JP2013543374A - 抗カリエス組成物およびプロバイオティクス/プレバイオティクス - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
口腔疾患の発症と関係する病原菌の増殖を直接阻害する、菌株の同定の最先端技術における既存の困難は、前記口腔内の大量の菌種によって引き起こされる;つまり、それらのすべての中から、直接病原菌種の増殖を阻害する菌株を単離することに関与する困難、すなわちそれらの多くが培養できない種であることが、これまでこの問題を解決することを難しくしていた。
口腔感染症:本発明の目的のために、口腔感染症は好ましくはカリエス、歯周炎、歯肉炎および口臭である。
プロバイオティクス:本発明の目的のために、用語プロバイオティックは、食物(ミルク、ヨーグルトなど)、栄養補助食品(カプセル、タブレット、錠剤、粉末などの形状で)または他のものに加えられる、生きている微生物の使用を指し、該微生物は活発なまま存在し、前記プロバイオティックを含む食物または類似の製品を摂取する被験体へ生理学的な効果を発揮する。十分な量を摂取すれば、この場合口腔の健康に有益な効果が得られる。
プレバイオティクス:本発明の目的のために、用語プレバイオティクスは、食物、チューインガム、栄養補助食品または他のものに加えられる物質の使用を指し、該物質は口腔の健康に有益な微生物の構築に及び/または病原細菌の構築を妨げるのに好都合な口腔微生物叢の組成物に効果を発揮する。
メタゲノム:サンプル、個体または生態系の中に存在する、すべての細菌のゲノムを表わす。
微生物叢:人間と共存する微生物または細菌の集合である。
生物活性の抗微生物化合物:生物学的に活性なペプチド、タンパク質、抗生物質、色素など、脊椎動物及び無脊椎動物で見出され、天然の抗生物質として振る舞う化合物であり、固有の免疫応答の一部である。例えばペプチドのようなこれらの化合物のうちのいくつかは、他のものの中で例えばデフェンシン及びカスリシジンのようにヒトによって作られる。それらは細菌、菌類および隠遁した(cloistered)ウイルスに対して活性がある。
バクテリオシン:生成している菌株から近縁である他の種に対して、あるいは生成している菌株から系統的に離れた菌株に対して殺菌特性を持つ細菌によって分泌された生物学的に活性ペプチドである。
フォスミド:宿主細胞、一般に細菌細胞へ容易に導入し得る、及び細菌あるいはヒトDNA断片を輸送し得る環状DNAフラグメント。
機能性食品:栄養上の特徴のためだけでなく、健康状態を改善するか、疾患にかかる危険を減らすような特定の機能も満たすよう作成された食物として定義される。この目的のために、ミネラル、ビタミン、脂肪酸、有益な効果を備えた細菌、食物繊維および酸化防止剤など生物学的に活性な化合物が、それに加えられる。
培養できる菌株:培養できる菌株は、標準好気生活または嫌気生活状態下の人工実験培養培地の中で、純粋培養で増殖し、安定した状態で増殖し続けるものであると考えられる。
a)カリエスに苦しんでいない個体の歯肉縁上の歯垢からサンプルを得る工程、
b)適切な増殖条件下の適切な培地にサンプルを植え、及びカリエスに一度も苦しんだことのない個体で最も頻出するサンプルの細菌を単離する工程、
c)カリエス性細菌の増殖培地中で、単離された菌株を培養して、適切な培養時間後に増殖に対して阻害ハロを示す菌株を選択する工程を含むことを特徴としている。
a)カリエスに一度も苦しんだことのない個体の歯肉縁上の歯垢からサンプルを得る工程、
b)前記サンプルを溶解し、完全なゲノムDNAを前記サンプルから抽出する工程、
c)抽出されたDNAの残りから、ベクター、好ましくはプラスミドまたはフォスミドのメタゲノムライブラリを調製する工程であって、前記ベクターは宿主細胞に挿入され、かつ前記ベクターが運ぶ、抽出されたDNAを宿主細胞において発現することができる、工程、
d)宿主細胞にベクターを挿入する工程、
e)ベクターを含む宿主細胞のクローンを、カリエス生成微生物を持つ培地に植え、適切な培養時間後に増殖阻害ハロを示すクローンを選択する工程、
f)阻害活性を示したクローンのベクターのDNAをシーケンシングし、前記DNAがコードする化合物を合成及び/または精製する工程を含むことを特徴としている。
好ましい実施形態において、上記プロセスは、抽出されたDNAが少なくとも300μg/mlであることを特徴としている。別の好ましい実施形態において、前記プロセスは、DNA抽出プロセスの後に、好ましくは35乃至45kbの範囲内のサイズのDNAを含むフォスミドが構築されることを特徴としている。別の好ましい実施形態において、前記フォスミドは1kbより小さいサイズのDNAを含む。別の好ましい実施形態において、前記プロセスはフォスミドを挿入する宿主細胞がE.coliであることを特徴としている。
本発明に使用した微生物は、Research Building of the University of Valencia, Campus Burjassot, Burjassot 46100(Valencia,Spain)にあるスペイン培養細胞系統保存機関に以下の寄託番号を持って寄託した。
・CECT7746:2010年6月7日に寄託したStreptococcus属の菌株。
・CECT7747:2010年6月7日に寄託したStreptococcus属の菌株。
・CECT7773:2010年7月22日に寄託したStreptococcus属の菌株。
・CECT7774:2010年7月22日に寄託したRothia属の菌株。
