ES2608577T3 - Composiciones y probióticos/prebióticos anticaries - Google Patents

Abstract

La presente invención describe diferentes cepas bacterianas específicas aisladas de individuos sin caries y que se caracterizan por presentar actividad inhibitoria frente a organismos cariogénicos. La invención describe también un procedimiento de aislamiento de dichas cepas, así como de péptidos bioactivos, tipo péptidos antimicrobianos de origen humano y bacteriano, que también muestran actividad anticariogénica. Además, en la presente invención también se describen composiciones farmacéuticas y/o probióticas/prebióticas, alimentos funcionales, enjuagues bucales, pasta de dientes, chicles, etc, que comprenden al menos una de las cepas y/o al menos uno de los péptidos bioactivos descritos en la invención, o una combinación de los mismos y que son útiles para el tratamiento y/o prevención de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente, de la caries.

Description

imagen1

DESCRIPCIÓN

Composiciones y probióticos/prebióticos anticaries

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se engloba dentro del campo de la salud humana, más específicamente dentro del campo de la salud buco-dental.

ANTECEDENTES

La cavidad oral humana está habitada por cientos de especies bacterianas, la mayoría de las cuales son comensales y necesarias para mantener el equilibrio en el ecosistema oral. Sin embargo, algunas de ellas juegan un papel clave en el desarrollo de las enfermedades orales, principalmente caries dental y enfermedad periodontal (1). Las enfermedades orales empiezan con el crecimiento de la placa dental, un biofilm formado por la acumulación de bacterias conjuntamente con glicoproteinas de la saliva humana y los polisacáridos secretados por los microbios (2). La placa subgingival, localizada en el bolsillo subgingival neutro o alcalino, está típicamente habitado por anaerobios Gram negativos y es responsable del desarrollo de la gingivitis y periodontitis. La placa dental supragingival se forma en la superficie del diente e incluye bacterias acidogénicas y acidófilas, que al fermentar los azúcares ingestados en la dieta producen ácido y bajan el pH. Cuando el pH se acidifica demasiado (generalmente por debajo de un valor de 5.5) el esmalte del diente se desmineraliza y destruye, y por tanto estas bacterias son responsables de la caries dental, considerada la enfermedad infecciosa más extendida en el mundo, afectando a más del 80% de la población humana (3). Una mala salud oral puede estar asociada a otras patologías como, por ejemplo, la úlcera de estómago, el cáncer gástrico o enfermedades cardiovasculares, entre otras.

Una de las principales razones por las que, a fecha de hoy, aún no se han conseguido erradicar a los patógenos orales, es la dificultad para estudiar las comunidades microbianas que habitan la cavidad oral, ya que por un lado, la complejidad del ecosistema (varios cientos de especies han sido detectadas con múltiples niveles de interacción) hace difícil detectar a la/s potencial/es especie/s patógena/s (4); además, no hay un único agente etiológico que pueda ser identificado como en las enfermedades clásicas, siguiendo los postulados de Koch. Este hecho ha sido claramente demostrado en la enfermedad periodontal, donde existen al menos 3 especies bacterianas pertenecientes a grupos taxonómicos muy diferentes (el llamado “complejo rojo” de patógenos periodontales) y que han sido relacionadas con el desarrollo y progresión de la enfermedad periodontal (5). Por otro lado, existe una gran proporción de bacterias orales que no pueden ser cultivadas (6) y, por lo tanto, los métodos microbiológicos tradicionales dan una imagen incompleta de las comunidades naturales que habitan la placa dental. Sin embargo, el desarrollo actual de las técnicas metagenómicas y de las tecnologías de secuenciación de última generación (Next Generation Sequencing) permiten el estudio de la comunidad bacteriana en su totalidad, analizando el conjunto del ADN total de muestras microbianas complejas (Metagenoma) sin necesidad de cultivar las bacterias en sí.

En este sentido, estudios pioneros en metagenómica se han centrado en el ecosistema intestinal, principalmente mediante una aproximación tipo “shot-gun”, en la cual el ADN es clonado en plásmidos de pequeño tamaño seguido de secuenciación tradicional tipo Sanger (7,8). Aproximaciones más recientes incluyen la secuenciación de extremos de fósmidos de gran tamaño (9) y el uso de la tecnología de secuenciación “Illumina” con una alta cobertura de secuencias cortas (10). Estudios de la microbiota de la cavidad oral, así como otros hábitats del cuerpo humano como la piel, la vagina o el tracto respiratorio se han focalizado en la secuenciación de amplicones del ARN ribosomal (11,12). Estos estudios han proporcionado una mejora sustancial de nuestro conocimiento de estas comunidades bacterianas comparado con la anterior investigación basada en el cultivo, pero las estimaciones de diversidad microbiana están dificultadas por los sesgos en la amplificación por PCR (es decir, la PCR detecta solamente las bacterias más similares a las ya conocidas y en base a la cual se usan los cebadores de amplificación, dando una imagen incompleta de la diversidad presente), por el sesgo de clonación (hay una gran cantidad de genes que no se clonan porque resultan tóxicos para la bacteria hospedadora y por tanto este método no permite estudiar la totalidad del reservorio genético de la muestra) y por una baja longitud de secuencia (las secuencias de la tecnología Illumina tienen tan sólo entre 35-70 nucleótidos, haciendo en la mayoría de los casos imposible una asignación taxonómica o funcional fiable), que unido al hecho de que como se ha comentado previamente, existe una gran proporción de bacterias orales que no pueden ser cultivadas.

Para solventar los problemas arriba mencionados, la presente invención describe la obtención del metagenoma de placa dental mediante la secuenciación directa del ADN metagenómico por pirosecuenciación 454, eliminando así los posibles sesgos impuestos por las técnicas de clonación y de PCR y proporcionando además acceso a todo el repertorio genético de la comunidad bacteriana oral en diferentes estados de salud, así como la posibilidad de analizar qué especies bacterianas de las encontradas en el metagenoma obtenido pueden estar asociadas a una buena salud oral, al presentar una flora bacteriana diferente, aquellos individuos que nunca habían padecido caries respecto a los individuos que sí la habían padecido o la padecen. Mediante el metagenoma oral obtenido en la presente invención es posible dirigir el aislamiento, cultivo e identificación de las cepas con actividad anti-cariogénica, a partir del conglomerado de bacterias que comprende una muestra de la cavidad bucal, en concreto de la placa supragingival de individuos que nunca han padecido caries, es decir aquellas cepas capaces de inhibir el crecimiento de bacterias cariogénicas. Otra de las estrategias descritas en la presente invención es la obtención de una librería metagenómica de fósmidos (insertos de ADN de longitud larga, aproximadamente 35-45 Kb) de la placa dental de individuos que nunca han padecido caries. Mediante la obtención de dicha librería de fósmidos es posible el aislamiento e identificación de los péptidos bioactivos anticariogénicos sintetizados por las bacterias presentes en la cavidad oral de individuos que nunca han padecido caries. En este sentido, dado que en el estado de la técnica Streptococcus mutans ha mostrado ser el principal agente causal de la caries (13) no es sorprendente que la mayoría de las estrategias frente a esta enfermedad hayan ido enfocadas frente a dicho microorganismo. Estas estrategias han incluido el desarrollo de vacunas usando antígenos conocidos de superficie, estrategias de inmunización pasiva que puedan neutralizar la bacteria, la coagregación de S. mutans con cepas probióticas o el uso de proteínas inhibidoras específicas de S. mutans, entre otras (14).

imagen2

Otras estrategias diferentes han sido las descritas en diferentes documentos de patente que proponen el uso de diferentes cepas bacterianas, preferentemente S. mutans, que producen menor concentración de ácido (15), o el uso de los mismos recursos, por ejemplo los nutrientes, por parte de las cepas patógenas frente a las cepas no patógenas, suministrando altas concentraciones de bacterias no patógenas de forma continuada, lo que motiva el desplazamiento de las bacterias patógenas, siempre que compartan el mismo recurso (16), o incluso una menor adhesión de las cepas bacterianas cariogénicas al diente (17). En cambio, las cepas y péptidos bioactivos descritos en la presente invención, poseen por si mismos actividad antibiótica, preferentemente anticariogénica, frente a los microorganismos productores de caries. Por otro lado, en la patente WO20040072093 (18) se describen una serie de agentes antimicrobianos activos principalmente frente a microorganismos Gram-negativos, pero los principales agentes causantes de la caries, S. mutans y S. sobrinus, son microorganismos Gram-positivos. Además, los aislados de S. mitis y S. oralis productores de dichos péptidos antimicrobianos descritos en WO20040072093 (18) han sido aislados de la garganta de pacientes con fibrosis quística, no de la boca de personas sin caries, como es el caso de los péptidos y/o cepas de la invención. Asimismo, el uso terapéutico de dichos péptidos está dirigido al tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias y no de la caries, como es el caso de los péptidos bioactivos descritos en la presente invención.

