CN103119153B - 抗龋齿组合物和益生菌/益生素 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了分离自没有龋齿的个体的不同的具体的细菌菌株，其特征在于它们呈现针对生龋生物的抑制活性。本发明还公开了一种方法，所述方法用于分离所述菌株，以及生物活性肽，如来源于人和细菌的抗微生物肽，其也显示抗生龋活性。此外，本发明还公开了药物和/或益生菌/益生素组合物、功能食品、漱口水、牙膏、口香糖等，其包含可以用于治疗和/或预防口腔传染病、优选龋齿的本发明中描述的至少一种菌株和/或至少一种生物活性肽，或其组合。

Description

抗龋齿组合物和益生菌/益生素
发明领域
本发明属于人类健康领域；更具体地，口齿健康领域。
背景
人类口腔寄居有数百个细菌物种，其大多数是共生物种，它们对于维持口腔生态系统中的平衡是必需的。然而，它们中的一些在口腔疾病(主要是龋齿和牙周疾病)的发展中起作用(1)。口腔疾病以牙斑的生长为开始，牙斑是通过细菌与来自人唾液的糖蛋白和微生物分泌的多糖一起积累形成的生物膜(2)。位于中性或碱性的龈下囊中的龈下斑典型地寄居有革兰氏阴性厌氧菌，并且是齿龈炎和牙周炎发展的原因。龈上牙斑形成在牙齿表面并且包括酸化菌和嗜酸菌，所述菌在饮食中摄入的糖发酵后产生酸并降低pH。当pH过于酸性(通常具有低于5.5的值)，牙釉质被去矿化和破坏，并且，因此，这些细菌引起龋齿，而龋齿被认为是世界上分布最广的传染病，影响超过80％的人口(3)。糟糕的口腔健康可以与其他病理学相关联，如，例如，胃溃疡、胃癌或心血管疾病等。
口腔病原体至今未被根除的一个主要原因是在研究寄居于口腔的微生物群落中涉及的困难，因为，一方面，生态系统的复杂性(检测到数百个物种，其具有多个水平的相互作用)使得难以检测潜在的病原物种(4)；此外，如在典型疾病中，遵循Koch的假定，没有单个的病原学因子可以被鉴定。该事实已经在牙周病中清楚地显示，其中至少有3个属于十分不同的分类学组的细菌物种(所谓的牙周病原体的“红色复合体”)，所述物种与牙周病的发展和进展相关(5)。另一方面，大比例的口腔细菌不能被培养(6)并且，因此，常规微生物学方法给出寄居于牙斑的天然群落的不完整图像。然而，目前宏基因组技术(metagenomictechnique)和下一代测序技术的发展允许通过在不需要培养细菌自身的情况下分析复合微生物样品的总DNA(宏基因组(Metagenome))来研究作为整体的细菌群落。
在这点上，前沿宏基因组学方面的研究主要通过鸟枪法集中于肠内生态系统，其中DNA被克隆在小尺寸的质粒中，随后是常规Sanger型测序(7，8)。更近一些的方法包括测序大尺寸F黏粒的末端(9)和使用“Illumina”测序技术，该技术提供短序列的高覆盖(10)。对口腔以及其他人体生境如皮肤、阴道或呼吸道的微生物群的研究集中于测序核糖体RNA扩增子(11，12)。与之前基于培养的研究相比，这些研究提供给我们关于这些细菌群落的知识的实质进展，但是对微生物多样性的估计被以下因素妨碍：PCR扩增中的偏差(即PCR仅检测与已知的那些细菌最相似的细菌，并且基于所使用的扩增引物，给出当前多样性的不完整图像)，克隆偏差(大量基因不被克隆，因为它们对宿主细胞有毒性，并且，因此，该方法不允许研究样品的整个遗传库(reservoir))，以及低的序列长度(Illumina技术中的序列仅具有35-70个核苷酸，在大多数情况中这使得可靠的分类学或功能分配是不可能的)，以及如上所提及的事实：大比例的口腔细菌不能被培养。
为了解决上述问题，本发明公开了通过使用454-焦磷酸测序(454-pyrosequencing)直接测序宏基因组DNA从而获得牙斑的宏基因组，由此消除克隆和PCR技术的偏差，并且，此外，提供接近处于不同健康条件下的口腔细菌群落的整个遗传库的方法，以及分析在获得的宏基因组中发现的那些中哪些细菌物种可以与良好的口腔健康相关的可能性，因为与经历过或正在经历龋齿的那些个体相比，从未经历龋齿的那些个体展现不同的细菌群。通过本发明中获得的口腔宏基因组，能够从口腔样品(尤其从未经历龋齿的个体的龈上斑)中的细菌的聚集体中直接分离、培养并鉴定具有抗龋齿活性的菌株，即能够抑制生龋细菌生长的那些菌株。
本发明中公开的另一个策略是由从未经历龋齿的个体的牙斑获得F黏粒(长的DNA插入，约35-45Kb)的宏基因组文库。通过获得所述F黏粒文库，有可能分离并鉴定由存在于从未经历龋齿的个体的口腔中的细菌合成的生物活性抗生龋肽。在这点上，已知，现有技术中，变异链球菌(Streptococcusmutans)显示为龋齿的主因(13)，不令人意外地，针对该病的大多数策略以该微生物为目标。这些策略包括使用已知的表面抗原开发疫苗，可以中和细菌的被动免疫策略，变异链球菌（S.mutans)与益生菌菌株的共聚集，以及使用对变异链球菌特异的抑制蛋白等(14)。
其他不同的策略是公开在不同的专利文献中的那些，所述文献提出使用不同的细菌菌株，优选使用生产较低浓度的酸的变异链球菌(15)，或者使用相同资源，例如，致病菌株和非致病菌株的营养物，连续供应高浓度的非致病细菌，如果它们共享相同的资源，这导致致病细菌的置换(16)，或甚至利用生龋细菌菌株对牙齿的较低的粘附性(17)。相反，本发明公开的生物活性菌株和肽自身具有抗菌活性，优选针对生龋微生物的抗生龋活性。另一方面，专利WO20040072093(18)公开了大量主要针对革兰氏阴性微生物具有活性的抗微生物剂，但是龋齿的主因，变异链球菌和表兄链球菌(S.sobrinus)，是革兰氏阳性微生物。此外，生产WO20040072093(18)中公开的抗微生物肽的缓症链球菌(S.mitis)和口腔链球菌(S.oralis)分离菌已经分离自患有囊性纤维化(cysticfibrosis)的患者的喉部，不是如在本发明的肽和/或菌株的情况中那样分离自不具有龋齿的人的口部。类似地，所述肽的治疗用途目标在于治疗呼吸道疾病而非如在本发明公开的生物活性肽的情况中那样治疗龋齿。
在这点上，使得本发明分离和公开的细菌菌株与现有技术中公开的其他菌株不同的主要技术特征是它们可以通过常规微生物技术培养；在不需要遗传修饰的情况下，它们显示针对导致口腔传染病(优选龋齿)的生物的抑制活性；以及，它们分离自从未经历龋齿的个体。因此，本发明公开的抗生龋细菌自身以及生物活性抗生龋化合物，优选肽，都同样可以用作益生菌和/或益生素组合物本身，或用作设计用于治疗口腔感染，如，例如，龋齿、牙周炎等的不同药物组合物的部分，或甚至是用作功能食品。此外，本发明还公开了用于预防和/或治疗口腔传染病，优选龋齿的方法，所述方法包括给药药物有效量的上述至少一种菌株和/或至少一种抗微生物化合物，优选肽，或包含本发明的至少一种菌株和/或至少一种化合物(优选肽)的益生菌或药物组合物或功能食品。
发明内容
发明简述
现有技术中在鉴定直接抑制与口腔疾病的发生相关的病原菌的生长的细菌菌株方面存在的困难因此是由口腔中的大量细菌物种导致的；因此，在它们所有之中分离直接抑制致病物种生长的菌株(其中很多是不可培养的物种)所涉及的困难使得该问题至今难以解决。
本发明通过创建从未经历龋齿的个体的口腔的宏基因组解决了该问题。使用大规模测序、优选焦磷酸测序存在于取自从未经历龋齿的个体的口腔的样品中的DNA创建所述宏基因组，使得有可能鉴定在存在于所述个体的口腔中的细菌种群中最常见的细菌属和种。目前，使用培养、克隆或PCR技术，对样品中各种细菌频率的这种量化还是不可能的，因为这些技术仅鉴定部分的细菌，并且鉴定的那些细菌的比例由于方法自身(分别主要地由于特定物种的优选的培养、克隆或扩增)而有偏差。
原则上，本发明基于人类，但是可以用于任何高级哺乳动物，尤其是宠物或家畜，或甚至是野生动物群。在从未经历龋齿(作为典型口腔疾病的代表疾病)的个体中，足以确定每个物种的特征性宏基因组。一旦从自宏基因组获得的数据鉴别了在健康个体的口腔中最常见的细菌菌株，本发明之后的步骤包括在有利的培养基中以及在有利的条件下培养获得自这些个体的口腔的样品，以使研究下的哺乳动物物种的宏基因组中鉴定的最常见的属和种可以发展。
解决上述问题的第二备选方案包括尝试分离化合物，尤其是由存在于从未经历龋齿的个体的口腔中并且呈现针对生龋物种的生长的直接抑制活性的细菌菌株分泌的活性肽等。在本发明中，直接抑制能力被定义为通过抗菌作用在所述致病物种菌苔培养物中产生抑菌圈(inhibitionhalo)完全抑制生长的能力，同时不排除以下事实，即除了由其抗菌作用导致的抑制以外，菌株和化合物可以通过阻碍其他途径的生龋作用，如改变所述生龋菌株生长的最佳pH、阻碍其粘附到牙齿等，发挥其抗微生物作用、优选抗生龋作用。
为此，本发明再次从取自健康个体的口腔样品开始，但是，在此备选方案中，仅集中于可以由上述分离的菌株等分泌的细菌来源的化合物上。此外，可以存在由其他不可培养并且因此不能使用以上提出的策略分离的细菌菌株分泌的化合物。最后，除了来自寄居于口腔的细菌菌株的种群的细菌来源的化合物以外，所述口腔还含有由哺乳动物(尤其是人)细胞自身分泌的化合物，本发明优选基于此。这些化合物中的一些可以具有针对生龋微生物生长的直接抑制活性。为此，获得自健康个体口腔的样品被裂解，抽提其DNA，利用所述片段构建F黏粒，并将其克隆到可以在生龋物种的培养物中培养和测定的宿主细胞中，从而观察针对致病生龋物种生长的抑菌圈是否产生。
必须指出，虽然在已知其针对优选寄居于口腔的致病细菌生长的抑制能力的情况下，分离的抑制菌株和化合物获得自口腔的样品并且具有对抗致病的产生龋齿(生龋)细菌物种的活性，但是原则上分离的细菌菌株和化合物可以发现于身体的其他部分并且产生其他疾病或与其他疾病相关。为此，本发明的一个目的是将分离的菌株和化合物用作药物，尤其是作为抗微生物剂并且，更具体地，作为抗细菌剂。
因此，本发明公开了分离具有针对涉及口腔疾病的发生的致病微生物生长的抑制能力的可培养的细菌菌株和化合物，主要是生物活性肽。虽然在本发明中，龋齿的发生被认为是典型口腔疾病的代表性疾病，但是本发明可以应用于可归因于口腔致病微生物的任何传染病。为此，本发明优选集中于分离具有针对致病微生物(尤其是涉及龋齿发生的那些)生长的抑制能力的细菌菌株和化合物，主要是生物活性肽。
用于分离具有抗生龋能力的可培养的细菌菌株的方法是基于获得从未经历龋齿的个体的口腔宏基因组，以便确定哪个类型的细菌个体最频繁地存在于其口腔中并且分析它们中的哪些通过抑制生龋细菌的生长与良好的口腔健康相关。所述方法使得有可能分离、表征、培养具有抗生龋活性的不同菌株并将其保藏在西班牙典型培养物中心(SpanishTypeCultureCollection)(CECT)：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775。通过序列同源性分析，结论是呈现抗生龋活性并且保藏在CECT的四种菌株，具体地菌株CECT7746、7747、7773和7775，属于相同的细菌属：链球菌(Streptococcus)；因此，除了其功能性(抗生龋活性)和用于获得它们的方法以外，所述菌株具有结构和分类学相似性，因为如上所述，它们属于相同的细菌属，链球菌。
