CN105007911A

CN105007911A - 益生精氨酸分解口服组合物以及制备和使用益生精氨酸分解口服组合物的方法

Info

Publication number: CN105007911A
Application number: CN201480008761.XA
Authority: CN
Inventors: 玛塞尔·马托斯·纳西门托·法格伯格; 罗伯特·A·伯恩
Original assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 2013-02-14
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2015-10-28
Also published as: JP2016509025A; US20150366792A1; WO2014127066A1; HK1214146A1; US9655839B2; EP2956130A4; EP2956130A1

Abstract

本公开内容提供了益生精氨酸分解(arginolytic)口服组合物，制备益生精氨酸分解口服组合物的方法，以及使用益生精氨酸分解口服组合物以增加口腔中的精氨酸分解活性和/或治疗和/或预防龋齿的方法。

Description

益生精氨酸分解口服组合物以及制备和使用益生精氨酸分解口服组合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年2月14日提交、题为“Probiotic Oral Compositionsand Methods of Using Probiotic Oral Compositions”、具有系列号61/764,579的美国临时申请的优先权，其通过引用整体并入本文。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本发明用由美国国立口腔与颅面研究所(National Institute of Dentaland Craniofacial Research)授予的合约号DE10362在政府支持下进行。政府具有该发明中的某些权利。

序列表

本申请包括序列表，其已随本申请经由EFS-Web提交。序列表文件被命名为01974537.txt，大小为794字节，并且通过引用以其全部并入本文。

背景

口腔龋齿是世界范围内影响人类的最普遍的传染性和慢性疾病，并且与昂贵的治疗有关。口腔健康向口腔龋齿的转换以口腔生物膜的复合微生物群落的组成和代谢的变化为特征。通常称为牙菌斑的口腔生物膜不断地在所有的牙齿表面上形成并生长。尽管口腔生物膜中的细菌生成酸是口腔龋齿的直接原因，但是值得注意的是耐酸生物的比例增加表现为发生，以较少酸耐性的(即较不“耐酸的”)物种为代价。特别注意的是，较不耐酸生物的子集通过碱生成得到保护免受菌斑酸化的影响，所述碱生成显示出与口腔健康正相关。

口腔细菌的碱生成的主要路径之一是精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)，通过精氨酸脱亚胺酶系统精氨酸被分解代谢成鸟氨酸、氨和CO₂，伴随着ATP生成。因此，在细菌中ADS发挥着关键的生理功能，对生长和维护提供保护免受低pH和ATP的有害影响。口腔生物膜中的ADS活性能通过经由氨生成缓和pH来影响口腔微生物群落的生态。

定殖于牙齿和口腔软组织并形成口腔生物膜的多种细菌表达ADS。口腔龋齿增加的风险已与口腔生物膜经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)从精氨酸生成碱的降低的能力有关。特别地，来自无龋齿的受试者的菌斑细菌当与来自龋齿活跃的受试者的菌斑细菌相比展示较高的ADS活性水平。而且，在个体间在碱生成速率方面存在高度变异性，在一些情况中大于1000倍。对受试者间ADS活性差异的微生物基础的更好的理解以及为了改进口腔健康提高ADS活性会是有益的。

概述

简单地描述，本公开内容的实施方案提供了益生(probiotic)精氨酸分解(arginolytic)口服组合物，制备益生精氨酸分解口服组合物的方法，以及使用益生精氨酸分解口服组合物以增加口腔中的精氨酸分解活性和/或以治疗和/或预防龋齿的方法。

本公开内容的精氨酸分解益生口服组合物的实施方案包括分离的细菌菌株的混合物和药学上可接受的口服载体。在实施方案中，混合物包括至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，每种菌株能够经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨并且每种菌株满足以下标准中的至少一个：在环境精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株对生长的抑制，其中细菌菌株的混合物满足标准的至少两个。