・CECT7775:2010年7月22日に寄託したStreptococcus属の菌株。
最初に、歯肉縁上の歯垢のサンプルを、インフォームドコンセントに署名した後、カリエスに一度も苦しんでいないボランティアから採取しおよび比較のために以前カリエスに苦しんだことのあるボランティア、及びカリエスに苦しんでおり、前記カリエスの病変を呈しているボランティアから採取した。サンプルを得るプロセスは、バレンシア自治政府保険管理局の臨床調査倫理委員会(GSP−CSISP)によって承認された。各ボランティアの口内の健康状態は、世界保健機関(WHO)による口腔の健康の研究に関する推奨および分類(nomenclature)に従った歯医者によって評価された。サンプルは無菌のプローブを使用して得た。ボランティアは、サンプルを採取する24時間前から歯を磨かないように指示された。
パイロシーケンシングのプロセスで使用されなかった、研究に含まれていた健康なボランティアの歯肉縁上の歯垢から抽出した無傷のDNAのサンプルを使用し、前記ボランティアの歯垢のフォスミド(好ましくは35−45kbの間の長さを持つインサート)のメタゲノムライブラリを構築し、このためにEpiFOS(商標)Fosmid Library Production Kit(Epicentre Biotechnologies)をメーカーの取扱説明書に従って使用した。簡単に言えば、本発明のメタゲノムライブラリを構築するプロセスの好ましい代替案として、フォスミドは宿主、好ましくは大腸菌に挿入される。上記で説明したように、メーカーの取扱説明書にいくつかの変更、例えばライゲーションの時間を増やすこと(20℃の水浴で12時間)、パルスフィールドゲルから抽出したDNAではなく挿入の為にDNA全体を用いること、抽出したDNAの破損を最小限にするためのDNA抽出プロセスをわずかに変更すること(切ったピペットチップを使用すること、ボルテックスを避けること、DNAを濃縮するためのCentricom membranes(Millipore)を使用すること)を加えたものに従って、EpiFOS(商標)Fosmid Library Production Kit(Epicentre)を用いてライブラリを調製した。
カリエスを持つ個体及び健康な個体からの歯肉縁上の歯垢のメタゲノムを、本発明で記載したプロセスを経て一旦得て、前記口腔メタゲノムの多様性を以下の3つの技術を用いて分析した:
伝統的な培養技術及び先駆的な分子の研究に基づいた最初の研究は、16SrRNA遺伝子の増幅およびクローニングを含み、口腔内に約500の様々な種の多様性があると予想した(6)。現代の技術(次世代シーケンシング、NGS)を使用することで、操作的分類単位(OTU)は、4000及び19000の間であると見積もられた。OTUは、与えられた閾値よりも低い類似性を持つ16SrRNA遺伝子の配列は、異なる種に属するという事実を考慮に入れた、DNA配列に基づいた種の数の予想値である。使用される閾値は、16S rRNA遺伝子の標準である、97%の配列同一性である;したがって、類似性が97%以上であれば、同じ種であると考慮されるが、それが97%未満であれば、それは恐らく異なる種である。3人の健康な被験体のより長いパイロシーケンシングのリード(250pb)は、一人当たり約600OTUであると予想し、最近のプロジェクトはサンガー型シーケンシング(22)を用いた16S rRNA増幅産物のほぼ全長を持つ11447の増幅産物をシーケンスしようと試み、その結果10人の個体で300OTU以下と予想値が下がった。
本発明で分析された個体の口腔生態系の一部である生物の機能的な多様性を分析するために、得られたメタゲノムのシーケンスのリードをすべて、保存ドメインデータベース(CDD)(24)、サブシステムに基づいたアノテーションシステム(SEED)およびTigrFamsプロファイル(25)の様々なデータベースと比較した。
一度もカリエスに苦しんでいない個体からの歯肉縁上の歯垢のフォスミドライブラリが一旦得られると、異なるフォスミドインサートを持つE.coliの異なるクローンを、Streptococcus mutansまたはStreptococcus sobrinusなどのカリエス性細菌の培地に植えた。一度もカリエスに苦しんでいないボランティアのフォスミドメタゲノムライブラリのレプリカを、誘導剤(Epicentre Technologies)を使用してマルチプルコピーに予め誘導したライブラリ中の各プレートの96クローンの増殖を各ペトリ皿が担保(host)できるように、Nunc96ピンレポリケーターを使用して前記プレートにピンで植えた。この単純なスクリーニングを使用し、何千ものクローンの抗収率活性アッセイ(high−yield activity assay)を限られた時間の中で行い、カリエス性微生物の上で阻害ハロを生成するクローンを選択する(図1)。
実施例6に述べられているように、一旦7つのフォスミドの配列が得られたならば、2つの短い長さのDNAインサートのDNA配列を分析して、3’−5’および5’−3’方向にコードされたORFをすべて得た。これらのORFのうち、我々はリボソーム結合配列を含み(E.coliの16Sの3’末端に相補的な配列を持つ)、それゆえに効果的に翻訳されるもの、及びシグナルペプチドが存在するため(SIGNAL−IPソフトウェアを使って同定する)あるいは標準的ではない分泌経路(SECRETOME−Pソフトウェアを使って同定する)のいずれかによって分泌できるものを選択した。前記方法を使って、ヒト由来のフォスミド(T5A)から、わずか26アミノ酸の長さ(SEQ ID NO:8)の候補のORFを、細菌由来のフォスミド(S12E)から、39アミノ酸の長さ(SEQ ID NO:9)のもう一つの候補のORFを得た。もっと言えば、これらの遺伝子は、抗微生物ペプチドの特徴を持つアミノ酸組成を示し、さらにヒト由来のT5Aの場合、ジスルフィド架橋を形成できる二つのシステインの存在を確認した。このことは、これらの短い配列及びこれらの正味の正電荷とともに、これらの遺伝子が生物活性の抗微生物ペプチドであることを示唆する。