另一方面，用于分离和表征生物活性抗生龋肽的方法是基于由从未经历龋齿的个体获得F黏粒宏基因组文库。使用所述方法，有可能表征由在从未经历龋齿的个体中发现的细菌(包括不可培养的细菌)生产的具有抗生龋能力的肽以及由所述个体自身合成的抗微生物化合物(例如防卫素型)。测定所述肽从而确定其针对生龋细菌如例如变异链球菌或表兄链球菌生长的抑制活性。
本发明的另一方面公开了不同的、具体的可培养的细菌菌株，CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775，所述菌株分离自具有极好的口腔健康并且从未经历龋齿的个体，其特征在于它们呈现针对产生口腔传染病的生物(优选针对产生龋齿微生物)的抑制活性。从存在于从未经历龋齿的个体的牙斑中的细菌的宏基因组，通过与现有细菌DNA文库的同源性，鉴定在从未经历龋齿的健康个体中最常出现的细菌的属和种。在没有龋齿的个体中最常出现并且显示出在具有龋齿的个体中不存在或以极低的频率出现的细菌属于以下属中的一个：罗氏菌属(Rothia)、格鲁比卡氏菌属(Globicatella)、约翰森氏菌属(Johnsonella)、金氏菌属(Kingella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、Phocoenobacter、Mannheimia、嗜血菌属(Haemophilus)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、链球菌属和Aggregatibacter；其中链球菌属是最丰富的。在这点上，本发明优选的细菌菌株是菌株CECT7746、CECT7747、CECT7773和CECT7775，它们都属于链球菌属。
本发明中公开的另一方面描述了生物活性化合物，优选肽，其抑制产生口腔传染病的生物(优选产生龋齿微生物)的生长。具体地，其描述了由包含在任何以下F黏粒插入片段中的DNA序列编码的，具有针对产生口腔传染病的生物、优选产生龋齿微生物的抑制活性的肽：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14。
更具体地，由包含在以下F黏粒插入片段中的DNA序列编码的，具有针对产生口腔传染病的生物的抑制活性的肽：SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，其特征在于它们是细菌来源的并且具有与细菌素相似的特征。类似地，由包含在以下F黏粒插入片段中的DNA序列编码的，具有针对产生口腔传染病的生物的抑制活性的肽：SEQIDNO：1，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，特征在于它们来源于人并且具有与防卫素相似的特征。
更具体地，本发明公开了2种具体的肽：SEQIDNO：8，一种来源于人的具有与那些防卫素相似的特征的抗微生物肽；SEQIDNO：9，一种来源于细菌的具有与细菌素的那些相似特征的肽。
此外，本发明公开了固体、粉状(用于直接吸入或在溶液中)或浆状口腔卫生用组合物，如牙膏，口香糖，糖果，棒等，或液体漱口液，如漱口剂，糖浆，饮料等，或益生菌和/或益生素食品组合物，在所述组合物中包含本发明的具有针对产生口腔传染病的生物，优选产生龋齿微生物的抑制活性的菌株和/或化合物，优选肽。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的菌株和/或肽被添加到呈现针对口腔菌群的抗微生物活性并且可市售的组合物(如型的漱口剂)中，当本发明的菌株和/或肽被添加到其组合物中时，所述漱口剂显示针对产生口腔传染病的生物，优选产生龋齿微生物的提高的抑制作用。
本发明的一个优选实施方案是益生菌/益生素或功能食品，其组合物包含本发明的具有针对产生口腔传染病的生物，优选产生龋齿微生物的抑制活性的菌株和/或化合物，优选肽。益生菌或功能食品的概念包括，但不限于：乳制品，如乳酪，例如，汁、固体食物，如糖，例如，以及茶，草药医生(herbalist)产品和辅助药学(parapharmacy)产品，如维生素复合物，以及营养补剂等。
为了本发明，解释以下术语：
口腔传染病：对本发明来说，口腔传染病优选是龋齿、牙周炎、牙龈炎和口臭。
益生菌(Probiotics)：对本发明来说，术语益生菌是指使用活的微生物，所述活的微生物被添加到食品(牛奶、乳酪等)、饮食补剂(以胶囊、片剂、丸剂、粉剂等的形式)或其他中，保持活性并且对摄取含有所述益生菌的食物或类似产品的对象发挥其生理学作用。以足够量摄取，它们具有有益作用，在此情况中，对口腔健康具有有益作用。
益生素(Prebiotics)：对本发明来说，术语益生素是指使用这样的物质，所述物质被添加到食品、口香糖、饮食补剂或其他中，其对口腔微生物群的组分发挥作用，有利于建立对口腔健康有利的细菌和/或阻碍致病细菌建立。
宏基因组(Metagenome)：表示存在于样品、个体、或生态系统等中的所有细菌的基因组。
微生物群系：是与人类共存的微生物或细菌的集合。
生物活性抗微生物化合物：是化合物如生物活性肽、蛋白、抗生素、色素等，其被发现于脊椎动物或无脊椎动物中并且充当天然抗生素，是先天免疫应答的一部分。这些化合物中的一些，例如肽，由人类生产，如，例如，防卫素和cathelicidin等。它们具有针对细菌、真菌和隐匿(cloistered)病毒的活性。
细菌素：是由细菌分泌的生物活性肽，所述细菌具有针对与生产菌株密切相关的其他物种，或针对在系统发生上远离生产菌株的菌株的杀菌性质。
Phosmid：环状DNA片段，其可以容易地引入到宿主细胞，通常是细菌细胞中，并且运输细菌或人DNA片段。
功能食品：被定义为那些食品，制备所述食品不仅因其营养特性，而且还用于实现特殊功能，如改善健康或减少感染疾病的风险。为此，生物活性化合物，如矿物质、维生素、脂肪酸、具有有益作用的细菌、膳食纤维和抗氧化剂等被添加到其中。
可培养的细菌菌株：可培养的细菌菌株被认为是那些菌株，其生长在纯培养物中，并且在人工实验室培养基中在标准需氧生活或厌氧生活条件下以稳定方式保持生长。
附图描述
图1.A.培养皿的照片，其显示大肠杆菌（E.coli)克隆的初筛，所述克隆含有来自没有龋齿的个体的牙斑的DNA的F黏粒，其在变异链球菌的菌苔培养物上产生抑菌圈。B.培养皿的照片，其显示大肠杆菌克隆的确认筛选，所述克隆含有来自没有龋齿的个体的牙斑的DNA的F黏粒，其在变异链球菌的菌苔培养物上产生抑菌圈。
图2.变异链球菌生龋细菌(阳性对照，没有添加生龋抑制剂，在图中以实线表示)在BHI培养基(脑心浸液)中，和在加料有100μl(点线)、150μl(短划线)、200μl(具有短划和点的线)、300μl(长划线)或400μl(具有长划和两点的线)的浓缩上清的3-10-kD级分的BHI培养基中的生长曲线，所述浓缩上清分别由1.5-、2.25-、3.0-、4.5-和6-ml细胞培养物产生，所述细胞载有S12EF黏粒，所述F黏粒含有本发明的来源于细菌的细菌素型的抗微生物肽。每半小时(共计19小时)采集的数据显示3个实验的平均。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图3.变异链球菌生龋细菌在BHI培养基(实线，阳性对照，没有添加生龋抑制剂)中和在具有50μl(划线)和100μl(点线)的浓缩上清的0-3-kD级分的BHI培养基中的生长曲线，所述浓缩上清分别由2-和4-ml细胞培养物产生，所述细胞载有T5AF黏粒，所述F黏粒含有本发明的来源于人的防卫素型的抗微生物肽。每半小时(共计12小时)采集的数据，显示3个实验的平均。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图4.变异链球菌生龋细菌在和来源于细菌的S12E抑制剂存在下的生长曲线。在37℃在BHI培养基中采集数据达19小时，所述数据表示3个实验的平均。实线表示没有细菌的阴性对照。短划线表示阳性对照，变异链球菌在不存在和S12E抑制剂的情况下的生长。长划线表示变异链球菌在存在100μl的的情况下的生长。点线表示变异链球菌在存在100μl的S12E抑制剂的情况下的生长。具有短划和点的线表示变异链球菌在存在100μl的的S12E抑制剂的情况下的生长。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图5.变异链球菌生龋细菌在S12E抑制剂(本发明的来源于细菌的细菌素型的抗微生物肽)存在下的生长曲线，所述S12E抑制剂在实验室中化学合成并重悬在0.1％TCA中。数据显示三个独立实验的变异链球菌在30小时内在37℃的温度在100μl的BHI培养基中的生长，其以600nm处的吸光度测量30分钟。实线表示没有细菌的阴性对照。具有黑方块的线表示变异链球菌在BHI培养基中的生长。点线表示阳性对照，变异链球菌在BHI培养基中在10μl的0.1％TCA存在下的生长。具有短划和点的线表示变异链球菌在BHI培养基中在存在重悬在10μl的0.1％TCA中的0.3mg的S12E肽的情况下的生长。短划线表示变异链球菌在BHI培养基中在存在重悬在10μl的0.1％TCA中的0.03mg的S12E肽的情况下的生长。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图6.变异链球菌(A)和表兄链球菌(B)生龋细菌在存在S12E抑制剂(本发明的来源于细菌的细菌素型的抗微生物肽)的情况下的生长曲线，所述S12E抑制剂在实验室中被化学合成并重悬在超纯水中。数据显示变异链球菌在48小时内在37℃的温度在200μl的BHI培养基中的生长，其以600nm处的吸光度测量30分钟，并且是三个独立实验的平均。在图A和图B中，实线表示没有细菌的阴性对照；点线表示变异链球菌(A)或表兄链球菌(B)在BHI培养基中的生长。短划线表示阳性对照，变异链球菌(A)或表兄链球菌(B)在BHI培养基中在水存在下的生长。具有黑方块的线表示变异链球菌(A)或表兄链球菌(B)在BHI培养基中在存在重悬在超纯水中的0.23mg的本发明的S12E肽的情况下的生长。具有黑色菱形的线表示变异链球菌(A)或表兄链球菌(B)在BHI培养基中在存在重悬在超纯水中的0.047mg的本发明的S12E肽的情况下的生长。