CN103405760A - 迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用。迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA作为亚单位疫苗蛋白。同时，迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA可作为疫苗佐剂应用于疫苗中。本发明的菌毛蛋白作为亚单位疫苗能够有效保护鱼类抵抗迟缓爱德华氏菌感染，作为佐剂能够显著提高亚单位疫苗的免疫保护效应。

Description

迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用。 

背景技术

迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA是菌毛的主要组成成分，其分子量为18.4KDa。由于其在细菌侵染时可起到增强细菌对宿主的吸附能力，故菌毛在细菌致病过程中发挥着重要的作用。研究发现迟缓爱德华氏菌FimA具有凝集红细胞的能力，fimA基因突变导致迟缓爱德华氏菌侵染细胞以及组织的能力降低。因此，菌毛蛋白FimA是一个毒力因子，有望应用于细菌的病害防控。 

发明内容

本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的免疫应用。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用，迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA作为亚单位疫苗蛋白。 

所述迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA与佐剂混配可作为迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗。 

所述迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA与佐剂按体积比为1:1。 

一种迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用，迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA可作为疫苗佐剂应用于疫苗中。 

本发明具有如下优点：本发明的菌毛蛋白FimA作为亚单位疫苗能够有效保护鱼类抵抗迟缓爱德华氏菌感染，作为佐剂能够显著提高疫苗的免疫保护效应。 

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的菌毛蛋白FimA电泳图谱，其中，泳道1，分子量标准。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。 

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法： 

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。 

2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001）。 

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。 

实施例1 

菌毛蛋白FimA表达质粒pEtFimA的构建： 

本发明的菌毛蛋白FimA的序列已公开（GenBank accession No.YP_003295086.1）。 

另菌毛蛋白FimA可按如下方式获得：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,55℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃40s,65℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将载体pET259（pET259构建过程参见Zheng W,Hu Y,Zhang M,Sun L.2010.Analysis of the expression and antioxidative property of a peroxiredoxin 6 from Scophthalmus maximus.Fish Shellfish Immunol.29，305–311. 

）用SwaI酶切后回收5.4kb片段，将其与上述纯化的PCR片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（30ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为质粒pEtFimA。 

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化钠,97.5％蒸馏水。所述菌株TX1于2008年1月9号保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，保藏编号为：CGMCC No.2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda），所述F1为5’-CCCGGGATGAAGAAAATTTTACTGCCTGTT-3’；R1为5’-CCCGGGTTTATATTCGATGGTGAACGGG-3’。 

实施例2 

重组菌毛蛋白FimA的诱导表达和纯化 

将上述实施例1的质粒pEtFimA用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自于“天根生化科技有限公司”，北京），在含有卡那霉素（30ug/ml）的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取一个转化子，将其命名为BL21/pEtFimA。将BL21/pEtFimA于含有卡那霉素（30ug/ml）的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,再加入100ml新鲜的含有卡那霉素（30ug/ml）的LB液体培养基中，于37℃下以200rpm的转速摇动培养至OD₆₀₀为0.6,加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，18℃继续以转速160rpm摇动培养12h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用His Trap HP Columns（购于美国GE Healthcare公司）回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳，测定其分子量大小（参见图1）（电泳条件：8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h）。将纯化的蛋白 经质谱分析，证实其为具有FimA氨基酸序列的菌毛蛋白。所述裂解液为终浓度的10mM NaH₂PO₄、10mM Tris和8M尿素,pH8.0。 

实施例3 

菌毛蛋白FimA作为疫苗的应用 

步骤1）佐剂及疫苗混合液的制备。 

佐剂制备：将5%（质量比）NaOH和5%（质量比）Al₂(SO₄)₃以2：5体积比混合，混合后以10,000g离心5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml。 

疫苗混合液制备：将上述实施例2纯化的菌毛蛋白FimA在PBS中稀释至100ug/ml；将稀释后的疫苗蛋白与佐剂等体积混合，即为FimA疫苗混合液。 

对照液制备：将PBS与佐剂等体积混合。 

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8%NaCl,0.02%KCl,0.358%Na₂HPO₄.12H₂O,0.024%NaH₂PO₄，余量为水。 

步骤2）疫苗的免疫应用。将70条大菱鲆（每条重约12,6g）随机分为2组，每组35条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1）的FimA疫苗混合液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1）的佐剂对照液。 

步骤3）迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TX1至OD₆₀₀为0.8,然后离心（5000g，4℃）10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5x10⁶cfu/ml。 

步骤4）疫苗免疫保护效应检测。在步骤2）免疫注射后的第30天，用上述步骤3）的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2）的2组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，9条；B组，32条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)： 

RPS=100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比) 

根据此公式算出FimA的免疫保护效率为72％。因此，所得菌毛蛋白FimA作为疫苗能够高效地保护鱼类抵御迟缓爱德华氏菌侵染。 

实施例4 

菌毛蛋白FimA作为疫苗佐剂的应用 

步骤1）疫苗混合液制备：将上述实施例纯化的FimA在PBS中稀释至100ug/ml；将哈氏弧菌疫苗VhhP2（其具体制备过程见Sun K,Zhang W,Hou J,Sun L.Immunoprotective analysis of VhhP2,a Vibrio harveyi vaccine candidate.Vaccine2009;27:273340）在PBS中稀释至100ug/ml；将稀释后的FimA与疫苗VhhP2等体积混合，混合液命名为FimA＋VhhP2。 

步骤2）免疫应用。将140条大菱鲆（同上）随机分为4组，每组35 条。将这4组分别命名为A、B、C和D组。将A、B和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1）的FimA、VhhP2、VhhP2＋FimA，将D组的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS（对照组）。 

步骤3）哈氏弧菌T4悬液的制备。在LB培养基中培养哈氏弧菌T4至OD₆₀₀为0.8,然后离心（5000g，4℃）10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5x10⁷cfu/ml。 

所述哈氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985，分类命名为哈氏弧菌（Vibrio harveyi）。 

步骤4）疫苗免疫保护效应检测。在步骤2）免疫注射后的第30天，用上述步骤3）的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2）的4组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，24条；B组,12条；C组，4条；D组,31条。 

根据上述RPS公式算出FimA，VhhP2，VhhP2＋FimA的免疫保护效率分别为22.6％，61.3％和87.1％，其中VhhP2＋FimA的免疫保护效率（即87.1％）显著（P<0.05）高于VhhP2的免疫保护效率（即61.3％）。因此，所得菌毛蛋白FimA能显著提高疫苗的免疫保护效应。 

Claims (3)

1.一种迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用，其特征在于：迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA作为亚单位疫苗蛋白。

2.按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用，其特征在于：所述迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA与佐剂混配可作为迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗。

3.一种迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA的应用，其特征在于：迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白FimA可作为疫苗佐剂应用于疫苗中。