부착되지만, 특정 임균의 이소게닉 필리 없는 세포에는 부착되지 않음을 보여준다.
실시예 15에 기재된 바와 같이, 네이티브 콜레라 독소를 지니거나 지니지 않은 임균 r필린으로 마우스를 비내 면역화시킨다. 마우스가 보조제없이 r필린으로 면역화된 후 일어난 풀링된 혈청으로부터 항원 ELISA에서 상당한 면역 반응이 검출되었고; 이 반응은 네이티브 콜레라 독소의 첨가에 의해 증진된다. 풀링된 혈청은 온전한, 필리 달린 임균 세포에 부착하기 위해 낮은 ELISA 역가를 가지고; 이러한 결합은 마우스가 네이티브 콜레라 독소로 면역화될 때 대폭 증진된다.
실시예 16에 기재된 바와 같이, 면역전자 현미경은 r필린에 대한 항체가 임균의 표면에 난 필리 필라멘트의 길이를 따라 부착됨을 보여준다. 이는 항체가 생체내에서 박테리아의 표면에 존재하는 에피토프에 부착되었음을 보여준다.
실시예 17은 재조합 필린 올리고머에 대한 항혈청의 경우에 얻어진 것과 비교해 이종성 필리 달린 박테리아 분리물에 부착하는 r필린 항혈청의 경우에 얻어진 것보다 높은 역가임을 보여준다. r필린은 pH 12 포스페이트 완충액에 대한 r필린의 투석에 의해 r필린 올리고머로 전환된다.
필리는 인간 점막 세포에 엔.고노리아의 초기 부착을 매개한다. 따라서, 항원이 이들 세포로 이들 박테리아의 부착을 저해하는 항체를 유도할 수 있다면, 이는 이러한 항원이 백신 후보자라는 증거를 제공한다.
실시예 18에 기재된 바와 같이, r필린에 대한 기니아 피그 항체는 이종성 필리를 발현시키는 임균을 인간 경부 내피 세포에 부착되는 것을 현저히 저해한다. 임균의 필리형성은 이러한 박테리아의 감염도와 상관된다(2,3,32).
이들 데이터는 재조합 필리가 온전한 임균 세포상의 다양한 필리와 결합하는 항체를 유도할 수 있음과, 항혈청이 임균의 콜로니화 및 감염으로부터 면역된 인간을 보호하는 작용 활성 (박테리아 부착의 저해)을 나타냄을 보여준다(32,33). 디.노도수스로부터 재조합 필린을 발현시키는 이.콜라이 세포를 이용한 면역화가 면역원성(23,25,28)이지만, 공격에 대해 보호적이지 못함이 예전에 보고되었다. 이들 결과로 인해, 이들 조사자는 결집된 필러스를 위해 재조합 서브유닛 필린의 사용에서 관심을 돌렸다. 그러나, 본원에 기재된 데이터는 정제 후, 재조합적으로 발현된 필린 단백질이 임균의 콜로니화로부터 인간의 보호와 상관된 면역 반응을 유도함을 암시한다. 이에 따라, 이들 데이터는 r필린이 엔.고노리아에 대한 유력한 백신 후보자라는 관점을 지지한다.
실시예 19에 기재된 바와 같이, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질의 N-말단이 서열 분석되었다. 35 아미노-말단 잔기의 서열 분석은 DNA 서열에서 빠진 아미노산 서열과 일치하는 결과를 제공한다. (시그널을 지닌) 키메라 r필린의 분자량은 질량 스펙트럼 분석에 따르면 17,659 달톤으로 나타났고, 이에 비해 아미노산 함량에 기초한 예상된 질량은 17,676 달톤이다. 반면, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질을 세제를 이용하여 크기 배제 컬럼 크로마토그래피를 행하면 69,480 달톤의 겉보기 분자량이 얻어진다. 임균 r필린의 경우와 같이, 이는 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질이 응집되었음을 암시한다.
실시예 20에 기재된 바와 같이, ELISA로 분석시, 수막구균 키메라 부류 I r 필린 단백질에 대한 풀링된 항혈청은 수막구균 부류 I r필린 단백질과 필리 달린 수막구균 세포 모두에 대한 높은 종점 역가를 가진다. 실시예 20에 기재된 바와 같이, 보조제, 특히 StimulonTM QS-21은 수막구균 부류 I r필린 단백질과 필리 달린 수막구균 세포 모두로 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 대한 항혈청의 결합을 위한 상당한 반응을 일으킨다.
실시예 21에 기재된 바와 같이, 면역전자 현미경은 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 대한 항체가 수막구균의 필리의 길이를 따라 결합됨을 나타낸다. 이는 항체가 생체내에서 박테리아의 표면상에 존재하는 에피토프에 부착됨을 암시한다.
실시예 4에서, 임균 r필린에 대한 항혈청이 인식되었고 필리 달린 수막구균 세포에 부착됨을 보여준다. 실시예 22에서, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 대해 생긴 항혈청이 필리 달린 임균 세포에 부착함을 보여준다.
실시예 23에 기재된 바와 같이, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 대한 기니아 피그 항혈청을 지닌 유년기 래트의 수동 면역화는 생체내에서 수막구균 박테리아혈증을 막는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 면역 혈청을 수용하는 동물에서 콜로니화 수준이 상당히 감소되었다. 또한, 재조합적으로 발현된 필린을 이용하여 생긴 면역 반응은 생체내에서 이종성 필린 단백질을 발현시키는 수막구균으로부터 보호할 수 있다.
실시예 24에 기재된 바와 같이, 콜레라 독소가 있거나 없이 수막구균 키메라 부류 I r필린을 마우스에 비내 면역화시키며, 여기서 콜레라 독소는 아미노산 위치 29의 글루탐산이 히스티딘으로 대체되는 돌연변이 형태로 존재한다(CT-CRM, E29H). 보조제의 부재하에 마우스를 r필린으로 면역화시킨 후 일어난 풀링된 혈청으로부터 항원 ELISA에서 상당한 면역 반응이 검출되었으며; 이러한 반응은 돌연변이체 CT-CRM, E29H 콜레라 독소의 첨가에 의해 증진된다.
실시예 25에 기재된 바와 같이, 엔.메닌지티디스의 부류 I 균주에 의한 마우스 비인강의 콜로니화의 방해가 MPLTM으로 보조된 수막구균 키메라 부류 I r필린으로 피하 면역된 마우스에서 입증된다.
실시예 26에 기재된 바와 같이, 웨스턴 블랏 분석은 수막구균 키메라 부류 II r필린으로 면역화된 기니아 피그로부터 얻어진 항혈청이 부류 I 또는 부류 II 필린을 발현시키는 필리 달린 수막구균 세포로부터 완전 세포 용해물에 부착함을 보여준다.
실시예 27에 기재된 바와 같이, 부분 정제된 수막구균 키메라 부류 II r필린에 대해 유도된 항혈청은 상동성 박테리아 균주에서 나온 수막구균 세포에 부착한다.
또한, 이들 데이터는 r피린, 특히 수막구균 키메라 부류 I 및 부류 II r필린 단백질이 엔.메닌지티디스에 대한 유력한 백신 후보자라는 관점을 지지한다.
임균 r필린 단백질은 엔.고노리아에 의해 야기된 질환으로부터 포유동물을 보호하는 백신의 제조에 유용하다. 수막구균 r필린 단백질, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질 및 수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질은 엔.메닌지티디스에 의해 야기된 질환으로부터 포유동물을 보호하는 백신의 제조에 유용하다.
부가적으로, 여러 나이제리아 종에 대한 크로스-보호는 엔.메닌지티디스에 의해 야기된 질환으로부터 포유동물을 보호하기 위해 임균 r필린 단백질을 함유한 백신으로 면역화하거나 엔.고노리아에 의해 야기된 질환으로부터 포유동물을 보호하기 위한 수막구균 r필린 단백질, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질 또는 수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질을 함유한 백신으로 면역화시켜 제공된다.
이들 백신 조성물은 분리되어 정제된 r필린 단백질을 포함하며, 여기서 백신 조성물은 포유동물 숙주에서 보호 면역 반응을 유발한다.
r필린 단백질을 함유한 백신은 주사액 또는 현탁액을 제조하기 위한 통상적인 방법으로 면역학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합될 수 있다. 백신에 의해 유도된 항체의 수준은 StimulonTM QS-21(미국 매사츄세츠 프래밍햄의 Aquila Biophrmaceuticals, Inc.), MPLTM(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; 미국 몬태나 해밀톤의 RIBI ImmunoChem Research, Inc.), 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, IL-12(미국 매사츄세츠 캠브리지의 Genetics Institute) 및 콜레라 독소(야생형 또는 돌연변이 형태, 예를 들면 미국 가특허 출원 번호 60/102,430에 따르면, 아미노산 위치 29의 글루탐산이 또다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 대체됨)와 같은 보조제를 이용하여 향상될 수 있다.
본 발명의 백신은 피하, 복강내 또는 근육내 주사와 같은 통상적인 주사법에 의해 인간으로 투여되고, 경구, 점막, 비내 또는 질내 투여되어, 엔.고노리아 또는 엔.메닌지티디스에 의해 야기된 질환으로부터 보호를 위한 활성 면역 반응을 유도한다. 투여량은 업계의 숙련인에게 공지된 수단에 의해 결정된다. 백신 1회 투여량으로 보호가 제공될 수 있거나, 여러 번의 부스터 양의 투여가 필요할 수 있다.
본 발명을 좀더 잘 이해할 수 있기 위해, 하기의 실시예가 기재되어 있다. 실시예는 단지 설명을 위한 것이고 본 발명의 범위를 제한하는 의도는 아니다.
Sambrook 등이 기재한 프로토콜에 따른 표준 분자 생물학 기술을 이용한다.(31).
실시예 1
박테리아 및 세포 배양
박테리아 및 배양 조건
임균 분리물을 플로리다 탐파; 캐나다 오타와; 워싱턴 디.시.; 워싱턴 시애틀; 뉴욕 로체스터; 노쓰캐롤라이나 차펠 힐; 및 일리노이 에반스톤에서 입수했다. 수막구균 분리물을 노쓰캐롤라이나 차펠 힐; 및 네덜란드 빌토벤에서 입수했다.
박테리아를 필요할 때까지 동결 건조 형태로 보관하거나 -70 ℃에서 동결시킨다. 고체 배지에서 생장시킬 때, 아가 플레이트를 수분을 함유한 대기 및 5%(용적/용적) CO2를 함유한 37℃의 배양기에서 배양했다. 엔.고노리아 및 엔.메닌지티디스를 헤모글로빈없이 GC 배지 염기(미국 미시간 디트로이트의 Difco Laboratories)에서 생장시키고, 덱스트로스(400 mg/L), 글루타민(10 mg/L), 코카복실라제(20 ㎍ /L) 및 철 나이트레이트(500 ㎍/L)를 보충했다. 엔.메닌지티디스의 액체 현탁 배양액을 아가가 결핍된 동일 배지에서 37 ℃의 교반 배양기(70 RPM)에서 생장시켰다. 마우스 코 조직 분쇄물로부터 수막구균의 배양을 수반하는 실험에서, 박테리아를 하기의 항생제(Difco) 혼합물: 콜리스틴 설페이트(75 ㎍/mL), 니스타틴(125 ㎍/mL), 반코마이신(30 ㎍/mL) 및 트리메토프림 락테이트(50 ㎍/mL)와 함께 앞서 기재된 GC 배지에서 생장시켰다. 필리 달린 임균을 콜로니 형태 및 매일 계대된 개개 콜로니에 의해 확인하여 표현형을 유지했다. 수막구균 세포의 필리화 상태는 pH 8에서 30초간 NanoVan 염색(미국 뉴욕 스토니 브룩의 Nanoprobes)으로 염색된 샘플의 투과 전자 현미경 조사에 의해 평가했다. 이.콜라이를 20 g/L Bacto 트립톤(Difco), 5 g/L 효모 추출물(Difco), 0.6 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl 및 1%(중량/용적) 아가(pH 7.5)로 구성된 SOB 아가에서 생장시키거나 아가가 첨가되지 않은 SOB 브로쓰에서 생장시켰다. 몇몇 실험의 경우, Bacto 트립톤을 등량의 HySoyTM(미국 뉴욕 노르위치의 Sheffield Products)으로 대체했다.
내피 세포 배양
ME-180 세포주(미국 메릴랜드의 벨츠빌의 ATCC)는 경부 종양에서 본래 유도된 표피형 종양이다. 이 세포를 37 ℃에서 5%(용적/용적) CO2의 습기를 함유한 대기에서 10%(용적/용적) 태 송아지 혈청(미국 미주리 세인트 루이스의 Sigma), 페니실린 G(1000 유닛/mL)(Gibco BRL), L-스트렙토마이신(1 mg/mL)(Gibco BRL) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640(미국 메릴랜드 게이터스버그의 Gibco BRL)에서 생 장시켰다. 세포를 3일 내지 4일간마다 분할했다.
실시예 2
이. 콜라이에서 임균 pilE 의 클로닝 및 발현
동결된 필리 달린 엔.고노리아 균주 Pgh3-1 샘플을 PCR 반응에서 pilE DNA원으로 사용했다. pilE 유전자를 (리더 서열을 포함한) 완전한 필린 단백질의 3' 및 5' 말단을 인식하는 하기 프라이머를 이용하여 증폭시켰다: 5' CCC CGC GCC ATG GAT ACC CTT CAA AAA GGC3'(PILEFWD)(서열 번호:5) 및 5' GGG CCT GGA TCC GTG GGA AAT CAC TTA CCG 3'(PILEREV)(서열 번호:6). PCR 산물은 pilE 암호화 영역의 초기에 NcoI 부위 및 말단에 BamHI 부위를 함유한다. NcoI 부위를 클로닝을 위해 유전자로 도입했다. 이는 시그널 서열에서 두번째 아미노산을 아스파라긴(AAT)에서 아스파르트산(GAT)로 변화시킨다. 아미노산 2가 성숙 단백질의 정상 프로세싱 동안 절개된 시그널 펩티드의 일부이기 때문에, 이러한 변화는 항원성 또는 면역원성에 영향을 미칠 것으로 기대되지 않는다. PCR 산물을 pCRTMII TA 클로닝 벡터(미국 캘리포니아 칼스베드의 Invitrogen)로 클로닝하고, 연결시킨 다음, 이.콜라이 TOP10F'(Invitrogen)로 형질전환시켰다. 100 ㎍/mL 앰피실린 함유 플레이트 또는 50 ㎍/mL 카나마이신 함유 플레이트에서 콜로니를 선별했다. 플라스미드 DNA를 이들 형질전환물의 밤새 배양액으로부터 분리하고 효소 EcoRI 및 NotI을 이용하여 제한 절단에 의해 분석했다.