具有黑色三角的线表示变异链球菌(A)或表兄链球菌(B)在BHI培养基中在存在重悬在超纯水中的0.094mg的本发明的S12E肽的情况下的生长。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图7.变异链球菌生龋细菌在存在4μg、40μg和80μg的本发明的T5A抑制剂的情况下的生长曲线，所述T5A抑制剂在实验室中被化学合成并重悬在超纯水中。数据显示变异链球菌在44小时内，在37℃的温度在200μl的BHI培养基中的生长，其以600nm处的吸光度测量30分钟，并且是三个独立实验的平均。实线表示没有细胞的阴性对照。短划线表示变异链球菌在具有超纯水的BHI培养基中的生长(阳性对照)。具有黑方块的线表示变异链球菌在BHI培养基中在存在1μl的本发明的T5A肽(来源于人的防卫素型的抗微生物肽)的情况下的生长。具有黑色菱形的线表示变异链球菌在BHI培养基中在存在10μl的本发明的T5A肽的情况下的生长。具有黑色三角的线表示变异链球菌在BHI培养基中在存在20μl的本发明的T5A肽的情况下的生长。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图8.变异链球菌生龋细菌在液体培养基中在存在上清的情况下的生长曲线，所述上清被浓缩10倍并且作为其分子量的函数被分离，其由载有W4DF黏粒的大肠杆菌细菌细胞的培养物产生，所述W4DF黏粒包含编码本发明的来源于人的防卫素型的抗微生物肽的多核苷酸序列SEQIDNO：13。每半小时(共计24小时)采集的数据显示3个实验的平均。作为对照，该图显示变异链球菌在存在未转化的大肠杆菌epi300细菌培养物的浓缩上清的情况下的生长曲线。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图9.变异链球菌生龋细菌在液体培养基中在存在上清的情况下的生长曲线，所述上清被浓缩10倍并且作为其分子量的函数被分离，其由载有T5HF黏粒的大肠杆菌细菌细胞的培养物产生，所述T5HF黏粒包含编码本发明的来源于人的防卫素型的抗微生物肽的多核苷酸序列SEQIDNO：14。每半小时(共计24小时)采集的数据显示3个实验的平均。作为对照，该图显示变异链球菌在存在未转化的大肠杆菌epi300细菌培养物的浓缩上清的情况下的生长曲线。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图10.变异链球菌生龋细菌在液体培养基中在存在上清的情况下的生长曲线，所述上清被浓缩10倍并且作为其分子量的函数被分离，其由载有A5D11F黏粒的大肠杆菌细菌细胞的培养物产生，所述A5D11F黏粒包含编码本发明的来源于人的防卫素型的抗微生物肽的多核苷酸序列SEQIDNO：6。每半小时(共计24小时)采集的数据显示3个实验的平均。作为对照，该图显示变异链球菌在存在未转化的大肠杆菌epi300细菌培养物的浓缩上清的情况下的生长曲线。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图11.变异链球菌生龋细菌在液体培养基中在存在上清的情况下的生长曲线，所述上清被浓缩10倍并且作为其分子量的函数被分离，其由载有A4H11F黏粒的大肠杆菌细菌细胞的培养物产生，所述A4H11F黏粒包含编码本发明的来源于人的防卫素型的抗微生物肽的多核苷酸序列SEQIDNO：7。每半小时(共计24小时)采集的数据显示3个实验的平均。作为对照，该图显示变异链球菌在存在未转化的大肠杆菌epi300细菌培养物的浓缩上清的情况下的生长曲线。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图12.培养皿的照片，其显示变异链球菌的菌苔培养物的生长在存在本发明公开的CECT7746(A)、CECT7747(B)、CECT7773(C)、CECT7774(D)和CECT7775(E)菌株的分离菌的情况下被抑制。
图13.培养皿的照片，其显示表兄链球菌的菌苔培养物的生长在存在本发明公开的CECT7746(A)、CECT7747(B)和CECT7775(C)菌株的分离菌的情况下被抑制。
图14.变异链球菌生龋细菌在BHI培养基中在存在上清的情况下的生长曲线，所述上清被浓缩10倍并且作为其分子量的函数被分离，其获得自处于稳定期的菌株CECT7746(A)和CECT7747(B)的培养物。每15分钟(共计20小时)采集的数据显示4个实验的平均。标记为antb的线表示用抗菌的氯霉素处理(阳性对照)。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图15.变异链球菌生龋细菌在BHI培养基中在存在上清的情况下的生长曲线，所述上清被浓缩10倍并且作为其分子量的函数被分离，其获得自处于稳定期(est)和对数期(EXP)的菌株CECT7746的培养物。每15分钟(共计24小时)采集的数据显示4个实验的平均。标记为clorf的线表示用抗菌的氯霉素处理(阳性对照)。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图16.变异链球菌生龋细菌在BHI培养基中在存在被浓缩10倍且小于3kDa的上清的情况下的生长曲线，所述上清获得自在100℃处理10分钟的菌株CECT7746(A)和CECT7747(B)的培养物。每15分钟(共计24小时)采集的数据显示4个实验的平均。图的X轴显示以小时表示的时间，Y轴显示细菌培养物的光密度(OD)。
图17.培养皿的照片，其显示变异链球菌的菌苔培养物的生长在存在菌株CECT7746(在照片中显示为46)和CECT7747(在照片中显示为47)的培养物的上清的情况下在需氧生活和厌氧生活条件下被抑制。
图18.由来自人工牙齿模型中的人唾液培养物的生物膜(已经向其加入细菌菌株CECT7746和CECT7747或它们相应的上清)在需氧生活和厌氧生活条件下产生的以mM表示的乳酸浓度。更多的细节见实施例15。所用的阴性对照是菌株C7.1，其是属于缓症链球菌/口腔链球菌/Streptococcusinfantis组的物种的分离菌，其获得自没有龋齿的个体，但是不产生对生龋物种生长的抑制。
发明详述
本发明的一个目的是选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775。在一个优选实施方案中，本发明的细菌菌株的特征在于它们属于链球菌属，其选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。在另一个优选实施方案中，本发明公开的抗微生物的细菌菌株呈现针对产生口腔传染病的生物，优选，产生龋齿生物的生长的抑制活性。在一个优选实施方案中，本发明的菌株的特征在于，除了竞争性地生长以占据牙齿以外，它们能够产生针对生龋细菌生长的抑制物质。
本发明的另一个目的涉及选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775，或其组合，其用作药物。在一个优选实施方案中，本发明公开的抗微生物的细菌菌株的特征在于它们属于链球菌属并且选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明的另一个目的涉及选自以下任何一项的至少一种可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775或其组合在制备药物中的用途。在一个优选实施方案中，所述用途的特征在于细菌菌株属于链球菌属，其选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明的另一个目的涉及选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775，或其组合，其用作抗微生物剂，优选用作抗细菌剂。在一个优选实施方案中，抗微生物的细菌菌株的特征在于它属于链球菌属并且选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明的另一个目的涉及选自以下任何一项的至少一种可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775或其组合在制备抗微生物组合物，优选抗细菌组合物中的用途。在一个优选实施方案中，所述用途的特征在于细菌菌株属于链球菌属并且选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明的另一个目的涉及选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775，或其组合，其用于治疗口腔传染病，优选治疗龋齿。在一个优选实施方案中，本发明的细菌菌株的特征在于它属于链球菌属并且选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明的另一个目的涉及选自以下任何一项的至少一种可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775或其组合在制备用来治疗口腔传染病，优选治疗龋齿的组合物中的用途。在一个优选实施方案中，本发明的菌株的用途的特征在于可培养的细菌菌株属于链球菌属并且选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明的另一个目的涉及选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775，或其组合，其用作设计用来改善口腔健康，优选用来预防龋齿的益生菌或功能食品。在一个优选实施方案中，本发明的菌株的特征在于它们属于链球菌属，其选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明公开的另一个目的涉及选自以下任何一项的至少一种可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775或其组合在制备用来改善口腔健康(优选用来预防龋齿)的益生菌或功能食品中的用途。在一个优选实施方案中，至少一种上述细菌菌株的用途的特征在于所述菌株属于链球菌属并且选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明公开的另一个目的涉及益生菌/益生素组合物或功能食品，其包含如在本发明中所述的至少一种可培养的抗微生物菌株，以及由所述菌株分泌的抗生龋物质、化合物或分子。