バクテリオシンの阻害効果を、市販の競合品と比較するために、液体BHI培地内で同様のS.mutans増殖実験を、前述の実施例で記載したように、ただし今回はa)100μlの市場での口内洗浄液の主力製品の一つ(抗歯垢剤及び口内消毒剤であるListerine(登録商標))、b)バクテリオシンを含むS12Eクローンの100μlの濃縮した上清(前述の実施例で説明されたように))及びc)100μlのListerine(登録商標)+バクテリオシンを含むS12Eクローンの100μlの上清を加えて行った。S.mutansの増殖に対するこの濃度100μlでのバクテリオシンの阻害効果は、この菌種への市販製品の阻害効果よりも大きく(図4)、さらにバクテリオシンを市販製品に加えることで、前記製品のS.mutansに対する阻害効果が著しく向上することを前記図4で観察できる。
単離した二つの阻害ペプチド(SEQ ID NO:8及び9)の化学的な合成を、固相合成法(32及び33)によって行った。SPPS(固相ペプチド合成)によるペプチド合成は、合成的に実験室でペプチド及びタンパク質を作成するために使用される最も一般的な方法で、細菌内で発現するのが難しい天然ペプチドの合成、天然ではないアミノ酸の結合またはペプチド修飾(例えばジスルフィド架橋の形成)を可能にする。
その他の潜在的な抗微生物化合物について、阻害ハロを生成する全てのフォスミドからDNAを分離し、その端とインサートの全長の配列を決定した(表3)。これは、抗微生物化合物(抗微生物ペプチドだけではなく)を生成する細菌の一覧と同時に、これらをコードするヒトゲノムの領域の一覧を得ることを可能にした。対応するクローンが生成した濃縮された上清(前述の実施例で示したように)の0−3kDa,3−10kDa,10−100kDa及び>100kDaの画分をS.mutansの液体培地に加えることで、S.mutans培地上で阻害実験を行った。これらの実験は、阻害を引き起こすサイズ画分が、T9B及びT4H細菌フォスミドとW4D(図8),T5H(図9),A5D11(図10)及びA4H11(図11)ヒトフォスミドの0−3kDa画分、及びT1F細菌フォスミドの3−10kDa画分であることを明らかにした。したがって、これらの結果は、小さなサイズのペプチド、すなわち0−3kDaまたは3−10kDaの間の大きさを備えたペプチドによって阻害が生み出されることをもう一度示しており、この結果はそれらがバクテリオシン型またはヒトデフェンシン/カセリシジンの抗細菌ペプチドであるという事実と一致している。
カリエスに一度も苦しんでいない少数の成人人口の存在は、カリエス性細菌(23)に対する潜在的なアンタゴニスト効果を備えた菌種の存在の示唆へと導いた。健康な個体から得られた無毒な単離株との病原性菌株の細菌置換(bacterial replacement)は、咽頭感染症を防ぐことが十分に証明されており、腸及び他のヒトの生態系の感染症を防ぐために設計されたプロバイオティックに基づいている。健康な被験体の口腔微生物叢に対してカリエス性細菌のメタゲノムを動員することで、S.mutans及びS sobrinusが完全に存在しないことを示す。驚いたことに、カリエス性細菌が検出されないのは、健康な個体で最も豊富な属であるStreptococcus属(主にS. sanguisと類似のもの)、Aggregatibacter属及びNeisseria属の他の種の非常に強い動員を伴う時であった。
菌株CECT7746及びCECT7747の特徴づけを様々な技術を用いて行った。最初に、これらの2つの菌株の完全なゲノムを、ショットガン(7、8)及びペアーエンドパイロシーケンシングを用いて得た;これらの2つの末端の間の既知の長さが配列のアセンブリを助けるように、後者は、約3000のヌクレオチドのフラグメントへとDNAを破壊し、各末端からおよそ200のヌクレオチドの配列を決定することから成る。
菌株7746
ショットガンタイプ:合計165,105,921のヌクレオチドを備えた441.549のリード。
ペアーエンドタイプ:合計32,721,622のヌクレオチドを備えた187.530のリード。
菌株7747
ショットガンタイプ:合計5,711,998のヌクレオチドを備えた28.021のリード。
ペアーエンドタイプ:合計51,501,510のヌクレオチドを備えた305.826のリード。
本発明の2つの菌株、CECT 7746及び7747を37℃の温度で、BHI培地内で増殖させ、その次に、指数増殖期と定常期に、培地の上清を集め、0.2ミクロンのフィルターに通して濾過し、任意の細菌の残留物を除去した。続いて、本発明で示される、前の実施例で述べたように、100、10及び3kDa(Amicon、Millipore)の孔サイズを備えた膜を用いて、遠心分離することで、前述の上清をもう一度濾過した。
カリエス性細菌の増殖に対する本発明の菌株の阻害作用が、好気生活又は嫌気生活によって修正されるか否かを決定するために、固体のBHI培地に、嫌気ジャー内で12時間、定常期において、液体培地で、本発明の菌株を一滴の培地で最初に植え、次に37℃でS.mutansのタペストリー培養(tapestry culture)、又は37℃でS.mutansを一滴の培地で植えることにより、阻害試験を行った。
