CN101780273A - 一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用 - Google Patents

一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其制备和应用。具体为分泌型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其构建为：以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，产物与pBS-T于室温连接，将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb，同时将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗。所得疫苗菌具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达90％。制备过程简单，无需灭活处理等步骤，且不需任何佐剂。

Description

一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用。
背景技术
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)为水产养殖生物重要病原菌，能够感染多种水产养殖动物，包括鱼、虾、贝等。目前对于哈氏弧菌的防控依赖抗生素和免疫防治。由于抗生素对环境以及人类健康的潜在危害性，其使用已逐渐在国际上受到限制。针对哈氏弧菌的疫苗主要为简单的灭活疫苗，分泌型疫苗的应用尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种哈氏弧菌分泌型疫苗：序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。
哈氏弧菌分泌型疫苗的构建：
1)质粒pBSVhP1的构建：以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5后在含有安卡青霉素(Ap)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，质粒为pBSVhP1；
所述引物为F11 5’-CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3’和R85’-CTCGAGGATATCACTGGTTGCGCGCT-3’；
2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建：将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb，同时将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗DH5α/pTVP1M。
哈氏弧菌分泌型疫苗的应用：将表达上述所得的序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至OD600为0.8-1，而后离心收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4×108cfu/ml，即为疫苗菌悬液，所得疫苗菌悬液具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。
所述质粒DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至OD600为0.8-1为首先将DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；而后取0.1ml过夜培养后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap的LB液体培养基中，于28℃摇动培养至OD600为0.8-1。
将所述疫苗菌悬液100ul腹腔注射于牙鲆体内，20天后再次将100ul疫苗菌悬液液腹腔注射于牙鲆。
本发明具有如下优点：
1.高保护率。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达90％。
2.制备简单。本发明的疫苗制备过程简单，只需常规的细菌培养，无需灭活处理等步骤。
3.无需佐剂。本发明的疫苗应用时不需如弗氏佐剂等有副作用的免疫刺激剂。
4.本发明构建的分泌型疫苗是将疫苗抗原基因通过一种载体菌表达并且以可溶性重组蛋白的形式分泌至胞外，从而被免疫系统识别并产生相应的保护性免疫应答。本发明疫苗相对灭活疫苗而言，转基因载体菌为基础的分泌型疫苗具有免疫效应强、重复性好、操作简单、造价低廉。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PGR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1
哈氏弧菌分泌型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。序列表SEQ ID No1
ATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGTTGTATCACCTCGGCACTCTGTTTCCATTCTTCTCTCGCTTTTTCGCAATCGACAGA
ACTCCCAAATGATGCGGATTTAGCGCAGACACCTGCGTCACTGATGCTTGCGCCTGAAGACGTCGCCATCGCTGATCGTT
ATATCGTTGTATTTCATCAACCTCAAATGATGATGAATAATTCACTTGAATTACAGCAGTTCACACAACAATCTGTGGAC
CGAATGTCTGGTTTGTACTCAATAGAAGTGGAATCAGTATTCGACAATTCGATCAGCGGTTTCGTTGCGACGTTAGCTCC
TGAACAGCTGAAAGCGTTACGTGCTGATCCACGTGTTGAATACATCGAGCAAGACAGAATTCTTACACTAGACCCAATAG
TCTCGGCAGAAGTAAACCAAAGTAATGCAATTTGGGGGCTAGACCGAATTGATCAACGTAGTCTGCCTCTCAATAACAAT
TACAGCGCCAACTTTGATGGAACGGGCGTCACGGCTTACGTTATCGATACGGGTGTGAACAACTCGCACGTTGAATTTGC
CGGACGCTCCATTTCGGGATATGACTTTGTCGACAATGATGCGGATGCCAGTGACTGTAATGGACACGGCACACACGTAG
CGGGCACGATCGGCGGATCTTTGTATGGCGTGGCAAAGAACGTGAGCATTGTTGGTGTCAGAGTGCTTAGCTGTTCTGGC
TCAGGTTCAACGTCCGGCGTTATTGCGGGTGTTGATTGGGTAGCTGCCAATGCTTCTGGTCCTTCGGTTGCCAACATGAG
TTTAGGTGGTGGGCAATCTGTTGCTCTTGATAGCGCAGTGCAAAGCGCAGTTCAGTCCGGCGTTAGCTTTATGCTTGCAG
CTGGTAACTCCAATGCTGATGCCTGTAACTACTCACCTGCGCGTGTTTCTTCTGGTGTTACTGTCGGCTCGACGACGAGC
TCTGACGCACGTTCTAGTTTTTCAAACTGGGGTAGCTGTGTCGATGTTTTTGCTCCAGGATCACAAATCAAGTCTGCTTG