本发明公开的另一个目的涉及一种医药组合物或为口腔健康设计的组合物，其包含如本发明中所述的至少一种可培养的抗微生物菌株或由所述菌株分泌的抗生龋物质、化合物或分子。
本发明公开的另一个目的涉及包含SEQIDNO：8的抗微生物化合物或由包含任何一种以下序列的DNA序列编码的抗微生物化合物：SEQIDNO：1、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14。
本发明公开的另一个目的涉及由SEQIDNO：8组成的抗微生物化合物或由任何一种以下序列组成的DNA序列编码的抗微生物化合物：SEQIDNO：1、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14。在本发明的一个优选实施方案中，上述抗微生物化合物针对产生口腔传染病的生物，优选产生龋齿生物的生长呈现抑制活性。在另一个优选实施方案中，所述抗微生物化合物是肽。
本发明的另一个目的涉及在前述各段中提及的抗微生物化合物，或其组合，其用作药物。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备药物中的用途。
本发明的另一个目的涉及上述抗微生物化合物，或其组合，其用于制备抗微生物组合物，优选抗细菌组合物。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备抗微生物组合物，优选抗细菌组合物中的用途。
本发明的另一个目的涉及上述抗微生物化合物，或其组合，其用于治疗口腔传染病，优选治疗龋齿。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备设计用于治疗口腔传染病的组合物，优选抗龋齿组合物中的用途。
本发明的另一个目的涉及本发明中以上提及的抗微生物化合物，其用作设计用来改善口腔健康，优选预防龋齿的益生素或功能食品。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备用来改善口腔健康，优选用来预防龋齿的益生素或功能食品中的用途。
本发明公开的另一个目的涉及益生菌/益生素组合物或功能食品，其包含如在本发明全文中所述的至少一种抗微生物化合物。
本发明公开的另一个目的涉及医药组合物或口腔健康用组合物，其包含如在本发明全文中所述的至少一种抗微生物化合物。
本发明公开的另一个目的涉及包含序列SEQIDNO：9的抗微生物化合物或由包含任何一种以下序列的DNA序列编码的抗微生物化合物：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5。
本发明公开的另一个目的涉及由序列SEQIDNO：9组成的抗微生物化合物或由任何一种以下序列组成的DNA序列编码的抗微生物化合物：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5。在一个优选实施方案中，所述抗微生物化合物呈现针对产生口腔传染病的生物，优选，产生龋齿生物的生长的抑制活性。在另一个优选实施方案中，上述抗微生物化合物的特征在于它们是肽。在另一个优选实施方案中，上述抗微生物化合物的特征在于它们抑制口腔中酸，优选是乳酸的产生。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的抗微生物化合物，或其组合，其用作药物。
本发明的另一个目的涉及如在本发明中所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备药物中的用途。
本发明的另一个目的涉及如上所提及的抗微生物化合物，或其组合，其用于制备抗微生物组合物，优选抗细菌组合物。
本发明的另一个目的涉及如上所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备抗微生物组合物，优选抗细菌组合物中的用途。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的抗微生物化合物，或其组合，其用于治疗口腔传染病，优选治疗龋齿。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备设计用于治疗口腔传染病的组合物，优选抗龋齿组合物中的用途。
本发明的另一个目的涉及如上所述的抗微生物化合物，或其组合，其用作设计用于改善口腔健康，优选用来预防龋齿的益生素或功能食品。
本发明公开的另一个目的涉及如上所述的至少一种抗微生物化合物或其组合在制备设计用于改善口腔健康，优选用来预防龋齿的益生素或功能食品中的用途。
本发明公开的另一个目的涉及益生菌/益生素组合物或功能食品，其包含如在本发明中所述的至少一种抗微生物化合物。
本发明公开的另一个目的涉及医药组合物或口腔健康用组合物，其包含如在本发明中所述的至少一种抗微生物化合物。
本发明公开的另一个目的涉及用于分离可培养的抗微生物的细菌菌株的方法，所述菌株优选具有针对产生口腔传染病的生物并且，更优选，产生龋齿生物的生长的抑制活性，其特征在于所述方法包括：
a)由从未经历龋齿的个体的龈上牙斑获得样品，
b)在适当的培养基中在适当的条件下接种样品从而仅培养和分离在从未经历龋齿的个体中最常见的那些细菌，通过宏基因组的焦磷酸测序来对后者进行估计，
c)在用于生龋细菌的生长培养基中培养分离的菌株并且，在适当的培养时间后，选择针对所述生长呈现抑菌圈的那些菌株。
在一个优选实施方案中，上述方法的特征在于，在步骤b)中，通过对宏基因组进行焦磷酸测序(该技术使得有可能估计每种细菌物种的比例)来估计在从未经历龋齿的个体中最常见的细菌。在另一个优选实施方案中，上述方法的特征在于，在步骤c)中，优选选择属于以下属的细菌：链球菌、罗氏菌属、奈瑟氏球菌属、格鲁比卡氏菌属、约翰森氏菌属、嗜血菌属、金氏菌属、心杆菌属、Mannheimia、Phocoenobacter和Aggregatibacter。具体地，选择以下菌株：CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775。更具体地，选择属于链球菌属的细菌，优选属于以下物种的那些：血链球菌(S.sanguis)、口腔链球菌、缓症链球菌、S.infantis或尚未被描述但是属于包括这四个物种的链球菌子群的新物种。更具体地，至少一种抗微生物的细菌菌株选自：CECT7746、CECT7747、CECT7773或CECT7775。
本发明公开的另一个目的涉及用于预防和/或治疗传染病，优选口腔传染病并且，更优选，龋齿的方法，所述方法包括施用可以有效抑制日常地存在于所述口腔中的致病微生物，优选生龋微生物生长的量的本发明中所述的至少一种可培养的抗微生物菌株；或包含所述菌株的本发明所述的益生菌/益生素组合物或功能食品；或包含所述菌株的本发明所述的医药组合物或口腔健康用组合物。
本发明的另一个目的涉及用于获得抗微生物化合物的方法，所述化合物优选具有针对产生口腔传染病的生物并且，更优选，产生龋齿生物的生长的抑制活性，其特征在于它包括：
a)由从未经历龋齿的个体的龈上牙斑获得样品，
b)裂解所述样品并从其中提取完整的基因组DNA，
c)由保留的提取的DNA，制备能够被插入并且在宿主细胞中表达它们携带的提取的DNA的载体(优选质粒或F黏粒)的宏基因组文库，
d)将载体插入到宿主细胞中，
e)将含有所述载体的宿主细胞的克隆接种到具有产生龋齿微生物的培养物中，并且在适当的培养时间后选择呈现生长抑菌圈的那些克隆，
f)测序显示抑制活性的克隆的载体的DNA，合成和/或纯化由所述DNA编码的化合物。
在一个优选实施方案中，上述方法的特征在于提取的DNA的浓度至少为300μg/ml。在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于，在DNA提取过程后，构建包含具有范围优选35至45kb的尺寸范围的DNA的F黏粒。在另一个优选实施方案中，所述F黏粒包含尺寸小于1kb的DNA。在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于其中插入F黏粒的宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于所述微生物的培养物(其上接种有具有包含在F黏粒中的DNA插入片段的克隆)是生龋细菌，优选变异链球菌或表兄链球菌的培养物。在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于F黏粒的DNA序列选自包括以下的序列：SEQIDNO：1，SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：13，SEQIDNO：14，或其组合。在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于F黏粒的DNA序列选自由以下组成的序列：SEQIDNO：1，SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：13，SEQIDNO：14，或其组合。
在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于获得包含选自SEQIDNO：8或SEQIDNO：9的序列的至少一种抗微生物肽，或由包含任何一项以下的DNA序列编码的抗微生物化合物：SEQIDNO：1，SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：13，SEQIDNO：14。在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于获得由选自SEQIDNO：8或SEQIDNO：9的序列组成的至少一种抗微生物肽，或由任何一项以下组成的DNA序列编码的抗微生物化合物：SEQIDNO：1，SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：13，SEQIDNO：14。
在另一个优选实施方案中，F黏粒的DNA序列SEQIDNO：1，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，以及具有SEQIDNO：9的抗微生物肽来源于细菌，优选细菌素。在另一个优选实施方案中，F黏粒的DNA序列SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4和SEQIDNO：5来源于人，优选防卫素/cathelicidin。