En este sentido, las cepas bacterianas aisladas y descritas en la presente invención, tienen como características técnicas principales que les diferencian del resto de cepas descritas en el estado de la técnica que pueden cultivarse mediante técnicas microbiológicas convencionales; que presentan actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente caries, sin necesidad de estar modificadas genéticamente y que han sido aisladas de individuos que nunca han padecido caries. Por consiguiente, tanto las propias bacterias anticariogénicas, como, asimismo, los compuestos bioactivos anticariogénicos, preferentemente péptidos, descritos en la presente invención pueden usarse como composiciones probióticas y/o prebióticas propiamente dichas,

o formando parte de diferentes composiciones farmaceúticas utilizadas para el tratamiento de infecciones de la cavidad bucal, como, por ejemplo, caries, periodontitis, etc, o incluso como alimentos funcionales. Además, en la presente invención también se describe un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente caries, que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de, al menos, una de las cepas y/o al menos uno de los compuestos antimicrobianos, preferentemente péptidos, descritos anteriormente, o de la composición probiótica o farmacéutica o de los alimentos funcionales que comprendan al menos una de las cepas y/o al menos uno de los compuestos, preferentemente péptidos, de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención

Los problemas existentes en el estado de la técnica a la hora de identificar cepas bacterianas que, directamente, inhiban el crecimiento de gérmenes patógenos relacionados con la aparición de enfermedades en la cavidad bucal, se basan, pues, en la enorme cantidad de especies bacterianas en dicha cavidad, por lo que el problema de aislar de entre todas ellas cepas que inhiban directamente el crecimiento de especies patógenas, siendo muchas de ellas especies no cultivables, ha hecho hasta la fecha este problema de difícil solución.

La presente invención resuelve este problema mediante la realización del metagenoma de la cavidad bucal de individuos que nunca han padecido caries. Con la realización de dicho metagenoma, empleando una secuenciación masiva, preferentemente mediante pirosecuenciación, del ADN presente en las muestras tomadas de la cavidad bucal de dichos individuos que nunca han padecido caries, permite identificar los géneros y especies de bacterias más frecuentes en la población bacteriana presente en la cavidad bucal de dichos individuos. Esta cuantificación de la frecuencia de cada bacteria en la muestra no había sido posible, hasta ahora, por técnicas de cultivo, clonación o PCR, dado que estas técnicas identifican sólo parte de las bacterias y las proporciones de las que sí identifica están sesgadas por la propia metodología (principalmente por el cultivo, clonación o amplificación preferente de ciertas especies, respectivamente).

En principio, la invención se ha basado en seres humanos, pero podría aplicarse a cualquier mamífero superior, especialmente animales de compañía o cabañas ganaderas, o incluso a fauna salvaje. Bastaría con determinar el metagenoma característico de cada especie, en individuos que nunca hayan padecido caries, como enfermedad representativa de las enfermedades típicas de la cavidad bucal. A partir de los datos obtenidos del metagenoma, una vez identificadas las cepas bacterianas más frecuentes en la cavidad bucal de los individuos sanos, el siguiente paso de la presente invención es cultivar las muestras obtenidas de la cavidad bucal de estos individuos, en los medios de cultivo y en las condiciones favorables, para que se desarrollen los géneros y las especies más frecuentes identificadas en el metagenoma de la especie de mamífero investigada.

imagen3

En la presente invención se define la capacidad inhibitoria directa, como aquella capacidad que inhibe completamente el crecimiento, al crear halos de inhibición en cultivos césped de dichas especies patógenas, debido a su acción antibiótica, sin descartar que, adicionalmente a dicha inhibición debida a su efecto antibiótico, las cepas y los compuestos puedan ejercer su efecto antimicrobiano, preferentemente anticariogénico, dificultando la acción cariogénica por otras vías, tales como modificar el pH óptimo de crecimiento de dichas cepas cariogénicas, dificultar su adhesión a los dientes, etc….

Para ello se ha procedido a lisar las muestras obtenidas de la cavidad bucal de individuos sanos, extraer el ADN de las mismas, construir fósmidos con dichos fragmentos y clonarlos en una célula huésped que se pueda cultivar y ensayar en cultivos de especies cariogénicas, para observar si se producen halos de inhibición de crecimiento de las especies cariogénicas patógenas.

Hay que hacer notar que, aunque las cepas aisladas se han obtenido a partir de muestras de la cavidad bucal y se muestran activas contra especies bacterianas patógenas productoras de caries (cariogénicas), debido a su capacidad inhibidora del crecimiento de bacterias patógenas que pueblan preferentemente la cavidad bucal, en principio, las cepas bacterianas podrían encontrarse en otras partes del organismo y producir o asociarse a otras enfermedades. Por ello, es objeto de la presente invención, el uso de las cepas como medicamentos, particularmente, como agentes antimicrobianos y, más específicamente, como anti-bacterianos.

Por lo tanto, en la presente invención se describe pues el aislamiento de cepas bacterianas cultivables con capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos implicados en la aparición de enfermedades de la cavidad bucal. A lo largo de la presente invención, se ha tomado como enfermedad representativa de las enfermedades típicas de la cavidad bucal, la aparición de caries, pero la invención se aplica a cualquier enfermedad infecciosa atribuible a microorganismos patógenos de la cavidad bucal. Por ello, la presente invención se centra, preferentemente, en el aislamiento de cepas bacterianas con capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos implicados, particularmente en la aparición de caries.

El procedimiento de aislamiento de cepas bacterianas cultivables con capacidad anticariogénica se basa en la obtención del metagenoma oral de individuos que nunca han padecido caries, para averiguar qué tipo de bacterias presentan dichos individuos, de forma más frecuente en su cavidad bucal y, analizar cuáles de ellas están asociadas a una buena salud oral, al inhibir el crecimiento de bacterias cariogénicas. Mediante dicho procedimiento se ha conseguido aislar, caracterizar, cultivar y depositar en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) diferentes cepas con actividad anticariogénica: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775. Mediante análisis de homología de secuencias, se concluyó que las cuatro cepas pertenecían al mismo género bacteriano: Streptococcus, compartiendo, por tanto, dichas cepas además de su funcionalidad (actividad anticariogénica) y su procedimiento de obtención, similitud estructural y taxonómica, al pertenecer, como hemos mencionado previamente, al mismo género bacteriano, Streptococcus.

Otro aspecto de la presente invención describe diferentes cepas bacterianas cultivables específicas, CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, aisladas de individuos con excelente salud oral y que nunca han sufrido caries, caracterizadas por presentar actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries. A partir del metagenoma de las bacterias existentes en la placa dental de individuos que nunca habían padecido caries, se identificaron, por homología con las librerías de ADN bacterianos existentes, los géneros y especies de bacterias que aparecían con más frecuencia en individuos sanos que nunca habían padecido caries. Las bacterias que aparecieron con más frecuencia en individuos sin caries y que aparecían ausentes o en muy baja frecuencia en individuos con caries pertenecían a alguno de los siguientes géneros: Rothia, Globicatella, Johnsonella, Kingella, Cardiobacterium, Phocoenobacter, Mannheimia, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus y Aggregatibacter; siendo el género Streptococcus de los más abundantes. En este sentido, las cepas bacterianas preferidas de la invención son las cepas CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, todas ellas pertenecientes al género Streptococcus.

La invención describe, asimismo, composiciones de aseo bucal, sólidas, pulverulentas (para su ingesta directa o disueltas) o pastosas, tipo dentífricos, chicles, caramelos, tabletas, etc… o soluciones líquidas de enjuague bucal, tales como colutorios, jarabes, bebidas, etc… o composiciones probióticas y/o prebióticas de alimentos que comprendan en su composición bien las cepas de la invención, con actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries. En una realización preferida de la invención, las cepas de la invención se añaden a composiciones que presentan actividad antimicrobiana para la flora de la cavidad bucal y que pueden encontrarse comercialmente, tipo colutorios como el Listerine®, mostrando dichos colutorios un efecto mejorado en su actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries, al añadirse en su composición las cepas y/o los péptidos de la invención.

imagen4

Una realización preferida de la invención lo constituyen probióticos/prebióticos o los alimentos funcionales, que comprenden en su composición las cepas y de la invención, con actividad inhibitoria frente a organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente frente a microorganismos productores de caries. Dentro del concepto de probiótico o de alimento funcional, se pueden citar, de forma no limitativa: productos lácteos, tales como yogures, por ejemplo, zumos, alimentos sólidos, tipo dulces, por ejemplo, así como infusiones, productos de herboristería y para-farmacia, tales como complejos vitamínicos, con suplementos nutricionales, etc….

A efectos de la presente invención se hacen constar los siguientes términos:

Enfermedad infecciosa de la cavidad bucal: a efectos de la presente invención las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal son preferentemente caries, periodontitis, gingivitis y halitosis.

Probióticos: a efectos de la presente invención el término probiótico se refiere a la utilización de microorganismos vivos que se adicionan a alimentos (leche, yogures, etc), suplementos dietéticos (en forma de cápsulas, tabletas, pastillas, polvo, etc) u otros, permaneciendo activos y ejerciendo sus efectos fisiológicos en el sujeto que ingiere el alimento o similar que contiene dicho probiótico. Ingeridos en cantidades suficientes tienen efectos beneficiosos, en este caso, sobre la salud bucal.

Prebióticos: a efectos de la presente invención el término prebiótico se refiere a la utilización de sustancias que se adicionan a alimentos, chicles, o suplementos dietéticos u otros, que ejercen un efecto en la composición de la microbiota oral favoreciendo el establecimiento de bacterias beneficiosas para la salud oral y/o desfavoreciendo el establecimiento de bacterias patógenas.

Metagenoma: representa los genomas de todas las bacterias que se encuentran presentes en una muestra, en un individuo o en un ecosistema, etc.

Microbioma: es el conjunto de microbios o bacterias que conviven con el ser humano.