本発明で開示された菌株の抗カリエス性効果を実証するために、酸の生成に対する阻害アッセイを、人工歯モデルにおけるバイオフィルム上で菌株CECT7746及びCECT7747で行った。前記実験を、Academic Center for Dentistry Amsterdam(ACTA、Amsterdam)のActive Attachment バイオフィルムモデル上で行った。前記バイオフィルムモデルは、Exterkate RA et al.(37)に記載された。簡潔には、プロバイオティック菌株が存在する又は存在しない、あるいはその上清が存在する又は存在しない、高い割合のS.mutans(4%より高い)を有するボランティアのヒトの唾液を、ヒドロキシアパタイトディスク又はガラスディスクに接種する。本アッセイでは、Streptococcus mitis/oralis/infantisグループの種に属し、カリエスを有さない個体から得た、カリエス性種の増殖の阻害をもたらさないため陰性対照としてふるまう、分離株C7.1とともに、本発明で開示された菌株CECT7746及び7747を試験する。
1. 唾液接種菌液で形成したバイオフィルム。
2. 唾液接種菌液+CECT7746で形成したバイオフィルム。
3. 菌株CECT7746で形成したバイオフィルム。
4. 唾液接種菌液+CECT7747で形成したバイオフィルム。
5. 負荷CECT7747で形成したバイオフィルム。
6. 唾液接種菌液+非阻害Streptococcus菌株(菌株C7.1)で形成したバイオフィルム。
7. 唾液接種菌液+活発な阻害物質を包含した菌株CECT7746の上清で形成したバイオフィルム。
8. 唾液接種菌液+活発な阻害物質を包含した菌株CECT7747の上清で形成したバイオフィルム。
9. 唾液接種菌液+非阻害菌株(菌株C7.1)の上清で形成したバイオフィルム。
10. 非阻害Streptococcus菌株(菌株C7.1)で形成したバイオフィルム。
Claims (71)
- CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774及びCECT7775のいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746、CECT7747、CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の抗微生物菌株。
- 抗微生物菌株は、口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエス性生物の増殖に対して阻害活性を示す、請求項1及び2に記載の抗微生物菌株。
- 薬として使用するための、CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774及びCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746、CECT7747、CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項4に記載の抗微生物菌株。
- 薬の調製における、CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774及びCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される、培養できる抗微生物菌株の少なくとも1つの使用。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746、CECT7747、CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の使用。
- 抗微生物剤、好ましくは抗菌剤として使用するための、CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774及びCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746、CECT7747、CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の抗微生物菌株。
- 抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製における、CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774及びCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される、培養できる抗微生物菌株の少なくとも1つの使用。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746、CECT7747、CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項10に記載の使用。
- 口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置で使用するための、CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774及びCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746、CECT7747、CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項12に記載の抗微生物菌株。