本发明公开的另一个目的涉及用于预防和/或治疗传染病，优选口腔传染病并且，更优选，龋齿的方法，所述方法包括施用可以有效抑制日常地存在于所述口腔中的致病微生物生长的量的如在本发明全文中所述的至少一种抗微生物化合物；或包含本发明中所述的至少一种抗微生物化合物的益生菌/益生素组合物或功能食品，或包含本发明中所述的至少一种抗微生物化合物的医药组合物或口腔健康用组合物。
根据布达佩斯条约的微生物的保藏
本发明中使用的微生物保藏在西班牙典型培养物中心(SpanishTypeCultureCollection)(CECT)(位于ResearchBuildingofUniversityofValencia，CampusBurjassot，Burjassot46100(Valencia，Spain))，具有以下保藏号：
·CECT7746：链球菌属的细菌菌株，保藏于2010年6月7日。
·CECT7747：链球菌属的细菌菌株，保藏于2010年6月7日。
·CECT7773：链球菌属的细菌菌株，保藏于2010年7月22日。
·CECT7774：罗氏菌属的细菌菌株，保藏于2010年7月22日。
·CECT7775：链球菌属的细菌菌株，保藏于2010年7月22日。
下列实施例的目的是说明本发明而不是限制其范围。
实施例1.获得龈上牙斑的宏基因组
首先，在签署知情同意书后，由从未经历龋齿的志愿者采集龈上牙斑样品，并且，出于比较目的，从之前经历龋齿的志愿者和经历龋齿并且此外在所述龋齿中呈现病变的志愿者采集类似样品。采样过程由ClinicalResearchEthicsCommitteeofGeneralDirectorateofPublicHealthofValencianRegionalGovernment(巴伦西亚地区政府公共健康总董事会临床研究伦理委员会)(GSP-CSISP)批准。由牙科医生遵照WorldHealthOrganisation(WHO)(世界卫生组织)的StudiesinBuccalHealth(口腔健康研究)的建议和术语评估每个志愿者的口腔健康状况，并且使用无菌探针采集样品。要求志愿者在样品采集前24小时内不要刷牙。
为了研究牙斑中的微生物多样性并获得其宏基因组，将从每个个体的所有牙齿的表面的牙斑收集的材料混合以便之后将其裂解并获得每个牙斑的总DNA。提取DNA：使用MasterPureTMCompleteDNAandRNAPurificationKit(完整DNA和RNA纯化试剂盒)(EpicentreBiotechnologies)，遵照制造商的指导，并在裂解步骤过程中增加使用溶菌酶的处理(1mg/ml，37℃，30分钟)。利用NanoDrop(ThermoScientific)测量DNA浓度，并且选择的样品必须优选具有大于300μg/ml的DNA浓度和至少5μg的总量(由于焦磷酸测序中涉及的仪器和方法的灵敏性阈值所致)。此外，将DNA样品跑琼脂糖凝胶以便验证从志愿者的牙斑提取的基因组DNA的完整性。随后，通过GSFLX-Titanium化学测序仪(Roche)对所提取的DNA进行焦磷酸测序。焦磷酸测序由以下组成：通过氮在压力下将DNA破碎为约500-800个核苷酸的片段，在末端添加接头(adapter)，这使得有可能将DNA锚定到直径小于一微米的球体。将所述球体引入到充当微型反应器的特殊油中，以便进行乳液PCR(emPCR)，其中扩增结合到每个球体中的DNA。
在富集了已经扩增DNA的球体后，将溶液置于GSFLX测序仪(Roche)中的钛板上，其中发生焦磷酸测序反应。该反应包括在将核苷酸加入光束中后，通过一组酶如荧光素酶转化每个由聚合酶释放的焦磷酸分子。该光束与添加的核苷酸的数量成比例并且，以此方式，高灵敏度室将光脉冲转化为相应的DNA序列(19)。所述DNA的平均长度为425pb。通过″454ReplicarFilter″将通过454-焦磷酸测序技术人为复制的、系统地出现的那些序列从最终数据的组中排除(20)，以使给定序列的读数(reads)的数目仅与其在样品中的频率相关。
在来自龈上牙斑的样品中，宏基因组中人DNA的量的范围为0.5％-40％(表1)，并且通过Megablast(21)使用人基因组数据库进行鉴定，并且从最终数据的组中排除。
表1.进行焦磷酸测序的口腔样品及其宏基因组的特征。
1“P”指示龈上牙斑样品。带有编号的样品指示来自龋齿口腔的样品取自哪个牙齿。
2龋齿(C)、不存在(absent)(A)和堵塞(obstructed)(O)的牙齿(dentalpiece)的数目。括号中的数目指示患者的暴露的龋齿的数目。
3在宏基因组中检测的并通过RDP分类器(classifier)分配的16SrRNA的序列的数目。
4Simpson、Shannon和Chao1多样性指数，在属的水平进行。
随后，425pbs的平均值允许在宏基因组的大部分中进行功能分配(表2)。此外，所述读数的拼接(assembly)产生1103个大于5kpb的重叠群(assembly)[“叠连群(contig)”]和354个大于10kpb的重叠群。对于6个口腔样品中的每一个，我们获得了平均为129.5Mpb的高质量筛选的序列(大于100pb，并且其中超过90％的核苷酸具有99.99％的准确度：通过焦磷酸测序仪的核苷酸读数正确的概率；即，99.99％的准确度意味着仅有0.01％的核苷酸是不正确的(测序误差))。在具有龋齿病变的两个样品中，约70％的序列属于人DNA，并且在此情况中，获得平均32.5Mpb的高质量筛选的读数。
表2.基于不同的分类系统对存在于口腔宏基因组中的样品进行功能分配
1h：没有龋齿的健康个体；c：过去具有龋齿的个体；ac：目前具有龋齿的个体；cav：龋齿病变的样品。
(n)：绝对计数。
(％)：分配功能的样品中的读数的总百分比。
acdd：向在NCBIConservedDomainsdatabase(NCBI保守结构域数据库)中分析的保守结构域分配。
bcog：向直向同源群的组分配。
cTfam：向TigrFams分配。
dseed：向Seed/MG-RAST子系统分配。
实施例2.构建龈上牙斑的F黏粒宏基因组文库
使用提取自入选研究的健康志愿者的龈上牙斑的、未用于焦磷酸测序过程的完整DNA样品，执行所述志愿者的牙斑的F黏粒(具有优选35-45kb的长度的插入片段)的宏基因组文库，为此使用EpiFOSTMFosmidLibraryProductionKit(F黏粒文库制备试剂盒)(EpicentreBiotechnologies)，遵照制造商的指示进行。简言之，在用于构建本发明的宏基因组文库的方法的优选的备选方案中，F黏粒被插入到宿主，优选大肠杆菌(Escherichiacoli)中。如上所述地制备该文库，使用EpiFOSTMFosmidLibraryProductionKit(F黏粒文库制备试剂盒)(Epicentre)，遵照制造商的指示，并进行一些修改，如增加连接时间(12小时，在20℃水浴中)，使用总DNA用于插入，而不是提取自脉冲场凝胶的DNA，稍微修改DNA提取方法以使之后的间断尽可能少(使用切过的移液管头，避免涡旋振荡，使用Centricom膜(Millipore)来浓缩DNA)。
通过将F黏粒封装到λ噬菌体颗粒中并且随后使它们在大肠杆菌Epi300T1R菌株感染，进行DNA到大肠杆菌宿主中的插入。在封装过程中，将连接产物置于与病毒在30℃在1ml噬菌体缓冲液中接触3小时。通过使病毒颗粒与大肠杆菌菌株接触，在37℃进行感染达30分钟。之前，通过在含有氯霉素的LB-琼脂培养基中培养混合物的不同稀释液，进行滴定以选择菌落在板中的最佳浓度(足够远以便能够在无菌棒的帮助下接种单个克隆)。
随后，将每个菌落接种到96孔Elisa板中的含有氯霉素的液体LB培养基中，其中在贮藏前它们将被允许再次生长。将克隆贮藏在96孔Elisa型板(Nunc)中，在-80℃的温度，在19％甘油中，以便防止形成冰晶并保持细胞的完整性。F黏粒在不诱导产生多拷贝的情况下被冷冻以防止它们之间的重组过程。
然后将具有不同F黏粒插入片段的不同大肠杆菌克隆接种到生龋细菌，如变异链球菌或表兄链球菌的培养物中。在所述培养物中选择那些克隆，所述克隆在接种点附近呈现抑菌圈(图1)。通过包含在每个F黏粒中的DNA的序列同源性，基于不同的可用的公共序列数据库，鉴定获得的克隆。为了获得每个F黏粒的DNA序列，提取其总DNA(通过使用来自QIAGEN的midiprep试剂盒将它与载体DNA分离)，并且对其进行直接焦磷酸测序。相应的ORF以及，随后，由其编码的肽，就是这样获得的。
实施例3.分析人口腔宏基因组的多样性
在遵照本发明所述的方法获得来自具有龋齿的个体和来自健康个体的龈上牙斑的宏基因组后，使用三种不同技术分析所述口腔宏基因组的多样性：
通过分析16SrRNA的分类学分配：通过利用BLASTN(26)对RDP数据库(RibosomalDatabaseProject(核糖体数据库项目))进行相似性搜索，从获得自每个宏基因组的读数提取16SrRNA序列。排除尺寸小于200pb的序列。使用RDP分类器(27)进行序列的系统发生分配，其中置信阈值为80％。
基因分类学分配：基于最近公共祖先(lowestcommonancestor)(LCA)算法，通过在MEGAN软件(28)中描述的特征，进行所有ORF的分类学分配。为了获得每个序列的LCA，使用BLASTx数据库对包括来自非冗余NCBI数据库(NR)的非真核序列的另一个专用数据库进行同源性搜索。对于每个序列读数，在获得LCA方面仅考虑显示至少90％的重合(coincidence)的那些结果。
读数的分类学分配(PhyMM)：使用PhymmBL(29)进行所述分类学分配，PhymmBL通过核苷酸的同源性和组成联合序列的分配；为此，使用隐性马可夫(Markov)模型。从包含细菌和古菌的所有基因组的人口腔微生物群系数据库(HOMD)(30)，以及NCBI数据库(RefSeq)(2010年3月)获得所有可用的完整基因组，并通过PhymmBL将其用于构建用于进行分类学结构模型和同源性搜索的本地数据库。在该分析中，我们仅使用大于200pb的序列以预测分类学鉴定。使用所述读数长度，估计使用PhymmBL的搜索的类别水平的准确度大于75％。在MySQL数据库中分析所有分类学和功能结果以用于其之后的分析。
使用这三种方法获得的结果显示直接测序的宏基因组中的少量16S基因足以描述存在于口腔宏基因组中的主要分类学组，而不存在与克隆或PCR技术相关的偏差。
