WO2011122843A2 - 어류의 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 그 제조방법 - Google Patents

어류의 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 그 제조방법 Download PDF

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김진우
조미영
김이청
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이남실
이덕찬
김병관
원경미
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Definitions

  • the present invention relates to a combination inactivating vaccine for preventing streptococcal disease of fish and a method of manufacturing the same.
  • Streptococcosis is a disease that occurs in marine fish and is characterized by eye prolapse and changes in the gill cap. The fish are transferred to these Streptococcus species through broodstock or feed to infect fish. Appears between autumn.
  • Streptococcus showed the second highest detection rate with 16.4%.
  • Streptococcus sp The causative agent of streptococci in cultured flounder (flatfish) is Streptococcus sp.
  • Streptococcal infections in the flounder are poorly eaten, uneven on the bottom, and slow to swim, making it easier to catch, and inverting the body and opening the head. They may also cause color fading, ocular protrusion, whitening, redness, redness of the head and upper jaw, redness inside the gill cover and gill cover, and hernias. Dissecting flounder infected with streptococcus Fading, redness of the minister, plural differences, and hypertrophy of the kidneys and spleen appear.
  • Antibiotics have been used to treat cultured flounders with streptococcal disease. However, due to their high resistance to antibiotics, treatment with antibiotics is becoming difficult (Kim Jong-hoon, Korea Fisheries and Fisheries). 36, 654-660, 2003) .In addition, the industry suffers from this loss due to the economic loss and the excessive growth rate following the antibiotic administration.
  • This invention relates to gamma-hemolytic isolates from overflows infected with streptococci.
  • Streptococcus parauberis ⁇ ⁇ Streptococcus parauberis FP2284 (Microbial Accession No. KCTC 11633BP) and Beta-hemolytic Streptococcus (Streptococa)
  • strain FP5024 Microbial Accession Number KCTC 11634BP.
  • Another object of the present invention is the above-mentioned gamma-hemolytic Streptococcus parauberis FP2284 (Microorganism Accession No. KCTC 11633BP) antigen and the beta-hemolytic Streptococcus niae ( «reptoioc «!> Iiae) FP5024 (Microorganism Accession No. KCTC 11634BP) To provide a combination inactivating vaccine for preventing streptococcal disease comprising an antigen and a method of manufacturing the same. ⁇
  • Another object of the present invention is to provide a method of immunizing fish by administering the above inactivated vaccine to fish.
  • the present invention is gamma-hemolytic Streptococcus parauberis) FP2284 and beta-hemolytic Streptococcus. im ' ae) provides the FP5024 strain.
  • the present invention provides an inactivated vaccine using the strain.
  • Inactivated Gamma-Hemolytic Streptococcus paraw ⁇ n FP2284 (Microbial Accession No. KCTC 11633BP) Antigen and Inactivated Beta-hemolytic Streptococcus iniae FP5024 (Microbial Accession No. KCTC 11634BP) Antigen Provided is a combined inactivated vaccine for preventing streptococcal disease.
  • the inactivated vaccine can be manufactured using a method known in the art.
  • an inactivating agent In order to manufacture the inactivated vaccine, an inactivating agent must be used.
  • the inactivator may be used without limitation as long as it is widely known in the art.
  • FP2284 Antigen and Beta-hemolytic Streptococcus iniae can be combined in a ratio of 1: 1. When combined in the above ratio, streptococcosis The prevention effect is excellent.
  • An adjuvant may be further added to the combination inactivating vaccine according to the present invention.
  • the adjuvant can be used without limitation any known in the art.
  • sugars and amino acids as stabilizers mineral oils, vegetable oils, alum, aluminum phosphate, bentonite, silica, muralmyl dipeptide derivatives, thymosin, interleukin, and the like can be used as adjuvants.
  • Injections are divided, sealed and used as vaccines. These vaccines can be used as a dry preparation by infusion as well as liquefied as well as liquid.
  • a drying agent can be used by completely dissolving a dry substance with the sterilizing liquid added just before use.
  • the combination inactivated vaccine according to the present invention can be used for fish of any age at risk of infection. However, from the viewpoint of farming conservation, it is preferable to use small fish or fry.
  • the present invention provides a method for immunizing a fish, comprising administering the vaccine to the fish.
  • the fish is a fish such as flounder, such as the risk of infection
  • the present invention provides an effect of effectively preventing streptococcosis caused by two types of bacteria by one administration of a combination inactivating vaccine. Therefore, the present invention is effective
  • parauberis K.CT 365 ⁇ shows increased protein expression compared to strain
  • ( ⁇ ) shows increased expression compared to ⁇ iniae FP5024 strain.