정확한 크기의 삽입물을 함유한 4개의 클론을 DNA 서열 분석용으로 제공하 여 pilE PCR DNA 분획의 존재를 입증했다. pPX1999로 명명된 클론 #17을 pilE 유전자원으로 이용했다. pPX1999 및 pTrcHisA(Invitrogen)의 플라스미드 DNA를 NcoI과 BamHI 제한 효소로 절단하고, DNA 분획을 겔 분리하여, 연결시킨 다음 이.콜라이 TOP10F'로 형질전환시켰다. 앰피실린 내성 콜로니를 선별하고, 새로운 형질전환물의 플라스미드 DNA를 분리한 다음, BamHI과 NcoI 제한 효소를 이용하여 DNA 제한 분석을 행했다. 정확한 제한 패턴을 지닌 두 개의 클론을 DNA 서열 분석용으로 제공했다. 두 클론은 정확한 DNA 서열을 가지며 이를 pPX2000으로 명명했다.
재조합 필린의 발현을 시험하기 위해, 이들 클론을 함유한 배양액을 SOB + 100 ㎍/mL 앰피실린 및 12 ㎍/mL 테트라사이클린의 교반 플라스크 또는 발효조에서 생장시켰다. 교반 플라스크를 사용할 경우, 이.콜라이를 A600 = 0.9 - 1.0이 얻어질 때까지 1 L 배지에서 생장시켰다. 재조합 필린의 발현을 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도 1 mM이 되게끔 첨가하고 1-4시간 동안 계속 생장시켜 유도했으며, 이 시점에서 원심분리(4 ℃에서 20분간 13,689 x g)에 의해 세포를 모아 -20 ℃에서 보관했다. 발효조의 경우, 플레이트로부터 밤새 배양액을 이용하여 다시 밤새 생장된 500 mL 배지를 함유한 플라스크에 접종했다. 이 액체 배양액을 사용하여 8.9 L 배지를 함유한 Biostat B 발효조(미국 펜실베니아 알렌타운의 Braun Biotech)에 접종했다. HySoyTM-함유 배지에 최종 농도 1%(중량/용적)의 덱스트로스를 보충할 경우 발효조에서 증진된 박테리아 생장이 얻어졌다. 배양액이 A600 = 1.0에 이르면, IPTG를 최종 농도 1 mM로 첨가하고 세포를 추가 1-4시간 동안 생장시킨 다음 원심분리(4 ℃에서 20분간 13,689 x g)로 수거했다. 배지를 버리고 세포 펠릿을 -20 ℃에서 보관했다. IPTG를 도입하면, r필린 단백질의 발현이 상당히 증가되어 3 내지 4시간 후기 유도시 최대 수준에 이르렀다.
유도된 배양액 샘플을 나트륨 도데실 설페이트(SDS-PAGE)의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석했다. 재조합 필린을 쿠마시 블루 염색을 이용하여 확인했고 임균 필리(클론 #A33020023, 미국 캘리포니아 에머리빌의 Biospacific)에 특이한 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 이의 존재를 확인했다.
실시예 3
카나마이신 내성 마커를 함유한 임균 재조합 pilE 플라스미드의 작제
AmpR 마커가 KanR 마커로 대체된 플라스미드를 작제했다. 하기에 지적된 것을 제외하고는, 실시예 2의 과정을 이용했다. TrcFXba 프라이머, 5' GGC TCT AGA CTG TCA GAC CAA GTT TAC TC 3' (서열 번호:7), 및 TrcRXba 프라이머, 5' GGC TCT AGA TTG AAG CAT TTA TCA GGG 3'(서열 번호:8)을 이용하여 pTrcHisA 플라스미드 DNA상에서 PCR 반응을 수행했다. 밑줄친 서열은 XbaI 제한 부위를 암호화 한다. 대략 3.5 kb PCR 산물은 pTrcHisA DNA 마이너스 앰피실린 암호화 영역을 함유한다. 또다른 PCR 반응을 pACYC177 플라스미드 DNA(미국 매사츄세츠 비벌리의 New England Biolabs)상에서 KanFXba 프라이머, 5' GGC TCT AGA TAA ACA GTA ATA CAA GGG G 3'(서열 번호:9), 및 KanRXba 프라이머, 5' GGC TCT AGA TTA GAA AAA CTC ATC GAG C 3'(서열 번호:10)을 이용하여 수행했다. 또한, 밑줄친 서열은 XbaI 제한 부위를 암호화 한다. 대략 860 bp PCR DNA 산물은 카나마이신 내성 유전자를 암호화 한다. 두 PCR 산물을 아가로스 겔에서 정제하고, DNA를 XbaI 제한 효소로 절단하여, 추출한 다음 연결했다. 연결 반응의 일부를 이.콜라이 TOP10F'로 형질전환시키고 형질전환 믹스의 일부를 30 ㎍/mL 카나마이신을 함유한 SOB 플레이트상에 두었다.
총 48 KanR 콜로니를 앰피실린 또는 카나마이신을 함유한 SOB 플레이트상으로 2회 스트리킹했다. 예상한 바대로, 모든 KanR 콜로니는 앰피실린 민감성이었다. 클로닝 디자인이 대칭이기 때문에, 카나마이신 삽입물의 두 배향을 분리했다. 오리지날 앰피실린 유전자로서 동일한 시계방향 배향의 카나마이신 삽입물을 장래 연구를 위해 선별하여 pZ564로 명명했다. lacIq 유전자, trc 프로모터 및 pZ564내의 다중 클로닝 부위를 함유한 DNA 영역을 하기의 방법으로 (pilE를 함유한) pPX2000 플라스미드의 유사한 영역으로 교체했다: pZ564 및 pPX2000 모두를 SphI 및 XmnI 제한 효소로 절단했다. pPX2000으로부터 대략 2.2 kb DNA 분획 및 pZ564로부터 대략 2.6 kb DNA 분획을 겔 정제하고, 연결시킨 다음 이.콜라이 TOP10F'로 형질전환시켰다. 생성된 정확한 플라스미드를 pPX2002로 불렀다.
선택 항생제를 앰피실린에서 카나마이신으로 바꿀 때 재조합 필린 단백질 발현의 유사한 유도 시간 경과 및 수준이 관찰되었다.
실시예 4
이. 콜라이에서 수막구균 부류 I pilE 의 클로닝 및 발현
임균 및 수막구균 부류 I 필린의 DNA 및 아미노산 서열의 높은 상동성으로 인해(7), 수막구균 세포에서 발현된 필리에 부착하는 임균 r필린 항혈청의 능력을 완전 세포 ELISA를 이용하여 평가했다. 이러한 항혈청은 균주 H355로부터 엔.메닌지티디스 필리 달린 세포에 부착하기 위한 역가 151,100을 나타낸다.
이러한 부착은 필린 단백질을 나타내는 것 같은 데, 이는 이러한 균주로부터 완전 세포 용해물의 웨스턴 블랏이 오직 단일 밴드만이 필린에 부착된 항혈청과 함께 이동함을 보여주기 때문이다(데이터에는 나타나지 않음). 다수의 기타 수막구균 균주는 완전 세포 ELISA에서 낮은 역가를 나타내지만, 필리의 존재는 투과 전자 현미경으로는 확인되지 않았다. 이들 데이터를 기초로, 엔.메닌지티디스로부터 부류 I 필린을 클로닝하여 이를 재조합적으로 발현시키기로 했다. 초기에, 엔.고노리아의 pilE의 경우와 동일한 방법을 수행했다. 하기에 지적된 바를 제외하고, 실시예 2의 과정을 사용했다.
부류 I pilE를 하기 프라이머: 5' CCC CGC GCC ATG GAC ACC CTT CAA AAA GGT TTT ACC 3' (NMFPILE)(서열 번호:11), 및 5' GGG CCT GGA TCC GAG TGG CCG TGG AAA ATC ACT TAC CGC 3'(NMRPILE)(서열 번호:12)를 이용하여 엔.메닌지티디스 균주 H44/76의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 예상한 바와 같이, 대략 600 bp DNA의 PCR 산물이 얻어졌다. PCR 반응 산물의 일부를 pTrcHisA로 삽입시키기 위해 BamHI과 NcoI 제한 효소로 절단했다. 절단된 DNA를 아가로스 겔상에서 전기영동하고 DNA 분 획을 겔 정제했다. DNA 분획을 연결하고 이.콜라이 TOP10F'로 형질전환시켰다. 앰피실린 내성 클론의 미니플라스미드 예비 분석을 BamHI과 NcoI 제한 효소를 이용하여 수행했다. 정확한 제한 절단 패턴을 발현시키는 클론을 RZ1142로 부르고 플라스미드를 pPX2003으로 불렀다.
유도 후, 완전 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분석시 대략 15,000 달톤의 분자량을 지닌 쿠마시 블루로 염색된 폴리펩티드의 존재가 관찰되었다. SDS-PAGE와 웨스턴 블랏에 의한 이들 클론 중 4에서 완전 세포 용해물의 분석은 엔.고노리아 균주 LB2의 온전한 필리에 대한 폴리클로날 항체와의 적절한 이동성 및 반응성의 단백질의 존재를 입증해 보였다. 정제된 부류 I r필린은 길이가 167 아미노산이다. 그러나, 이러한 재조합 필린의 발현 수준은 동일한 조건하에 생장된 pPX2000 또는 pPX2002를 이용하여 얻어진 것보다 상당히 낮다. 재조합 부류 I pilE에서 DNA 서열의 분석은 이.콜라이에서 이러한 단백질의 낮은 수준의 발현을 설명하는 다수의 역반복부가 존재함을 보여준다.
실시예 5
이. 콜라이에서 임균 및 수막구균 부류 I 키메라 pilE 의 작제 및 발현
수막구균 필린 단백질의 발현을 증가시키기 위해, pPX2003(실시예 4에 기재된 수막구균 부류 I pilE 작제물)에서 초기 60 아미노산을 암호화 하는 DNA를 pPX2002(실시예 3에 기재된 임균 pilE 작제물, 7개의 아미노산 시그널 펩티드 포함)(서열 번호:4)의 대등한 영역으로 교체했다. 하기에 지적된 것을 제외하고, 실시예 2의 과정을 수행했다.
수막구균 pilE 유전자의 보존된 5' 말단 영역을 하기의 방법으로 엔.고노리아 균주 Pgh3-1의 동일 영역으로 교체했다. BsmBI 부위를 하기와 같이 수막구균 pilE 유전자로 도입했다: DNA를 하기 프라이머: 5' CCG GCG CGT CTC TCA CGG CGA ATG GCC CGG C 3' (CL-1ESPF)(서열 번호:13) 및 5' GGG CCT GGA TCC GAG TGG CCG TGG AAA ATC ACT TAC CGC 3' (NMRPILE)(서열 번호:14) 및 Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 pPX2003으로부터 PCR 증폭시켰다. 예상된 PCR DNA 산물을 pCR2.1(Invitrogen)으로 직접 클로닝하고 TOP10F' 세포로 형질전환시켜 생성된 플라스미드를 pZ578로 칭했다. 하기 방법으로 BsmBI 부위를 임균 pilE로 도입했다. 프라이머 5' GCA TAA TTC GTG TCG CTC AAG GCG C 3' (TRCUPFW)(서열 번호:15) 및 5' GCC GCG CGT CTC CCG TGA TTC AGG TAA TAC TCG G 3'(PILEESPR)(서열 번호:16) 및 pfu DNA 폴리머라제를 사용하여, pPX2000의 pilE 유전자의 5' 말단을 PCR 증폭시켰다. 생성된 임균 PCR 산물과 pZ578을 BsmBI으로 절단하고 연결시켰다. 연결된 DNA를 5' GCA TAA TTC GTG TCG CTC AAG GCG C 3'(TRCUPFW)(서열 번호:17) 및 5' GGG CCT GGA TCC GAG TGG CCG TGG AAA ATC ACT TAC CGC 3'(NMRPILE)(서열 번호:18) 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다.
DNA PCR 산물은 예상 크기(대략 850 bp)이고 이를 NcoI과 BamHI으로 절단하여 대략 600 bp 분획을 얻었다. 이러한 분획을 겔 분리하고 임균 pilE 유전자를 교체하여 NcoI- 및 BamHI-컷 pPX2000 벡터로 직접 클로닝했다. 앰피실린에 강한 생성된 플라스미드를 pPX2004로 라벨링하고 이를 사용하여 TOP10F'를 형질전환시켰다. 이러한 형질전환물의 분석은 원하는 키메라 pilE DNA의 존재를 입증해 준다. IPTG 를 이용한 유도 후, pPX2003에서 발현된 수막구균 r필린의 양에 비해 발현된 수막구균 키메라 부류 I r필린 작제물의 양에 있어 상당한 증가가 있었다. 1% 옥틸-β-D-글루코피라노시드(OG)를 이용한 추출과 재조합 임균 필린의 경우 실시예 7에 기재된 정제 프로토콜(10 mM TrisTM에서 TMAE FractogelTM 컬럼, 0.1%(중량/용적) ZwittergentTM 3-14를 이용해 pH 8.5)을 사용하여, 매우 정제된 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질을 얻었다(수율: 대략 5 mg/g 세포 습윤 중량). 이 물질은 SDS-PAGE 및 레이저 덴시토미터로 분석시 순도가 90% 이상이었다. SDS-PAGE는 크기가 대략 15,000 달톤의 거대 밴드의 존재를 보여주었다. 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질은 길이가 167 아미노산이고, 정제된 단백질의 아미노-말단 36 잔기의 서열 분석에 따르면 7개 아미노산의 시그널 서열을 포함한다.