Compuestos bioactivos antimicrobianos: son compuestos tales como péptidos, proteínas, antibióticos, pigmentos, etc… biológicamente activos que se encuentran en vertebrados e invertebrados y funcionan como antibióticos naturales, formando parte de la respuesta inmune innata. Algunos de estos compuestos, por ejemplo, péptidos, son producidos por el ser humano, como por ejemplo las defensinas y las catelicidinas, entre otros. Son activos contra bacterias, hongos y virus enclaustrados.

Bacteriocinas: son péptidos biológicamente activos secretados por bacterias que tienen propiedades bactericidas contra otras especies estrechamente relacionadas con la cepa productora, o contra cepas distanciadas filogenéticamente de la cepa productora.

Fósmidos: fragmentos de ADN circulares que pueden ser introducidos fácilmente en las células hospedadoras, generalmente bacterianas y transportar fragmentos de ADN bacteriano o humano.

Alimentos funcionales: se definen como aquellos alimentos que son elaborados no sólo por sus características nutricionales sino también para cumplir una función específica como puede ser el mejorar la salud y reducir el riesgo de contraer enfermedades. Para ello se les agregan componentes biológicamente activos, como minerales, vitaminas, ácidos grasos, bacterias con efecto beneficioso, fibra alimenticia o antioxidantes, etc.

Cepas bacterianas cultivables: se consideran cepas bacterianas cultivables aquellas que crecen en cultivo puro y se mantienen en crecimiento de forma estable, en un medio de cultivo artificial de laboratorio bajo condiciones estándar de aerobiosis o anaerobiosis.

Descripción de las figuras

Figura 1. A. Fotografía de una placa de cultivo petri donde se muestra el cribado inicial de los clones de E.coli que contienen los fósmidos procedentes de ADN de placa dental de individuos sin caries y que producen halos de inhibición sobre un cultivo en césped de S. mutans. B. Fotografía de una placa de cultivo petri dónde se muestra el cribado de confirmación de los clones de E.coli que contienen los fósmidos procedentes de ADN de placa dental de individuos sin caries y que habían producido halos de inhibición en un cultivo en césped de S. mutans.

Figura 2. Fotografías de placas petri que demuestran la inhibición del crecimiento de cultivos en césped de S. mutans en presencia de los aislados de las cepas CECT 7746 (A), CECT 7747 (B), CECT 7773 (C), y CECT 7775 (D) descritas en la invención.

Figura 3. Fotografías de placas petri que demuestran la inhibición del crecimiento de cultivos en césped de S. sobrinus en presencia de los aislados de las cepas CECT 7746 (A), CECT 7747 (B) y CECT 7775 (C) descritas en la invención.

Figura 4. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 veces y aislados en función de su peso molecular obtenidos de cultivos de las cepas CECT 7746 (A) y CECT 7747 (B) en fase estacionaria. Los datos, tomados cada 15 minutos durante 20 h, muestran la media de 4 experimentos. La línea marcada como antb representa el tratamiento con el antibiótico cloranfenicol (control positivo). En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

imagen5

Figura 5. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia de los sobrenadantes concentrados 10 veces y aislados en función de su peso molecular obtenidos de cultivos de la cepa CECT 7746 en fase estacionaria (est) y exponencial (EXP). Los datos, tomados cada 15 minutos durante 24 h, muestran la media de 4 experimentos. La línea marcada como clorf representa el tratamiento con el antibiótico cloranfenicol (control positivo). En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 6. Curvas de crecimiento de la bacteria cariogénica S. mutans en medio de cultivo HBI en presencia del sobrenadante concentrado 10 veces y menor de 3 KDa obtenido de cultivos de la cepa CECT 7746 (A) y CECT 7747 (B) y sometido a un tratamiento a 100ºC durante 10 minutos. Los datos, tomados cada 15 minutos durante 24 h, muestran la media de 4 experimentos. En el eje X de la gráfica se muestra el tiempo expresado en horas y en el eje Y la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos.

Figura 7. Fotografías de placas petri que demuestran la inhibición del crecimiento de cultivos en césped de S. mutans en presencia de los sobrenadantes de cultivos de las cepas CECT 7746 (mostrado como 46 en la fotografía) y CECT 7747 (mostrado como 47 en la fotografía) en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis.

Figura 8. Concentración de ácido láctico expresada en mM producida por el biofilm procedente del cultivo de saliva humana en un modelo de diente artificial en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, al que se ha añadido las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT 7747 o sus respectivos sobrenadantes. Para mayor detalle ver Ejemplo 15. Como control negativo se utilizó la cepa C7.1, que es un aislado perteneciente a las especies del grupo Streptococcus mitis/oralis/infantis, obtenido de un individuo sin caries pero que no produce inhibición del crecimiento de especies cariogénicas.

Descripción detallada de la invención

Un objeto de la presente invención lo constituye una cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775. En una realización preferida, las cepas bacterianas antimicrobianas descritas en la invención, presentan actividad inhibitoria del crecimiento de los organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente, de los organismos productores de caries. En una realización preferida, las cepas de la invención se caracterizan por que además de crecer de forma competitiva para ocupar el diente, son capaces de producir sustancias inhibidoras del crecimiento de las bacterias cariogénicas.

Otro objeto de la presente invención se refiere a las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usadas como medicamento

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, en la fabricación de un medicamento.

Otro objeto de la presente invención hace referencia a una cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usada como agente anti-microbiano, preferentemente como agente anti-bacteriano.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, en la fabricación de una composición anti-microbiana, preferentemente de una composición anti-bacteriana.

Otro objeto de la presente invención hace referencia a una cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usada en el tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente en el tratamiento de la caries.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para la elaboración de una composición destinada al tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, preferentemente para el tratamiento de la caries.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usadas como probiótico o alimento funcional destinado a mejorar la salud bucal, preferentemente a prevenir la caries.

imagen6

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de al menos una de las cepas bacterianas antimicrobianas cultivables seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para la elaboración de un probiótico, o de un alimento funcional destinado a mejorar la salud bucal, preferentemente a prevenir la caries. Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a una composición probiótica/prebiótica o alimento funcional que comprende al menos una cepa antimicrobiana cultivable según se ha mencionado a lo largo de la presente invención, así como las sustancias, compuestos o moléculas anti-cariogénicas secretadas por dichas cepas.

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a una composición médico-farmacéutica o composición para la salud bucal que comprende al menos una cepa antimicrobiana cultivable según se ha descrito a lo largo de la presente invención o las sustancias, compuestos o moléculas anti-cariogénicas secretadas por dichas cepas.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un procedimiento de aislamiento de cepas bacterianas antimicrobianas cultivables, preferentemente con actividad inhibitoria del crecimiento de los organismos productores de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal y más preferentemente, de los organismos productores de la caries, caracterizado por comprender:

a) Obtener muestras de la placa dental supragingival de individuos que nunca han padecido caries.

b) Sembrar las muestras en medios y condiciones adecuadas para crecer y aislar solo las bacterias que son más

frecuentes en individuos que nunca hayan padecido caries, estimando éstas mediante la pirosecuenciación del

metagenoma.

c) Cultivar las cepas aisladas en un medio de crecimiento para bacterias cariogénicas y seleccionar, al cabo de un

periodo de tiempo de cultivo apropiado, aquellas cepas que presenten halos de inhibición de dicho crecimiento.

En una realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que en la etapa b) las bacterias más frecuentes en individuos que nunca han padecido caries se estiman mediante procedimientos de pirosecuenciación del metagenoma, técnica que permite estimar las proporciones de cada especie bacteriana. En otra realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que en la etapa c) se seleccionan preferentemente bacterias pertenecientes a los géneros: Streptococcus, Rothia, Neisseria, Globicatella, Johnsonella, Haemophilus, Kingella, Cardiobacterium, Mannheimia, Phocoenobacter y Aggregatibacter. Específicamente se seleccionan las cepas: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775. Más específicamente se seleccionan bacterias pertenecientes al género Streptococcus, preferentemente pertenecientes a las especies: S. sanguis, S. oralis, S. mitis, S. infantis o especies nuevas no descritas pero pertenecientes al subgrupo de Streptococcus donde se engloban estas cuatro especies. Más específicamente se selecciona al menos una cepa bacteriana antimicrobiana de entre: CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 o CECT 7775.

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, preferentemente de la cavidad bucal y más preferentemente de la caries, que comprende la administración de una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos, preferentemente microorganismos cariogénicos, presentes habitualmente en dicha cavidad, de al menos una de las cepas antimicrobianas cultivables descritas en la presente invención; o de la composición probiótica/prebiótica o de los alimentos funcionales descritos en la presente invención que comprendan dichas cepas; o de la composición médicofarmacéutica o de la composición para la salud bucal descrita en la presente invención que comprendan dichas cepas.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, preferentemente de la cavidad bucal y más preferentemente de la caries, que comprende la administración de una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos presentes habitualmente en dicha cavidad, de al menos un compuesto antimicrobiano según se describe a lo largo de la presente invención; o de la composición probiótica/prebiótica o de los alimentos funcionales que comprenden al menos uno de los compuestos antimicrobianos descritos en la presente invención, o de la composición médico-farmacéutica o de la composición para la salud bucal que comprende al menos uno de los compuestos antimicrobianos descritos en la presente invención.

Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest

Los microorganismos utilizados en la presente invención fueron depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España), con nº de depósito:

 CECT 7746: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 7 de Junio de 2010.