  • Figure 2 is a micrograph showing the epicarditis observed in S. parauberis infected fish.
  • Figure 3 is a S. after administration of the combined vaccine to the flounder according to an embodiment of the present invention. iniae. ⁇ This is the graph showing the change in the grand antibody.
  • FIG. 5 is a graph showing the change in the target antibody against S. im ' . After immersion administration of the combined vaccine of the present invention.
  • Figure 6 is about / ⁇ raw ⁇ n ' ⁇ ll after immersion administration of the combination vaccine of the present invention
  • FIG. 7 is a result of staining of liver, kidney, heart and gill tissues of the test zone on day 1 of the combined vaccine treatment according to an embodiment of the present invention: 1 is 1 mg (Si) + l mg (Sp) / fish, 2 Is 2 mg (Si) + 2 mg (Sp) / fish.
  • FIG. 8 is a result of staining of liver, kidney, heart and gill tissues of 1 week of mixed vaccine treatment according to an embodiment of the present invention: 1 is 1 mg (Si) + l mg (Sp) / fish , 2 is 2 rag (Si) + 2 mg (Sp) / fish test.
  • 1 is 1 mg (Si) + l mg (Sp) / fish
  • 2 is 2 mg (Si) + 2 mg (Sp) / fish.
  • Vaccine strains were isolated from cultured olive flounder in Jeju Island, which showed symptoms such as color blackening, ocular prolapse, cloudiness, ascites, and intestinal bleeding. Specifically, 1.5% NaC added
  • FP2284 and FP5024 are Mata et al. (Mata, AI, et al., Appl. Environ. Microbiol, 68: 5177-5180, 2004) and Zlotkin et al. (1998) (Zlotkin, A. Dong, Appl. Environ.
  • Microbiol., 64L 4065-4067, 1998) was subjected to multiplex PCR using the primers shown in Table 1 and amplified.
  • the 16S rDNA nucleotide sequences of the FP2284 and FP5024 were engraved with SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • FP5024 was identified as S. iniae.
  • S. pamuberis was identified as P27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '), which is a universal bacterial primer (Bioneer, Korea).
  • P1492r 5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3 '
  • PCR reaction products after amplification using P1492r were sequenced using AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer) and AccuPrep PCR Plasmid Extension Kit (Bioineer). Sequencing sequence of FP2284 and
  • the FP2284 is "Streptococcus parauberis (Steptococcus parauberis)
  • FP2284 which was named” Streptococa iniae FP5024 ".
  • the two strains, FP2284 and FP5024 were deposited on February 5, 2010, at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC), respectively, with microbial accession number KCTC 11633BP and microbial accession number KCTC 11634BP.
  • the LD values of the vaccine strain of Example 1 are shown in Table 1 below.
  • the LD value was measured using methods well known in the art (Hall, J. ⁇ . And Golding, LA: Standard methods for whole effluent toxicity testing: development and application.Report No. MFE 80205. NIWA report for the ministry for environment, Wellington, New Zeland. 1998).
  • Aldolase class- ⁇ aldolase
  • Anti-tumor glycoprotein Anti-tumor glycoprotein
  • / raraw ⁇ ww FP2284 was diluted to l .Ox 10 5 CFU / mL and injected 0.1 mL into the abdominal cavity of healthy flounder, and the total number of bacteria in the internal organs was examined while breeding at 20 ⁇ 1 ° C.
  • parauberis FP2284 was detected in the spleen and kidney at the same level as the injection concentration from day 3, and mortality was observed from day 8 after injection.
  • the larvae showed color deterioration, abdominal distension and mild bleeding around the eyes.
  • the anatomical findings were hepatic hemorrhage, clear ascites, and severe anemia of internal organs.
  • test vaccine was intraperitoneally injected at 0.1 ml per body, and the control group was intraperitoneally injected with sterile physiological saline. Immersion treatment was immersed in the vaccine mixture for 5 minutes, and control was immersed in the breeding water for 5 minutes.
  • the blood was collected and serum was isolated.
  • the microtiter method was used for the investigation.
  • S. pdmuberis female I antibodies were found to have a similar trend to S. im e, with the highest concentration of 5 mg (Si) +10 mg (Sp) / fish at 2 weeks of treatment. Antibodies were shown, but 1 mg (Si) + l mg (Sp) / fish 2 mg (Si) +2 rag (Sp) / fish and 5 mg (Si It was judged that the concentration of +5 mg (Sp) / fish was excellent (Fig. 4).
  • Unantibody titers were significantly higher at 100 mg + 100 g / mH at 2 weeks and higher at 10 mg + 10 mg / m £ at 4 weeks for Sp antigen (FIGS. 5 and FIG. 6).