실시예 6
이. 콜라이에서 임균 및 수막구균 부류 II 키메라 pilE 의 작제 및 발현
수막구균 부류 II pilE의 초기 클로닝은 필리 달린 엔. 메닌지티디스 균주 FAM18 세포의 염색체 DNA의 분리 및 PCR 반응에서 부류 II pilE DNA의 증폭을 수반한다. 부류 II pilE 유전자를 (리더 서열을 포함한) 완전한 필린 단백질의 3' 및 5' 말단을 인식하는 하기 프라이머: 5' GCG GCC GCC ATG GAA GCA ATC CAA AAA GGT TTC ACC C 3'(PILE2FWD)(서열 번호:19) 및 5' GCG GCC GGA TCC GGT CAT TGT CCT TAT TTG GTG CGG C 3'(PILE2REV)(서열 번호:23)을 이용하여 증폭시켰다. 실시예 2와 유사한 방법에서, 생성된 PCR 산물은 pilE 암호화 영역의 초기에 NcoI 부위 및 말단에 BamHI 부위를 함유한다. NcoI 부위를 클로닝을 위해 유전자로 도입시켰다. 이로인해 시그널 서열의 두번째 아미노산이 라이신(AAA)에서 글루탐산(GAA)으로 변화되었다. 앞서 언급했듯이, 이러한 변화는 항원성 또는 면역원성에 대해 어떠한 효과를 미칠 것으로 기대치 않는다. PCR 산물을 pCR2.1 클로닝 벡터(Invitrogen)으로 클로닝하고, 연결한 다음, 이. 콜라이 TOP10F'로 형질전환시켰다. 콜로니를 100 ㎍/mL 앰피실린-함유 플레이트 또는 50 ㎍/ml 카나마이신 플레이트상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 이들 형질전환물의 밤새 배양액으로부터 분리하고 효소 EcoRI을 이용하여 제한 절단에 의해 분석했다.
pPX8001로 명명된 클론 #8을 pilE 유전자원으로 사용했다. pPX8001과 pTrcHisC(Invitrogen)의 플라스미드 DNA를 각각 NcoI과 BamHI 제한 효소로 절단하고, 생성된 DNA 분획을 겔 분리하고, 연결한 다음 이.콜라이 TOP10F'로 형질전환시켰다. 앰피실린 내성 콜로니를 선별한 다음, 새로운 형질전환물의 플라스미드 DNA를 분리하고, BamHI과 NcoI 제한 효소를 이용하여 DNA 제한 분석을 수행했다. 정확한 제한 패턴을 지닌 두 개의 클론을 DNA 서열 분석용으로 제공했다. 두 클론은 pPX8002로 명명된 정확한 DNA 서열을 가진다.
재조합 부류 II 필린의 발현을 시험하기 위해, 이들 클론, pPX8002를 함유한 10 mL 배양액을 100 ㎍/mL 앰피실린과 12 ㎍/mL 테트라사이클린을 함유한 SOB의 50 mL 튜브에서 A600 = 1.0이 되도록 생장시켰다. 재조합 단백질의 발현은 IPTG를 최종 농도 1 mM로 첨가하여 유도되고 배양액을 3시간 동안 연속 배양했다. 유도된 세포 의 완전 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 블루로 염색하였을 때, 새로운(유도된) 밴드는 검출되지 않았다. 이는 FAM18 pilE 유전자 산물이 쿠마시 블루를 이용해 식별가능한 수준보다 낮은 수준으로 발현되었음을 암시한다. FAM18 pilE를 pET17b 플라스미드 중으로 클로닝하고 pilE 시그널 서열의 존재 또는 부재하에 이.콜라이 BL21(DE3)pLysS로 형질전환시키면, 재조합 단백질의 상당한 발현은 검출되지 않았다. 두 개의 다른 균주 엔.메닌지티디스(NmB, 2996)의 부류 II pilE 유전자를 동일한 pTrcHis 플라스미드 및 TOP10F' 발현 시스템 중으로 클로닝할 때도 마찬가지 결과가 얻어졌다.
구체적으로 말하면, 균주 NMB와 2996은 PCR과 서열분석 데이터를 기초로 부류 II 필린을 발현시키는 것으로 나타났다. 주형으로 염색체 DNA 또는 세포와 별도 반응시에 부류 I 프라이머 세트(NMFPILE 및 NMRPILE) 및 부류 II 프라이머 세트(PILE2FWD 및 PILE2REV)를 이용하여 다수의 엔.메닌지티디스 균주로부터 pilE 유전자를 증폭시켰다. PCR 산물을 pTrcHisC 중으로 클로닝하고 서열 분석하거나, 직접 서열 분석했다. 서열 배열을 수행했다: H44/76 균주의 것과 유사한 서열을 부류 I으로 분류하고, FAM18 균주의 것과 유사한 서열을 부류 II로 분류했다. 모든 균주가 증폭되는 동안 서열이 얻어지지 않았다. PCR 데이터를 기초로 예비 분류를 행했다. 부류 I 균주는 부류 II 프라이머가 아닌 부류 I 프라이머와 정확한 크기의 PCR 산물을 제공하는 것이고, 부류 II 균주는 부류 I 프라이머가 아닌 부류 II 프라이머와 정확한 크기의 PCR 산물을 제공하는 것이다.
수막구균 부류 I 필린을 이용한 실험을 기초로, 부류 II pilE의 초기 60 아 미노산을 암호화 하는 영역(보존된 아미노-말단 영역)을 엔.고노리아 균주 Pgh3-1의 대응되는 영역과 교체했다. 생성된 키메라 pilE의 발현을 다양한 프로모터를 이용하여 다수의 이.콜라이 발현 균주에서 조사했다. 연구된 균주는 PR13(Rnase 결손), BL21(프로테아제 결손), KS474(주변세포질 프로테아제 결손), AD494(Novagen, 세포질에서 디설파이드 결합 형성) 및 TOPP의 3 균주(Stratagene, 단백질을 발현시키기 힘든 경우에 유용한 비-K12 균주)를 포함한다. 모든 경우에, 재조합 단백질이 쿠마시 블루-염색된 SDS-PAGE에서 검출되지 않았다. (T7 프로모터를 포함한) 다른 발현 플라스미드 pET17B도 조사해 보면 마찬가지 결과가 얻어졌다.
pPX8002에서 네이티브 부류 II pilE 유전자 서열이 염기 447에서 끝이남을 주목해야 한다. 네이티브 수막구균 부류 II pilE 종결 부위의 하류(3')에서 발견된 DNA 서열, 뉴클레오티드 447-519는 스템과 루프 구조를 형성하는 역 반복부를 함유한다. 스템과 루프 구조는 전사의 효과적인 종결자일 수 있기 때문에, pPX8002에서 이러한 부가적인 3' 서열(74 염기)의 생략은 이.콜라이에서 키메라 부류 II pilE 메세지의 전사에 영향을 미칠 수 있을 것으로 추정된다. 따라서, 모든 차후 클로닝은 이러한 하류 3' 말단 서열을 복원시킨다.
발현을 저해하는 영역을 확인하기 위해 엔.메닌지티디스 균주의 부류 II pilE 유전자의 각종 부위를 엔.고노리아 균주 Pgh3-1의 pilE 유전자의 대응되는 영역으로 체계적으로 교체했다. 교체 영역은 5' 또는 3' 말단에서 출발하고 진행방향으로 커진다. 네이티브 pilE 부류 II의 오직 84 뉴클레오티드의 내부 영역이 남을 때까지 5' 및 3' 말단의 이중 교체물을 작제했다. 이 영역을 교체하면, rGC를 인식 하고, 예상한 바대로, 이러한 클론은 pPX2000과 유사한 쿠마시 블루 염색 수준에서 r필린을 발현시켰다. FAM18 pilE 유전자의 하기 영역(뉴클레오티드 넘버로 기재됨)을 Pgh3-1의 대응 영역(괄호로 기재)으로 교체했다: 단일 영역 교체물은 1-108(1-108), 1-181(1-181), 1-294(1-282), 439-499(478-553), 379-519(367-553), 295-519(283-553), 295-378(283-366)이고; 이중 영역 교체물은 1-294(1-284) 및 379-519(367-553), 1-181(1-181) 및 439-499(478-553), 1-181(1-181) 및 379-519(367-553), 1-294(1-282) 및 439-499(478-553)이다.
pTrcHis 발현 시스템을 이용하여 이들 작제물을 이.콜라이 TOP10F'에서 발현시킬 때, 두 작제물은 쿠마시 블루로 검출가능한 수준의 재조합 단백질을 생성한다: (디설파이드 루프와 3' 연장을 포함하는) 뉴클레오티드 379-519의 교체물을 함유한 초기 단백질; 및 (보존된 5' 영역을 포함하는) 뉴클레오티드 1-181 및 (디설파이드 루프 및 3' 연장을 포함하는) 379-519의 교체물을 함유한 두번째 단백질. 5' 영역만의 교체가 재조합 단백질의 발현을 유도하지 않고 초기 작제물이 대부분의 네이티브 수막구균 필린 서열을 보유하기 때문에, 이러한 작제물(뉴클레오티드 379-519)이 추가 조사를 위해 선택되었다. 수막구균 및 임균 단백질의 아미노산 서열이 이 영역에서 상당히 다르지만, 디설파이드 루프가 상당한 항원성 변이를 가지는 것으로 기록되어 있다(17,18). 따라서, 이 영역(예, 디설파이드 루프)에 대한 면역 반응은 수막구균 중에서 최소 크로스-반응성을 나타낸다. 최근에, 임균 삽입물이 수막구균 디설파이드 루프 크기의 거의 두배(39 잔기:18 잔기)이기 때문에, 생성된 키메라 단백질은 SDS-PAGE 겔상에서 대략 19,000 달톤의 겉보기 분자량으로 이동한다.
이러한 키메라 유전자의 작제를 하기의 방법으로 수행했다. 하기 프라이머: 5' GCG GCC GCC ATG GAA GCA ATC CAA AAA GGT TTC ACC C 3'(PILE2FWD)(서열 번호:19) 및 5' GCC GCG CGT CTC CGA ACC GGA GTT TTG TTT GCC 3'(REV-CYS)(서열 번호:20)을 이용하여 pPX8002(FAM18 부류 II pilE)를 증폭시켜 5' 분획을 얻었다. 임균 디설파이드 루프(즉, 임균 유전자의 3' 말단)를 프라이머 5' CCG GGC CGT CTC GGT TCG GTA AAA TGG TTC TGC 3'(FWD-CYS)(서열 번호:21) 및 5' GGG CCT GGA TCC GTG GGA AAT CAC TTA CCG 3'(PILEREV)(서열 번호:22)를 사용하여 pPX2000에서 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 각각 정제하고, 제한 효소 BsmBI으로 별도로 절단한 다음, 연결시켜 완전한 길이의 키메라 pilE를 형성하고, 프라이머 PILE2FWD 및 PILEREV를 사용하여 증폭시켰다. 이 PCR 산물을 제한 효소 NcoI과 BamHI으로 절단하고, 마찬가지로 제한된 pTrcHisC로 연결시켜 TOP10F' 캄피턴트 세포로 형질전환시켰다.
형질전환물을 배양하고 제한 효소 NcoI과 BamHI을 이용하여 분석했다. 정확한 크기의 삽입물을 지닌 4개의 클론을 제한 효소 StuI을 이용하여 분석했다. 이들 중, 셋은 정확한 제한 지도를 제공한다. 정확한 제한 패턴을 지닌 세개의 클론 중 둘을 서열 분석했다. 클론 #5는 정확한 DNA 서열을 가지고 이를 pPX8017로 명명했다. 이 클론은 서열 번호:3로 명시된 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 이 중 뉴클레오티드 1-378은 엔.메닌지티디스에서 나온 것이고 뉴클레오티드 379-510은 엔.고노리아에서 나온 것이다.
50 mL 튜브중의 10 mL 배양액으로 발현을 체크했다. 세포를 A600이 대략 1.0이 될 때까지 100 ㎍/ml 앰피실린과 12 ㎍/ml 테트라사이클린으로 보충된 SOB에서 생장시켰다. 최종 농도 1 mM이 되게끔 IPTG를 첨가하여 배양을 유도했다. 3-4시간 동안 계속 생장시키고, 이 시점에서 세포를 원심분리(4℃에서 20분간 13,689 x g)에 의해 모아 -20℃에서 보관했다. 발효조에서, 플레이트의 밤새 배양액 또는 동결된 스톡을 사용하여 또다시 밤새 생장된 500 mL 배지를 함유한 플라스크에 접종했다. 이 액체 배양액을 사용하여 8.9 L 배지를 함유한 Biostat B 발효조(Braun Biotech, 미국 펜실베니아 알렌타운)에 접종시켰다. HySoyTM-함유 배지에 최종 농도 1%(중량/용적)의 덱스트로스를 보충시키면 발효조에서 증진된 박테리아 생장이 얻어졌다. 배양액이 A600 = 4.0-6.0에 이르면, IPTG를 최종 농도 1 mM로 첨가하고 또다시 2-4시간 동안 세포를 생장시킨 후 원심분리(4℃에서 20분간 13,689 x g)로 회수했다. 배지를 버리고 세포 펠릿을 -20℃에서 보관했다. IPTG를 이용하여 유도하면, 키메라 부류 II r필린 단백질의 발현이 상당히 증가했다.
유도된 배양액의 샘플을 나트륨 도데실 설페이트(SDS-PAGE)의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석했다. 쿠마시 블루 염색을 이용하면 재조합 수막구균 키메라 부류 II 필린이 보이고 (대략 19,000 달톤의 겉보기 분자량) 이의 동정은 부류 II 필린 단백질의 아미노 말단의 보존된 영역에 위치된 임균 펩티드(Glu Ala Ile Leu Leu Ala Glu Gly Gln Lys Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Lys)(서열 번호:24)에 대한 폴리클로날 항혈청을 이용하여 웨스턴 블 랏으로 확인했다. 수막구균 키메라 부류 II r필린은 길이가 170 아미노산(시그널 포함)(서열 번호:4)이고, 여기서 아미노산 1-126은 엔.메닌지티디스에서 유래된 것이고 아미노산 127-170은 엔.고노리아에서 유래된 것이다.
실시에 7
이. 콜라이로부터 재조합 임균 필린의 분리 및 정제
하기 과정을 이용하여 상기 실시예 2와 3에서 얻어진 재조합 임균 필린을 정제했다. 이 과정을 사용하여 실시예 4에서 얻어진 수막구균 재조합 필린을 정제하고 이를 사용하여 초기에 상기 실시예 5에서 얻어진 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질을 정제했다. 차후, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질의 분리 과정을 하기 실시예 8에 기재된 바와 같이 변형시켰다.
r필린을 발현시키는 이.콜라이의 하부-세포 분획화는 단백질이 이러한 단백질을 용해시키는 1%(용적/용적) TritonTM X-100의 능력을 기초로 세포막, 대부분은 내막과 결합됨을 보여준다. 0.05-0.1%(용적/용적) TritonTM X-100의 존재하에 오염 이.콜라이 단백질을 제거하는 시도에서, pH 9.5이하에서 r필린이 이온 교환 컬럼과 일관되게 결합하지 않음을 발견했다. 이에따라, 이.콜라이 막 제조물의 r필린 단백질을 선택적으로 용해시키는 다수 세제의 능력을 조사했다.