 CECT 7747: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 7 de Junio de 2010.

 CECT 7773: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 22 de Julio de 2010.

 CECT 7774: cepa bacteriana del género Rothia depositada el 22 de Julio de 2010

 CECT 7775: cepa bacteriana del género Streptococcus depositada el 22 de Julio de 2010.

imagen7

Los ejemplos que se detallan a continuación tienen como objetivo ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1. Obtención del metagenoma de placa dental supragingival.

5 En primer lugar, se procedió a la toma de muestras de placa dental supragingival de voluntarios que nunca han padecido caries, así como, a efectos comparativos, también de las mismas muestras de voluntarios que habían padecido caries anteriormente y de voluntarios que padecen caries y que además presentan lesiones en dichas caries,después de firmar el consentimiento informado. El procedimiento de muestreo fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica de la Dirección General de la Salud Pública de la Generalitat Valenciana (GSP-CSISP). El estado

10 de salud bucal de cada voluntario fue evaluado por un dentista siguiendo las recomendaciones y la nomenclatura de los Estudios de Salud Bucal de la Organización Mundial de la Salud (OMS), y las muestras fueron tomadas con sondas estériles. Se pidió a los voluntarios que no se cepillaran los dientes 24 horas antes de la toma de muestras.

Para estudiar la diversidad microbiana en la placa dental y obtener su metagenoma, el material recogido de la placa de

15 las superficies de todos los dientes de cada individuo fue mezclado para posteriormente proceder a su lisis y obtener el ADN total de cada placa dental. El ADN se extrajo utilizando el MasterPure™ Complete ADN y ARN Purification Kit (Epicentre Biotechnologies), siguiendo las instrucciones del fabricante y añadiendo un tratamiento con lisozima (1 mg/ml a 37 ºC durante 30 minutos) durante la etapa de lisis. La concentración de ADN se midió con NanoDrop (Thermo Scientific) y las muestras elegidas deberán tener preferentemente una concentración de ADN por encima de los 300

20 ug/ml y una cantidad total de al menos 5 ug (debido al umbral de sensibilidad de los aparatos y procedimientos involucrados en la pirosecuenciación). Además, las muestras de ADN fueron corridas en un gel de agarosa con el fin de comprobar la integridad del ADN genómico extraído de las placas dentales de los voluntarios. Posteriormente se procedió a la pirosecuenciación de dicho ADN extraído mediante el secuenciador GS FLX-Titanium Chemistry (Roche). La pirosecuenciación consiste en la fragmentación del ADN en fragmentos de unos 500-800 nucleótidos mediante

25 nitrógeno a presión, añadiendo a los extremos unos adaptadores que permiten anclar el ADN a unas esferas de tamaño inferior a un micrómetro de diámetro. Las esferas se introducen en un aceite que funciona a modo de microreactor para realizar una PCR en emulsión (emPCR) donde se amplifica el ADN integrado en cada esfera.

Tras un enriquecimiento de las esferas que han amplificado el ADN, se pone la solución en unas placas de titanio en el

30 secuenciador GS FLX (Roche), donde tiene lugar la reacción de pirosecuenciación. Ésta consiste en la transformación de cada molécula de pirofosfato que la polimerasa libera al añadir un nucleótido en un haz de luz, mediante un juego de enzimas como la luciferasa. Este haz de luz es proporcional al número de nucleótidos añadidos y de esta forma una cámara de alta sensibilidad traduce los pulsos de luz en la secuencia de ADN correspondiente (19). La longitud promedio de dicho ADN fue de 425 pb. Las secuencias replicadas artefactualmente mediante la técnica de

35 pirosecuenciación 454 que aparecían de forma sistemática fueron eliminadas del conjunto de datos final a través del "454 Replicar Filter" (20), para que el número de lecturas de una secuencia determinada estuviera relacionada únicamente con su frecuencia en la muestra.

La cantidad de ADN humano en los metagenomas varió entre 0.5-40% en las muestras de placa dental supragingival 40 (Tabla 1) y fueron identificadas haciendo uso de la base de datos del genoma humano mediante Megablast (21) y eliminadas del conjunto de datos final.

Tabla 1. Características de las muestras orales pirosecuenciadas y su metagenoma.

Muestra1

Indice CAO2 Nº de lecturas % ADN humano Total Mbp Contigs >5kbp Contig más grande 16S reads 3 Simpson Index4 Shannon Index4 Chao1 Index4

NOCA_01P

0 347927 40.59 77.54 13 12856 543 0.93 3.19 100 ± 24.6

NOCA_03P

0 347927 22.76 100.13 49 43857 374 0.91 2.94 92 ± 28.4

CA1_01P

8 (1) 494659 2.23 203.71 657 46856 1160 0.94 3.21 120 ± 24.8

CA1_02P

6 (4) 315892 2.74 129.85 154 15919 575 0.92 3.11 85.2 ± 9

CA_04P

25 (15) 402049 11.54 142.37 181 19835 663 0.89 2.89 74.4 ± 9.9

CA_06P

11 (8) 354192 10.83 123.27 47 51033 615 0.95 3.38 129.2 ± 41

CA_06_1.6

11 (8) 305820 66.97 37.52 0 3376 194 0.92 3.21 77 ± 13.3

CA_05_4.6

10 (7) 291162 74.99 27.67 2 29784 130 0.88 2.82 55.3 ± 8.3

45 1 “P” indica muestras de placa dental suprangingival. Las muestras con código numérico indican el diente del cual se han extraído muestras de la cavidad de la caries.

imagen8

2 Número de piezas dentales con caries (C), ausentes (A) y obstruidas (O). El número entre paréntesis indica el número de caries expuestas del paciente. 3 Número de secuencias del rARN 16S detectadas en el metagenoma y asignadas mediante el clasificador RDP 4 Índices de diversidad de Simpson, Shannon, y Chao1, realizados a nivel de género.

5 A continuación, una media de 425 pbs permitió la asignación funcional en una fracción significativa del metagenoma (Tabla 2). Además, el ensamblaje de dichas lecturas produjo 1103 ensamblados [“contigs”] mayores de 5 Kpb y 354 mayores de 10 Kpb. Obtuvimos una media de 129.5 Mpb de secuencias filtradas de alta calidad (mayores de 100 pb y donde más del 90% de los nucleótidos tenían una exactitud del 99.99%: La probabilidad de que el nucleótido leído por el

10 pirosecuenciador sea correcto; es decir, un 99.99% de exactitud implica que sólo el 0.01% de los nucleótidos son incorrectos (errores de secuenciación) para cada una de las 6 muestras orales. En las dos muestras de lesiones de caries, entorno al 70% de las secuencias correspondían a ADN humano, obteniendo en este caso un promedio de 32.5 Mpb de lecturas filtradas de alta calidad.

15 Tabla 2. Asignación funcional de las muestras presentes en el metagenoma oral según diferentes sistemas de clasificación.

Muestra

Salud dental1 Total lecturas cdd (n)a cd (%) cog (n)b cog (%) Tfam (n) c Tfam (%) seed (n)d seed (%)

NOCA_01P

s 204218 126729 62 108929 53 82457 40 111497 50

NOCA_03P

s 244881 116575 48 95327 39 74356 30 93391 38

CA1_01P

c 464594 321997 69 280652 60 214050 46 271868 59

CA1_02P

c 295072 182091 62 150966 51 118716 40 146161 55

CA_04P

ca 339503 192003 57 161384 48 126281 37 158887 48

CA_06P

ca 306740 182349 59 151524 49 119477 39 146032 47

CA_05_4.6

cav 70503 40999 58 31864 45 26245 37 29625 42

CA_06_1.6

cav 97722 54305 56 45440 46 35395 36 44552 46

1 s: individuos sanos sin caries; c: individuos con caries en el pasado; ca: individuos con caries activas; cav: muestras de lesiones de caries.

20 (n): recuento absoluto (%): porcentaje total de lecturas en la muestra que fueron asignadas una funciónacdd : asignación a dominios conservados analizados en la base de datos del NCBI Conserved Domains bcog: asignación a conjuntos de grupos ortólogos cTfam: asignación a Tigr Fams

25 dseed : asignación a los subsistemas Seed / MG-RAST

Ejemplo 2. Construcción de la librería metagenómica de fósmidos de placa dental supragingival.

Con las muestras del ADN intacto extraído de la placa dental supragingival de los voluntarios sanos incluidos en el

30 estudio, y que no había sido utilizado para el proceso de pirosecuenciación, se procedió a la realización de la librería metagenómica de fósmidos (insertos que tienen una longitud preferentemente de 35-45 kb) de la placa dental de dichos voluntarios, utilizando para ello el kit EpiFOS™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre Biotechnologies) y de acuerdo a las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Brevemente, los fósmidos, en una alternativa preferida del procedimiento de construcción de la librería metagenómica de la invención, se insertan en un hospedador,

35 preferentemente Escherichia coli. La elaboración de la librería se realiza, como se ha comentado previamente, con el kit EpiFOS™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre) siguiendo las indicaciones del fabricante con algunas modificaciones, como son el aumento del tiempo de ligación (12 horas en un baño a 20ºC), el uso de ADN total para su inserción y no el ADN extraído del gel de campo pulsante, modificar ligeramente el procedimiento de extracción del ADN para que éste se rompa lo menos posible (uso de puntas de pipeta cortadas, evitar el vórtex, uso de membranas

40 Centricom (Millipore) para concentrar el ADN).

La inserción del ADN en el hospedador E. coli se realiza mediante el empaquetado de los fósmidos en partículas del fago lambda y su posterior infección en cepas Epi300T1R de E. coli. En el empaquetado se pone en contacto el producto de la ligación y los virus durante 3 horas a 30ºC en 1 ml de tampón para fagos. La infección se realiza a 37 ºC

45 durante 30 minutos, poniendo en contacto las partículas del virus con la cepa de E. coli. Se realiza una titulación previa para seleccionar la concentración óptima de colonias en una placa (que estén lo suficientemente separadas entre sí como para poder sembrar con ayuda de un palillo estéril una única colonia), plaqueando diferentes diluciones de la mezcla en medio LB-agar con cloranfenicol.