  • the protection against S. iniae strain was the highest at 10 mg + 10 mgM concentration (Table 4).
  • industrialization is more difficult than the injection method.
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Abstract

본 발명은 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP)균주 및 베타-용혈성 스트랩토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 11634BP)균주를 포함하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 이를 이용하여 어류를 면역시키는 방법에 대한 것이다.

Description

명세서
발명의명칭:어류의연쇄구균증예방용흔합불활성화백신및그 제조방법
기술분야
[1] 본발명은어류의연쇄구균증예방용흔합불활성화백신및그제조방법에 관한것이다.
[2]
배경기술
[3] 연쇄구균증은해산어류에나타나는질병으로,어류의안구돌출이나아가미 뚜껑내측의적변화등을특징을나타낸다ᅳ사육수나생사료를통해이러한 연쇄구균이어류에옮겨가서어류를감염시키며，주로여름에서가을사이에 나타난다.
[4] 양식넙치 (광어 )의세균성질병조사결과，비브리오균 (V rio),연쇄구균， 포토박테리움균Photobacterium damselae),에드와드시엘라탈다 (Edwarte Za tarda),및슈도모나스균 (/ ew¾mona5)이전체세균성질병의 65.3%를
차지하였으며，그중연쇄구균은 16.4%로두번째로높은검출률을나타내었다.
[5] 양식넙치 (광어)의연쇄구균증의원인균은스트렙토코커스—(Streptococcussp.
)이다.넙치의연쇄구균증감염증상을보면,먹이섭취가불량하고바닥에 홑어져있으며,완만한유영을하고있어쉽게잡을수있게된다.또한몸체를 반대로뒤집고머리를을려입을열고있는경우도있다.그리고체색혹화， 안구의돌출,백탁，충혈，두부및상하턱의발적，아가미뚜껑및아가미뚜껑 내측의발적，및탈장등이나타나는것도있다.연쇄구균증에감염된넙치를 해부해보면，간장의을혈이나퇴색,장관의발적,복수가차는현상，신장과 비장의비대가나타난다.
[6] 이와같은연쇄구균증에걸린양식넙치를치료하기위해항생제를투여해오고 있다.그러나항생제에대한내성도가높게나타나고있어서항생제사용에의한 치료는어려워지고있는실정이다 (김종훈둥，한국수산학회지 , 36: 654-660, 2003).게다가항생제투여에따른경제적손실및넘치의성장률저하로인해 관련업계는이증고를겪고있다.
[7] 연쇄구균증은일단발병하면치료가어렵기때문에질병의예방이매우
중요하지만，사육환경및사육관리의개선만으로는질병발생을억제하는데 한계가있다.따라서보다근본적인예방대책으로서백신의개발이시급한 실정이다.
[8] 이에본발명자들은경제적이고효과적인연쇄구균증예방방법에대하여 연구를계속하여감마-용혈성스트렙코커스파라우베리스 (Streptococci paraw^n )와베타-용혈성스트랩코커스이니애 (Sireptococa /mze)의흔합 백신을발명하기에이르렀다.
[9]
발명의상세한설명
기술적과제
[1이 본발명은연쇄구균증에감염된넘치로부터분리된감마-용혈성
스트렙토코커스파라우베리 ^{Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP)및베타-용혈성스트렙토코커스이니애 (Streptococa
Mae) FP5024(미생물기탁번호 KCTC 11634BP)균주를제공하기위한것이다.
[11] 본발명의또다른목적은상기감마-용혈성스트렙토코커스파라우베리스( Streptococcus parauberis) FP2284(미생물기탁번호 KCTC 11633BP)항원및상기 베타-용혈성스트렙토코커스이니애 (« reptoioc «!>iiae)FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 11634BP)항원을포함하는연쇄구균증예방용흔합불활성화 백신및그제조방법을제공하기위한것이다. ᅳ
[12] 본발명의또다른목적은상기흔합불활성화백신을어류에투여하여어류를 면역시키는방법을제공하기위한것이다.
[13]
과제해결수단
[14] 본발명은감마-용혈성스트랩토코커스파라우베리스Streptococcus parauberis) FP2284및베타-용혈성스트렙토코커스이니애
Figure imgf000004_0001
im'ae)FP5024 균주를제공한다.
[15] 상기감마-용혈성스트렙토코커스파라우베리스 (Streptococcus parauberis) FP2284및베타-용혈성스트렙토코커스이니애
Figure imgf000004_0002
Mae) FP5024는 연쇄구균증에감염된제주도양식넙치로부터분리된것으으로, 2010년 2월 5일자로한국생명공학연구원미생물자원센터에각각 KCTC 11633BP및 KCTC 11634BP로기탁되었다.