GTATGATGGCGGTTATAAGACGATAAGTGGCACTTCAATGGCAACCCCACATGTTGCTGGTGTTGCTGCGCTTTATCTCC
AAGAAAACAGTGCACTTTCACCAAGCCAAGTGGAAGCGCTGATCGTTGAGCGCGCAACCAGTGGCAAAGTCACGGATACA
AGAGGCAGTGTGAATAAATTGCTTTACAGTTTAACGGATGCCGATTGTGGTCAAGATTGTGGTGGTCCTGATCCAACGCC
AGACCCAGAAGGTAAATTGACCTCTGGTGTGCCAGTGAGTGGCTTGAGCGGTTCAACAGGGCAGGTAGCTTATTACTACG
TAGATGTAGAAGCAGGGCAACGTCTAACGGTACAAATGTATGGCGGCAGCGGTGATGCAGATTTGTATCTACGCTTTGGC
TCTAAGCCAACGATTAATGCTTGGGATTGTCGACCTTTCAGATACGGCAACAGTGAGACATGTACAGTTAATGCCACTCA
AAGCGGACGTTACCACGTAATGATTCAAGGCTATTCAAGCTACAACGGTGTAAGCATCCAAGCGAGTTACTAG
(a)序列特征：
●长度：1593bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：双链DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：哈氏弧菌T4
(f)特异性名称：Vhp1
哈氏弧菌分泌型疫苗的构建：
1)质粒pBSVhP1的构建：以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，51℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，62℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBSVhP1；
2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建：将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb片段，同时将质粒pBT3(可按照此文献进行构建，Zhang W，Sun K，Cheng S，Sun L.Characterization of DegQVh，a serine protease and a protective immunogenfrom a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl Environ Microbiol 2008；74：6254 62.并也可由公众在市面购得)用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，挑取1个转化子，命名为DH5α/pTVP1M。将DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB培养基中过夜培养，提取质粒，用引物BRF2(5‘-ATAGGGGTTCCGCGCACA-3’)测序，测序结果证明DH5α/pTVP1M确实含有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；其中所述菌株T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985，分类命名为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。
所述引物为F11 5’-CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3’和R85’-CTCGAGGATATCACTGGTTGCGCGCT-3’。
实施例2
疫苗菌悬液：将上述所得的表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0.1ml过夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于28℃下转速160rpm摇动培养至OD600为0.8-1，而后将细菌培养液离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4×108cfu/ml，即为疫苗制备液。
疫苗对照液：将质粒pBT3用Hanahan方法转化入DH5α，得转化子DH5α/pBT3。将DH5α/pBT3在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0.1ml过夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于28℃下转速160rpm摇动培养至OD600为0.8-1，而后将细菌培养液离心(同上)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4×108cfu/ml，即为疫苗对照液。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na2HPO4.12H2O，0.024％NaH2PO4。
实施例3
将上述疫苗菌悬液免疫注射：将80条牙鲆(每条重约10g)随机分为2组，每组40条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul疫苗菌悬液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100ul疫苗对照液。20天后，再次将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul疫苗菌悬液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100ul疫苗对照液。
哈氏弧菌悬液的制备：在LB培养基中分别培养哈氏弧菌T4至OD600为0.6，然后离心(5000g，4℃，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为8×107cfu/ml，即为哈氏弧菌悬液。
疫苗的免疫保护效应检测：将上述免疫注射后的牙鲆第35天，用上述的哈氏弧菌悬液腹腔注射于上述的A和B组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，3条；B组，30条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100×(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故DH5α/pTVP1M针对哈氏弧菌的免疫保护效率为90％。
由此得出DH5α/pTVP1M能够高效地保护牙鲆抵御哈氏弧菌侵染。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1593
<212>DNA
<213>哈氏弧菌T4
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1593)
<223>
<400>1
atg tta aag aaa cta cta agt tgt tgt atc acc tcg gca ctc tgt ttc     48