50 Posteriormente, se procede a inocular cada una de las colonias en una placa Elisa de 96 pocillos en medio LB líquido con cloranfenicol donde se dejarán crecer de nuevo antes de su almacenaje. Los clones se encuentran almacenados en placas tipo Elisa de 96 pocillos (Nunc) a una temperatura de –80ºC en glicerol al 19% para evitar la formación de cristales de hielo y mantener la integridad de las células. Los fósmidos se congelan sin inducir a copia múltiple para evitar procesos de recombinación entre los mismos.

imagen9

Los diferentes clones de E. coli con los diferentes insertos de fósmidos, se siembran puntualmente en cultivos de bacterias cariogénicas, tales como Streptococcus mutans o Streptococcus sobrinus. Se seleccionan aquellos clones que en dichos cultivos presenten un halo de inhibición alrededor del punto de siembra (Figura 1). Los clones obtenidos se identifican mediante homología de secuencias del ADN contenido en cada fósmido, frente a diferentes bases de datos públicas de secuencias disponibles. Para obtener la secuencia de ADN de cada fósmido se extrae el ADN total de los mismos separándolo del ADN del vector mediante kits midipreps de QIAGEN, procediendo a su pirosecuenciación directa. Así se obtienen los respectivos ORFs y, posteriormente, los péptidos codificados por los mismos.

Ejemplo 3. Análisis de la diversidad del Metagenoma oral humano.

Una vez obtenido el metagenoma de la placa dental supragingival de individuos con caries y de individuos sanos según el procedimiento descrito en la presente invención, se procedió a analizar la diversidad de dicho metagenoma oral utilizando tres técnicas diferentes:

Asignación taxonómica mediante el análisis del rARN 16S: las secuencias del ARNr 16S fueron extraídas de las lecturas (reads) obtenidas de cada metagenoma mediante búsquedas de similitud con BLASTN (26) contra la base de datos RDP (Ribosomal Database Project). Las secuencias que presentaban un tamaño menor a 200 pb fueron eliminadas. La asignación filogenética de las secuencias se realizó utilizando el Clasificador RDP (27) con un umbral de confianza del 80%.

Asignación taxonómica génica: la asignación taxonómica de todos los ORFs se llevó a cabo sobre la base del algoritmo del último ancestro común (lowest common ancestor, LCA) mediante las características descritas en el software MEGAN (28). Para obtener el LCA de cada secuencia se llevó a cabo búsquedas de homología utilizando la base de datos BLASTx contra otra base de datos personalizada que incluye secuencias no eucariotas de la base de datos NCBI no redundante (NR). Para cada secuencia leída, sólo aquellos resultados que mostraron una coincidencia de al menos un 90% fueron considerados para la obtención del LCA.

Asignación taxonómica de las lecturas (reads) (PhyMM): dicha asignación taxonomica se realiza mediante el uso de PhymmBL (29) que combina la asignación de secuencias tanto por homología como por la composición de nucleótidos utilizando para ello los modelos ocultos de Markov. Todos los genomas completos disponibles se obtuvieron de la base de datos Microbioma Oral Humano (HOMD) (30) así como del NCBI (RefSeq) que contienen todos los genomas de bacterias y arqueas (marzo, 2010), y se utilizaron para construir una base de datos local para realizar construcciones taxonómicas modelo y búsquedas de homología mediante PhymmBL. En este análisis sólo hicimos uso de secuencias de más de 200 pb para predecir la identificación taxonómica. Mediante dicha longitud de lectura, la exactitud de la búsqueda mediante PhymmBL, a nivel de clase, ha sido estimado en más del 75%. Todos los resultados taxonómicos y funcionales fueron analizados en una base de datos MySQL para su posterior análisis.

Los resultados obtenidos mediante la utilización de estos tres métodos muestran que un pequeño número de genes 16S en metagenomas secuenciados directamente son suficientes para describir los principales grupos taxonómicos presentes en el metagenoma oral, sin los sesgos asociados a las técnicas de clonación o de PCR.

De las muestras examinadas se pueden observar diferencias interesantes entre individuos sanos y enfermos. Los tres métodos mostraron una tendencia a que los grupos taxonómicos Bacilli y Gamma-proteobacteria fueran más comunes en individuos sanos, mientras que los taxones típicamente anaeróbicos como Clostridiales y Bacteroidetes son más frecuentes en muestras de enfermos. Las lecturas asignadas a Beta-proteobacterias (principalmente Neisseriales) y al phylum TM7 (todavía sin un nombre determinado y sin ningún miembro cultivado hasta la fecha) estaban en muy baja proporción en muestras de enfermos y pueden por tanto estar asociadas a condiciones de salud.

Análisis de correspondencia entre los metagenomas basados en la asignación taxonómica de las lecturas del rARN 16S mostraron que las muestras con mala salud oral tendían a agruparse, mientras que diferentes consorcios bacterianos pueden ser encontrados en individuos sanos. Mediante el presente estudio metagenómico, la invención demuestra que los géneros Streptococcus y Rothia, son géneros prevalentes en sujetos sin caries y más preferentemente el género Streptococcus. Por ello, a la hora de seleccionar en las muestras tomadas de la placa supragingival de individuos que nunca habían padecido caries, aquéllas que pudieran tener actividad anti-cariogénica, la selección se dirigió en la búsqueda (medios de cultivo, parámetros de cultivo, morfología al microscopio de las bacterias, morfología de las colonias, etc…) de especies pertenecientes a dichos géneros Streptococcus y Rothia, más preferentemente al género Streptococcus.

Una de las potentes aplicaciones de las aproximaciones de LCA y phymmBL es que la mayor parte de las lecturas con coincidencias significativas pueden asignarse a un origen taxonómico y también a una posible función. Relacionando la taxonomía y la función se ha podido predecir el papel, ecológico o metabólico, que puede desempeñar cada grupo bacteriano. Haciendo uso del sistema de clasificación funcional de COGs (Cluster of Orthologous Groups), se observa que las categorías no están igualmente distribuidas, y que ciertos grupos bacterianos están especialmente dotados para llevar a cabo determinadas funciones. Por ejemplo, una gran proporción de genes involucrados en mecanismos de defensa (p.ej. endonucleasas de restricción y bombas de expulsión de fármacos) están codificados por Bacilli, lo cual unido a la mayor presencia de Streptococci en personas sin caries, nos llevó a predecir que esas bacterias podían ser potenciales productores de inhibidores naturales de patógenos humanos en una posible estrategia de terapia de reemplazamiento para el tratamiento de las enfermedades infecciosas bucales.

imagen10

Ejemplo 4. Análisis de la riqueza y abundancia microbiana presente en el metagenoma oral humano

Estudios iniciales basados en técnicas tradicionales de cultivo y trabajos moleculares pioneros incluyendo amplificación y clonaje del gen 16S rARN predijeron una diversidad de alrededor de 500 especies diferentes en la cavidad oral (6). El uso de tecnologías de última generación (Next Generation Sequencing, NGS) dieron estimaciones de entre 4000 y 19000 unidades taxonómicas operativas (OTUs). Las OTUs son una estimación del número de especies en base a las secuencias de ADN, considerando que secuencias del gen 16S rARN con una similitud menor de un umbral determinado pertenecen a especies distintas. El umbral usado es el estándar para el gen 16S rARN, un 97% de identidad de secuencia; así, si la similitud es superior al 97% se considera de la misma especie, pero si es inferior al 97% es probable que sea una especie diferente. Lecturas de pirosecuenciación más largas (250 pbs) en tres sujetos sanos estimaron en torno a 600 OTUs por persona, y un reciente proyecto intentó secuenciar 11447 amplicones de casi la longitud completa de amplicones de 16S rARN por secuenciación de tipo Sanger (22), reduciendo las estimaciones por debajo de 300 OTUs en 10 individuos.

Aunque nuestras estimaciones de diversidad microbiana están más cerca de las obtenidas a partir de lecturas secuenciadas por Sanger (6,22), las lecturas de 16S rARN extraídas de nuestros datos metagenómicos identificaron 186 nuevos OTUs que no se habían detectado previamente por amplificación por PCR. Las curvas de rarefacción (la saturación en el número de especies según se incrementa el esfuerzo de muestreo) y diferentes índices de diversidad como se describe en la Tabla 1 (en concreto los índices de Shannon, Simpson, y Chao1) basados en 4254 lecturas de rARN, indicaron una estimación de 73-120 géneros para las muestras de placa dental (Tabla 1 y 2). No se observaron claras diferencias en cuanto a la diversidad encontrada entre las muestras de los voluntarios con distinto estado de salud, aunque las dos muestras procedentes de las lesiones de caries tendían a tener menos diversidad.