[16] 본발명은상기균주를이용한불활성화백신을제공한다.구체적으로
불활성화된감마-용혈성스트렙토코커스파라우베리스 (Streptococciwparaw^n ) FP2284(미생물기탁번호 KCTC 11633BP)항원및불활성화된베타-용혈성 스트렙토코커스이니애 (Streptococcus iniae) FP5024(미생물기탁번호 KCTC 11634BP)항원을포함하는연쇄구균증예방용흔합불활성화백신을제공한다.
[17] 상기불활성화백신은이기술분야에널리공지된방법을이용하여제조할수 있다.상기불활성화백신을제조하기위해서는불활성화제를사용해야한다. 상기불활성화제는이기술분야에널리공지된것이라면어느것이나제한없이 사용할수있다.
[18] 상기감마-용혈성스트렙토코커스파라우베리스Streptococcus parauberis)
FP2284항원과베타-용혈성스트렙토코커스이니애
Figure imgf000004_0003
iniae) FP5024 항원은 1:1의비율로흔합될수있다.상기비율로흔합되는경우，연쇄구균증 예방 효과가 우수하다.
[19] 2종 이상의 불활성화 항원을 혼합시 킬 경우에는 흔합에 의한 백신 부작용의 발생，항원상호의 간섭 -예를 들어 흔합시키기 전의 각 항원에 특이적 인 항원성과 면역원성의 저하 등이 나타날 수 있다. 그러나 본 발명과 같이 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 FP2284 및 베타-용혈성 스트랩토코커스 이니애 ( Streptococcus iniae) FP5024에서 유래하는 불활성화 항원을 흔합시킬 경우에는， 항원성과 면역원성이 확보되고 부작용이 관찰되지 않는다.
[20] 본 발명에 따른 흔합 불활성화 백신에는 보조제 (adjuvant)를 더 첨가할 수 있다. 상기 보조제는 이 기술분야에 알려진 것은 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면，안정화제로서 당류나 아미노산류，또한 보조제로서 광물유, 식물유, 백반，인산알루미늄, 벤토나이트，실리카，무라밀디펩티드 (muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신, 인터류킨 등을 이용할 수 있다.
[21] 이어서，적당한 용적의 , 예를 들어 약 10-500 m£ 부피의 바이알에 백신액을
나누어 주입하고 밀봉 후 백신으로 사용한다. 이 러한 백신은 액상뿐만 아니라, 나누어 주입한 다음에 동결건조함으로써 건조제제로 사용할 수 있다. 또, 건조제제는 사용 직전에 첨가한 감균액으로 건조 물질을 완전하게 재용해하여 사용할 수 있다.
[22] 본 발명에 따른 흔합 불활성화 백신은 감염의 위험성 이 있는 임의의 연령의 어류에 사용할 수 있다. 단, 양식 보전의 관점에서, 작은 물고기 내지 치어를 사용하는 것이 바람직하다.
[23] 본 발명은 상기 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법을 제공한다. 상기 어류는 감염의 위 험성이 있는 넙치 등의 어류를
포함하다.
[24] 본 발명의 불활성화 백신을 이용하여 어류를 면역시키는 방법은 본 발명의
백신을 복강내 투여 등을 이용하여 어류에 투여하는 단계를 포함한다.
[25]
발명의 효과
[26] 본 발명은 흔합 불활성화 백신 1회 투여로 2 종류의 세균에 의한 연쇄구균증을 효과적으로 예방할 수 있는 효과를 제공한다. 따라서 본 발명은 효과가
우수하면서도 경제적인 백신을 제공한다.
[27]
도면의 간단한 설명
[28] 도 1은 본 발명에 따른 균주의 2-DE 프로필을 나타낸 것이다: (O)은
parauberis K.CT 365 \ 균주에 비해 발현이 증가된 단백질체를 나타내고， (→)은 ^ iniae FP5024 균주에 비해 발현이 증가된 단백질체를 나타냄 .
[29] 도 2는 S. parauberis 감염어에서 관찰된 심외막염을 보여주는 현미경 사진이다.
[3이 도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따른 흔합 백신을 넙치에 주사 투여한 후의 S. iniae.^} 대한 웅집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
[31] 도 4는본 발명의 일 실시 예에 따른 흔합 백신올 넙치에 주사 투여한 후의 S.
/wraMten 에 대한 웅집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
[32] 도 5는 본 발명의 흔합 백신을 침지 투여한 후의 S. im' .에 대한 웅집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
[33] 도 6은 본 발명의 흔합 백신을 침지 투여한 후의 /^raw^n'^ll 대한
웅집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
[34] 도 7은 본 발명의 일 실시 예에 따른 흔합 백신 처리 1일째 시험구의 간장，신장, 심장 및 아가미 조직 염색 결과이다: 1은 1 mg(Si)+l mg(Sp)/fish, 2는 2 mg(Si)+ 2 mg(Sp)/fish 시 험구임 .