1 L 배양액에서 세포 펠릿(대략 5 g 습윤 중량)을 10 mM Hepes(pH 7.2) 30 mL(Research Organics, 미국 오하이오 클리브랜드), 1 mM EDTA를 첨가하여 해동시키고 Microfluidizer 세포 분쇄기(Microfluidics International Corp., 미국 매사 츄세츠 뉴톤)를 사용하여 세포를 파괴한다. 용해물을 원심분리(10분간 12,000 x g)하여 정화하고 막을 펠릿화했다(1시간 동안 288,652 x g). 막을 10 mM Hepes(pH 7.4) 33 mL, 1 mM MgCl2에서 재현탁시키고 실온에서 한 시간동안 하기 세제 중 하나로 추출했다: (a) TritonTM X-100(TX100)(Calbiochem-Novabiochem International, 캘리포니아 샌디에고), (b) 환원 TritonTM X-100(Calbiochem), (c) 옥틸-β-D-글루코피라노시드(OG)(Calbiochem), (d) ZwittergentTM 3-8(Z3-8)(Calbiochem), (e) ZwittergentTM 3-10(Z3-10)(Calbiochem), (f) ZwittergentTM 3-12(Z3-12)(Calbiochem), (g) ZwittergentTM 3-14(Z3-14)(Calbiochem), (h) Empigen BBTM (Calbiochem) 또는 (i) TweenTM 80 (ICN, 오하이오 클리브랜드).
EmpigenTM BB (1% 용적/용적), ZwittergentTM 3-10(1% 중량/용적), 환원 TritonTM X-100(1% 용적/용적), 옥틸 글루코시드(1% 중량/용적)+ZwittergentTM 3-10(1% 중량/용적) 또는 3-14(0.1% 중량/용적) 각각은 이.콜라이 단백질로 최소 오염된 재조합 필린 단백질을 선택적으로 추출한다. ZwittergentTM 3-12는 심지어 0.1%(중량/용적)에서조차 재조합 단백질과 상당수의 이.콜라이 단백질 모두를 용해시킨다. TweenTM 80은 시험 농도(0.1-1% 용적/용적)에서 재조합 단백질을 추출하지 못했다.
용해된 단백질을 원심분리(1시간 동안 288,652 x g)에 의해 불용성 막 물질로부터 분리했다. (r필린을 함유한) 상등액을 하기 비-이온 세제 중 하나를 함유한 10 mM TrisTM (pH 8.5)을 이동하여 4℃에서 밤새 투석했다: (a) 0.1% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14, (b) 1% (중량/용적) ZwittergentTM 3-10 또는 (c) 1%(중량/용적) OG. 투석된 물질을 FractogelTM EMD TMAE-650(S)(EM Separations Technology, 로드 아일랜드 웨이크필드)에서 분획화하고, 컬럼을 10 mM TrisTM (pH 8.5) 및 개개 세제에서 평형화시켰다. 결합된 단백질을 적절한 세제를 함유한 10 mM TrisTM (pH 8.5)에서 0에서 0.2 M NaCl의 직선 구배를 이용하여 용출했다. r필린을 함유한 분획을 풀링하고, 순도와 단백질 함량을 분석했다. 때때로, r필린의 순도를 증가시키기 위해, 풀링된 물질을 출발 완충액으로 투석시키고 TMAE 컬럼상에서 두번째 분획화를 수행했다.
컬럼에서 선택적으로 용출된 r필린은 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE의 레이저 덴시토미터 분석으로 판단시 고도로 정제되었다(>90% 균일). 1%(중량/용적) ZwittergentTM 3-10, 1%(중량/용적) OG 또는 0.1% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14를 이용하여 추출 및 컬럼 크로마토그래피를 수행할 경우 마찬가지 결과가 얻어졌다. 총 이.콜라이 단백질의 상당 비율인 r필린의 수율은 SOB 배지를 지닌 1.5 L 교반 플라스크에서 자란 대략 10 mg/L 배양액이다. (pPX2002를 함유한) 재조합 이.콜라 이를 HySoyTM계 배지를 이용하여 발효조에서 생장시키면, 정제된 r필린의 수율은 배양액의 대략 30 mg/L로 증가하고, 이는 7 mg r필린/g 세포 매스에 대응된다. 1% 덱스트로스가 발효조에 포함되면, r필린의 전체 수율은 대략 100 mg/L로 증가했다.
정제된 r필린을 10 mM 나트륨 포스페이트, 0.05%(중량/용적) Z3-14를 함유한 140 mM NaCl(pH 7)(PBS)로 투석하고, 멸균 여과한 다음 4℃에서 보관하거나 -20℃에서 동결시켰다.
실시예 8
이. 콜라이로부터 수막구균 키메라 부류 I r 필린의 분리 및 정제
pPX2004를 함유한 이.콜라이 세포의 대규모 배양액을 실시예 2에 기재된 Biostat B 발효조에서 생장시켰다. 박테리아 세포(이.콜라이 pPX2004의 대략 88 그램 습윤 중량)를 10 mM Hepes 440 mL, 1 mM EDTA(pH 7.5)에서 재현탁시키고 Microfluidizer Model 110Y(Microfluidics Corp., 매사츄세츠 뉴턴)를 사용하여 파괴했다. 파괴된 세포를 10℃에서 20분간 6,084 x g으로 원심분리시켜 정제했다. 상등액을 모으고 막 분획을 10℃에서 1시간 동안 205,471 x g으로 원심분리시켜 분리했다. 펠릿을 10 mM Hepes 220 mL, 1 mM MgCl2, 1% (중량/용적) 옥틸-β-D-글루코피라노시드(pH 7.5)에서 분쇄시켜 재현탁시키고 실온에서 90분간 교반했다. 현탁물을 10℃에서 1시간 동안 205,471 x g으로 원심분리했다. 원심분리 후, 용해된 키메라 부류 I r필린을 함유한 상등액을 0.22μ Nalgene 진공 필터를 통해 여과하고 4℃에서 보관했다. 옥틸글루코시드 추출물의 pH를 농축 NaOH를 이용하여 pH 8.5로 조절하고 차후 25 mM TrisTM, 0.1% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14(pH 8.5)로 평형화된 200 mL TMAE FractogelTM 컬럼(EM Separations Technology, 뉴저지 깁스타운)상으로 로딩했다. 결합되지 않은 단백질을 추가 평형 완충액 400 mL를 이용하여 컬럼을 통해 세척시켰다. 25 mM TrisTM, 0.1% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14(pH 8.5)에서 10 컬럼 용적에 걸쳐 10.0 mL/분의 용출속도로 직선 NaCl 구배(0-0.2 M NaCl)을 이용하여 r필린을 용출시켰다. 키메라 부류 I r필린을 함유한 분획을 풀링하고 dH2O를 이용하여 1:1 희석한 다음 10 mM NaPO4, 0.1% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14(pH 6)으로 평형화된 40 ㎛ 세라믹 하이드록시아파티트 컬럼(Bio-Rad, 캘리포니아 헤큘리즈) 100 mL상으로 로딩했다. 결합되지 않은 단백질을 평형 완충액 추가 200 mL를 이용하여 컬럼을 통해 세척했다. 0.1% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14를 함유한 직선 NaPO4 구배(10-150 mM NaPO4)를 이용하여 10 컬럼 용적에 걸쳐 5.0 mL/분의 용출 속도로 키메라 부류 r필린을 용출시켰다. SDS-PAGE 분석에 의해 분획을 선별하고 키메라 부류 I r필린을 함유한 것들을 풀링했다. 정제된 물질은 쿠마시 블루-염색된 겔의 레이저 덴시토미터로 측정시 적어도 95%로 순수하다. 정제된 키메라 부류 I r필린의 수율은 대략 35 mg/g 습윤 중량 세포이다.
실시예 9
이. 콜라이로부터 수막구균 키메라 부류 II r 필린의 분리 및 정제
구체적으로 명시되지 않으면 모든 단계를 실온에서 수행한다. 동결된 이.콜라이 세포를 10 mM Hepes 10 ml(pH 7.2), 1 mM EDTA/g 세포에서 재현탁시키고, Microfluidizer 세포 분쇄기를 이용하여 분쇄시켜 세포를 파괴했다. 세포 용해물을 13,689 x g으로 30분간 원심분리하여 정화시켰다. 생성된 상등액을 4℃에서 30분간 388,024 x g으로 원심 분리했다. 상등액을 버리고 막을 함유한 펠릿을 밤새 -20℃에서 동결시켰다. 막 펠릿을 9 mL/10 mM Hepes 튜브(pH 7.2), 1 mM MgCl2에서 재현탁하고 1시간 동안 1%(중량/용적) ZwittergentTM 3-16(Calbiochem)으로 추출했다. 현탁액을 388,024 x g으로 30분간 원심분리하고 생성된 펠릿을 앞서 기재된 바와 같이 ZwittergentTM 3-16으로 다시 추출했다. 원심분리(388,024 x g 30분간) 후, 펠릿을 50 mM TrisTM(pH 8.0) 9 mL, 5 mM EDTA중으로 재현탁시키고 실온에서 밤새 부드럽게 교반하면서 1%(중량/용적) N-라우릴사르코실(Sigma)로 추출했다. 이로인해 수막구균 키메라 부류 II r필린이 용해되었다. 불용성 물질을 원심분리(388,024 x g 30분간)로 제거하여 버렸다. ZwittergentTM 3-14를 수막구균 키메라 부류 II r필린을 함유한 상등액에 첨가하여 최종 농도 1%(중량/용적)을 만들고 물질을 50 mM TrisTM(pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% ZwittergentTM 3-14로 밤새 투석했다. 투석된 물질 분취량(1 mL, 1.3 mg 단백질)을 50 mM TrisTM (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1%(중량/용적) ZwittergentTM 3-14에서 평형화된 Mono-QTM(Pharmacia, 뉴저지 피츠카타웨이) 컬럼(5 x 10 mm)위로 0.5 mL/분의 유동 속도로 통과시켰다. 키메라 부류 II r필린을 함유한 결합되지 않은 물질을 풀링하고 밤새 10 mM NaPO4 (pH 6.8), 1%(중량/용적) ZwittergentTM 3-14로 투석했다. 이 물질은 대략 80%로 순수하고 하기 실시예 26과 27에 기재된 조사에 이용했다. 이러한 물질의 추가 정제는 10 mM NaPO4 (pH 6.8), 1%(중량/용적) ZwittergentTM 3-14에서 평형화된 1 mL 하이드록시아파티트 컬럼(Bio-Rad)위로 이를 통과시켜 얻어졌다. 정제된 수막구균 키메라 부류 II 단백질을 1%(중량/용적) ZwittergentTM 3-14를 함유한 0-0.5 M NaPO4의 직선 구배를 이용하여 용출시켰다. 쿠마시 블루 또는 은으로 염색된 겔을 이용하는 SDS-PAGE에 의해 키메라 부류 II r필린에 대한 분획을 선별했다. 두 분석은 대략 19,000 달톤의 분자량을 지닌 단일 폴리펩티드 밴드의 존재를 보여주었다. 이러한 물질은 폴리아크릴아미드 겔의 레이저 덴시토미터 분석에 의하면 95% 이상의 순도를 보인다.
실시예 10
임균 r 필린에 대한 분석 방법
BSA를 표준으로 이용하여 비신코닌산 단백질 분석(Pierce, 일리노이 록포드)으로 단백질 함량을 측정했다. 단백질 제조물의 순도를 SDS의 존재하에 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정하고 Personal Densitometer SI(Molecular Devices)를 이용한 레이저 덴시토미터로 분석했다. 제조물에서 필린의 존재는 실시예 2에 기재된 엔.고노리아 균주 P9(Biospacific)에서 정제된 필리에 대항해서 생긴 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 확인되었다. 필린 단백질의 N-종결 서열을 Applied Biosystems 477A Protein Sequencer을 이용하여 결정했다. 두 서열은 정제된 r필린이 N-종결 서열 분석을 위해 제공될 때 종종 검출된다. 주된 서열은 7개의 아미노산 리더 서열을 포함한 완전한 필린 단백질을 나타낸다. 샘플의 10-20%를 포함하는 소(minor) 서열은 r필린 단백질이며 여기에는 리더 서열이 없고 서열은 성숙 임균 필린 단백질의 N-종결 잔기인 페닐알라닌에서 출발한다. 두 r필린 단백질 형태의 경우, 아미노-말단 잔기의 서열분석은 DNA 서열에서 유래된 서열과 일치하는 결과를 제공한다.
재조합 필린의 질량은 Finnagan MAT LasermatTM 2000(캘리포니아 샌 호세)를 이용하여 플라이트 (MALDI-TOF) 질량 분석기의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 시간에 의해 측정되었다. 말의 마이오글로빈을 이용하여 기구를 16,951.5 달톤의 예상 질량의 0.01% 이내로 보정했다. 재조합 필린을 등 분량의 시아노-4-하이드록시신남산 매트릭스(70:30 아세토니트릴:0.1% (용적/용적) 트리플루오로아세트산/물에서 10 mg/mL)와 혼합했다. 이 혼합물의 분취량(1 μL)을 샘플 스테이지에 두고, 공기 건조시킨 다음, MALDI-TOF 질량 분석기로 분석했다. 15회 실행(각 실행은 10 샷의 합을 나타냄)에서 나온 데이터를 평균하여 r필린의 질량을 측정했다. (시그널 을 지닌) r필린의 분자량은 18,001 달톤으로 나타났고, 이는 아미노산 함량을 기준으로 한 예상 질량 17,981 달톤에 필적한다. 질량 17,232 달톤(평균)의 소 피크를 각 롯(lot)에서 검출했다. 재조합 필린의 두 형태의 분자량간의 차이(769 달톤)는 774 달톤의 질량을 지닌 리더 서열의 초기 6 아미노산(Met Asp Thr Leu Gln Lys)(서열 번호:2, 아미노산 1-6)의 손실분으로 여겨진다.
0.05% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14를 함유한 BPS에서 평형화된 분석용 SuperoseTM 12 컬럼(Pharmacia, 뉴저지 피츠카타웨이)을 이용한 크기 배제 컬럼 크로마토그래피에 의해 매우 상이한 겉보기 분자량의 r필린을 얻었다. 이들 조건하에, 단백질은 68,899의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이는 재조합 단백질이 결집되었음을 의미한다. 그러나, 크기 배제 컬럼에서 나온 단백질의 용출은 단백질의 형상에 의해 굉장히 영향을 받을 수 있다. 속도 침강 원심분리 실험의 결과는 재조합 필린이 대략 45,000 달톤의 용액내 분자량을 가짐을 증명한다. 세제(ZwittergentTM 3-14)를 제거하는 시도에서, 재조합 단백질을 PBS만으로 투석했다. 투석된 재조합 단백질은 가용성인 것 같고 고속 원심분리(122,000 x g 1시간 동안)에 의해 펠릿화되지 않았다. 재조합 단백질로부터 세제의 완전한 분리를 입증하는 시도는 없었다. PBS에서 겔 여과에 의한 물질의 분석은 단백질이 452,349 달톤의 겉보기 분자량을 가짐을 나타낸다. 이는 추가적인 결집이 행해졌음을 의미한다. 덩어리 상태의 서브유닛의 수는 측정되지 않았다.