Una herramienta eficaz para cuantificar la presencia de especies seleccionadas en metagenomas es el reclutamiento de secuencias. Aquellas lecturas metagenómicas individuales que dan coincidencias por encima de un determinado umbral de identidad frente un genoma bacteriano de referencia, son “reclutadas” para trazar un gráfico que variará en densidad dependiendo de la abundancia de ese organismo en la muestra. Si la media de identidad nucleotídica mostrada está por encima de 94%, el reclutamiento probablemente haya sido realizado frente a lecturas de la misma especie (23).

Comparando nuestros metagenomas frente a los 1117 genomas disponibles hasta la fecha utilizando los algoritmos Nucmer y Promer v 3.06, hemos sido capaces de estimar la abundancia de estas especies en nuestras muestras. Curiosamente, las bacterias relacionadas con Aggregatibacter y Streptococcus sanguis estaban entre las más abundantes en gente sin caries, lo que concuerda con la mayor frecuencia de amplificación por PCR de estas especies de la cavidad oral de individuos sanos. El género Neisseria también era frecuente en muestras de individuos sanos. Además, los gráficos de reclutamiento indican que unos pocos taxones son normalmente dominantes en cada metagenoma, sugiriendo que aunque la diversidad bacteriana es grande en la cavidad oral, unos pocos taxones comprenden la mayor parte de las células bacterianas.

Ejemplo 5. Diversidad funcional en el ecosistema oral

Para analizar la diversidad funcional de los organismos que forman parte del ecosistema oral de los individuos analizados en la presente invención, todas las lecturas obtenidas de las secuencias de los metagenomas fueron comparadas frente a diferentes bases de datos: base de datos de dominios conservados (CDD) (24), sistema de anotación por subsistemas (SEED) y perfiles TigrFams (25).

El análisis de correspondencia (CoA) de las muestras en base a la asignación funcional de las lecturas dieron unos patrones de agrupamiento similares para los tres sistemas de clasificación funcional (CDD, SEED y TigrFams). Las muestras de personas enfermas (con caries) tendieron a agruparse juntas, indicando que un grupo similar de funciones estaban codificadas en sus metagenomas, y las muestras de individuos que nunca habían padecido caries, junto con uno de los individuos que presentaba un bajo número de las mismas, están agrupados aparte. Cuando se compara la asignación funcional de los metagenomas orales frente al microbioma intestinal de personas adultas (8) las muestras orales se agrupan conjuntamente, indicando que el intestino y la boca son dos ecosistemas diferentes en términos de frecuencias relativas de funciones codificadas. En la presente invención se demuestra que existen bloques de funciones sobre-representadas en el microbioma intestinal, mientras otras aparecen sobre-representadas en las muestras orales.

En las muestras orales, los individuos se agrupan en base a su estado de salud. Desde un punto de vista aplicado, esinteresante que muchas categorías funcionales estén sobre-representadas en muestras de individuos sin caries. Éstas incluyen genes de captura de ADN involucrados en competencia en las bacterias Gram-positivas, otros involucradas en el metabolismo de fosfolípidos, sistemas de fosfotransferasas inducibles por fructosa y manosa, el regulón estreptocócico mga, proteínas involucradas en la fermentación de ácidos mixtos, genes de quorum-sensing y péptidos antibacterianos tipo bacteriocinas. Dichos compuestos bioactivos, bacteriocinas, son potenciales agentes anticaries, y por tanto la presente invención demuestra que la placa dental de individuos que nunca han sufrido caries es un reservorio genético de nuevas sustancias antimicrobianas y potencialmente anti-cariogénicas.

imagen11

Ejemplo 6. Identificación de bacterias anticaries

La existencia de una pequeña proporción de la población humana adulta que nunca ha padecido de caries ha llevado a sugerir la presencia de especies bacterianas con un potencial efecto antagonista frente a bacterias cariogénicas (23). El reemplazamiento bacteriano de las cepas patógenas por aislados inocuos obtenidos de individuos sanos se ha mostrado satisfactoriamente como preventivo en infecciones de faringe y es la base de los probióticos para prevenir enfermedades infecciosas en el intestino y otros ecosistemas humanos (31). Reclutamientos metagenómicos de bacterias cariogénicas frente al microbioma oral de sujetos sanos muestra una total ausencia de S. mutans y S sobrinus. Curiosamente, la ausencia de detección de bacterias cariogénicas va acompañada por un intenso reclutamiento de otras especies de Streptococos (principalmente los similares a S. sanguis), Aggregatibacter y Neisserias, las cuales suponen los géneros más abundantes en estos individuos.

Dada la posibilidad de que aislados de estos géneros dominantes puedan estar involucrados en interacciones antagonistas con bacterias cariogénicas, muestras frescas de placa dental de 10 individuos sanos (incluyendo los 2 individuos sanos de los que se obtuvieron las secuencias metagenómicas) fueron tomadas y usadas para cultivar en condiciones óptimas para el crecimiento de especies de Neisseria, Rothia y Streptococcus (en concreto en medios de cultivos de agar sangre, agar chocolate, brucella agar y TSA, en condiciones de aerobiosis y en jarras de anaerobiosis). Después de un examen microscópico, se seleccionaron diplococos y estreptococos (para maximizar la posibilidad de encontrar especies de Streptococcus, Rothia y Neisseria), obteniéndose una colección de 249 aislados.

Aquellos que podían crecer en el mismo medio que S. mutans y S. sobrinus fueron transferidos a cultivos en césped en presencia de dichas bacterias cariogénicas. Este simple cribado identificó 16 cepas que mostraron halos de inhibición (Figuras 2 y 3). Mediante técnicas de PCR y secuenciación del rARN 16S se identificó a la mayoría de dichas cepas como pertenecientes a las especies de Streptococcus, con 96-99% de identidad de secuencia a las especies S. oralis,

S. mitis y S. sanguis o alguna especie relacionada y también a las especies de Rothia con un 100% de identidad de secuencia en el gen 16S con la especie R. mucilaginosa. De las cepas que mostraron halos de inhibición frente a S. mutans y/o S. sobrinus se ha realizado el depósito de las mismas en la CECT, asignándoseles los números CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775. Como se ha comentado previamente, las cepas CECT 7746, CECT 7747, CECT 7773 y CECT 7775, pertenecen al mismo género bacteriano Streptococcus, compartiendo, por tanto, además de su método de obtención, similitud estructural y taxonómica, al pertenecer al mismo género bacteriano.

Específicamente, dichas cepas, dentro del género bacteriano Streptococcus se asemejan, en base a la secuencia del gen ribosomal 16S, a las especies S. mitis (CECT 7746 y CECT 7775) y S. oralis (CECT 7747 y CECT 7779). La secuenciación del genoma completo de las cepas CECT 7746 y 7747 revela que se trata de especies nuevas del género Streptococcus (ver Ejemplo 12), que son cepas hermanas a pesar de provenir de individuos diferentes y además, se encuentran dentro del cluster de especies S. mitis/oralis/infantis. Los halos de inhibición de dichas cepas depositadas en la CECT sobre cultivos de especies cariogéniocas, S. mutans o S. sobrinus, se pueden observar en las Figuras 2 y 3, respectivamente.

Ejemplo 7. Caracterización de las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT 7747

La caracterización de las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT 7747 se llevó a cabo mediante diferentes técnicas. En primer lugar, se procedió a la obtención del genoma completo de estas dos cepas mediante pirosecuenciación tipo “shot-gun” (7,8) y “pair-ends”, esta última consistente en la rotura del ADN en fragmentos de unos 3000 nucleótidos y la secuenciación de aproximadamente 200 nucleótidos desde cada extremo, de tal manera que la distancia conocida entre estos dos extremos ayuda en el ensamblaje de las secuencias.

Para la obtención del genoma completo para cada una de las cepas CECT 7746 y CECT 7747, se partió de muestras recogidas de cada uno de los cultivos de dichas cepas, específicamente se utilizó un cuarto de placa de cultivo para los experimentos de pirosecuenciación mediante el pirosecuenciador GS-FLX de Roche (química Titanium) mediante el sistema "shot-gun” (7,8) y otro cuarto de placa de cultivo para los experimentos de pirosecuenciación mediante el sistema de “pair-ends”. La cantidad de secuencia obtenida para cada una de las cepas mediante ambos sistemas fue:

Cepa 7746

Tipo Shot-gun: 441.549 lecturas, con un total de 165.105.921 nucleótidos

Tipo Pair-ends: 187.530 lecturas, con un total de 32.721.622 nucleótidos

Cepa 7747

Tipo Shot-gun: 28.021 lecturas, con un total de 5.711.998 nucleótidos

Tipo Pair-ends: 305.826 lecturas, con un total de 51.501.510 nucleótidos El tamaño esperado de los genomas para cada una de las cepas era de unos 2.1 Mb.

imagen12

Para la cepa CECT 7746, el tamaño de los ensamblados mayores de 500 pb es de 2.122.087 pb. En el caso de la cepa CECT 7747, el tamaño de los contigs mayores de 500 pb es de 1.953.989 pb.

Las secuencias se filtraron y se ensamblaron mediante el software Newbler (Roche) adaptado por los inventores con parámetros standard, obteniendo un total de 109 ensamblados >500 pb para la cepa CECT 7746 y de 51 contigs para la cepa CECT 7747. A continuación, se procedió a la anotación automática de dichos genomas obteniéndose la secuencia completa del genoma de dichas cepas CECT 7746 y CECT 7747.