Met Leu Lys Lys Leu Leu Ser Cys Cys Ile Thr Ser Ala Leu Cys Phe
1               5                   10                  15
cat tct tct ctc gct ttt tcg caa tcg aca gaa ctc cca aat gat gcg     96
His Ser Ser Leu Ala Phe Ser Gln Ser Thr Glu Leu Pro Asn Asp Ala
            20                  25                  30
gat tta gcg cag aca cct gcg tca ctg atg ctt gcg cct gaa gac gtc    144
Asp Leu Ala Gln Thr Pro Ala Ser Leu Met Leu Ala Pro Glu Asp Val
        35                  40                  45
gcc atc gct gat cgt tat atc gtt gta ttt cat caa cct caa atg atg    192
Ala Ile Ala Asp Arg Tyr Ile Val Val Phe His Gln Pro Gln Met Met
    50                  55                  60
atg aat aat tca ctt gaa tta cag cag ttc aca caa caa tct gtg gac    240
Met Asn Asn Ser Leu Glu Leu Gln Gln Phe Thr Gln Gln Ser Val Asp
65                  70                  75                  80
cga atg tct ggt ttg tac tca ata gaa gtg gaa tca gta ttc gac aat    288
Arg Met Ser Gly Leu Tyr Ser Ile Glu Val Glu Ser Val Phe Asp Ash
                85                  90                  95
tcg atc agc ggt ttc gtt gcg acg tta gct cct gaa cag ctg aaa gcg    336
Ser Ile Ser Gly Phe Val Ala Thr Leu Ala Pro Glu Gln Leu Lys Ala
            100                 105                 110
tta cgt gct gat cca cgt gtt gaa tac atc gag caa gac aga att ctt    384
Leu Arg Ala Asp Pro Arg Val Glu Tyr Ile Glu Gln Asp Arg Ile Leu
        115                 120                 125
aca cta gac cca ata gtc tcg gca gaa gta aac caa agt aat gca att     432
Thr Leu Asp Pro Ile Val Ser Ala Glu Val Asn Gln Ser Asn Ala Ile
    130                 135                 140
tgg ggg cta gac cga att gat caa cgt agt ctg cct ctc aat aac aat     480
Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln Arg Ser Leu Pro Leu Asn Asn Asn
145                 150                 155                 160
tac agc gcc aac ttt gat gga acg ggc gtc acg gct tac gtt atc gat     528
Tyr Ser Ala Asn Phe Asp Gly Thr Gly Val Thr Ala Tyr Val Ile Asp
                165                 170                 175
acg ggt gtg aac aac tcg cac gtt gaa ttt gcc gga cgc tcc att tcg     576
Thr Gly Val Asn Asn Ser His Val Glu Phe Ala Gly Arg Ser Ile Ser
            180                 185                 190
gga tat gac ttt gtc gac aat gat gcg gat gcc agt gac tgt aat gga     624
Gly Tyr Asp Phe Val Asp Asn Asp Ala Asp Ala Ser Asp Cys Asn Gly
        195                 200                 205
cac ggc aca cac gta gcg ggc acg atc ggc gga tct ttg tat ggc gtg     672
His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Ser Leu Tyr Gly Val
    210                 215                 220
gca aag aac gtg agc att gtt ggt gtc aga gtg ctt agc tgt tct ggc     720
Ala Lys Asn Val Ser Ile Val Gly Val Arg Val Leu Ser Cys Ser Gly
225                 230                 235                 240
tca ggt tca acg tcc ggc gtt att gcg ggt gtt gat tgg gta gct gcc     768
Ser Gly Ser Thr Ser Gly Val Ile Ala Gly Val Asp Trp Val Ala Ala
                245                 250                 255
aat gct tct ggt cct tcg gtt gcc aac atg agt tta ggt ggt ggg caa     816
Asn Ala Ser Gly Pro Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gln
            260                 265                 270
tct gtt gct ctt gat agc gca gtg caa agc gca gtt cag tcc ggc gtt     864
Ser Val Ala Leu Asp Ser Ala Val Gln Ser Ala Val Gln Ser Gly Val
