CN102716499B - 一种海豚链球菌三价dna疫苗及其构建方法 - Google Patents

一种海豚链球菌三价dna疫苗及其构建方法 Download PDF

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本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种海豚链球菌三价DNA疫苗及其构建方法。以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒等体积混合，即为三价DNA疫苗；本发明所得疫苗在免疫后一个月和两个月时对海豚链球菌感染的保护效率高达90％以上。

Description

一种海豚链球菌三价DNA疫苗及其构建方法
技术领域
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种海豚链球菌三价DNA疫苗及其构建方法。
背景技术
海豚链球菌（Streptococcus iniae）是一种革兰氏阳性菌，能够感染多种养殖海水和淡水鱼类，包括牙鲆、罗非鱼、石斑、美国红鱼等，因此长期以来在我国以及国际上被认为是一种主要鱼类病原菌。另外，海豚链球菌是一种人畜共患性病原，能够通过患病动物而传染人类，因此其免疫防治研究具有重要意义。目前，由于缺乏有效的疫苗，我国海豚链球菌病防治主要依赖抗生素等药物的使用。在这种情况下，针对该菌的有效疫苗研发已成为水产养殖业的迫切需要。
发明内容
本发明目的在于提供一种海豚链球菌三价DNA疫苗及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海豚链球菌三价DNA疫苗,以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒等体积混合，即为三价DNA疫苗；
所述引物为：
F1：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3‘；
R1：5’-CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’；
F2：5’-CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3；
R2：5’-GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’；
F3：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’；
R3：5’-CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’。
以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别于用SmaI酶切的质粒pCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5α后分别在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18－24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗。
海豚链球菌三价DNA疫苗的构建方法，以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别于用SmaI酶切的质粒pCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5α后分别在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18－24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗；
所述引物为：
F1：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3‘；
R1：5’-CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’；
F2：5’-CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3；
R2：5’-GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’；
F3：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’；
R3：5’-CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’。
所述三价DNA疫苗在PBS中稀释至终浓度为150μg/ml，即为疫苗制备液。
本发明具有如下优点：本发明的三价DNA疫苗在免疫后一个月和两个月时对海豚链球菌感染的保护效应高达90％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001）；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1
三价DNA疫苗S3D的构建
1）质粒pCNF的构建：以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR条件为：94°C 60s预变性模板DNA,然后94°C 40s,50°C60s,72°C 60s,5个循环后改为94°C 40s,62°C 60s,72°C 60s,25个循环后再在72°C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将质粒pCN3（pCN3构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiellatarda antigens.Vaccine 2009;27:5195 202.）用SmaI酶切，回收5.4kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pCNF。
所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏日期：2007年3月22日。保藏编号为：CGMCC No.1984，分类命名为海豚链球菌（Streptococcusiniae）。
所述引物为F1：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3’和
R1：5’-CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水.
2）质粒pCNG的构建：pCNG的构建过程与上述pCNF的构建完全相同，唯一区别在于所用PCR引物为F2：5’-CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3’和R2：5’-GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’。
3）质粒pCNI的构建：pCNI的构建过程与上述pCNF的构建完全相同，唯一区别在于所用PCR引物为F3：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’和R3：5’-CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’。
4）三价DNA疫苗S3D的构建：将上述质粒pCNF、pCNG和pCNI以等比例混合，即为三价DNA疫苗S3D。
实施例2
疫苗的应用
步骤1）疫苗制备液的制备。将上述DNA疫苗S3D在PBS中稀释至终浓度为150μg/ml，即为疫苗制备液。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％ NaCl,0.02％ KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％ NaH2PO4，余量为水。
步骤2）疫苗的接种。将100条牙鲆（每条重约11.4g）随机分为4组，每组25条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1）的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS。
步骤3）海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中培养海豚链球菌G26至OD600为0.9,然后离心（5000g，4°C，10min），收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x108cfu/ml，即为海豚链球菌悬液。
步骤4）疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2）免疫注射后的第30天，用上述步骤3）的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2）的A和B组鱼，每条鱼的注射量为100ul；在步骤2）免疫注射后的第60天，用上述步骤3）的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2）的C和D组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，2条；B组，22条；C组，2条；D组，20条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS=100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故三价DNA疫苗S3D在免疫后一个月和两个月时对海豚链球菌的免疫保护效率分别为91％和90％。
由此得出DNA疫苗S3D对海豚链球菌具有非常好的免疫保护效应。

Claims (4)

1.一种海豚链球菌三价DNA疫苗,其特征在于：以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒等体积混合，即为三价DNA疫苗； 
所述引物为： 
F1：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3’； 
R1：5’-CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’； 
F2：5’-CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3’； 
R2：5’-GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’； 
F3：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’； 
R3：5’-CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’； 
所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1984，分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。 
2.按权利要求1所述的海豚链球菌三价DNA疫苗,其特征在于：以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别与用SmaI酶切的质粒pCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5α后分别在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18－24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗。 
3.一种权利要求1所述的海豚链球菌三价DNA疫苗的构建方法，其特征在于：以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别于用SmaI酶切的质粒pCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5α后分别在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18－24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗； 
所述引物为： 
F1：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3’； 
R1：5’-CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’； 
F2：5’-CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3’； 
R2：5’-GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’； 
F3：5’-CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’； 
R3：5’-CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’； 
所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1984，分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。 
4.权利要求1所述的海豚链球菌三价DNA疫苗的构建方法，其特征在于：所述三价DNA疫苗在PBS中稀释至终浓度为150μg/ml，即为疫苗制备液。 
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