从检测的样品，可以在健康和生病的个体之间观察到有趣的差异。通过三种方法显示的趋势是芽孢杆菌(Bacilli)和γ变形菌(Gamma-proteobacteria)分类学组在健康个体中最常见，而典型的厌氧分类单元，如梭菌(Clostridials)和拟杆菌(Bacteroidets)在来自生病对象的样品中最常见。分配给β变形菌(主要是奈瑟氏球菌)和TM7门(目前还没有确定的名称，并且还没有任何成员已经被培养)的读数以极低的比例存在于来自生病个体的样品中并且，因此，可能与健康状况相关。
基于16SrRNA读数的分类学分配的宏基因组之间的一致性分析显示，来自口腔健康不良的个体的样品倾向于集中成组(grouptogether)，而在健康个体中可以发现不同的细菌群组(consortia)。通过提供宏基因组研究，本发明证明链球菌属和罗氏菌属，更优选，链球菌属，是没有龋齿的受试者中的优势属。为此，当我们由从未经历龋齿的个体的龈上牙斑样品选择可能具有抗生龋活性的那些样品时，选择的目标在于搜索(培养基、培养参数、细菌的显微镜形态学、菌落的形态学等)属于所述链球菌属和罗氏菌属，更优选，链球菌属的物种。
LCA和PhymmBL方法的一个有力应用是大多数具有明显重合的读数可以分配到分类学起源并且，此外，分配到可能的功能。通过与分类学和功能相关联，有可能预测每个细菌组可能的生态学或代谢作用。使用COG(直向同源组簇(ClusterofOrthologousGroups))功能分类系统，可以观察到类别不是均匀分布的，并且特定细菌组尤其适于执行特定功能。例如，大比例的参与防御机制的基因(例如限制性内切酶和药物排出泵)由芽孢杆菌编码，这与链球菌更多地一起存在于没有龋齿的人中，允许我们预测那些细菌可能是用于治疗口腔传染病的可能的替代治疗策略中人病原体的天然抑制剂的潜在生产者。
实施例4.分析在人口腔宏基因组中呈现的微生物丰富性(richness)和丰度(abundance)
基于常规培养技术的初始研究和包括扩增和克隆16SrRNA基因在内的开拓性的分子工作，预测多样性为在口腔中有约500个不同的物种(6)。使用最新一代技术(新一代测序，NGS)给出的估计为4000至19000个运算分类学单位(OTU)。OTU是基于DNA序列的对物种数目的估计值，其考虑了以下事实：具有低于给定阈值的相似性的16SrRNA基因的序列属于不同的物种。所用阈值是16SrRNA基因的标准，97％序列同一性；因此，如果相似性大于97％，则认为是相同的物种，而如果其小于97％，则它可能是不同的物种。三个健康受试者中较长的焦磷酸测序读数(250pbs)估计约600OTUs/人，并且一项最近的计划尝试使用Sanger型测序对含有几乎全长的16SrRNA扩增子的11447个扩增子进行测序(22)，将10个个体中的估值降低至低于300OTUs。
虽然我们对微生物多样性的估值更接近使用Sanger测序的读数获得的那些(6，22)，但是从我们的宏基因组数据提取的16SrRNA读数鉴定了186个之前未通过PCR扩增检测到的新的OTU。基于4254rRNA读数，稀疏曲线(rarefactioncurve)(当采样压力增加时的物种数目的饱和度)和如在表1中所述的不同的多样性指数(具体地，Shannon、Simpson和Chao1指数)，指示牙斑样品的估计值为73-120个属(表1和2)。虽然在具有不同健康状况的志愿者的样品之间没有观察到关于多样性的显著差异，但是具有龋齿病变的两个样品倾向于呈现更低的多样性。
一种量化宏基因组中所选物种的存在的有效工具是序列募集(recruitment)。那些具有针对参比细菌基因组的大于特定同一性阈值的重合的个体宏基因组读数被“募集”以绘图，取决于样品中生物的丰度，所述图的多样性不同。如果显示的平均核苷酸同一性大于94％，则很可能针对来自相同物种的读数进行募集(23)。
在将我们的宏基因组与目前可获得的1117个基因组比较后，使用Nucmer和Promerv3.06算法，我们能够估计这些物种在我们的样品中的丰度。令人惊奇地，在没有龋齿的人中与Aggregatibacter和血链球菌相关的细菌是最丰富的，这与这些物种在健康个体的口腔中更高的PCR扩增频率一致。奈瑟氏球菌属在来自健康个体的样品中也是常见的。此外，募集图指示在每个宏基因组中一些分类单元通常是占优势的，这表明，虽然口腔中存在高的细菌多样性，但是一些分类单元包括大部分的细菌细胞。
实施例5.口腔生态系统中的功能多样性
为了分析作为本发明中分析的个体的口腔生态系统的一部分的生物的功能多样性，将获得的所有宏基因组序列读数与不同的数据库比较：保守结构域数据库(CDD)(24)，基于子系统的注释系统(SEED)和TigrFams特征(profile)(25)。
基于读数的功能分配的样品的一致性分析(CoA)提供三个功能分类系统(CDD、SEED和TigrFams)的相似的分组模式。来自生病受试者(具有龋齿)的样品倾向于集中成组，指示相似的功能组在其宏基因组中被编码，并且来自从未经历龋齿的个体的样品，与呈现低的龋齿数目的个体中的一个被一起分开分组。当将口腔宏基因组的功能分配与成年人肠内微生物群系(8)相比时，口腔样品集中成组，指示在编码的功能的相对频率方面，肠和口腔是两个不同的生态系统。本发明证明存在在肠微生物群系中过度表现的(over-represented)功能组，而其他在口腔样品中过度表现。
在口腔样品中，基于其健康状况给个体分组。从应用的角度，有趣的是注意到许多功能分类在来自没有龋齿的个体的样品中过度表现。这些包括参与革兰氏阳性细菌中的竞争的DNA捕获基因，参与磷脂代谢的其他基因，果糖和甘露糖诱导的磷酸转移酶系统，链球菌mga调节子，参与混合酸性发酵的蛋白，群体感应基因和细菌素型的抗细菌肽。所述生物活性化合物，细菌素，是潜在的抗龋剂并且，因此，本发明证明从未经历龋齿的个体的牙斑是新的抗细菌和潜在的抗生龋物质的遗传库。
实施例6.在本发明的F黏粒文库中获得的克隆在生龋链球菌培养物上的的抑制测定
在获得来自从未经历龋齿的个体的龈上牙斑的F黏粒文库后，将具有不同的F黏粒插入片段的大肠杆菌的不同的克隆接种到生龋细菌，如变异链球菌或表兄链球菌的培养物中。通过Nunc96针复制器(96-pinreplicator)将那些从未经历龋齿的志愿者的F黏粒宏基因组文库的拷贝固定在所述平板上，以使每个培养皿可以接受之前通过诱导物(EpicentreTechnologies)诱导为多拷贝的文库中的每个板的96个克隆的生长。使用该简单的筛选，可以在有限的时间内对数千个克隆进行高产率活性测定，从而选择在生龋细菌上产生抑菌圈的那些克隆(图1)。
如在本发明的实施例2中所说明的，这些F黏粒的DNA序列或插入片段，是潜在地生产在琼脂中散布并且防止导致龋齿的那些细菌生长的分泌物质的那些。随后，使用阳性克隆进行第二活性筛选以排除假阳性(图1B)。通过包含在每个F黏粒中的DNA的序列同源性，针对可用序列的不同的公共数据库，鉴别获得的克隆。
为了获得每个F黏粒的DNA序列，提取其总DNA(通过使用来自QIAGEN的midiprep试剂盒将它与载体DNA分离)，并且进行直接测序。使用经典Sanger技术通过市售PCClFos载体的反向(SEQIDNO：10和SEQIDNO：11)和T7(SEQIDNO：12)引物对二十个F黏粒的末端进行测序。在被测序的二十个F黏粒中，四个序列显示与细菌DNA的同源性(30％-98％)，另外五个序列显示与人DNA的99％-100％的同源性。因此，在呈现抑制能力的F黏粒末端的序列中，四个来源于细菌，五个来源于人。在两种情况(一个是细菌一个是人)中，插入片段显示为具有非常短的长度；为此，两个末端的序列重叠，因此获得全长的插入片段。使用该方法完整测序的来源于人的插入片段具有244个核苷酸(SEQIDNO：1)，而细菌插入片段具有666个核苷酸(SEQIDNO：2)。
通过焦磷酸测序获得其他七个插入片段的序列，使用2-5个F黏粒的组，并且将其DNA结合在基因组测序仪FLX焦磷酸测序仪(Roche)的1/16或1/8个平板中。通过Newbler程序(Roche)使用标准参数拼接获得的序列，并且基于之前获得的插入片段末端序列使获得的组合件与相应的F黏粒相关。九个插入片段的特征显示在表3中。
表3.具有针对生龋细菌的抑制能力的F黏粒的DNA插入片段的特征
名称 来源 插入片段长度(pb) 序列编号
T5A 人 244 SEQ ID NO：1
S12E 细菌 666 SEQ ID NO：2
T1F 细菌 42797 SEQ ID NO：3
T4H 细菌 28023 SEQ ID NO：4
T9B 细菌 33804 SEQ ID NO：5
A5D11 人 45166 SEQ ID NO：6
A4H11 人 32692 SEQ ID NO：7
W4D 人 34079 SEQ ID NO：13
T5H 人 27661 SEQ ID NO：14
实施例7.鉴定短S12E和T5AF黏粒中的抗微生物肽。
在如在实施例6中所述地获得七个F黏粒的序列后，分析两个长度短的DNA插入片段的DNA序列，以获得在3’-5’和5’-3’方向上编码的所有ORF。在这些ORF中，我们选择包含核糖体结合序列(具有来自大肠杆菌的16S的3’-端互补序列)并且因此可以被有效翻译的那些，以及可以通过信号肽的存在(使用SIGNAL-IP软件鉴定)或通过非经典分泌通路(使用SECRETOME-P软件鉴定)分泌的那些。使用所述方法，在来源于人的F黏粒中获得一个候选ORF(T5A)，其长度仅为26个氨基酸(SEQIDNO：8)，并且在来源于细菌的F黏粒中获得另一个候选ORF(S12E)，其长度为39个氨基酸(SEQIDNO：9)。此外，这些基因显示抗微生物肽的氨基酸组合物特征，并且，此外，在来源于人的T5A的情况中，观察到可以形成二硫键的两个半胱氨酸的存在。这，与其短的长度和其正的净电荷一起，表明它们是生物活性抗微生物肽。
随后，纯化所述肽。为此，基于其分子量将它们与剩余的分泌产物分离。因此，将诱导为多拷贝的15ml的每个克隆在脑心浸液(BHI)培养基中培养，将细胞离心并收集上清，将所述上清通过孔隙大小为0.2微米的Millipore滤膜过滤以除去任何细菌残渣。将含有分泌产物的该上清再次通过Amicon10-kDMillipore滤膜过滤，并使滤液再一次通过Amicon3-kDMillipore滤膜，由此获得1ml体积的3至10kD的级分。在低温条件下在speed-vac中将大小小于3kD的级分(0-3kD级分)浓缩至1ml体积。
随后，将50-、100-和150-μl体积的这两个级分(3-10kD和0-3kD)分别添加到变异链球菌的液体培养物和表兄链球菌的液体培养物中，并且在48孔Fluostar照度计中每隔半小时(总计12-19小时)测量光多样性，每种处理进行三次。如可以在图2和3中观察到的，生龋细菌的生长曲线显示，在来源于人的防卫素型的抗微生物肽的情况中(图3)，小于3kD的级分对生龋细菌具有依赖剂量的抑制作用，而在来源于细菌的细菌素型的抗微生物肽的情况中，3-10kD级分对所述生龋细菌具有依赖剂量的抑制作用(图2)，这与基于每种F黏粒的氨基酸序列估计的分子量一致。