세제가 샘플로부터 완전히 제거되었는 지를 모르기 때문에 단백질이 여전히 마이셀 상태일 수 있어, 452,349의 값은 추정치로 간주되어야 한다. r필린이 백신 형태로 제형될 때 대략 15-30배로 희석된다면, 백신내의 r필린은 대략 450 kD의 겉보기 분자량을 가질 것으로 여겨진다.
실시예 11
r 필린으로부터 면역 혈청의 제조
보조제와 혼합된 정제된 임균 r필린 단백질 20 ㎍으로 피하 면역된 기니아 피그(암컷, 200 g)를 이용하여 면역원성 연구를 수행했다. 연구된 보조제는 (a) PBS(pH 6)에서 StimulonTM QS-21 (25 ㎍/투여량); (b) PBS(pH 7)에서 알루미늄 포스페이트(Lederle Laboratories, 뉴욕 펄 리버, 100 ㎍/투여량); 또는 (c) 단독 PBS(pH 7)이다. 초기에, 동물을 0, 4 및 8주째에 면역화시키고 혈청을 0, 4, 6 및 10주째에 얻었다. 시간에 따른 면역 반응 분석은 8주째 세번째 백신접종이 면역 반응을 상승시키지 않아, 재조합 필린을 이용한 후기 연구가 6주째 채혈로 종결됨을 설명해 준다.
임균 r필린의 면역 반응을 조절하는 보조제의 능력을 조사하기 위해, 마우스(8주간 자란 암컷, 5 또는 10 동물/그룹)를 0, 4 및 6주째에 1-10 ㎍ 정제 단백질로 피하 면역시키고 0, 4, 6 및 8주째에 혈청을 얻었다. RPMI 1640 (75㎕)을 질내에 떨어뜨리고 3-4회 빨아내어 8주째에 질 세척을 행했다. 각 그룹에서 나온 세척액을 함께 풀링하고 태 소 혈청 50 ㎕를 각 풀에 첨가했다.
수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질의 경우, 마우스를 0 및 4주째만 면역 화시키고 0, 4 및 6주째에 혈청을 얻었다. 마우스에서 모든 r필린 비경구 면역원성 연구를 위해, 하기 보조제를 조사했다: (a) PBS (pH 6)에서 StimulonTM QS-21 (25㎍/투여량); (b) PBS (pH 7)에서 알루미늄 포스페이트(100 ㎍/투여량); (c) PBS (pH 7)에서 MPLTM (50 ㎍/투여량); (d) PBS (pH 7)에서 알루미늄 포스페이트(100 ㎍/투여량) 및 MPLTM (50 ㎍/투여량); 또는 단독 PBS (pH 7).
수막구균 키메라 부류 II r필린 단백질의 경우, 기니아 피그를 0 및 4주째만 PBS (pH 6)에서 StimulonTM QS-21 (25㎍/투여량)으로 보조된 20 ㎍ 단백질로 면역화시키고 0, 4 및 6주째에 혈청을 얻었다.
점막 면역 반응을 유도하는 재조합 발현된 필린(임균 또는 수막구균 키메라 부류 I)의 능력을 (a) 네이티브 콜레라 독소 1 ㎍의 존재 또는 부재하의 식염수 2.5 ㎕에서 임균 r필린 1 또는 10 ㎍, 또는 (b) 돌연변이체 CT-CRM 1 ㎍, E29H 콜레라 독소의 존재 또는 부재하에, PBS (pH 7) 10 ㎕에서 희석된 키메라 부류 I r필린 5 ㎍을 마우스로 비내 면역화시켜 평가했다. 0, 2 및 3주째에 면역화시켰다.
실시예 12
임균 r 필린에 대한 면역 반응의 웨스턴 블랏 분석
정제된 임균 r필린을 사용하여 실시예 11에 기재된 프로토콜에 따라 기니아 피그를 면역화시켰다. 임균 r필린으로 면역화된 기니아 피그에서 유도된 항혈청을 우선 웨스턴 블랏으로 분석했다(데이터는 제시되지 않음). 이들 블랏은 임균 r필린 에 대한 항혈청이 필리 달린 임균 세포의 완전 세포 용해물중의 필린에 대응되는 밴드를 인식하고; 동일한 임균에서 나온 필리없는 세포 용해물에서 염색이 보이지 않음을 설명한다.
임균 필린 올리고머로 면역된 기니아 피그의 항혈청으로부터 비교 데이터를 얻었다. 앞서 기재된 온전한 필리를 해리시켜 필린 올리고머를 얻었다(4). 간단히 말해, 이는 4℃에서 48시간 동안 37 mM 나트륨 포스페이트(pH 12)로 온전한 필리를 투석시킨데 이어, 50 mM TrisTM, 145 mM NaCl (pH 8.0)으로 투석을 수반했다. 필린 올리고머를 원심분리(100,000 x g 1시간 동안)하여 정화시켰다. 원심분리 후, 필린 올리고머가 상등액에 남았다. 임균 r필린에 대한 항혈청과 비교해, 필린달린 세포 용해물에서 필린에 결합하는 동안 필린 올리고머 항혈청도 필리 달린 세포 및 필리없는 세포 모두의 용해물에서 다수의 기타 밴드에 결합했다(데이터는 제시되지 않음). 이들 밴드는 필린 올리고머 제조물에서 오염물을 나타내고 필리와 결합하지는 않은 것 같다.
실시예 13
재조합 임균 필린 ELISA
정제된 단백질 또는 박테리아 세포에 대한 종점 역가를 ELISA로 측정했다. 모든 ELISA 과정에서, 배양은 달리 언급이 없으면 실온에서 1시간 동안이다. 종점 역가는 광학 흡광도가 (1차 항체를 함유하지 않은) 블랭크 웰의 것의 0.10배 큰 값에서 추론된 희석값으로 정의된다. 기니아 피그 항혈청 분석을 위해, 정제된 재조 합 필린을 0.1 M TrisTM (pH 8)에서 희석시켜 최종 농도 1 ㎍/mL를 만들었다. 분취량(100 ㎕)를 마이크로타이터 플레이트(Immulon II, Nunc, 일리노이 나퍼스빌)의 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양했다. 플레이트를 Skanwash 300 플레이트 세척기(Skatron Instruments, 버지니아 알렉산드리아)를 이용하여 0.05% (용적/용적) TweenTM-20 (PBS-T)를 함유한 PBS로 5회 세척했다. PBS-T에서 1%(중량/용적) BSA 200 ㎕를 사용하여 웰을 블로킹하고, 세척한 다음 (PBS-T에서 0.1%(중량/용적) BSA에서 희석된) 항혈청의 분취량을 웰에 첨가했다. 플레이트를 세척하고 50 mM TrisTM (pH 8)중 0.1%(중량/용적) BSA에서 토끼 항-기니아 피그 IgG (중쇄 및 경쇄)(Zymed Laboratories, 캘리포니아 사우쓰 샌프란시스코) 희석된 1:2000 희석액과 접합된 알칼라인 포스파타제 100 ㎕를 이용하여 결합된 1차 항체를 검출했다. 플레이트를 세척하고 100 ㎕/p-니트로페놀 포스페이트 웰(Sigma)(0.5 M 디에탄올아민중 2 mg/mL, 0.25 mM MgCl2, pH 9.8)을 이용하여 발색시켰다. 30분 후, 3 N NaOH 50 ㎕를 첨가하여 반응을 멈췄다. 405 nm에서 Thermomax ELISA 플레이트 리더(Molecular Devices, 캘리포니아 서니베일)에서 흡광도를 읽었다.
표 1에 도시된 항원 ELISA로 알 수 있듯이, r필린으로 면역된 모든 동물이 매우 잘 반응했다.
표 1
정제된 재조합 임균 필린 단백질로, 임균 r필린에 대한 풀링된 기니아 피그 항혈청의 결합에 대한 종점 역가*
제조물 면역원 종점 역가
0주 4주 6주
1 r Pgh3-1 필린 (제조물 1) ≤100 51,345 494,805
2 r Pgh3-1 필린 (제조물 2) 54 30,237 594,298
3 r Pgh3-1 필린 (제조물 3) ≤100 24,830 546,682
* r필린의 세가지 다른 롯이 면역원으로 사용됨. 0 및 4주째 기니아 피그를 (피하)면역시키고 0, 4 및 6주째 채혈함. 풀링된 혈청에서 분석을 행함.
면역 반응에 대한 보조제의 효과
임균 r필린에 대한 면역 반응에 미치는 하기 보조제의 효과를 마우스에서 조사했다: (a) PBS(pH 6)에서 StimulonTM QS-21; (b) PBS(pH 7)에서 알루미늄 포스페이트; (c) PBS (pH 7)에서 MPLTM; (d) PBS(pH 7)에서 알루미늄 포스페이트 및 MPLTM; 또는 PBS(pH 7) 단독. 마우스 항혈청 분석을 위해, 항원 ELISA 프로토콜을 하기와 같이 변형시켰다. 마이크로타이터 플레이트(Costar EIA/RIA, Corning Costar, 매사츄세츠 캠브리지)를 37℃에서 밤새 PBS에서 1 ㎍/mL r필린 100 ㎕로 코팅했다. 플레이트를 Skantron 300 플레이트 세척기로 0.1% (용적/용적) TweenTM-20을 함유한 PBS를 이용하여 5회 세척했다. 웰을 0.1% (중량/용적) 젤라틴 및 0.02%(중량/용적) NaN3를 함유한 PBS로 블로킹했다. 1차 항체를 0.1% (중량/용적) 젤라틴, 0.05% (용 적/용적) TweenTM-20(PBS-TG) 및 0.02%(중량/용적)NaN3를 함유한 PBS에서 희석시키고 100 ㎕ 분취량을 2시간 동안 마이크로타이터 플레이트에서 배양했다. 세척 후, PBS-TG 및 0.02% (중량/용적) NaN3에서 1:8000으로 희석된 바이오티닐화된 토끼 항-마우스 IgG (Fc 영역)(Brookwood Biomedical, 앨라바마 버밍햄)를 이용하여 결합된 1차 항체를 검출했다. 플레이트를 세척하고 PBS-TG 및 0.02% (중량/용적) NaN3 (30분간 배양)에서 1:5000 (Zymed Laboratories)로 희석된 스트렙타비딘 접합된 홀스래디시 퍼옥시다제를 이용하여 2차 항체를 검출했다. 플레이트를 세척하고 0.03% (용적/용적) 수소 퍼옥사이드를 함유한 0.1 M 시트레이트(pH 4.2)에서 0.5 mg/mL 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS)를 이용하여 30분간 발색시킨 다음 SLT 340 ATTC 마이크로플레이트 리더(SLT Labinstruments, 노쓰캐롤라이나 리서치 트라이앵글 파크)를 이용하여 405 nm에서 모니터링했다. 로그-로그 플롯을 이용하여 데이터를 플롯팅하고 앞서 기재된 바와 같이 종점 역가를 측정했다.
r필린에 MPLTM을 보조시키면, StimulonTM QS-21의 경우에 도시된 것과 크기가 유사한 체액 면역 반응이 마우스에서 얻어졌다(표 2a). 동일한 동물로부터 질 세척 분석도 이들 동물의 질 세척에서 명백한 IgG 역가를 보여준다.
표 2a
임균 r필린에 대한 체액 면역 반응에 미치는 보조제의 효과* :
항원 ELISA 완전 세포 ELISA
상동성 균주 이종성 균주
보조제 r필린 Pgh3-1 LB2 #11 T-1 I756
AlPO4 361,260 249,410 93,444 141,622 42,535 89,615
MPLTM 1,262,735 902,891 499,223 586,642 165,301 321,340
AlPO4+ MPLTM 1,159,670 265,269 112,856 160,814 41,368 110,162
StimulonTM QS-21 4,915,200 1,053,446 478,338 440,014 111,753 333,341
표 2b
임균 r필린에 대한 면역 반응에 미치는 보조제의 효과* (질 세척**):
보조제 r필린 역가 완전 세포 역가***
IgG IgA LB2 P+ LB2 P-
AlPO4 1,452 262 68 ≤50
MPLTM 6,409 26 1,128 0
AlPO4 + MPLTM 938 12 120 ≤50
StimulonTM QS-21 2,716 175 311 37
* Balb/c 마우스(5/그룹)를 0, 4 및 6주째 앞서 기재된 바와 같이 보조된 r필린 10 ㎍으로 면역시킴. 동물을 0, 4, 6 및 8주째 채혈함. 8주째 풀링된 혈청에서 분석을 행함. 0주째 종점 역가는 ≤5000임. ** 8주째 풀링된 질 세척물이 얻어짐. *** 건조된 세포를 이용하는 완전 세포 ELISA. P+: 필리 달린 세포. P-: 필리 달린 모 세포에서 유도된 필리없는 변종.
실시예 14
임균 완전 세포 ELISA
온전한, 결집 필리상에서 발견된 상당수의 크로스-반응성 에피토프의 r필린의 발현이 완전 세포 ELISA에서 차후 증명되었으며, 정제된 r필린에 대한 항혈청은 이종성 필리를 발현시키는 다수의 임균에 대해 높은 역가를 나타내었다. 살아있는 임균 세포에 결합하는 기니아 피그 항혈청의 능력은 하기 프로토콜을 사용하여 행해졌다. 마이크로타이터 플레이트(Immunolon II)를 4℃에서 PBS에서 0.01% (중량/용적) 폴리-L-라이신 (Sigma) 100 ㎕를 사용하여 밤새 배양했다. 박테리아의 밤새 아가 배양액을 Dacron swab를 사용하여 PBS로 수거하고 현탁액의 혼탁도를 A600 = 1.0으로 조절했다. 폴리-라이신 용액을 마이크로타이터 플레이트로부터 버리고 박테리아 현탁액 100 ㎕ 분취량을 웰에 첨가했다. 플레이트를 핸드-헬드 Nunc 플레이트 세척기를 사용하여 PBS로 5회 세척하고 1% (중량/용적) BSA를 함유한 PBS 200 ㎕(PBS-B)로 블로킹했다. 플레이트를 PBS로 5회 세척하고 PBS중의 0.1% (중량/용적) BSA에서 희석된 항혈청 100 ㎕ 분취량을 웰에 첨가했다. PBS로 5회 세척 후, PBS중의 0.1% (중량/용적) BSA에서 1:2000 희석으로 앞서 실린 적절한 알칼라인 포스파타제 접합물 100 ㎕를 사용하여 결합된 항혈청을 검출했다. 플레이트를 세척하고, 발색시킨 다음 앞서 기재된 바와 같이 흡광도를 읽었다(30분간 전개).