制备用于口服使用的精氨酸分解细菌菌株的混合物的方法的实施方案包括至少以下步骤：(a)获得从口腔样品分离的细菌菌株的混合物；(b)分离并鉴定能经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨的精氨酸分解细菌菌株；(c)进行一种或更多种单独的测定以鉴定能够在以下测定条件中的至少一个下表达ADS活性的精氨酸分解细菌菌株：在环境精氨酸不存在下，在葡萄糖的存在下，在非酸性pH下，在有氧条件下，以及在与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的存在下；(d)选择至少两种不同的分离的在步骤(c)中鉴定的精氨酸分解细菌菌株以制备精氨酸分解细菌的混合物，其中混合物在所述条件中的至少两个下表达ADS活性。

在实施方案中，本公开内容提供了预防或减少宿主的口腔龋齿的发生的方法以及减缓或阻止宿主中的口腔龋齿损伤的进展的方法。方法包括向宿主施用包含分离的细菌菌株的混合物和药学上可接受的口服载体的益生口服组合物，其中混合物包括至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，每种菌株能经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨并且每种菌株满足以下标准中的至少一个：在环境精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株对生长的抑制，其中细菌菌株的混合物满足标准的至少两个。

本公开内容还提供了增加生成氨的细菌在宿主的口腔中的量的方法的实施方案，方法包括向宿主施用包含分离的细菌菌株的混合物和药学上可接受的口服载体的益生口服组合物，其中混合物包括至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，每种菌株能经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨并且每种菌株满足以下标准中的至少一个：在环境精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株对生长的抑制，其中细菌菌株的混合物满足标准的至少两个。

本公开内容的其他方法、组合物、植物(plants)、特征和优势对于本领域技术人员在检查以下附图和详细描述之后将会清楚或变的清楚。意图所有此类另外的组合物、方法、特征和优势包括于该说明书中，并且在本公开内容的范围内。

附图简述

回顾以下描述的本公开内容的多种实施方案的详细描述连同附图后，本公开内容的另外的方面将更容易地被理解。

图1示出了从牙菌斑筛选ADS阳性细菌菌株的数字图像。当奈斯勒(Nessler′s)试剂检测生成的氨时，ADS阳性表型通过黄-橙色显示。

图2A-2D表示了一系列条形图，所述条形图示出了戈登链球菌(S.gordonii)DL1和ADS阳性分离株在不同环境条件下的ADS活性水平。图示出了响应不同糖(图2A)、不同pH(图2B)、精氨酸的存在或不存在(图2C)、和有氧(w/O₂)或厌氧(w/o O₂)条件(图2D)的ADS活性。结果表示三个独立实验的平均和标准偏差(误差线)。

图3A-3D为一系列条形图，所述条形图示出了在不同的环境条件：不同的糖(图3A)、不同的pH(图3B)、精氨酸的存在或不存在(图2C)、和有氧与厌氧条件(图3D)下生长的来自龋齿活跃的和无龋齿的受试者的精氨酸分解分离株的ADS活性水平的比较。结果表示三个独立实验的平均和标准偏差(误差线)。

图4A-4D为一系列条形图，所述条形图示出了显示戈登链球菌DL1(图4A)和ADS阳性分离株戈登链球菌A8(图4B)、澳大利亚链球菌(S.australis)A12(图4C)和血链球菌(S.sanguinis)A33(图4D)对生长的变形链球菌(S.mutans)UA159的抑制效应的测定。

描述

在更详细的描述本公开内容之前，要理解该公开内容并不局限于描述的特定实施方案，并且当然像这样可变化。还理解的是，本文使用的术语仅为了描述特定的实施方案的目的并且不被意图是限制性的。

在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一，除非上下文另外清楚地规定，和在该陈述的范围中的任何其他陈述的或中间的值包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可独立地包括于所述较小的范围，并且还包括于本公开内容内，隶属于陈述的范围的任何特定的排除性限制。在陈述的范围包括上限和下限之一或两者的情况下，排除这些包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容属于的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可以使用与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。