- 口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置のために設計された組成物の調製における、CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774およびCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される、培養できる抗微生物菌株の少なくとも1つの使用。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746,CECT7747,CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項14記載の使用。
- 口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプロバイオティックまたは機能性食品として使用するためのCECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774およびCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746,CECT7747,CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項16記載の抗微生物菌株。
- 口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプロバイオティックまたは機能性食品の調製におけるCECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774およびCECT7775またはその組み合わせのいずれかから選択される、培養できる抗微生物菌株の少なくとも1つの使用。
- 抗微生物菌株は、Streptococcus属に属し、CECT7746,CECT7747,CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項18記載の使用。
- 請求項1から3のいずれかに記載の、少なくとも1つの抗微生物菌株を含むプロバイオティック/プレバイオティック組成物または機能性食品。
- 請求項1から3のいずれかに記載の、少なくとも1つの抗微生物菌株を含む医薬組成物または口腔健康のための組成物。
- 配列SEQ ID NO:9を含む抗微生物化合物または以下の配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14のいずれかを含むDNA配列によってコードされる抗微生物化合物。
- 配列SEQ ID NO:9から成る抗微生物化合物または以下の配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14のいずれかから成るDNA配列によってコードされる抗微生物化合物。
- 抗微生物化合物は、口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエス性生物の増殖に対する阻害活性を示す、請求項22または23に記載の抗微生物化合物。
- 抗微生物化合物がペプチドであることを特徴とする、請求項22から24のいずれかに記載の抗微生物化合物。
- 薬として使用するための請求項22から25いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 薬の調製における請求項22から25いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製で使用するための、請求項22から25いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製における請求項22から25いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置で使用するための、請求項22から25いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 口腔感染症の処置のために設計された組成物、好ましくはカリエスの処置のために設計された組成物の調製における、請求項22から25いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレバイオティックまたは機能性食品として使用するための、請求項22から25いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレバイオティックまたは機能性食品の調製における、請求項22から25いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 請求項22から25いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物を含む、プロバイオティック/プレバイオティック組成物または機能性食品。
- 請求項22から25いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物を含む、医薬組成物または口腔健康のための組成物。