완전 세포 ELISA로 분석하면, r필린에 대한 기니아 피그 항혈청은 다양한 지리학적 위치의 필리 달린 분리균과 결합하지만, 동일한 임균의 상응하는 필리없는 세포에는 결합하지 않았다(표 3).
표 3
다양한 균주의 살아있는 임균 세포로 r필린에 대한 기니아 피그 항혈청의 결합에 대한 종점 역가*
균주 원천 Pgh3-1 r필린 (제조물 1) Pgh3-1 r필린 (제조물 2) Pgh3-1 r필린 (제조물 3)
Pgh 3-1 P+ 피츠버그 2,940,971 2,461,272 2,373,641
Pgh 3-1 p- 피츠버그 <250 <250 <250
LB2 P+ 미지 505,439 481,815 825,517
LB2 P- 미지 187 34 114
I-756 P+ 캐나다 온타리오 689,309 713,904 1,026,231
1948 P+ 루마니아 290,367 259,487 325,640
1635P P+ 파나마 2,714,006 ≥546,750 ≥546,750
22714FB P+ 노쓰캐롤라이나 포트 브래그 397,763 346,895 498,882
T-1 P+ 미지 189,490 317,370 272,828
M-2 P+ 미지 124,906 117,734 151,966
3138K P+ 한국 220,730 179,127 584,044
N-2 P+ 버지니아 노르포크 350,210 337,232 435,164
J474B P+ 자마이카 238,640 205,247 380,970
새로운 임상 분리균 52407 P+ 플로리다 탬파 598,124 890,678 778,607
#11 P+ 뉴욕 로체스터 214,673 292,358 385,985
FA1090:
2-57-U17 P+ 노쓰 캐롤라이나 차펠 힐 1,364,126 2,379,267 3,791,263
2-42-U14 P+ 노쓰 캐롤라이나 차펠 힐 1,449,757 1,964,641 11,619,267
* r필린의 세가지 다른 롯을 면역원으로 사용함. 기니아 피그를 앞서 기재된 바와 같이 (피하) 면역시킨 다음 채혈함. 6주된 혈액의 풀링된 혈청을 분석함. 0주째 혈청의 종점 역가는 ≤250임. P+: 필리 달린 세포. P-: 필리 달린 모 세포에서 유도된 필리없는 변종.
r필린에 대한 마우스 항혈청의 완전 세포 ELISA 분석(표 2)을 마이크로타이터 플레이트(여기서 박테리아는 하기 프로토콜에 의해 웰에서 건조됨)를 이용하여 행했다. 박테리아의 밤새 아가 배양액을 Dacron swab를 이용하여 PBS로 회수하고 현탁액의 혼탁도를 A600=0.1로 조절했다. 박테리아 현탁액의 분취량(100 ㎕)을 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 공기 건조했다. 모든 액체를 증발시킨 후, 플레이트 를 봉하고 사용시까지 4℃에서 보관했다. 마우스 항혈청의 항원 ELISA에 대해 앞서 기재된 프로토콜에 따라 나머지 분석을 행했다. 완전 세포 ELISA의 데이터(표 2 및 3)는 r필린이 필리 달린 임균의 표면에 보존된 에피토프에 부착하는 항체를 유도함을 암시한다.
실시예 15
임균 r 필린에 대한 점막 면역 반응의 유도
임균은 생식기 점막 질환이기 때문에, 점막 면역 반응을 유도하는 점막 면역화 능력을 조사함이 관건이다. 이를 하기의 방법으로 수행했다. 마우스를 0, 1 및 2주째 네이티브 콜레라 독소 1 ㎍의 존재 또는 부재하에 식염수에서 임균 r필린(10 ㎕에서 1 또는 10 ㎍)으로 비내 면역화시켰다. 5개의 Swiss-Webster 마우스 그룹을 0, 1 및 2주째 콜레라 독소 존재 또는 부재하에 r필린으로 비내 면역화시켰다. 풀링된 혈청에서 분석을 행했다. 0주째 종점 역가는 <50이다.
하기 표 4에서 알 수 있듯이, 보조제의 부재하에 동물이 r필린으로 면역화되면 항원 ELISA에서 상당한 면역 반응이 검출되었다(0주째 역가는 <300임). 이러한 반응은 네이티브 콜레라 독소를 첨가하여 증진되었다.
표 4
정제된 재조합 임균 필린 단백질로, 임균 r필린에 대한 풀링된 마우스 항혈청의 결합에 대한 종점 역가
항원 (투여량 ㎍) 보조제 (투여량 ㎍) 22일 36일 50일
r필린 (1) r필린 (10) r필린 (1) r필린 (10) 없음 없음 없음 콜레라 독소(1) 콜레라 독소(1) 콜레라 독소(1) 1,684 29,046 4,673 107,011 <300 1,287 20,658 7,526 321,714 <300 2,291 71,067 3,273 280,079 <300
다음, 이들 혈청을 엔.고노리아 균주 FA1090 세포에 대해 수행된 ELISA에 의해 온전한, 필리 달린 임균 세포에 결합하는 능력을 조사했다. 세포를 앞서 기재된 마이크로타이터 플레이트상에서 건조시켰다. 표 5에서 알 수 있듯이, 낮은 역가가 r필린 단독의 경우에 검출되었다(0주째 역가는 <300임). 필리 달린 세포에 대한 결합은 콜레라 독소의 첨가에 의해 굉장히 증진되었다.
표 5
완전, 필리 달린 임균 세포로, 임균 r필린에 대한 풀링된 마우스 항혈청의 결합에 대한 종점 역가
항원 (투여량 ㎍) 보조제 (투여량 ㎍) 22일 36일 50일
r필린 (1) r필린 (10) r필린 (1) r필린 (10) 없음 없음 없음 콜레라 독소(1) 콜레라 독소(1) 콜레라 독소(1) 1,009 6,009 1,133 209,522 239 852 6,252 1,456 57,767 <500 729 5,564 1,048 38,127 <500
실시예 16
임균 면역전자 현미경법
필리 달린 박테리아에 대한 항혈청의 결합의 가시화를 하기 프로토콜을 이용 하여 수행했다. 금 도금된 그리드를 recA-, 필리 달린 엔.고노리아의 후기 로그상 액체 배양액 중 분취량으로 5분간 스폿팅하고 과량의 유체를 여과지로 제거했다. 그리드를 PBS-B로 5분간 블로킹한 다음 PBS에서 1% (중량/용적) 피시 젤라틴(Fluka, 뉴욕 론콘코마)으로 10분간 블로킹했다. 그리드를 실온에서 1-60분간 PBS-B에서 희석된 폴리클로날 항혈청으로 배양했다. PBS-B 비말상에 그리드를 띄워 결합되지 않은 항체를 제거했다(4 x 30 초). 30분간 PBS-B에서 1:5 희석된 보조 항-기니아 피그 IgG(Jackson Research Labs, 펜실베니아 웨스트 그로브)에 결합된 12 nm 콜로이드 골드 한 방출위에 그리드를 띄워 결합된 1차 항체를 검출했다. 그리드를 앞서 기재된 바와 같이 PBS-B 비말로 5회 세척했다. 샘플을 PBS중 1% (용적/용적) 글루타랄데히드(Electron Microscopy Sciences, 펜실베니아 포트 와싱턴)로 안정화시키고, 희석수에서 5 x 1분 세정한 다음 NanoVan 염색(NanoProbes, 뉴욕 스토니 브룩)(pH 8)을 이용하여 30초간 가볍게 염색했다. 그리드를 여과지와 접촉시켜 모든 액체를 제거하고 80 kv의 가속 전압을 이용하여 15-75,000 배율로 Zeiss 10C 투과 전자 현미경으로 조사했다.
면역전자 현미경에서 알 수 있듯이(도 1a), 재조합 필린에 대한 항체는 임균의 표면상에 이종성 필리 필라멘트의 길이를 따라 결합되었다. 이는 항체가 생체내 박테리아 표면상에 존재하는 에피트프와 결합했음을 암시한다.
실시예 17
임균 r 필린 올리고머의 완전 세포 ELISA
온전한 필리의 r필린 (또는 필린 올리고머)의 생화학적 및 면역학적 성질을 구분하기 위해, 정제된 r필린을 pH 12 포스페이트 완충액으로 투석시켜 r필린 올리고머로 전환시켰다. 이러한 물질 (r필린 올리고머)에 의해 유도된 항혈청을 완전 세포 ELISA를 사용하여 살아있는, 필리 달린 임균에 결합하는 능력을 조사했다. 표 6에서 알 수 있듯이, r필린 올리고머에 대한 항혈청은 처리되지 않은 r필린에 의해 유도된 항혈청과 비교해 볼때 다양한 필리 달린 임균 세포에 결합하는 상당히 낮은 종점 역가를 가진다. 이는 r필린 올리고머가 r필린 단백질상에 일반적으로 존재하는 상당수의 크로스-반응성 에피토프를 상실했음을 암시한다.
표 6
필리 달린 엔.고노리아 세포에 결합하는 r필린 기니아 피그 항혈청에 대한 종점 역가에 미치는 pH 12 ("올리고머화")의 효과*
균주 r필린 r필린 올리고머**
I-756 927,564 16,903
FA-19 107,100 1,982
FA1090 (2-57-U17) 721,786 6,737
LB2 905,711 4,205
#11 225,602 6,999
#4 288,120 8,104
3138K 106,315 5,429
T-1 497,987 42,162
1848 166,864 8,616
J474B 576,640 25,002
* 기니아 피그(그룹당 4)를 0주 및 4주째 StimulonTM QS-21 25 ㎕로 보조된 r필린 항원 20 ㎍로 (피하) 면역시킴. 6주째 풀링된 혈청을 분석함. ** 정제된 r필린을 4℃에서 48시간 동안 37 mM 나트륨 포스페이트 (pH 12)로 투석한 다음, 24시간 동안 PBS로 투석함.
실시예 18
인간 경부 세포에 대한 부착 저해
필리가 인간 점막 세포에 대한 엔.고노리아의 초기 결합을 매개하기 때문에, 내피세포로의 이들 박테리아의 부착력을 저해하는 r필린 항체의 능력을 조사했다. 경부암에서 유도된 ME-180 세포를 선택했다. 부가적으로, 이들 실험에서 필리 달린 박테리아의 덩어리화를 최소화하기 위해, 이들을 액체 현탁 배양액에서 생장시켰다. 이는 필리 발현을 유지하기 위해 임균 Pgh3-1 또는 I756의 recA- 유도체를 이용할 것을 요구한다. 이들 recA- 균주는 결과를 좀더 해석하기 쉽도록 액체 배양액에서 4-5시간 생장 동안 상당한 덩어리를 보이지 않는다.
이들 실험에서, 8 웰 챔버 슬라이드(Nunc)에 ME-180 세포를 시딩(seeding)하여 세포가 실험당일에 80-90% 유착되게 했다. recA- 임균 세포의 밤새 배양액을 (37℃에서 데워진) PBS로 스왑하고 최종 A600=0.2에 이르도록 0.4% (중량/용적) NaHCO3로 보충된 액체 GC 배지의 플라스크를 접종하는 데 사용했다. 세포 배양액을 대략 4 시간 동안 120 RPM으로 37℃에서 교반하면, 이 시점에서 배양액이 대략 A600 = 800에 이른다. 박테리아 세포 현탁액을 RPMI 1640에서 1:8로 희석시켰다. 2차 8 웰 챔버의 웰을 최소 1시간 동안 RPMI 1640 및 태 송아지 혈청 300 ㎕으로 배양했다. RPMI 1640 블록을 버리고 항혈청 또는 RPMI 1640 (송아지 혈청없이) 40 ㎕를 첨가한 다음, 희석된 박테리아 현탁액 (= 8 x 107 CFU) 260 ㎕를 첨가하고 37℃/5% (용 적/용적) CO2에서 1시간 동안 배양했다. ME180 세포를 지닌 챔버 웰 슬라이드를 항생제가 없는 RPMI 1640으로 1회 세척했다. 그 다음, 박테리아와 항혈청의 예비배양된 혼합물을 ME180 세포 상에 첨가하고 슬라이드를 37℃에서 30분간 배양했다. 결합되지 않은 박테리아 세포를 함유한 배지를 경부 세포 단층으로부터 제거하고 웰을 RPMI 1640으로 3회 부드럽게 세척했다. 마지막 세척 후, 챔버 웰을 슬라이드로부터 제거하고, 30-60초 동안 메탄올에 세포를 고정시키고 Wright-Giemsa 염색(VWR Scientific, 펜실베니아 웨스트 체스터)으로 염색했다. 물에서 탈색시킨 후, 커버슬립을 각 웰위에 마운팅시켰다.
오일 이머젼(oil immersion)을 이용하는 광 현미경으로 슬라이드를 조사하고 시험 혈청에 문외한인 사람으로 하여금 대표적인 광경을 사진 찍게했다. 사진을 샘플의 존재에 관해 모르는 사람으로 하여금 분석케 했다. 부가적으로, 필리 달린 임균이 덩어리로 내피 세포 단층에 결합하기 때문에, 임균 세포의 결합에 미치는 항혈청의 효과를 개개 박테리아 대신 박테리아 덩어리를 헤아려 정량했다. 각 웰을 가로질러 10군데의 랜덤 범위에서 관찰된 필리 달린 박테리아 덩어리의 수를 측정했다. 면역 및 정상 혈청을 함유한 웰간의 %차를 측정했다. 또한, 분석할 샘플에 대해 모르는 조사자로 하여금 이러한 분석을 독립적으로 행했다.
초기 결과는 필리 달린 세포 및 필리 없는 세포가 ME180 세포의 유착 단층에 대한 상이한 결합 패턴을 지님을 보여준다. 두 필리 달린 임균은 전형적으로 유착 단층내에서 선택된 내피 세포에 대한 박테리아 덩어리 형태로 결합했다. 반면, 대 응되는 이소게닉 필리없는 박테리아는 내피 세포 단층에 결합하지 않거나(Pgh3-1) 내피 세포 단층에 대해 낮은 수준의 분산 결합(I756)을 보였다. 따라서, 내피세포 단층상에 박테리아의 응집은 필리의 존재와 상관된다.