[35] 도 8은 본 발명의 일 실시 예에 따른 흔합 백신 처 리 1주일째 시험구의 간장, 신장，심장 및 아가미 조직 염색 결과이다: 1은 1 mg(Si)+l mg(Sp)/fish, 2는 2 rag(Si) + 2 mg(Sp)/fish 시험구임 .
[36] 도 9는 본 발명의 일 실시 예에 따른 흔합 백신 처 리 4주일째 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직 염색 결과이다: 1은 1 mg(Si)+l mg(Sp)/fish, 2는 2 mg(Si) + 2 mg(Sp)/fish 시 험구임 .
[37]
발명의 실시를 위한 형 태
[38] 이하 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들
실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
[39]
[4이 실시 예 1: 백신 균주의 분리 및 동정
[41] 백신 균주는 체색흑화, 안구돌출 및 백탁, 복수, 장출혈 등의 증상을 나타내는 제주도의 양식 넙치로부터 분리하였다. 구체적으로, 1.5% NaC 첨가된
BfflA(Difco, USA) 배지를 사용하여 병든 어류의 내부 장기 조직을 무균적으로 적출하여 도말한 후 30°C에서 24~48 시간 배양하여 분리하였다. 순수 분리한 콜로니 중 그람 양성 균주를, "FP2284" 및 "FP5024" 라 명명하였다. 상기 FP2284 및 FP5024는，각각， Mata 등의 방법 (Mata, A.I, 등, Appl. Environ. Microbiol, 68: 5177-5180, 2004)과 Zlotkin 등의 방법 (1998)(Zlotkin, A.둥， Appl. Environ.
Microbiol., 64L 4065-4067, 1998)에 따라 표 1과 같은 프라이머를 이용， 멀티플렉스 PCR을 실시하여 증폭시 켰다. 상기 FP2284 및 FP5024의 16S rDNA 염기서열은 각각 서 열번호 1 및 2로 난타내었다.
[42] Mata 등의 방법을 이용한 1차 동정 결과, 상기 FP2284는 S. parauberis로
동정되었으며， Zlotkin 둥의 방법을 이용한 1차 동정 결과, 상기 FP5024는 S. iniae 로 동정되 었다. 상기 1차 동정 결과 S. pamuberis로 동정된 것은 유니버셜 박테리아 프라이머 (Bioneer, Korea)인, P27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 P1492r(5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3') - 사용하여 증폭 후 PCR 반웅 산물은 AccuPrep PCR 정제 키트 (Bioneer) 및 AccuPrep PCR 플라스미드 익스텐션 키트 (Bioineer)를 이용하여 시퀀싱을 실시하였다 . FP2284의 염기서 열 및
GenBank에 등록되어 있는 Streptococcus 속 세균의 유전 정보를 Clustal W 프로그램을 사용하여 멀티플 얼라인먼트를 실시하고 각 균종간의 상동성을 비교하였다. FP2284의 16S rRNA 유전자에 대한 염기서 열 분석 결과， GenBank에 등록되어 있는 Streptococcus 속의 유사 균주와 비교한 결과 S. parauberis AF284579, AY584477, X89967 및 AY942572 등의 균주와 98%의 상동성을 나타내었다. 따라서 상기 FP2284는 S. parauberis —판단되었다. 마찬가지로 상기 FP2284에서 사용한 프라이머와 시퀀싱 방법을 이용하여， FP5024의 16S rRNA 유전자에 대한 염기서 열을 분석한 결과, Streptococcus iniae ATCC 29178 균주와 99%의 상동성을 보였다. 따라서 상기 FP5024는 S. iniae로 판단되었다.
[43] 상기 FP2284는 "스트랩토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis)
FP2284"로 명명되었고，상기 FP5024는 "스트렙토코커스 이니애 (Streptococa iniae) FP5024' '로 명 명되었다. 이 두 균주， FP2284 및 FP5024는, 2010년 2월 5일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에，각각, 미생물 기탁번호 KCTC 11633BP 및 미생물 기탁번호 KCTC 11634BP로 기탁되었다.
[44]
[45] 실시 예 2: 백신 균주의 병원성
[46] 실시 예 1의 백신용 균주의 LD 값은 아래 표 1과 같다. 상기 LD값 측정은 이 기술분야에서 널리 공지된 방법을 이용하였다 (Hall, J.人. and Golding, L.A: Standard methods for whole effluent toxicity testing: development and application. Report No. MFE 80205. NIWA report for the ministry for environment, Wellington, New Zeland. 1998).