Una vez obtenido el genoma completo de las cepas CECT 7746 y CECT 7747, se procedió a la asignación taxonómica de dichos aislados en base a los árboles filogenéticos obtenidos en base a la secuencia completa de los genes 16S y 23S rRNA, que son los más extendidos a la hora de hacer árboles filogenéticos bacterianos.

Concatenando las secuencias de los genes 16S y 23S rRNA se obtuvo un sólo fragmento de más de 4.000 nucleótidos, que se alineó con el mismo fragmento de las especies de Streptococci secuenciadas hasta la fecha. Las secuencias se alinearon usando el software informático libre MAFFT, alineando por separado los genes del 16S y del 23S, y posteriormente se concatena el alineamiento. Después se depura el alineamiento usando el software informático libre GBlocks para seleccionar las posiciones informativas conservadas. El árbol se obtiene usando el programa RAxML, mediante el método de máxima verosimilitud, con 500 repeticiones. El árbol filogenético obtenido puso de manifiesto que ambas cepas son hermanas a pesar de provenir de individuos diferentes y además, se encuentran dentro del cluster de especies S. mitis/oralis/infantis, y la topología del árbol sugiere que se trata de cepas pertenecientes a una especie nueva no descrita.

Para determinar si dichas cepas pertenecen a especies diferentes se utilizó la técnica ANI (average nucleotide identity). Cuando se comparan los genomas de cepas secuenciadas, la similitud media a nivel de nucleótido entre los genes homólogos de la misma especie es superior al 95% (34, 35). De hecho, los taxónomos dan por bueno este valor de ANI del 95% como límite para separar aislados bacterianos pertenecientes a distintas especies y como alternativa al clásico umbral del 70% en el valor de hibridización DNA-DNA (36). Utilizando el software informático libre J-species para determinar los valores de ANI entre las dos cepas secuenciadas de la invención, CECT 7746 y CECT 7747, y el resto de Streptococci secuenciados, se comprobó que se trata de dos cepas pertenecientes a una especie nueva no descrita actualmente. En el caso de la cepa bacteriana de la invención CECT 7746 no existe ninguna cepa con una similitud por encima del umbral del 95% y en el caso de la cepa bacteriana de la invención CECT 7747, sólo otra cepa de las secuenciadas, el Streptococcus M143, supera dicho umbral. Dicha cepa M143 es una cepa que a pesar de tener un borrador de su genoma secuenciado no está descrita taxonómicamente como una especie. Los resultados para calcular el ANI se obtuvieron mediante dos metodologías diferentes: Mummer y Blast (36), mostrando ambas metodologías resultados casi idénticos.

Ejemplo 8. Ensayos de inhibición de bacterias cariogénicas, S. mutans, en presencia de los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas CECT 7746 y CECT 7747 descritas en la invención.

Se crecieron las dos cepas de la invención CECT 7746 y 7747 en medio de cultivo ICC a una temperatura de 37ºC. A continuación, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos en fase exponencial y en fase estacionaria, filtrándose por un filtro de 0.2 micras para eliminar cualquier resto bacteriano. Posteriormente, dichos sobrenadantes se volvieron a filtrar mediante centrifugación con membranas de un tamaño de poro de 100, 10 y 3 KDa (Amicon, Millipore), según se describe en los ejemplos previos que se muestran en la presente invención.

La fracción de los sobrenadantes obtenidos de cada una de las cepas CECT 7746 y 7747, recogidos en la fase estacionaria de crecimiento de las mismas y que produjeron inhibición del crecimiento de cultivos bacterianos de S. mutans, se concentró en la fracción de tamaño inferior a 3 KDa para ambas cepas testadas CECT 7746 (Figura 4 A) y CECT 7747 (Figura 4 B). Dichos resultados ponen de manifiesto que la sustancia inhibidora sintetizada por dichas cepas y que presenta efecto bactericida específico contra especies cariogénicas, debe tener un pequeño tamaño, preferentemente <3 KDa como en el caso de las bacteriocinas.

Por el contrario, cuando se llevó a cabo el mismo experimento pero con las muestras de los sobrenadantes de los cultivos de las cepas de la invención CECT 7746 y 7747 recogidos durante la fase exponencial del crecimiento de los mismos, no se observó inhibición del crecimiento de los cultivos bacterianos de S. mutans (Figura 5), indicando que el agente inhibidor sólo se produce en fase estacionaria del crecimiento bacteriano de las cepas de la invención.

Cuando las muestras del sobrenadante concentrado obtenidas en fase estacionaria y menor de 3 KDa se sometió a una temperatura de 100ºC durante 10 minutos, se comprobó que la actividad inhibidora de dicho sobrenadante sobre cultivos de S. mutans se mantuvo e incluso aumentó (Figura 6). Estos resultados son consistentes con que el agente inhibidor es una bacteriocina y no otro tipo de péptido, ya que las bacteriocinas de pequeño tamaño son extremadamente termoestables e incluso aumentan su efecto antimicrobiano al poderse eluir mejor en el medio tras disolverse sus agregados con el choque térmico.

A continuación, se realizaron ensayos de inhibición con los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención CECT 7746 y CECT 7747 frente a cultivos de S. mutans, pero alterando el orden de la siembra y la temperatura de crecimiento de los cultivos de dicha bacteria cariogénica, para comprobar si dichas modificaciones tenían algún efecto sobre la actividad inhibitoria de los sobrenadantes de las cepas de la invención. En primer lugar, se sembraron placas de cultivo con la bacteria cariogénica S. mutans y transcurridas 24 h, en la misma placa de cultivo, se sembraron las cepas de la invención. Transcurrido un tiempo no se observaron halos de inhibición. En cambio, cuando se sembraron placas de cultivo con ambas cepas a la vez, se observó inhibición en el crecimiento de S. mutans, tal como habíamos mostrado anteriormente. La mayor inhibición en el crecimiento de cultivos de S. mutans, se observó cuando se sembraron primero las cepas de la invención, CECT 7746 y 7747, y 24 h después se sembraron las cepas de S. mutans, indicando la existencia de una mayor concentración del agente o sustancia inhibidora antes del crecimiento de la bacteria cariogénica, y que, además, la presencia de dicha bacteria no es necesaria para activar la producción del agente inhibidor por parte de las cepas de la invención.

imagen13

A continuación, se realizaron experimentos de inhibición del crecimiento de bacterias cariogénicas en medio sólido sembrando primero las cepas de la invención mediante una gota del cultivo en medio líquido en fase estacionaria, seguido de un cultivo en tapiz de S. mutans a diferentes temperaturas: 30ºC, 33ºC, y 36ºC. No se observó inhibición del crecimiento de S. mutans a la temperatura de 30ºC, pero sí a 33ºC, siendo de hecho superior a la obtenida a 36ºC.

Ejemplo 9. Ensayos de inhibición de bacterias cariogénicas, S. mutans, cultivadas en presencia de los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención CECT 7746 y CECT 7747, en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis.

Para determinar si la acción inhibitoria del crecimiento de bacterias cariogénicas mediante las cepas de la invención se veía modificada por un ambiente aerobio o anaerobio, se realizaron experimentos de inhibición en medio sólido ICC sembrando primero las cepas de la invención mediante una gota del cultivo en medio líquido en fase estacionaria en una jarra de anaerobiosis durante 12 h, seguido de un cultivo en tapiz de S. mutans a 37ºC, o seguido de un sembrado con una gota de cultivo de S. mutans a 37ºC.

Los resultados de ambos experimentos pusieron de manifiesto que la inhibición del crecimiento de S. mutans, es mucho menor en condiciones anaerobias, especialmente para la cepa CECT 7746 (Figura 7). Por tanto, los resultados demuestran que, para las cepas de la invención, la inhibición ejercida sobre las bacterias cariogénicas, es más efectiva durante la etapa aerobia de la formación de la placa dental, es decir, en el período de adhesión y formación inicial de la biopelícula o biofilm sobre el diente.

Ejemplo 10. Efecto anticariogénico de las cepas bacterianas CECT 7746 y CECT 7747 y sus sobrenadantes sobre biofilm en un modelo de diente artificial.

Para poner de manifiesto el efecto anticariogénico de las cepas bacterianas descritas en la presente invención, se realizaron ensayos de inhibición de producción de ácido con las cepas CECT 7746 y CECT 7747, sobre biofilm en un modelo de diente artificial. Dichos experimentos se realizaron en el Active Attachment biofilm model del Academic Center for Dentistry Amsterdam (ACTA, Amsterdam). Dicho modelo de biofilm fue descrito por Exterkate RA et al (37). Brevemente, discos de hidroxiapatita o vidrio se inoculan con saliva humana de un voluntario con un porcentaje elevado de S. mutans (superior al 4%), con o sin presencia de la cepa probiótica, o de su sobrenadante. Para los presentes ensayos se testaron las cepas CECT 7746 y 7747 descritas en la presente invención, así como la cepa C7.1, que es un aislado perteneciente a las especies del grupo Streptococcus mitis/oralis/infantis, obtenido de un individuo sin caries pero que no produce inhibición del crecimiento de especies cariogénicas y que por tanto sirve como control negativo.