다음, 균주 I-756의 필리 달린 세포가 ME-180에 결합함을 저해하는 Pgh3-1 r필린에 대한 기니아 피그 항혈청의 능력을 시험했다. 대표적인 사진 분석(도 2a(6주)와 도 2b (0주) 비교)은 r필린에 대한 항체가 경부 내피세포로 필리 달린 임균의 결합을 저해함을 나타낸다. 반면, r필린 항혈청은 정상 기니아 피그 혈청과 비교시 동일한 균주의 필리없는 세포의 결합에 영향을 미치지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 이들 조건하에 결합된 박테리아의 수를 측정할 수는 없지만, 정상 또는 면역 혈청의 존재하에 결합된 박테리아 덩어리를 헤아려 부착력을 정량했다. 이 방법을 이용하여, r필린에 대한 항혈청이 정상 기니아 피그 혈청과 비교시 내피 세포에 결합된 박테리아 덩어리에서 대략 60% 감소가 일어났음을 결론지었다.
이러한 분석이 쉽게 정량가능한 데이터를 제공하지는 않지만, 박테리아 덩어리를 헤아려 얻어진 추정치가 항혈청의 효과의 측정치의 범위이내였다. 이는 r필린 단독에 대한 항혈청을 이용하여 극복될 수 없는 기타 세포 표면 성분 (예, Opa 단백질)에 의해 매개된 결합으로 인한 것이다.
실시예 19
수막구균 키메라 부류 I r 필린에 대한 분석 방법
키메라 수막구균 부류 I r필린에 대한 실시예 10에 기재된 분석 방법을 사용했다. MALDI-TOF 질량 분석기로 측정시, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질의 서브유닛 분자량은 17,659 달톤이고, 이는 아미노산 함량을 기준으로 17,676 달톤의 예상 질량과 매우 유사하다. 이 단백질을 0.05% (중량/용적) ZwittergentTM 3-14를 함유한 PBS에서 평형화된 SuperoseTM 12 컬럼을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피로 분석하면, 키메라 부류 I r필린은 69,480 달톤의 겉보기 분자량을 가진다. 이는 본질적으로 동일한 조건하에 분석된 임균 r필린의 겉보기 분자량(68,899 달톤)과 일치한다.
정제된 수막구균 부류 I r필린 단백질의 N-종결 서열을 Edman 분해로 측정하면 (세가지 다른 샘플에서 나온) 결과는 예상된 단백질 서열과 일치한다. 모든 서열에 대해 적어도 35개 잔기를 측정했다.
실시예 20
수막구균 키메라 부류 I r 필린 ELISA
정제된 단백질 또는 박테리아 세포에 대한 종점 역가를 실시예 13과 14에 기재된 방법을 사용하여 ELISA로 측정했다. 개개 채혈로부터 풀링된 혈청을 이용하여 ELISA를 수행했다. 완전 세포 ELISA를 열로 사멸된(56℃ 60분간) 수막구균 세포에서 행하거나 모노타이터 플레이트상에서 직접 건조시켰다. 세포 현탁액을 620 nm에서 0.1의 흡광도로 희석하고 100 ㎕ 분취량을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 두었다. 각 플레이트를 37℃ 또는 실온에서 건조시키고, 밀봉한 다음 사용시까지 4℃에서 보관했다. 완전 세포 ELIDA에 대한 프로토콜을 하기와 같이 변형시켰다: (1) 1차 및 2차 항혈청을 0.1% (용적/용적) TweenTM-20 및 0.1% (중량/용적) BSA를 함유한 PBS에서 희석하고; (2) Skanwash 300 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 0.05% (용적/용적) TweenTM-20를 함유한 PBS로 5회 세척했다.
표 7에 도시된 항원 ELISA로 알 수 있듯이, 키메라 부류 I r필린으로 면역된 모든 기니아 피그는 매우 잘 반응했다.
표 7
정제된 수막구균 키메라 부류 I r필린으로 수막구균 키메라 부류 I r필린 항혈청의 결합에 대한 종점 역가*
채혈: 보조제:
StimulonTM QS-21 AlPO4 없음
0주 23 12 32
4주 26,607 12,067 4,829
6주 1,519,956 372,539 302,911
* 기니아 피그(그룹당 4)를 (a) PBS (pH 6)에서 StimulonTM QS-21 25 ㎕; (b) 식염수에서 AlPO4 100 ㎕; 또는 (c) 단독 PBS (pH 7)로 보조된 키메라 부류 I r필린 20 ㎍으로 0 및 4주째 (피하) 면역시킴. 동물을 0, 4 및 6주째 채혈함. 풀링된 혈액을 모든 분석에 사용함.
필리 달린 세포에 대한 중요한 반응을 표 8에 도시된 바와 같이 ELISA로 확인했다.
표 8
엔.메닌지티디스 (균주 H355)의 필리 달린 세포로 수막구균 키메라 부류 I r필린의 결합에 대한 종점 역가*
채혈: 보조제:
StimulonTM QS-21 AlPO4 없음
0주 28 19 53
4주 1,293 1,052 381
6주 61,497 25,477 16,467
* 세포를 열로 죽임.
면역 반응에 대한 보조제의 효과
수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 면역 반응에 미치는 보조제의 효과를 실시예 13에 기재된 방법을 이용하여 마우스에서 조사했다. 표 9에 도시된 바와 같이, 수막구균 키메라 부류 I r필린을 지닌 항 혈청의 결합에 대한 대부분의 중요한 반응은 StimulonTM QS-21을 첨가하여 달성되었다.
표 9
정제된 수막구균 키메라 부류 I r필린으로 수막구균 키메라 부류 I r필린 항혈청의 결합에 대한 종점 역가*
채혈: 보조제:
StimulonTM QS-21 AlPO4 MPLTM AlPO4/MPLTM 없음
0주 <50 44 <50 31 <50
4주 44,011 29,925 40,146 110,093 <250
6주 707,084 103,437 284,455 137,686 115,022
* 마우스(그룹당 10)를 (a) PBS (pH 6)에서 StimulonTM QS-21 25 ㎕; (b) 식염수에서 AlPO4 100 ㎕; (c) PBS (pH 7)에서MPLTM 50 ㎍; (d) 식염수에서 AlPO4 100 ㎍및 50 ㎍MPLTM; 또는 (e) 단독 PBS (pH 7)로 보조된 수막구균 키메라 부류 I r필린 10 ㎍으로 0 및 4주째 (피하) 면역시킴. 동물을 0, 4 및 6주째 채혈함. 풀링된 혈액을 모든 분석에 사용함.
표 10에 도시된 바와 같이, 엔.메닌지티디스의 필리 달린 세포로 항혈청의 결합에 대한 가장 중요한 반응을 StimulonTM QS-21을 첨가하여 달성했다.
표 10
엔.메닌지티디스 (균주 H355)의 필리 달린 세포로 수막구균 키메라 부류 I r필린 항혈청의 결합에 대한 종점 역가*
채혈: 보조제:
StimulonTM QS-21 AlPO4 MPLTM AlPO4/MPLTM 없음
0주 172 146 153 160 <50
4주 6,088 2,310 4,205 5,647 311
6주 171,718 25,135 52,053 17,039 16,617
* 세포를 열로 죽임.
추가 분석은 키메라 부류 I r필린에 대한 항혈청이 부류 I 필린 또는 몇몇 경우에 부류 II 필린을 발현시키는 수막구균 세포에 결합함을 설명해 주었다. 표 11에 도시된 결과는 이러한 부분 크로스-반응성을 입증했다.
표 11
엔.메닌지티디스의 필리 달린 세포로 수막구균 키메라 부류 I r필린의 결합에 대한 종점 역가*
균주 발현된 필린 부류 0일 보조제
StimulonTM QS-21 AlPO4 MPLTM
H355 M982 CDC1521 I I II 409 217 988 127,383 >36,540 2,602 41,190 >36,540 1,345 102,987 >36,540 1,768
FAM18 II 3,518 >36,540 26,513 >36,540
*세포를 열로 죽이지 않고 마이크로타이터 플레이트상에서 직접 (실온에서) 건조시킴.
실시예 21
수막구균 키메라 부류 I r 필린 면역전자 현미경법
엔.메닌지티디스 균주 H355의 필리 달린 세포로 키메라 수막구균 부류 I r필린 항혈청의 결합의 가시화는 하기와 같이 투과-전자 현미경을 이용하여 수행했다. 엔.메닌지티디스의 밤새 배양액의 콜로니를 멸균 루프를 이용하여 조심스레 골라 변형된 Franz 배지[1.3 g/L 글루탐산, 20 mg/L 시스테인, 10 g/L Na2HPO4·7H2O, 90 mg/L KCl, 6 g/L NaCl, 2 g/L 효모 투석물 및 덱스트로스(4 g/L), 글루탐산 (100 mg/L), 코카복실라제(200 ㎍/L) 및 철 나이트레이트(5 mg/L)로 보충됨] 0.5-1.0 mL를 함유한 마이크로퓨지 튜브에 두었다. 금 도금 그리드를 세포 현탁액 분취량으로 5분간 스폿팅하고 과량의 유체를 여과지를 이용하여 제거했다. 박테리아 세포를 실온에서 30분간 4% (용적/용적) 파라포름알데히드, PBS중 0.1% (용적/용적) 글루타랄데히드로 고정시켰다. 그리드를 순서대로 (a) 5분간 PBS-B, (b) 10분간 PBS중 1% (중량/용적) 피시 젤라틴, 및 (c) 5분간 0.2 M 글라이신을 함유한 PBS를 이용하여 배양했다. 블로킹된 그리드를 실시예 16에 기재된 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 대한 항혈청으로 프로빙했다. 도 3a에서 도시된 바와 같이, 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 대한 항체는 필리의 길이를 따라 결합했다. 반면, 정상 혈청(0주)은 필리에 결합하지 않는 것으로 나타났다(도 3b).
실시예 22
수막구균 키메라 부류 I r 필린 항혈청과 임균 필리 달린 세포의 크로스 -반응성
수막구균 부류 I 필린과 임균 필린의 서열 유사성을 기초로 해서, 임균 r필린에 대한 항혈청이 필리 달린 수막구균 세포를 인식하여 이 세포에 결합함이 상기 실시예 4에 나타나 있다. 이 실시예에서, 수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 항혈청이 필리 달린 임균 세포에 결합함이 입증되었다. 마우스 및 기니아 피그 실험 의 데이터가 각각 표 12와 13에 요약되어 있다.
표 12
필리 달린 엔.고노리아 세포로 수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 마우스 항혈청의 결합에 대한 종점 역가
항원/보조제
GC 균주 Nm r부류 I 필린 GC r필린+MPLTM
StimulonTM QS-21 AlPO4 MPLTM AlPO4/MPLTM 없음
I756 4,527,943 79,927 114,958 56,627 57,426 356,936
FA1090 531,627 40,406 97,224 31,267 38,122 219,600
표 13
필리 달린 엔.고노리아 세포로 수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 기니아 피그 항혈청의 결합에 대한 종점 역가
항원/보조제
GC 균주 Nm r부류 I 필린 GC r필린 + StimulonTM QS-21
StimulonTM QS-21 AlPO4 없음
I756 301,969 122,714 78,111 46,424
FA1090 322,311 262,422 170,842 108,094
GC - 엔.고노리아; Nm - 엔.메닌지티디스
실시예 23
수막구균 키메라 부류 I r 필린 항혈청에 의해 수막구균 박테리아혈증으로부터 수동 보호
수막구균 박테리아혈증으로부터 보호하기 위한 백신의 능력을 평가하는 인증된 동물 모델은 본래 Saukkonen과 Leinonen에 의해 기재된 유년기 래트 모델이다(34). 필린을 발현하는 수막구균에 의해 야기된 박테리아혈증으로부터 보호하기 위한 (StimulonTM QS-21로 보조된) 수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 기니아 피그 항혈청의 능력을 시험했다. 0일째, (4-5일간 자란) Sprague-Dawley 유년기 래트를 PBS에서 1:5, 1:10 또는 1:20으로 희석된 키메라 부류 I r필린에 대한기니아 피그 항혈청(6주) 0.1 mL로 (복강내) 수동 면역시켰다. 대조 그룹에는 PBS에서 1:5로 희석된 정상 기니아 피그 혈청(0주) 0.1 mL를 주사했다. 24시간 후, 동물에 필리 달린 엔.메닌지티디스(균주 H355) 0.1 mL에 대략 5 x 105 콜로니 형성 단위(cfu)를 복강내 투여했다. 투여 3시간 후, 동물을 죽이고 심장 채혈물을 희석하고 GC 아가 플레이트상에 두었다. 플레이트를 5% CO2의 37℃에서 18-24시간 동안 배양했다. 박테리아 콜로니를 헤아리고 박테리아혈증의 수준을 측정했다. 변수 t 시험의 일 분석을 사용하여 정상 혈청(0주)을 받아들이는 대조 그룹과 면역 혈청(6주)을 받아들이는 그룹을 비교했다. 하기 표 14에 도시된 바와 같이, 수막구균 키메라 부류 I r필린에 특이한 기니아 피그 항혈청으로 수동 면역된 동물은 정상 기니아 피그 혈청으로 면역된 동물에 비해 박테리아혈증의 수준에 있어 로그 이상의 감소를 보였다. 이러한 차이는 p값이 <0.05로서, 통계학적으로 유의하다.
표 14
필리 달린 엔.메닌지티디스(균주 H355)가 투여된 유년기 래트에서 박테리아혈증을 예방하기 위한 수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 기니아 피그 항혈청의 능력*
채혈 희석 평균 cfu ± std
0주 1:5 4,87 ± 0.18
6주 1:5 3.55 ± 0.48**
6주 1:10 3.63 ± 0.36**
6주 1:20 3.98 ± 0.75**
* 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질에 대한 항혈청은 표 7에 기재된 기니아 피그로부터 얻어짐. ** p < 0.05. cfu ± std = 콜로니 형성 단위 ± 표준 편차
실시예 24
수막구균 키메라 부류 I r 필린에 대한 점막 면역 반응의 유도
0, 1 및 2주째 콜레라 독소(CT-CRM, E29H)의 크로스-반응성 돌연변이체 형태 1 ㎍의 존재 또는 부재하에 식염수에서 수막구균 키메라 부류 I r필린(10 ㎕에서 5 ㎍)으로 마우스를 비내 면역시켰다. 하기 표 15에 도시된 바와 같이, 동물을 보조제의 부재하에 r필린으로 면역화시키면 항원 ELISA에서 상당한 면역 반응이 검출되었다. 이 반응은 콜레라 독소를 첨가하면 증진되었다.