[47]
[48] 표 1
[Table 1]
Figure imgf000007_0001
[49] ,
[50] 실시 예 3: 백신 균牟의 주요 항원 특성 분석
[51] 표준 ·주인 S. parauberis KCTC 3651에 대한 토끼 항혈청을 이용한 슬라이드 웅집반웅 결과 S. paraM^/ 는 모든 균주에서 웅집반웅을 나타냈으며 대부분 용혈성 이 없는 것 (감마-용혈성)으로 나타났고， m xe 용혈성 시험 결과 베타-용혈성올 나타내었다.
[52] 백신 균주인 2종의 항원 단백질체 분석을 위하여 2-DE(Isoelectric focusing and SDS-PAGE) 분석올 수행하였다. 분석 결과， S. parauberis FP2284의 2-DE 맵에서， S. parauberis FP2284는 표준 균주인 S. parauberis KCTC 3651과 S. iniae FP5024에 비해 각각 13개 및 4개의 단백질 발현이 증가한 것으로 나타났다. 표준 균주에서 발현되지 않은 단백질을 Maldi-Ms/Ms로 추가 분석한 결과，클래스 -II
알돌레이즈 (class-Π aldolase) 및 안티 -튜머 글라이코프로틴 (Anti-tumor glycoprotein)으로 동정되 었다 (도 1).
[53]
[54] 실시 예 4: 백신 균주의 주요 항원 특성 분석
[55] BHIA 배지 (Brain Heart Infusion Agar, Difco, USA)에서 배양한 본 발명의 S.
/raraw^ww FP2284를 l .Ox 105 CFU/mL 농도로 희석하여 건강한 넙치의 복강에 0.1 mL씩 주사한 후 수은 20± 1°C에서 사육하면서 내부 장기에서의 총균수를 조사하였다. 그 결과， parauberis FP2284는 3일째부터 비장과 신장에서 주사 농도와 동일한 수준의 세균수가 검출되었으며 , 주사 후 8일째부터 폐사어가 관찰되 었다. 병어는 외관상 체색 혹화, 복부 팽만 및 안구 주변의 미 약한 출혈 증상을 나타내었으며，해부 소견으로는 간 층혈, 맑은 복수，내부 장기의 심한 빈혈 증상이 관찰되 었다. 병어 내부 장기의 병 리 조직 검사 결과, 비장 협조직의 광범위한 비후 및 다수의 MMC(melano-macrophage center), 심외막염 및 내부 장기의 막 조직에서 염증 소견이 관찰되 었다 (도 2).
[56]
[57] 실시 예 5: 흔합 불활성화 백신의 제조 및 접종
[58] 동결 보존된 S. parauberis FP2284와 S. iniae FP5024를 1·5%>(ν/ν) NaCl이 첨가된 BfflA 배지에서 30°C 온도로 24 시간 배양하였다. 배양된 평판배지의 집락을 무균적으로 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB에 접종 후 쉐이킹 인큐베이터 (JS Research Inc.)에서 150 rpm, 30°C 온도로 48 시간 배양하였다. 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린 (Merck, Germany)을 각 배양액의 0.59¾(v/v)가 되도록 첨가하여 쉐이킹 인큐베이터에서 150 rpm, 20°C로 24 시간 불활화하였다. 배양균의 불활화를 BHIA 아가 (agar)(Difco, USA)에서 최종 확인하였다. 불활화가 확인된 균액은 12,000 RPMD으로 원심분리 후 멸균 생리 식염수로 3회 세척한 후 균체를 수거하고 최종적 ^로 습균체 무게를 측정하여 실험구에 따라 농도를 달리하여 현탁하였다 (표 2). 백신액은 멸균된 유리 병에 분주하여 4°C에 보관 후 실험에 사용하였다.
[59] 시험어로 넙치를 이용하였다. 넙치에 대한 백신 접종은 복강주사법과
침지처리법의 두 가지 방법으로 수행하였다. 복강 주사의 경우，시 험 백신을 어체당 0.1 ml씩 복강 주사하였으며 대조구는 멸균 생리 식 염수를 동량씩 복강 주사하였다. 침지처리 법은 백신 흔합액에서 5분간 침지 처 리하였으며，대조구는 사육수에 5분간 침지 처리하였다.