La saliva humana está almacenada a -80 ºC. Las cepas probióticas CECT 7746 y 7747 y la cepa control C7.1, se crecen 12 horas en medio de cultivo HBI con sacarosa, hasta obtener una densidad de cultivo de aproximadamente 4 x 108 ufc (Unidades Formadoras de Colonias). A continuación, se mezcla la muestra de saliva al 50% con el inóculo de las cepas probióticas de la invención (CECT 7746 o 7747) o con el inóculo de la cepa control (C7.1) y se aplican sobre el disco de vidrio.

Los biofilms se forman durante 48 horas en medio de saliva artificial modificada (38) en aerobiosis y anaerobiosis, y una vez formados se incuban durante 3 horas a una temperatura de 37 ºC en agua peptonada con cisteína (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU) que contiene glucosa al 0.2% para poder medir la producción de ácido. Durante este período de incubación, las cepas producirán ácido, que es medido mediante una reacción colorimétrica: Dicho biofilm se transfiere a un tubo eppendorf y se incuba a una temperatura de 80 ºC durante 5 min para parar el metabolismo bacteriano. La cantidad de ácido L-láctico se determina enzimáticamente usando un ensayo colorimétrico con el espectrofotómetro Spectra Max M2 (Molecular Devices, USA), siguiendo el protocolo descrito por Pham LC et al. (38).

Para analizar la inhibición en la producción de ácido de los sobrenadantes, tanto de las cepas de la invención (CECT 7746 y 7747) como de la cepa control (C7.1), en primer lugar, se procedió a la obtención de los sobrenadantes de los cultivos de dichas cepas bacterianas. Para ello se crecieron cultivos de dichas cepas en medio ICC durante 12 horas. A continuación, se eliminaron las células bacterianas por centrifugado y posterior filtrado mediante poros de un tamaño de

0.2 micras. El medio se filtra por membranas Amicon Ultra (Millipore) de 100, 10 y 3 kDa. La fracción menor de 3 kDa se concentra a la mitad de su volumen en un rotavapor y se mezcla al 50% con la muestra de saliva, procediendo, al igual que en el caso de los probióticos, a formar el biofilm durante 48 horas y a una incubación de 3 horas en medio de cultivo

imagen14

de agua de peptona tamponada (Buffered Peptone Water) (38) que contiene glucosa al 0.2%, para así poder medir la producción de ácido. Cada tratamiento se repite por cuadruplicado en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis. Los grupos experimentales analizados han sido:

1.

Biofilms formado con inóculo de saliva.

2.

Biofilms formado con inóculo de saliva + CECT 7746.

3.

Biofilms formado con la cepa CECT 7746.

4.

Biofilms formado con inóculo de saliva + CECT 7747.

5.

Biofilms formado con la cepa CECT 7747.

6.

Biofilms formado con inóculo de saliva + cepa de Streptococcus no inhibidora (cepa C7.1).

7.

Biofilms formado con inóculo de saliva + sobrenadante de la cepa CECT 7746 conteniendo la sustancia activa inhibidora.

8.

Biofilms formado con inóculo de saliva + sobrenadante de la cepa CECT 7747 conteniendo la sustancia activa inhibidora.

9.

Biofilms formado con inóculo de saliva + sobrenadante de la cepa no inhibidora (cepa C7.1).

10.

Biofilms formado con la cepa Streptococcus no inhibidora (cepa C7.1).

Los resultados se muestran en la Figura 8, e indican que el biofilm monoespecífico formado únicamente por las cepas CECT 7746 (grupo experimental 3) ó CECT 7747 (grupo experimental 5) producen una cantidad de ácido significativamente inferior al de la saliva (grupo experimental 1). Tomando la saliva humana como valor de referencia (grupo experimental 1), los sobrenadantes de la cepa CECT 7747 (grupo experimental 8) redujeron significativamente la producción de ácido, tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, mientras que el sobrenadante de la cepa CECT 7746 (grupo experimental 7) redujo la cantidad de ácido producido por el biofilm únicamente en condiciones de anaerobiosis. La adición de la cepa CECT 7747 al biofilm redujo la producción de ácido tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, mientras que la adición de la cepa CECT 7746 al biofilm sólo produjo una reducción en aerobiosis.

La reducción de ácido, sobre todo en el caso de la cepa y los sobrenadantes de la cepa CECT 7747, es muy relevante para el tratamiento y prevención de la caries dental, ya que ésta se forma por la producción de ácido por parte de los microorganismos cuando éstos fermentan los azúcares ingeridos en la dieta. Es precisamente el pH ácido el que desmineraliza el esmalte y produce la caries, y por tanto cualquier especie acidogénica, no sólo los Streptococcus del grupo mutans, podrían ser potencialmente cariogénicos (2). La reducción en la producción de ácido es por tanto un indicador de que el efecto global del tratamiento con la cepa probiótica o su sobrenadante es la reducción de ácido y por tanto una menor probabilidad de desarrollo de caries.

BIBLIOGRAFIA

1.

P. D. Marsh, Dental Clinics of North America 54, 441 (2010).

2.

P. Marsh, BMC Oral Health 6, S14 (2006).

3.

P. E. Petersen, Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 39, 441 (Nov, 2004).

4.

S. S. Socransky, A. D. et al. J Clin Periodontol 25, 134 (Feb, 1998).

5.

R. P. Darveau, Nat Rev Microbiol 8, 481 (Jun 1, 2010).

6.

B. J. Paster et al., J Bacteriol 183, 3770 (Jun, 2001).

7.

S. R. Gill et al., Science 312, 1355 (Jun 2, 2006).

8.

K. Kurokawa et al., DNA Res 14, 169 (Aug 31, 2007).

9.

P. A. Vaishampayan et al., Genome Biol Evol 2010, 53 (2010).

10.

J. Qin et al., Nature 464, 59 (Mar 4, 2010).

11.

J. A. Aas, et al. J Clin Microbiol 43, 5721 (Nov, 2005).

12.

E. A. Grice et al., Genome Res 18, 1043 (Jul, 2008).

13.

W. J. Loesche, Microbiol Rev 50, 353 (Dec, 1986).

14.

M. W. Russell, et al. Caries Res 38, 230 (May-Jun, 2004).

15.

WO 2007/077210 "Probiotic oral health promoting product".

16.

WO 2005/018342 "Compositions and methods for the maintenance of oral health"

17.

EP 0195672 "Dental caries preventive preparations and methods for preparing said preparations"

18.

WO 2004/072093 "Antimicrobial agents" 19.- Margulies M, et al.Nature. 15;437(7057) (2005).

20.

Gomez-Alvarez V, et al. ISME J.;3(11). (Nov 2009).

21.

Zheng Zhang, et al. J Comput Biol. 7(1-2) (2000).

22.

E. M. Bik et al., Isme J (Mar 25, 2010).

23.

K. T. Konstantinidis, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 2567 (Feb 15, 2005).

24.

Marchler-Bauer A, et al. Nucleic Acids Res. 37:D205-10 (Jan 2009).

25.

Selengut JD, et al. Nucleic Acids Res. 35:D260-4 (Jan 2007).

26.

Altschul et al. J Mol Bio. 215 (3):403-10 (Oct 5, 1990)

27.

Cole JR. et al. Nucleic Acid Res. 37:D141-5 (Jan 2009)

28.

Huson DH. et al. Genome Res. 17 (3):377-86 (Mar 2007)

29.

Brady A and Salzberg SL. Nature Methods. 6 (9):673-6 (Sep 2006)

30.

Chen T et al. Database (Oxford) 6 (Julio 2010)

31.

J. R. Tagg. et al. Trends Biotechnol 21, 217 (Mayo, 2003).

32.

R. B. Merrifield (1963). J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149:2154.

33.

Albericio, F. (2000). Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). CRC Press. pp. 848. ISBN 0824703596.

34.

Konstantinidis KT, Tiedje JM. J Bacteriol. 2005 Sep;187(18):6258-64.

imagen15

5 35. Goris J, et al., Int J Syst Evol Microbiol. 2007 Jan;57(Pt 1):81-91.

36.

Richter M, Rosselló-Móra R. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Nov 10;106(45):19126-31.

37.

Exterkate RA, et al. Res. 2010;44(4):372-9.

38.

Pham LC, et al.Arch Oral Biol. 2011 Feb;56(2):136-47.

10

Claims (11)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.

   Cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7747, CECT 7746, CECT 7773, y CECT 7775.

2. 2.

   Cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7747, CECT 7746, CECT 7773 y CECT 7775 o una combinación de las mismas para ser usada como medicamento.

3. 3.

   Cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7747, CECT 7746, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usada como agente antimicrobiano.

4. 4.

   Cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7747, CECT 7746, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usada en la prevención y/o tratamiento de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.

5. 5.

   Cepa bacteriana antimicrobiana cultivable seleccionada entre cualquiera de las siguientes: CECT 7747, CECT 7746, CECT 7773 y CECT 7775, o una combinación de las mismas, para ser usada como probiótico o alimento funcional para mejorar la salud bucal.

6. 6.

   Composición probiótica/prebiótica o alimento funcional que comprende al menos una cepa antimicrobiana según la reivindicación 1.

7. 7.

   Composición médico-farmacéutica que comprende al menos una cepa anti-microbiana según la reivindicación

   1.

8. 8.

   Composición de salud bucal que comprende al menos una cepa anti-microbiana según la reivindicación 1.

9. 9.

   Composición probiótica/prebiótica o alimento funcional según la reivindicación 6 para uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.

10. 10.

    Composición médico-farmacéutica según la reivindicación 7 para uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.

11. 11.

    Composición de salud bucal según la reivindicación 8 para la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.

    155