        275                 280                 285
agc ttt atg ctt gca gct ggt aac tcc aat gct gat gcc tgt aac tac     912
Ser Phe Met Leu Ala Ala Gly Asn Ser Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr
    290                 295                 300
tca cct gcg cgt gtt tct tct ggt gtt act gtc ggc tcg acg acg agc     960
Ser Pro Ala Arg Val Ser Ser Gly Val Thr Val Gly Ser Thr Thr Ser
305                 310                 315                 320
tct gac gca cgt tct agt ttt tca aac tgg ggt agc tgt gtc gat gtt    1008
Ser Asp Ala Arg Ser Ser Phe Ser Asn Trp Gly Ser Cys Val Asp Val
                325                 330                 335
ttt gct cca gga tca caa atc aag tct gct tgg tat gat ggc ggt tat    1056
Phe Ala Pro Gly Ser Gln Ile Lys Ser Ala Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr
            340                 345                 350
aag acg ata agt ggc act tca atg gca acc cca cat gtt gct ggt gtt    1104
Lys Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val
        355                 360                 365
gct gcg ctt tat ctc caa gaa aac agt gca ctt tca cca agc caa gtg    1152
Ala Ala Leu Tyr Leu Gln Glu Asn Ser Ala Leu Ser Pro Ser Gln Val
    370                 375                 380
gaa gcg ctg atc gtt gag cgc gca acc agt ggc aaa gtc acg gat aca    1200
Glu Ala Leu Ile Val Glu Arg Ala Thr Ser Gly Lys Val Thr Asp Thr
385                 390                 395                 400
aga ggc agt gtg aat aaa ttg ctt tac agt tta acg gat gcc gat tgt    1248
Arg Gly Ser Val Asn Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Thr Asp Ala Asp Cys
                405                 410                 415
ggt caa gat tgt ggt ggt cct gat cca acg cca gac cca gaa ggt aaa    1296
Gly Gln Asp Cys Gly Gly Pro Asp Pro Thr Pro Asp Pro Glu Gly Lys
            420                 425                 430
ttg acc tct ggt gtg cca gtg agt ggc ttg agc ggt tca aca ggg cag    1344
Leu Thr Ser Gly Val Pro Val Ser Gly Leu Ser Gly Ser Thr Gly Gln
        435                 440                 445
gta gct tat tac tac gta gat gta gaa gca ggg caa cgt cta acg gta    1392
Val Ala Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Glu Ala Gly Gln Arg Leu Thr Val
    450                 455                 460
caa atg tat ggc ggc agc ggt gat gca gat ttg tat cta cgc ttt ggc    1440
Gln Met Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Leu Arg Phe Gly
465                 470                 475                 480
tct aag cca acg att aat gct tgg gat tgt cga cct ttc aga tac ggc    1488
Ser Lys Pro Thr Ile Asn Ala Trp Asp Cys Arg Pro Phe Arg Tyr Gly
                485                 490                 495
aac agt gag aca tgt aca gtt aat gcc act caa agc gga cgt tac cac    1536
Asn Ser Glu Thr Cys Thr Val Asn Ala Thr Gln Ser Gly Arg Tyr His
            500                 505                 510
gta atg att caa ggc tat tca agc tac aac ggt gta agc atc caa gcg    1584
Val Met Ile Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Asn Gly Val Ser Ile Gln Ala
        515                 520                 525
agt tac tag                                                        1593
Ser Tyr
    530
<210>2
<211>530
<212>PRT
<213>哈氏弧菌T4
<400>2
Met Leu Lys Lys Leu Leu Ser Cys Cys Ile Thr Ser Ala Leu Cys Phe
1               5                   10                  15