[60]
[61] 표 2 [Table 2]
흔합 백신 복강주사를 위 한 균액 농도 (S i : S. iniae, Sp : S. parauheris)
Figure imgf000009_0001
[62]
[63] 실시 예 6: 흔합 불활성화 백신의 면역원성 시험
[64] 6-1 : 옹집항체가 조사
[65] 실시 예 5에 따른 흔합 백신 접종 후 2， 4， 6, 8주째 시험어의 미부정맥에서
채혈하여 혈청올 분리하였으며，웅집 항체가는
마이크로타이터 (microtiter)법으로 조사하였다. 즉, 96 웰 마이크로플레이트 웰 (Corning, USA)에서 넙치로부터 분리한 혈청을 멸균 생리 식염수로 단계 회석한 후 24 시간 후 웅집괴 형성 유무를 관찰하였다.
[66] S. /m 에 대한 웅집항체가 조사 결과，백신 처리 2주째부터 웅집항체가의 증가가 확인되었으며 조사 8주째까지 지속적으로 유지되었다. 백신 처리 2주째에는 시험구중에서 5 mg(Si)+10 mg(Sp)/fish와 농도구에서 가장 높은 항체가를 나타내었으나, 백신 접종량 및 8주간의 웅집항체가 전체적 인 결과를 분석 시 1 mg(Si)+l mg(Sp)/fish 2 mg(Si)+2 mg(Sp)/fish 및 5 mg(Si)+5 mg(Sp)/fish의 농도구가 우수한 것으로 판단되었다 (도 3).
[67] S. pdmuberis여 I 대한 웅집항체가 조사 결과는 S. im e와 유사한 경향으로 백신 처리 2주째에는 시험구중에서 5 mg(Si)+10 mg(Sp)/fish의 농도구에서 가장 높은 항체가를 나타내었으나, 백신접종량 및 8주간의 웅집항체가 전체적인 결과 분석 시 1 mg(Si)+l mg(Sp)/fish 2 mg(Si)+2 rag(Sp)/fish 및 5 mg(Si)+5 mg(Sp)/fish의 농도구가 우수한 것으로 판단되 었다 (도 4).
[68]
[69] 6-2: 방어 력 조사
[70] 시험 백신이 방어 력에 미치는 효과를 조사하기 위하여 백신 접종 후 4주째 5. Mae 및 S. parauberis를 lx 107 CFU/ml로 조정한 후, 0. 1ml씩 복강주사법으로 인위 감염 후 2 주간 누적폐사율을 조사하였다. 상대생존율은 아래와 같이 계산하였다.
[71]
[72] 상대생존율 (%)={ 1- (시험구의 누적폐사율 /대조구의 누적폐사율) } X 100
[73]
[74] 방어 력 조사 결과, 흔합백신을 주사 후 각 균주에 대한 방어 력 조사 결과, 모든 백신 접종구에서 66.7% 이상의 상대 생존율을 나타내었으며，백신 접종량을 고려하였을 때 1 mg(Si)+l mg(Sp)/fish의 농도구가 가장 우수한 것으로
판단되 었다 (표 3).
[75]
[76] 표 3
[Table 3]
S. iniae ¾ S. parauberis 균주에 대한 방어력
Figure imgf000010_0001
[77]
[78] 비교예：침지처 리 법에 의 한 효과
[79] 실시 예 5의 흔합 백신을 침지법으로 처리하였을 때, Si 항원에 대한
웅집항체가는 2주째에 100 mg+100 g/mH 농도에서 유의 적으로 높게 나타났으며 Sp 항원의 경우 4주째에 10 mg+10 mg/m£ 농도에서 높게 나타나는 경향을 보였다 (각각 도 5 및 도 6). 또한 S. iniae 균주에 대한 방어 력은 10 mg+10 mgM 농도에서 가장 높게 나타났다 (표 4). 그러나 백신 접종량 및 효과를 고려하여 판단해보면, 주사처리법에 비하여 산업화에는 어 려움이 있을 것으로 판단된다.
[8이
[81] 표 4 [Table 4]
S. iniae 및 S". parauberis 균주에 대한
Figure imgf000011_0001
[83] 실시 예 7: 흔합 불활성화 백신 투여에 따른 안전성 조사
[84] 본 발명에 따른 백신 처리의 안전성 조사를 위하여 , 실시 예 5의 흔합백신
처 리구 중 효과가 높게 나타난 lmg(Si)+lmg(Sp)/fish, 2mg(Si)+2mg(Sp)/fish 복강주사구 및 대조구에 대한 병리조직학적 검사를 실시하였다. 백신 처리 1일, 1주일 및 4주일째 시험구의 간장, 신장，심장 및 아가미 조직을 10% 중성 포르말린에 고정 후 상법에 따라 H&E염색을 실시 후 검경하였다. 그 결과, 백신 처리구의 모든 장기에서 정상적 인 조직 소견이 관찰되었으며 , 심장에서도 심외막염 이 관찰되지 않아 백신의 독성 이 없음을 확인하였다 (도 7 내지 9).