- 配列SEQ ID NO:8を含む抗微生物化合物または以下の配列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5のいずれかを含むDNA配列によってコードされる抗微生物化合物。
- 配列SEQ ID NO:8から成る抗微生物化合物また以下の配列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5のいずれかから成るDNA配列によってコードされる抗微生物化合物。
- 抗微生物化合物は、口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエス性生物の増殖に対する阻害活性を示す、請求項36または37に記載の抗微生物化合物。
- 抗微生物化合物がペプチドであることを特徴とする、請求項36または37いずれかに記載の抗微生物化合物。
- 抗微生物化合物は、口腔内の酸、好ましくは乳酸の生成を阻害することを特徴とする請求項36から39いずれかに記載の抗微生物化合物。
- 薬としての使用するための請求項36から39いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 薬の調製における請求項36から39いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製で使用するための請求項36から39いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製における、請求項36から39いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置で使用するための、請求項36から39いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 口腔感染症の処置のために設計された組成物、好ましくは抗カリエス組成物の調製における請求項36から39いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレバイオティックまたは機能性食品として使用するための請求項36から39いずれかに記載の抗微生物化合物またはその組み合わせ。
- 口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレバイオティックまたは機能性食品の調製における請求項36から39いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用。
- 請求項36から39いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物を含むプロバイオティック/プレバイオティック組成物または機能性食品。
- 請求項36から39いずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物を含む医薬組成物または口腔健康のための組成物。
- 口腔感染症をもたらす生物、より好ましくはカリエス性生物の増殖に対する阻害活性を好ましくは持つ培養できる抗微生物菌株を単離するプロセスであって、
該プロセスは、
a)カリエスに一度も苦しんだことのない個体から歯肉縁上の歯垢のサンプルを得る工程、
b)適切な増殖条件下の適切な培地にサンプルを植え、及びカリエスに一度も苦しんでいない個体で最も頻出するサンプルの細菌を単離する工程、
c)カリエス性細菌の増殖培地中で、単離された菌株を培養して、適切な培養時間後に増殖に対して阻害ハロを示す菌株を選択する工程、
を含むことを特徴とするプロセス。 - 工程b)において、カリエスに一度も苦しんだことのない個体で最も頻出する細菌をゲノムのパイロシーケンシングによって得ることを特徴とする、請求項51に記載のプロセス。
- 工程c)において、菌株は好ましくは、Streptococcus属,Rothia属,Neisseria属,Globicatella属,Johnsonella属,Haemophilus属,Kingella属,Cardiobacterium属,Mannheimia属,Phocoenobacter属及びAggregatibacter属から選択されることを特徴とする、請求項51に記載のプロセス。
- 菌株は、CECT7746、CECT7747、CECT7773、CECT7774およびCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項53に記載のプロセス。
- 菌株は、Streptococcus属に属し、好ましくはS.sanguis、S.oralis、S.mitis、S.infantisに属する菌株が選択されることを特徴とする、請求項53に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの抗微生物菌株は、CECT7746,CECT7747,CECT7773またはCECT7775から選択されることを特徴とする、請求項55に記載のプロセス。
- 感染症、好ましくは口腔感染症、より好ましくはカリエスを予防する及び/または処置するための方法であって、
前記方法は、
口腔に常に生息する病原微生物、好ましくはカリエス性微生物の増殖を阻害するのに効果的な量の請求項1から3のいずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物菌株、または請求項20に記載のプロバイオティック/プレバイオティック組成物または機能性食品、あるいは請求項21に記載の医薬組成物または口腔健康のための組成物、を投与する工程を含むことを特徴とする方法。 - 口腔感染症をもたらす生物、より好ましくはカリエス性生物の増殖に対して阻害活性を好ましくは持つ抗微生物化合物を獲得するプロセスであって、