His Ser Ser Leu Ala Phe Ser Gln Ser Thr Glu Leu Pro Asn Asp Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Ala Gln Thr Pro Ala Ser Leu Met Leu Ala Pro Glu Asp Val
        35                  40                  45
Ala Ile Ala Asp Arg Tyr Ile Val Val Phe His Gln Pro Gln Met Met
    50                  55                  60
Met Asn Asn Ser Leu Glu Leu Gln Gln Phe Thr Gln Gln Ser Val Asp
65                  70                  75                  80
Arg Met Ser Gly Leu Tyr Ser Ile Glu Val Glu Ser Val Phe Asp Asn
                85                  90                  95
Ser Ile Ser Gly Phe Val Ala Thr Leu Ala Pro Glu Gln Leu Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Arg Ala Asp Pro Arg Val Glu Tyr Ile Glu Gln Asp Arg Ile Leu
        115                 120                 125
Thr Leu Asp Pro Ile Val Ser Ala Glu Val Asn Gln Ser Asn Ala Ile
    130                 135                 140
Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln Arg Ser Leu Pro Leu Asn Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Ala Asn Phe Asp Gly Thr Gly Val Thr Ala Tyr Val Ile Asp
                165                 170                 175
Thr Gly Val Asn Asn Ser His Val Glu Phe Ala Gly Arg Ser Ile Ser
            180                 185                 190
Gly Tyr Asp Phe Val Asp Asn Asp Ala Asp Ala Ser Asp Cys Asn Gly
        195                 200                 205
His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Ser Leu Tyr Gly Val
    210                 215                 220
Ala Lys Asn Val Ser Ile Val Gly Val Arg Val Leu Ser Cys Ser Gly
225                 230                 235                 240
Ser Gly Ser Thr Ser Gly Val Ile Ala Gly Val Asp Trp Val Ala Ala
                245                 250                 255
Asn Ala Ser Gly Pro Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gln
            260                 265                 270
Ser Val Ala Leu Asp Ser Ala Val Gln Ser Ala Val Gln Ser Gly Val
        275                 280                 285
Ser Phe Met Leu Ala Ala Gly Asn Ser Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr
    290                 295                 300
Ser Pro Ala Arg Val Ser Ser Gly Val Thr Val Gly Ser Thr Thr Ser
305                 310                 315                 320
Ser Asp Ala Arg Ser Ser Phe Ser Asn Trp Gly Ser Cys Val Asp Val
                325                 330                 335
Phe Ala Pro Gly Ser Gln Ile Lys Ser Ala Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr
            340                 345                 350
Lys Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val
        355                 360                 365
Ala Ala Leu Tyr Leu Gln Glu Asn Ser Ala Leu Ser Pro Ser Gln Val
    370                 375                 380
Glu Ala Leu Ile Val Glu Arg Ala Thr Ser Gly Lys Val Thr Asp Thr
385                 390                 395                 400
Arg Gly Ser Val Asn Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Thr Asp Ala Asp Cys
                405                 410                 415
Gly Gln Asp Cys Gly Gly Pro Asp Pro Thr Pro Asp Pro Glu Gly Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Ser Gly Val Pro Val Ser Gly Leu Ser Gly Ser Thr Gly Gln
        435                 440                 445