实施例8.比较测定本发明的生物活性肽针对生龋细菌的抑制活性。
为了比较细菌素的抑制作用与市场上可获得的其他竞争性产品的抑制作用，在液体BHI培养基中进行与在前述实施例中所述的那些相同的变异链球菌的生长实验，但是现在增加：a)100μl的市场上主要的漱口水中的一种(其实抗牙斑剂和口腔杀菌剂)，b)含有细菌素的S12E克隆的100μl的浓缩上清(如在前述实施例中所述的)(3-10-kDa级分)，以及c)100μl的的含有细菌素的S12E克隆的上清。在此浓度(100μl)，细菌素对变异链球菌生长的抑制作用，大于针对该细菌物种的商业化产品的抑制作用(图4)并且，此外，在图4中可以观察到，向商业化产品中添加细菌素显著提高所述产品针对变异链球菌的抑制活性。
实施例9.分析化学合成的S12E和T5A肽的生龋活性。
分离的2种抑制肽(SEQIDNO：8和9)的化学合成根据固相合成方法(32和33)进行。通过SPPS(固相肽合成(Solid-PhasePeptideSynthesis))的肽合成是实验室中用于合成制备肽和蛋白的最常见的方法，并且允许合成难以在细菌中表达的天然肽，非天然氨基酸的结合或肽修饰(例如，形成二硫键)。
在来源于人的肽的情况中，将保护基，Fmoc-Cys(trt)-OH，用于保护相当具有反应性并且在该肽中频繁出现的-SH集团。与球体共价结合的肽，其N端氨基基团是游离的，以使它可以结合单个的N保护的氨基酸。在结合后，后者被去保护并被洗去。在结合、洗涤、去保护和洗涤的重复循环后，肽链得以构建。当肽完整时，通过加入试剂(在此情况中，无水氟化氢)使其释放。通过质谱和HPLC进行用来验证合成的肽是正确的肽并且不含有杂质的质量控制。
为了确认鉴别的肽是具有针对生龋细菌的抑制活性的那些，化学合成S12E(来源于细菌的细菌素)和T5A(来源于人的具有与防卫素相似的结构的肽)肽，获得约4mg的各种所述肽，纯度大于80％。将它们完全重悬在0.1％三氯乙酸(TCA)中，并且进行用来测试所述化学合成的化合物对变异链球菌的液体培养物的抑制的实验。
在来源于细菌的细菌素型的S12E肽的情况中，针对变异链球菌的培养物的抑制活性被确认，尤其在高的浓度(图5)。随后，化学合成更多的S12E肽，现在具有大于95％的纯度，并且将所述肽重悬在超纯水中，以便证明之前获得的抑制作用不是由于TCA，而是由于化学合成的S12E肽自身。再一次，观察到用高纯度的化学合成的S12E肽处理变异链球菌和表兄链球菌的培养物对两种生龋细菌，变异链球菌(图6A)和表兄链球菌(图6B)，都产生依赖剂量的抑制作用。
在T5A肽(来源于人的，防卫素型的)的情况中，起先没有发现抑制作用。出现的是，该肽具有若干反应性的氨基酸，包括两个半胱氨酸，其存在在人抗微生物肽中是典型的，并且通常这两个半胱氨酸之间的二硫键对于肽具有活性是必须的。为此，再次合成所述肽，在半胱氨酸3和12之间加入二硫键，并且在合成期间保护反应性的氨基酸。在这些修饰后，确认该肽能够在不同浓度抑制生龋细菌变异链球菌的生长，其中当加入最大肽浓度(80μg)时，生长被完全抑制(图7)。
实施例10.鉴定长F黏粒中的抑制基因。
关于剩下的潜在的抗微生物化合物，从所有产生抑菌圈的F黏粒分离DNA，并对其末端和完整的插入片段测序(表3)。这使得有可能获得产生抗微生物物质(不仅是抗细菌肽)的细菌的目录，以及人基因组中编码它们的区域。在变异链球菌的液体培养物上，通过添加由相应的克隆产生的在0-3kDa、3-10kDa、10-100kDa和＞100kDa的级分中的浓缩上清(如在前述实施例中所述的)进行抑制实验。这些实验揭示导致抑制的尺寸级分在T9B和T4H细菌F黏粒和在W4D(图8)、T5H(图9)、A5D11(图10)和A4H11(图11)人F黏粒中是0-3kDa级分，而在T1F细菌F黏粒中是3-10kDa级分。因此，这些结果再一次显示抑制由小尺寸的肽，即0-3kDa或3-10kDa的肽产生，这与它们是细菌素型或人防卫素/cathelicidin的抗细菌肽的事实一致。
类似地，在所述F黏粒的序列上进行对编码具有这些大小(即，0-3kDa或3-10kDa，如可能的情况)的ORF的搜索，并且之后选择作为抑制剂编码基因的可能的候选的基因：具有核糖体结合序列的那些基因，存在信号肽并且氨基酸的用途与抗细菌肽类似和/或具有与其他已知抗细菌肽的序列类似的序列，和/或具有疏水性和/或正的净电荷。
实施例11.鉴定抗龋细菌。
小比例的从未经历龋齿的成人群体的存在提示存在具有针对生龋细菌的潜在对抗效应的细菌物种(23)。已经证明通过获得自健康个体的无害分离菌对致病菌株进行细菌替换令人满意地防止咽部感染，并且是用来防止肠和其他人生态系统中的传染病的益生菌的基础(31)。生龋细菌针对健康受试者的口腔微生物群系的宏基因组募集显示完全没有变异链球菌和表兄链球菌。令人惊奇地，与没有检测到生龋细菌相伴随的是其他物种的链球菌(主要是那些与血链球菌类似的)、Aggregatibacter和奈瑟氏球菌属(其在这些个体中是最丰富的属)的大量募集。
已知这些优势属的分离菌可以参与与生龋细菌的对抗性相互作用的可能性，从10个健康个体(包括从其获得宏基因组序列的2个健康个体)采集新鲜的牙斑样品并用于在最佳生长条件下培养奈瑟氏球菌、罗氏菌和链球菌的物种(具体地，在血琼脂、巧克力琼脂、布鲁氏菌(brucella)琼脂和TSA培养基中，在需氧生活下并且在无氧瓶中)。在显微镜检查后，选择双球菌(diplococci)和链球菌(streptococci)(以便使找到链球菌、罗氏菌和奈瑟氏球菌的物种的可能性最大)，并获得一组249个分离菌。
将能够在与变异链球菌和表兄链球菌相同的培养基中生长的那些转移到存在所述生龋细菌的菌苔培养物。该样品筛选鉴定了具有抑菌圈的16个菌株(图12和13)。使用PCR技术并且测序16SrRNA，大多数所述菌株被鉴定为属于链球菌的物种，在16S基因中显示与口腔链球菌、缓症链球菌和血链球菌物种或其他相关物种以及罗氏菌物种的96％-99％的序列同一性，与黏滑罗氏菌(R.mucilaginosa)物种的100％的序列同一性。将显示针对变异链球菌和/或表兄链球菌的抑菌圈的菌株保藏在CECT，被指定编号CECT7746，CECT7747，CECT7773，CECT7774和CECT7775。如之前所述，菌株CECT7746、CECT7747、CECT7773和CECT7775属于相同的菌属链球菌属并且，因此，除了获得它们的方法以外，享有结构和分类学相似性，因为它们属于相同的细菌属。
具体地，基于16S核糖体基因序列，属于细菌链球菌属的所述菌株相似于缓症链球菌(CECT7746和CECT7775)和口腔链球菌(CECT7747和CECT7773)物种。菌株CECT7746和7747的完整基因组的测序揭示它们是链球菌属的新物种(见实施例12)，它们是姐妹菌株(虽然来自不同个体)并且，此外，属于缓症链球菌/口腔链球菌/S.infantis物种簇。保藏在CECT具有编号CECT7774的另一个细菌菌株属于罗氏菌属并且，更具体地，属于黏滑罗氏菌(R.mucilaginosa)物种。所述保藏在CECT的菌株针对生龋物种(变异链球菌或表兄链球菌)的培养物的抑菌圈可以分别在图12和13中观察到。
实施例12.表征细菌菌株CECT7746和CECT7747。
通过不同的技术对细菌菌株CECT7746和CECT7747进行表征。首先，通过鸟枪(7，8)和双端(pair-ends)焦磷酸测序获得这两个菌株的完整基因组；后者包括将DNA破碎成约3000个核苷酸的片段并且测序从每个末端起的约200个核苷酸，以致这两个末端之间的已知距离有助于序列的拼接。
为了获得菌株CECT7746和CECT7747中每个的完整基因组，我们从收集自每个所述菌株的培养物的样品开始；具体地，将四分之一个培养板用于通过鸟枪系统(7，8)使用来自Roche的GS-FLX焦磷酸测序仪(TitaniumChemistry)的焦磷酸测序实验，将另外四分之一个培养板用于使用双端系统的焦磷酸测序实验。使用两种系统获得的每种菌株的序列量为：
菌株7746
鸟枪型：441.549个读数，总共165,105,921个核苷酸
双端型：187.530个读数，总共32,721,622个核苷酸
菌株7747
鸟枪型：28.021个读数，总共5,711,998个核苷酸
双端型：305.826个读数，总共51,501,510个核苷酸
每种菌株的预期的基因组尺寸为约2.1Mb。对于菌株CECT7746，大于500pb的重叠群的大小是2,122,087pb。在菌株CECT7747的情况中，大于500pb的叠连群(contig)的大小是1,953,989pb。
使用被本发明人用标准参数修改的Newbler软件(Roche)过滤并拼接序列，以获得菌株CECT7746的总计109个＞500pb的重叠群和菌株CECT7747的总计51个叠连群。随后，对所述基因组进行自动注释，以获得所述菌株CECT7746和CECT7747的基因组的完整序列。
在获得菌株CECT7746和CECT7747的完整基因组后，基于在16S和23SrRNA基因(其在制备细菌系统发生树时是分布最广泛的)的完整序列的基础上获得的系统发生树，对所述分离菌进行分类学分配。
通过将16S和23SrRNA基因的序列连在一起，获得大于4,000个核苷酸的单个片段，将其与目前被测序的链球菌物种的相同片段比对。使用MAFFT免费计算机软件，通过分别比对16S和23S基因，对序列进行比对，并且随后将比对联系在一起。之后，使用GBlocks免费计算机软件净化比对以便选择保守信息位置。使用RAxML程序，通过最大拟真法(maximumverisimilitude)，重复500次，获得所述树。获得的系统发生树显示虽然来自不同的个体但是两种菌株是姐妹菌株并且，此外，属于缓症链球菌/口腔链球菌/S.infantis物种簇，并且该树的布局表明它们是属于新的、未被描述的物种的菌株。
为了确定所述菌株是否属于不同的物种，使用ANI(平均核苷酸同一性)。当比较测序的菌株的基因组时，在核苷酸水平上，相同物种的同源基因之间的平均相似性大于95％(34，35)。实际上，分类学家承认该95％的ANI值是区分属于不同物种的细菌分离物的界限，并且是传统的DNA-DNA杂交值中70％阈值的备选方案(36)。使用J-species免费计算机软件确定本发明的两个被测序的菌株(CECT7746和CECT7747)和剩下的被测序的链球菌之间的ANI值，证明它们是属于之前未被描述的新物种的两个菌株。在本发明的细菌菌株CECT7746的情况中，不存在具有超过95％阈值的相似性的菌株，而在本发明的细菌菌株CECT7747的情况中，在被测序的那些菌株中仅有另一个菌株(链球菌M143)超过所述阈值。所述菌株M143是虽然具有草图(draft)基因组序列但是在分类学上未被描述为是一个物种的菌株。通过两种不同的方法获得用于计算ANI的结果：Mummer和Blast(36)，并且两种方法显示几乎相同的结果。