該プロセスは、
a)カリエスに一度も苦しんだことのない個体から歯肉縁上の歯垢のサンプルを得る工程、
b)前記サンプルを溶解し、完全なゲノムDNAを前記サンプルから抽出する工程、
c)抽出されたDNAの残りから、ベクター、好ましくはプラスミドまたはフォスミドのメタゲノムライブラリを調製する工程であって、前記ベクターは宿主細胞に挿入され、かつ前記ベクターが運ぶ、抽出されたDNAを宿主細胞において発現することができる、工程、
d)宿主細胞にベクターを挿入する工程、
e)ベクターを含む宿主細胞のクローンを、カリエス性微生物を持つ培地に植え、適切な培養時間後に増殖阻害ハロを示すクローンを選択する工程、
f)阻害活性を示したクローンのベクターのDNAをシーケンシングし、前記DNAがコードする化合物を合成及び/または精製する工程、
を含むことを特徴とするプロセス。 - 抽出されたDNAの濃度が少なくとも300μg/mlであることを特徴とする、請求項58に記載のプロセス。
- フォスミドは、DNA抽出プロセスの後に、好ましくは35乃至45kbの範囲内のサイズのDNAを含んで構築されることを特徴とする、請求項58に記載のプロセス。
- 前記フォスミドは、1kbより小さいサイズのDNAを含むことを特徴とする、請求項58に記載のプロセス。
- フォスミドを挿入する宿主細胞がE.coliであることを特徴とする、請求項58から61のいずれかに記載のプロセス。
- DNAインサートを持つフォスミドを含むクローンが植えられる微生物の培地は、カリエス性細菌、好ましくはS.mutansまたはS.sobrinusの培地であることを特徴とする、請求項58から62のいずれかに記載のプロセス。
- フォスミドのDNA配列は、SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14またはそれらの組み合わせを含む配列から選択されることを特徴とする、請求項58から63のいずれかに記載のプロセス。
- フォスミドのDNA配列は、SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14またはそれらの組み合わせから成る配列から選択されることを特徴とする、請求項58から63のいずれかに記載のプロセス。
- 配列SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9から選択される配列を含む抗微生物ペプチド、あるいはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14のいずれかを含むDNA配列によってコードされる抗微生物化合物の少なくとも1つが得られることを特徴とする、請求項58から65のいずれかに記載のプロセス。
- 配列SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9から選択される配列から成る抗微生物ペプチド、あるいは以下の配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14のいずれかから成るDNA配列によってコードされる抗微生物化合物の少なくとも1つが得られることを特徴とする、請求項58から65のいずれかに記載のプロセス。
- フォスミドのDNA配列であるSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13及びSEQ ID NO:14、並びにSEQ ID NO:8を持つ抗微生物ペプチドは、細菌由来であり、好ましくはバクテリオシンであることを特徴とする、請求項66または67に記載のプロセス。
- フォスミドのDNA配列であるSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及びSEQ ID NO:5は、ヒト由来であり、好ましくはデフェンシン/カセリシジンであることを特徴とする、請求項66または67に記載のプロセス。
- 感染症、好ましくは口腔感染症、より好ましくはカリエスを予防する及び/または処置するための方法であって、
前記方法は、
口腔に常に生息する病原微生物の増殖を阻害するのに効果的な量の請求項22から25のいずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物、または請求項34に記載のプロバイオティック/プレバイオティック組成物または機能性食品、あるいは請求項35に記載の医薬組成物または口腔健康のための組成物、を投与する工程を含むことを特徴とする方法。 - 感染症、好ましくは口腔感染症、より好ましくはカリエスを予防する及び/または処置するための方法であって、
前記方法は、
口腔に常に生息する病原微生物の増殖を阻害するのに効果的な量の請求項36から39のいずれかに記載の少なくとも1つの抗微生物化合物、または請求項49に記載のプロバイオティック/プレバイオティック組成物または機能性食品、あるいは請求項50に記載の医薬組成物または口腔健康のための組成物、を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
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