표 15
정제된 재조합 수막구균 키메라 부류 I r필린 단백질로 수막구균 키메라 부류 I r필린에 대한 풀링된 마우스 항혈청의 결합에 대한 종점 역가*
r필린, 보조제 없음 r필린 + CT-CRM
혈청 IgG IgA 기관지 세척** IgG IgA 코 세척** IgG IgA 질 세척** IgG IgA 6,168 490 <10 <10 <10 12 174 15 1,181,871 3,940 580 19 98 236 70 687
* 4주째 풀링된 혈청을 분석함. IgG와 IgA의 경우 0주째 풀링된 혈청에 대한 종점 역가는 <50임. ** 세척은 하기와 같이 수행함: 기관지: 폐를 1 mL RPMI 1640로 5회 세척하고, 50 ㎕태 소 혈청(FBS)를 샘플에 첨가하며, 원심분리(2,000 x g x 5분)에 의해 정제한 다음 20℃에서 보관함. 코: 코 세척을 RPMI 1640 0.5 mL로 1회 세척하고 FBS 20 ㎕를 샘플에 첨가한 다음 -20℃에서 보관함. 질: 질을 RPMI 1640 0.075 mL로 5회 세척하고 FBS 10 ㎕를 샘플에 첨가한 다음 -20℃에서 보관함.
실시예 25
수막구균 키메라 부류 I r 필린 항혈청에 의한 수막구균 콜로니화로부터 능동적 보호
인간에서 수막구균 질환의 초기 단계는 박테리아에 의한 비인강의 콜로니화이다. 이 과정에서, 필리는 내피세포로 초기 부착을 매개하는 중요한 역할을 담당하는 것 같다. 다수의 조사자는 신생아 동물에서 비인강을 콜로니화하는 과정을 기재하고 있지만, 수막구균 백신의 효능을 시험하는 모델로서 이를 조사한 사람은 한명도 없었다(35). 본원에 기재된 본 발명을 평가하기 위해, 성체 이계 교배된 마우 스를 사용하여 엔.메닌지티디스의 코 콜로니화 모델을 개발했다. Swiss-Webster 마우스를 0, 4 및 8주째 MPLTM을 피하 보조된 수막구균 키메라 부류 I r필린으로 면역화시켰다. 10주째에, 동물에 2 mg 철 덱스트란(Sigma)을 복강내 주사하고 40 ㎍의 철 덱스트란을 함유한 10 ㎕ 분량의 대략 1 x 107 cfu 중간-로그 상 필리 달린 수막구균으로 비내 투여했다. 투여 1일 후, 동물 수의 1/2에 2 mg 철 덱스트란을 추가 복강내 주사했다. 선택성 항생제를 함유한 GC 아가 플레이트상에 코 조직 분쇄물을 플레이팅시켜 투여한지 1 및 2일째 코에서 살아있는 박테리아의 수를 측정했다. 결과는 표 16에 나타나 있다.
표 16
엔.메닌지티디스 균주 H355가 투여된 마우스의 코 분쇄물에서 회수된 살아있는 박테리아 수 (cfu)*
항원(투여량 ㎍)* cfu/코
1일** 2일**
H355 완전 세포(25) 부류 I r필린 (10) 식염수 1,165 6,866 17,943 67 63 3,406
* 모든 백신을 100 ㎍ MPLTM/투여량으로 제형함. 각 그룹은 5 마우스로 구성됨. ** 비내 투여 후 일 수
실시예 26
수막구균 부류 II 키메라 r 필린에 대한 면역 반응의 웨스턴 블랏 분석
정제된 수막구균 부류 II 키메라 r필린을 사용하여 실시예 11에 기재된 프로토콜에 따라 기니아 피그를 면역화시켰다. 수막구균 부류 II 키메라 r필린으로 면역화된 기니아 피그에서 유도된 항혈청을 우선 웨스턴 블랏으로 분석했다(데이터 는 도시되지 않음). 이들 블랏은 수막구균 부류 II 키메라 r필린에 대한 항혈청이 부류 II 필린(FAM18) 또는 부류 I 필린(H355)을 발현시키는 필리 달린 수막구균 세포의 완전 세포 용해물에서 필린에 대응되는 밴드를 인식함을 보여준다. 반면, pTrcHis 벡터만을 함유한 이.콜라이에서 나온 채혈물에 대한 항혈청은 이들 웨스턴 블랏에서 필린 밴드와 반응하지 않았다.
실시예 27
필리 달린 수막구균셩 세포로 수막구균 키메라 부류 II r 필린에 대한 항혈청의 결합
부분 정제된 수막구균 키메라 부류 II r필린에서 유발된 항혈청은 역가 >36,450(0주 역가는 473임)을 지닌 상동성 균주, FAM18의 수막구균 세포에 결합하는 것으로 나타났다.
참고 문헌
Figure 112006079234218-PAT00001
Figure 112006079234218-PAT00002
Figure 112006079234218-PAT00003
본 발명에 의해서 엔.고노리아 또는 엔.메닌지티디스의 재조합 필린 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
<110> American Cyanamid Company <120> Vaccines Containing Recombinant Pilin Against Neisseria Gonorrhoeae or Neisseria Meningitidis <130> 33377-00/PCT <150> PCT/US 60/083,405 <151> 1998-04-29 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 504 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Aritificial Sequence <400> 1 atggataccc ttcaaaaagg ctttaccctt atcgagctga tgattgtgat cgccatcgtc 60 ggcattttgg cggcagtcgc ccttcccgcc taccaagact acaccgcccg cgcgcaagtt 120 tccgaagcca tccttttggc cgaaggtcaa aaatcagccg ttaccgagta ttacctgaat 180 cacggcgaat ggcccggcaa caacacttct gccggcgtgg catcttcttc aacaatcaaa 240 ggcaaatatg ttaaggaagt tacagtcgca aacggcgtca ttaccgccac aatgctttca 300 agcggcgtaa acaaagaaat ccaaggcaaa aaactctccc tgtgggccaa gcgtcaagac 360 ggttcggtaa aatggttctg cggacagccg gttacgcgca ccgacgccaa agccgacacc 420 gtcgccgccg ccgccaagac cgccgacaac atcaacacca agcacctgcc gtcaacctgc 480 cgcgacgcaa gtgatgccag ctaa 504 <210> 2 <211> 167 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Aritificial Sequence <400> 2 Met Asp Thr Leu Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val 1 5 10 15 Ile Ala Ile Val Gly Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Pro Ala Tyr Gln 20 25 30 Asp Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Val Ser Glu Ala Ile Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Gly Gln Lys Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp 50 55 60 Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser Ser Thr Ile Lys 65 70 75 80 Gly Lys Tyr Val Lys Glu Val Thr Val Ala Asn Gly Val Ile Thr Ala 85 90 95 Thr Met Leu Ser Ser Gly Val Asn Lys Glu Ile Gln Gly Lys Lys Leu 100 105 110 Ser Leu Trp Ala Lys Arg Gln Asp Gly Ser Val Lys Trp Phe Cys Gly 115 120 125 Gln Pro Val Thr Arg Thr Asp Ala Lys Ala Asp Thr Val Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Lys Thr Ala Asp Asn Ile Asn Thr Lys His Leu Pro Ser Thr Cys 145 150 155 160 Arg Asp Ala Ser Asp Ala Ser 165 <210> 3 <211> 510 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Aritificial Sequence <400> 3 atggaagcaa tccaaaaagg tttcaccctg atcgagctga tgatcgtcat cgccatcgtc 60 ggtatcttgg cagccgtcgc cctgcccgca taccaagact acaccgcgcg cgcccaaatg 120 tccgaagccc tgactttggc agaaggtcaa aaatccgcag tgatcgagta ttattccgac 180 aacggcacat tcccgaacag caatacttcc gcaggtattg ctgcctctaa cgagattaaa 240 ggtaagtatg tggcatcggt taaggttgaa ggtaatgcct ctgttgcttc tattaccgct 300 accatgaact ctagtaatgt gaataaggac atcaaaggta aaaccttggt actcgtcggc 360 aaacaaaact ccggttcggt aaaatggttc tgcggacagc cggttacgcg cgacaacgcc 420 gacaacgacg acgtcaaaga cgccggcaac aacggcatcg aaaccaagca cctgccgtca 480 acctgccgcg atacgtcatc tgatgccaaa 510 <210> 4 <211> 170 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Aritificial Sequence <400> 4 Met Glu Ala Ile Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val 1 5 10 15 Ile Ala Ile Val Gly Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Pro Ala Tyr Gln 20 25 30 Asp Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Met Ser Glu Ala Leu Thr Leu Ala Glu 35 40 45 Gly Gln Lys Ser Ala Val Ile Glu Tyr Tyr Ser Asp Asn Gly Thr Phe 50 55 60 Pro Asn Ser Asn Thr Ser Ala Gly Ile Ala Ala Ser Asn Glu Ile Lys 65 70 75 80 Gly Lys Tyr Val Ala Ser Val Lys Val Glu Gly Asn Ala Ser Val Ala 85 90 95 Ser Ile Thr Ala Thr Met Asn Ser Ser Asn Val Asn Lys Asp Ile Lys 100 105 110 Gly Lys Thr Leu Val Leu Val Gly Lys Gln Asn Ser Gly Ser Val Lys 115 120 125 Trp Phe Cys Gly Gln Pro Val Thr Arg Asp Asn Ala Asp Asn Asp Asp 130 135 140 Val Lys Asp Ala Gly Asn Asn Gly Ile Glu Thr Lys His Leu Pro Ser 145 150 155 160 Thr Cys Arg Asp Thr Ser Ser Asp Ala Lys 165 170 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 5 ccccgcgcca tggataccct tcaaaaaggc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 6 gggcctggat ccgtgggaaa tcacttaccg 30 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 7 ggctctagac tgtcagacca agtttactc 29 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 8 ggctctagat tgaagcattt atcaggg 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 9 ggctctagat aaacagtaat acaagggg 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 10 ggctctagat tagaaaaact catcgagc 28 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class I <400> 11 ccccgcgcca tggacaccct tcaaaaaggt tttacc 36 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class I <400> 12 gggcctggat ccgagtggcc gtggaaaatc acttaccgc 39 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class I <400> 13 ccggcgcgtc tctcacggcg aatggcccgg c 31 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class I <400> 14 gggcctggat ccgagtggcc gtggaaaatc acttaccgc 39 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 15 gcataattcg tgtcgctcaa ggcgc 25 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 16 gccgcgcgtc tcccgtgatt caggtaatac tcgg 34 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class I <400> 17 gcataattcg tgtcgctcaa ggcgc 25 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class I <400> 18 gggcctggat ccgagtggcc gtggaaaatc acttaccgc 39 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class II <400> 19 gcggccgcca tggaagcaat ccaaaaaggt ttcaccc 37 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class II <400> 20 gccgcgcgtc tccgaaccgg agttttgttt gcc 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 21 ccgggccgtc tcggttcggt aaaatggttc tgc 33 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 22 gggcctggat ccgtgggaaa tcacttaccg 30 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Neisseria Meningitidis Class II <400> 23 gcggccggat ccggtcattg tccttatttg gtgcggc 37 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 24 Glu Ala Ile Leu Leu Ala Glu Gly Gln Lys Ser Ala Val Thr Glu Tyr 1 5 10 15 Tyr Leu Asn His Gly Lys 20

Claims (13)

  1. 표준 고 해상 서던 하이브리드화 조건하에 프로세싱 이전에 서열 번호:2의 아미노산 1-167의 아미노산 서열 또는 성숙 단백질로 프로세싱 이후에 서열 번호:2의 아미노산 8-167의 아미노산 서열을 가지거나, 이와 생물학적으로 대등한 아미노산 서열을 가진 나이제리아 고노리아 및 부류 I 나이제리아 메닌지티디스의 키메라 재조합 필린 단백질을 암호화 하는 DNA 서열과 하이브리드화 하는 DNA 서열을 포함하는 분리되어 정제된 DNA.
  2. 제 1 항에 있어서, DNA 서열이 표준 고 해상 서던 하이브리드화 조건하에 서열 번호:1의 뉴클레오티드 1-501 또는 22-501의 뉴클레오티드 서열을 지닌 DNA 서열과 하이브리드화 하는 분리되어 정제된 DNA.
  3. 프로세싱 이전에 서열 번호:2의 아미노산 1-167의 아미노산 서열 또는 성숙 단백질로 프로세싱 이후에 서열 번호:2의 아미노산 8-167의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이와 생물학적으로 대등한 아미노산 서열을 가진 나이제리아 고노리아 및 부류 I 나이제리아 메닌지티디스의 키메라 재조합 필린 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리되어 정제된 DNA.
  4. 표준 고 해상 서던 하이브리드화 조건하에 프로세싱 이전에 서열 번호:2의 아미노산 1-167의 아미노산 서열 또는 성숙 단백질로 프로세싱 이후에 서열 번호:2의 아미노산 8-167의 아미노산 서열을 가지거나, 이와 생물학적으로 대등한 아미노산 서열 가진 나이제리아 고노리아 및 부류 I 나이제리아 메닌지티디스의 키메라 재조합 필린 단백질을 암호화 하는 DNA 서열과 하이브리드화 하는 DNA 서열을 포함하는 분리되어 정제된 DNA를 함유하는 플라스미드.
  5. 제 4 항에 있어서, 플라스미드가 표준 고 해상 서던 하이브리드화 조건하에 서열 번호:1의 뉴클레오티드 1-501 또는 22-501의 뉴클레오티드 서열을 지닌 DNA 서열과 하이브리드화 하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드.
  6. 제 3 항의 DNA를 포함하는 나이제리아 고노리아 및 부류 I 나이제리아 메닌지티디스의 키메라 재조합 필린 단백질을 암호화 하는 분리되어 정제된 DNA 서열을 함유하는 플라스미드.
  7. 제 6 항에 있어서, 플라스미드가 pPX2004 (ATCC 98637)로 명명된 플라스미드.
  8. 제 4 항의 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포.
  9. 제 8 항에 있어서, 숙주 세포가 에쉐리키아 콜라이 균주인 숙주 세포.
  10. 제 9 항에 있어서, 플라스미드가 pPX2004 (ATCC 98637)로 명명된 숙주 세포.
  11. 제 4 항의 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환하거나 형질감염시키고 숙주 세포가 키메라 재조합 필린 단백질을 발현시키는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 나이제리아 고노리아 및 부류 I 나이제리아 메닌지티디스의 키메라 재조합 필린 단백질의 제조방법.
  12. 프로세싱 이전에 서열 번호:2의 아미노산 1-167의 아미노산 서열 또는 성숙 단백질로 프로세싱 이후에 서열 번호:2의 아미노산 8-167의 아미노산 서열을 가지거나, 이와 생물학적으로 대등한 아미노산 서열을 가진 나이제리아 고노리아 및 부류 I 나이제리아 메닌지티디스의 분리되어 정제된 키메라 재조합 필린 단백질.
  13. 제 12 항에 따른 필린 단백질을 포함하고,
    인간 숙주에서 보호 면역 반응을 유발하는,
    나이제리아 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.
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