[85]
[86] - S. iniae FP5024 수탁증
출원인 또는 대.리인 국 11출원번호
파일 참조:번호 PCT11-006 PCT/KR2D11/002173 가탁된 QI생물 또는기타 생물학적 물절의 표시사항
(특허협력조약 규척 제 13초의 2)
A. 하기의 ≥入1사항은 ¾세서 .2. 축 .6. soil ^ima：기탁 a 미솅들 또는 기타 생 g학적 울질에 관한 것임.
B. ：기탁 g.의 확:인 이오 I의 추.；쟈척 기탁¾은 c 별도의 피ᅵ ;이지에
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ø 기탁기관의 명창
KRIBB한국 생울 a학'생 * ^학 ¾구소
기탁기관 ¾주소： (우편 ¾호 및 국명 포함)
다 국 대천광역시 305-333유성구 어은^ 52
； |탁일자 ：기학번호
201ϋ년 (32월 22알 (22，02.2{)10) KRIBB KCTC11633BP
G.牟가적 표시^항(기¾사¾이 ¾으면 §:란으 ¾ 저 I출 별 으 I 추^ III (3.1 XI |속 .□
5. parauberis FP2284
D. SAIAifOI ¾ 하고 있 Λ¾¾¾ ΙΑ¾0| S 지¾국을 1한 人항 01 iB
E.표시 λᅡ항의 별도제¾ (기 ΙΗ:사항이 으면 공&으≤ 제 )
하기의 표시사항은 후에 국제사무국에 제출될 31임 ( λ|λ항의 일반적 성질 S특¾» ¾)
수리관청 사응란 국제사부국 사용란
□ 당해 SXi는 국제출원과 항 ᅵ1 첩추되 '었 ¾ □ 당해 용지는 국제출원^ 함加 접수되 ¾音: 담당관 당당관
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대체용지 (규칙 저 I26조) 출원인 또는 대.리 국 1출 S번호
파일 &조번≤ PCT11-0D6 F¾T/KR )11/002173
I꽉& 미생울 또는 기타 생울학적 울질의 표시사항
(특허 조^ 규칙 제 i 3초의 2)
A. 하^의 표시사항은 명세서 _2_ 쪽 7 Soil 기¾돈! 기탁된 이생울 또는 기 생울학적 울질에 관한 것앙,
B. 기탁울의 확인 0|¾의： 추:;가적 31탁 S은 S별도의 I이지에 기재 □ 기 ᅣ기관의 명청
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S. inSae FP5Q24
D,표 A 항 ΘΙ지 S하고 있는 ¾§국@ IAᅡ향이 모든 지정: 을 위한 사항0| 0ᅡ닌 경우)
Ε. 표시사항의 별£ 제출 (기재사항이 없으연 공란으로 제출)
하기의 표 λΙ사항은 후에 국채사무국에 ¾Ι* 것 (표시사항의 일반적 성질을 특정 것)
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대체용지 (규칙 제 26조)

Claims

청구범위
[청구항 1] 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 감마-용혈성
스트렙토코커스 파라우베리 ^ᅳ Streptococcus parauberis)
FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 균주.
[청구항 2] 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 베타-용혈성
스트렙토코커스 이니애 0 ¾ptococ « iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 11634BP) 균주.
[청구항 3] 불활성화된 감마-용혈성 스트템토코커스 파라우베리스 (
Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 항원 및 불활성화된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니 애 (
Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 1 1634BP) 항원을 포함하는 연쇄구균증 예방용 흔합 불활성화 백신.
[청구항 4] 제 3항에 있어서 ,
상기 감마-용혈성 스트랩토코커스 파라우베리스 (Sirepto ?cci« parauberis) FP2284 항원과 상기 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니 애 (ᅳ Streptococcus iniae) FP5024 항원은 1： 1의 비율로 흔합되는 것인，연쇄구균증 예방용 흔합 불활성화 백신.
[청구항 5] 불성화시킨 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 (
Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 균주와 불활성화시킨 베타-용혈성 스트램토코커스 이니 애 ( Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 1 1634BP) 균주를 흔합시키는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 흔합 불활성화 백신의 제조방법 .
[청구항 6] 제 5항에 있어서，
상기 감마-용혈성 스트랩토코커스 파라우베리스 CStreptococ parauberis) FP2284 항원과 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니 애 ( Streptococcus iniae) FP5024 항원은 1: 1의 비율로 흔합되는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 흔합 불활성화 백신의 제조방법 .
[청구항 7] 겨13항 또는 제 4항의 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는,
어류를 면역시키는 방법 .
[청구항 8] 제 7항에 있어서，
상기 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는 어류를 면역시키는 방법 .
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