Val Ala Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Glu Ala Gly Gln Arg Leu Thr Val
    450                 455                 460
Gln Met Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Leu Arg Phe Gly
465                 470                 475                 480
Ser Lys Pro Thr Ile Asn Ala Trp Asp Cys Arg Pro Phe Arg Tyr Gly
                485                 490                 495
Asn Ser Glu Thr Cys Thr Val Asn Ala Thr Gln Ser Gly Arg Tyr His
            500                 505                 510
Val Met Ile Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Asn Gly Val Ser Ile Gln Ala
        515                 520                 525
Ser Tyr
    530

Claims (5)

1.一种哈氏弧菌分泌型疫苗，其特征在于：序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。
2.一种按权利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的构建，其特征在于：
1)质粒pBSVhP1的构建：以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5后在含有安卡青霉素(Ap)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，质粒为pBSVhP1；
所述引物为F115’-CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3’和R85’-CTCGAGGATATCACTGGTTGCGCGCT-3’；
2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建：将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb，同时将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗DH5α/pTVP1M。
3.一种按权利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于：将表达上述所得的序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至OD600为0.8-1，而后离心收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4x108cfu/ml，即为疫苗菌悬液，所得疫苗菌悬液具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。
4.按权利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于：所述质粒DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至OD600为0.8-1为首先将DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；而后取0.1ml过夜培养后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap的LB液体培养基中，于28℃摇动培养至OD600为0.8-1。
5.按权利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于：将所述疫苗菌悬液100ul腹腔注射于牙鲆体内，20天后再次将100ul疫苗菌悬液液腹腔注射于牙鲆。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102178943A (zh) * 2011-04-02 2011-09-14 中国科学院海洋研究所 一种交叉保护疫苗
CN102240404A (zh) * 2011-04-02 2011-11-16 中国科学院海洋研究所 一种哈氏弧菌dna疫苗及其构建方法和应用
CN102533999A (zh) * 2012-01-09 2012-07-04 天津师范大学 一种采用荧光rt-pcr技术检测牙鲆tlr1基因表达的方法
CN107596362A (zh) * 2017-09-06 2018-01-19 广东海洋大学 一种针对哈氏弧菌的红笛鲷dna疫苗
CN109010815A (zh) * 2018-08-16 2018-12-18 中国科学院海洋研究所 一种哈氏弧菌灭活疫苗及其制备和应用
CN112592873A (zh) * 2021-03-03 2021-04-02 山东省海洋资源与环境研究院(山东省海洋环境监测中心、山东省水产品质量检验中心) 一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株p5w及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101491671B (zh) * 2008-12-05 2012-11-21 中国科学院海洋研究所 一种交叉保护疫苗及其构建方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102178943A (zh) * 2011-04-02 2011-09-14 中国科学院海洋研究所 一种交叉保护疫苗
CN102240404A (zh) * 2011-04-02 2011-11-16 中国科学院海洋研究所 一种哈氏弧菌dna疫苗及其构建方法和应用
CN102533999A (zh) * 2012-01-09 2012-07-04 天津师范大学 一种采用荧光rt-pcr技术检测牙鲆tlr1基因表达的方法
CN107596362A (zh) * 2017-09-06 2018-01-19 广东海洋大学 一种针对哈氏弧菌的红笛鲷dna疫苗
CN109010815A (zh) * 2018-08-16 2018-12-18 中国科学院海洋研究所 一种哈氏弧菌灭活疫苗及其制备和应用
CN112592873A (zh) * 2021-03-03 2021-04-02 山东省海洋资源与环境研究院(山东省海洋环境监测中心、山东省水产品质量检验中心) 一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株p5w及应用
CN112592873B (zh) * 2021-03-03 2021-06-22 山东省海洋资源与环境研究院(山东省海洋环境监测中心、山东省水产品质量检验中心) 一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株p5w及应用

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