实施例13.在存在获得自本发明公开的CECT7746和CECT7747菌株的培养物的上清的情况下，生龋细菌变异链球菌的抑制测定。
将本发明的两个菌株，CECT7746和7747，在37℃的温度培养在BHI培养基中。随后，收集处于对数期和稳定期的培养物的上清，通过0.2微米滤膜过滤，以除去任何细菌残渣。随后，通过离心，使用孔隙大小为100、10和3kDa的膜(Amicon，Millipore)再一次过滤所述上清，如在本发明中显示的之前的实施例中所述。
获得自在生长的稳定期收集的、产生对变异链球菌的细菌培养物生长的抑制的菌株CECT7746和7747中的每个的上清的级分，在两种测试菌株，CECT7746(图14A)和CECT7747(图14B)的小于3kDa的尺寸级分中浓缩。所述结果显示由所述菌株合成的、呈现针对生龋物种的特异性杀菌效果的抑制物质，必须是小尺寸的，优选＜3kDa，如在细菌素的情况中。
相反，当利用在生长的对数期收集的本发明的菌株(CECT7746和7747)的培养物的上清的样品进行相同实验时，没有观察到对变异链球菌的细菌培养物的生长的抑制(图15)，这表明抑制剂仅在本发明的菌株的细菌生长的稳定期中产生。
当使在稳定期获得并且小于3kDa的浓缩上清的样品经受100℃的温度达10分钟时，证明所述上清对变异链球菌的培养物的抑制活性得到维持并甚至增强(图16)。这些结果与抑制剂是细菌素而不是其他类型的肽的事实一致，因为小尺寸的细菌素是及其具有热稳定性的并且甚至增加其抗微生物效果，因为在它们的聚集体通过热冲击溶解后它们更好地洗脱在培养基中。
随后，利用获得自本发明的细菌菌株CECT7746和CECT7747的培养物的上清进行针对变异链球菌的培养物的抑制测定，但是改变接种次序和所述生龋细菌的培养物的生长温度，以便证明所述改变是否对本发明的菌株的上清的抑制活性具有任何影响。
首先，用变异链球菌生龋细菌接种培养板并且，在24h后，将本发明的菌株接种到相同的培养板中。在一段时间后，没有观察到抑菌圈。相反，当在同一时间用两种菌株接种培养板时，观察到变异链球菌生长的抑制，如我们之前所显示的。当首先接种本发明的菌株CECT7746和7747，并且在24h后接种变异链球菌的菌株时，观察到变异链球菌的培养物生长的最大抑制，这说明在生龋细菌生长前存在更高浓度的抑制剂或物质，并且此外，所述细菌的存在对于激活通过本发明的菌株的抑制剂的生产不是必要的。
随后，通过以下方式在固体培养基中进行针对生龋细菌的生长的抑制实验：首先在稳定期中利用一滴培养物将本发明的菌株接种到液体培养基中，之后在不同的温度对变异链球菌进行挂毯培养(tapestryculture)：30℃、33℃和36℃。在30℃的温度没有观察到变异链球菌生长的抑制，但是在33℃观察到抑制，其实际上大于在36℃获得的抑制。
实施例14.针对在存在获得自本发明的细菌菌株CECT7746和CECT7747的培养物的上清的情况下、在需氧生活和厌氧生活条件下培养的生龋细菌变异链球菌的抑制测定。
为了确定本发明的菌株对生龋细菌生长的抑制作用是否被需氧或厌氧环境改变，通过以下方式在固体BHI培养基中进行抑制实验：首先在稳定期中利用一滴培养物将本发明的菌株接种到液体培养基中，在无氧瓶中12小时，之后在37℃对变异链球菌进行挂毯培养，或者之后在37℃用一滴变异链球菌的培养物接种。
两个实验的结果显示变异链球菌的生长的抑制在厌氧生活条件下更低，尤其是对于菌株CECT7746(图17)。因此，结果证明，对于本发明的菌株，施加于生龋细菌的抑制在牙斑形成的有氧步骤中(即在所述生物膜在牙齿上粘附和初始形成期间)更有效。
实施例15.细菌菌株CECT7746和CECT7747及其上清对人工牙齿模型中的生物膜的抗生龋作用。
为了证明本发明中公开的细菌菌株的抗生龋作用，利用菌株CECT7746和CECT7747在人工牙齿模型中的生物膜上进行针对酸生产的抑制测定。在ActiveAttachmentbiofilmmodeloftheAcademicCenterforDentistryAmsterdam(阿姆斯特丹牙科学学术中心的活性附着生物膜模型)(ACTA，Amsterdam)上进行所述实验。所述生物膜模型由ExterkateRA等(37)描述。简言之，用来自具有高百分比的变异链球菌(大于4％)的志愿者的人唾液，在存在或不存在益生菌菌株或其上清的情况下，接种羟基磷灰石或玻璃盘。在本测定中，测试本发明公开的菌株CECT7746和7747，以及菌株C7.1，菌株C7.1是属于缓症链球菌/口腔链球菌/Streptococcusinfantis组的物种的分离菌，其获得自没有龋齿的个体，但是不产生对生龋物种的生长的抑制，并且因此，充当阴性对照。
将人唾液贮藏在-80℃。使益生菌菌株CECT7746和7747和对照菌株C7.1在具有蔗糖的BHI培养基中生长12小时，直到获得约4x108cfu(Colony-FormingUnits(菌落形成单位))的培养物密度。随后，以50％将唾液样品与本发明的益生菌菌株(CECT7746或7747)的接种体或对照菌株(C7.1)的接种体混合，并且施于玻璃盘上。
所述生物膜在改良的人工唾液培养基(38)中在需氧生活和厌氧生活下形成达48小时，并且在形成后，在37℃的温度在含有0.2％葡萄糖的半胱氨酸胨水(Sigma-Aldrich，StLouis，USA)中温育3小时，以便测量酸的产生。在该温育期间，菌株将产酸，通过比色反应测量所述酸：将所述生物膜转移到Eppendorf管中并在80℃的温度温育5min以使细菌代谢停止。通过比色测定，使用SpectraMaxM2分光光度计(MolecularDevices，USA)，遵照PhamLC等(38)描述的方案，通过酶学方法确定L-乳酸的量。
为了分析本发明的菌株(CECT7746和7747)以及对照菌株(C7.1)的上清对酸生产的抑制，首先，获得所述细菌菌株的培养物上清。为此，使所述菌株的培养物在BHI培养基中生长12小时。随后，通过离心和之后的通过大小为0.2微米的孔隙的过滤除去细菌细胞。通过Amicon100-、10-和3-kDaUltra膜(Millipore)过滤培养基。在旋转蒸发仪中将小于3kDa的级分浓缩到其一半体积，并且以50％与唾液样品混合；随后，如在益生菌的情况中，在48小时内形成生物膜，并将其在含有0.2％葡萄糖的BufferedPeptoneWater(缓冲胨水)培养基(38)中温育3小时，以致能够测量酸的产生。
每种处理在需氧生活和厌氧生活条件下重复四次。分析的实验组为：
1.利用唾液接种体形成的生物膜。
2.利用唾液接种体+CECT7746形成的生物膜。
3.利用菌株CECT7746形成的生物膜。
4.利用唾液接种体+CECT7747形成的生物膜。
5.利用菌株CECT7747形成的生物膜。
6.利用唾液接种体+非抑制性链球菌菌株(菌株C7.1)形成的生物膜。
7.利用唾液接种体+含有活性抑制物质的菌株CECT7746的上清形成的生物膜。
8.利用唾液接种体+含有活性抑制物质的菌株CECT7747的上清形成的生物膜。
9.利用唾液接种体+非抑制性菌株(菌株C7.1)的上清形成的生物膜。
10.利用非抑制性链球菌菌株(菌株C7.1)形成的生物膜。
结果显示在图18中，并且显示单独通过菌株CECT7746(实验组3)或CECT7747(实验组5)形成的单特异性生物膜产生的酸的量明显低于通过唾液(实验组1)形成的生物膜产生的酸的量。将人唾液作为参比值(实验组1)，菌株CECT7747(实验组8)的上清在需氧生活和厌氧生活下都显著减少酸的产生，而菌株CECT7746(实验组7)的上清仅在厌氧生活条件下减少由生物膜产生的酸的量。向生物膜添加菌株CECT7747在需氧生活和厌氧生活下都减少酸的产生，而向生物膜添加菌株CECT7746仅在需氧生活下导致减少。
酸的减少，尤其在菌株CECT7747及其上清的情况中，与治疗和预防龋齿非常相关，因为后者形成的原因是当微生物发酵在饮食中摄入的糖时其产生酸。酸pH正是使釉质去矿化并且产生龋齿的因素，并且，因此，任何产酸物种，并且不仅是来自变异链球菌组的链球菌，都可能是潜在生龋的(2)。因此，产酸的减少是这样的指示物，即利用益生菌菌株或其上清的处理的总的效果是减少酸，并且因此，降低发展龋齿的可能性。
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Claims (10)

1.选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株：CECT7747，CECT7746，CECT7773和CECT7775。
2.选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株或其组合在制备抗微生物剂中的用途：CECT7747，CECT7746，CECT7773和CECT7775。
3.选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株或其组合在制备药物中的用途：CECT7747，CECT7746，CECT7773和CECT7775，所述药物用于治疗口腔传染病。
4.选自以下任何一项的可培养的抗微生物的细菌菌株或其组合在制备益生菌或功能食品中的用途：CECT7747，CECT7746，CECT7773和CECT7775，所述益生菌或功能食品被设计用于改善口腔健康。
5.益生菌/益生素组合物或功能食品，其包含至少一种根据权利要求1的抗微生物菌株。
6.医药组合物，其包含至少一种根据权利要求1的抗微生物菌株。
7.口腔健康组合物，其包含至少一种根据权利要求1的抗微生物菌株。
8.根据权利要求5的益生菌/益生素组合物或功能食品在制备药物中的用途，所述药物用于治疗口腔传染病。
9.根据权利要求6的医药组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗口腔传染病。
10.根据权利要求7的口腔健康组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗口腔传染病。
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