通过引用并入的在该说明书中提及的任何出版物和专利通过引用并入本文以公开并且描述出版物关于其被提及的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了其在提交日之前的公开内容，并且不应被理解为承认本发明由于之前的公开内容而无权先于此类出版物。另外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确认。

如本领域技术人员阅读该公开内容之后将清楚的，本文描述并例证的个体实施方案中的每个具有离散的组成部分和特征，其可容易地与其它若干实施方案中的任一个的特征分开或组合而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所提及的方法可以以事件提及的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。

除非另有指示，本公开内容的实施方案将使用医学、牙科学、生物学、微生物学、统计学、生物化学、分子生物学、药物学等的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被充分地解释。

必须注意，如在说明书和所附的实施方案中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代对象，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如关于“细胞(a cell)”包括多个细胞。在该说明书中以及在之后的实施方案中，将涉及许多术语，其将被定义为具有以下含义，除非相反的意向是明显的。

在描述多个实施方案之前，提供了以下定义并且应该被使用，除非另有指示。

定义

在描述公开的主题时，以下术语将根据以下陈述的定义被使用。

如本文使用的术语“核酸”指任何核苷酸和核苷的任何天然的和合成的线性和连续排列，例如cDNA、基因组DNA、mRNA、tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。为了便于讨论，本文中此类核酸可共同地被称为“构建体”、“质粒”、或“载体”。本公开内容的核酸的代表性实例包括细菌质粒载体，所述细菌质粒载体包括表达载体、克隆载体、粘粒载体和转化载体，诸如但不限于pBR322；动物病毒载体，诸如但不限于修饰的腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒、昆虫病毒(杆状病毒)等；源自噬菌体核酸的载体；以及合成的寡核苷酸，如化学合成的DNA或RNA。术语“核酸”还包括修饰的或衍生的核苷酸和核苷，诸如但不限于卤代核苷酸，所述卤代核苷酸诸如但不只是5-溴尿嘧啶，以及衍生的核苷酸，诸如生物素标记的核苷酸。

术语“分离的核酸”指具有(a)与任何天然存在的核酸不同或(b)与横跨多于三个单独的基因的天然存在的基因组核酸的任何片段不同的结构的核酸，并且包括DNA、RNA或其衍生物或变体。该术语涵盖例如但不局限于(a)这样的DNA:具有天然存在的基因组分子的部分的序列但是两侧无基因组分子在其中天然地存在的物种的基因组中的分子的该部分两侧的编码序列中的至少一个；(b)以一种方式掺入载体或掺入原核生物或真核生物的基因组核酸的核酸，以使得得到的分子不同于任何载体或天然存在的基因组DNA；(c)单独的分子，诸如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)或化学合成生成的片段、或限制性片段；(d)重组核苷酸序列，即杂合基因的部分，例如编码融合蛋白的基因，以及(e)重组核苷酸序列，即非天然存在的杂合序列的部分。本公开内容的分离的核酸分子可包括例如天然等位基因变体以及通过核苷酸缺失、插入、倒位或取代修饰的核酸分子。

对一些目的有利的是核苷酸序列为纯化的形式。关于核酸的术语“纯化的”表示序列具有相对于天然的环境增加的纯度。

本文中术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸序列”可互换地使用，并且包括但不限于编码序列(在置于适当的调控或控制序列的控制下时体外或体内转录并翻译成多肽的多核苷酸或核酸序列)；控制序列(例如翻译起始和终止密码子、启动子序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录因子结合位点、转录终止序列、上游和下游调控结构域、增强子、沉默子等)；和调控序列(转录因子结合至其并正向地(诱导)或负向地(抑制)改变基因的启动子的活性的DNA序列)。本文描述的术语没有暗示对长度或合成起点的限制。

如本文使用的术语“多肽”和“蛋白”指通过肽键连接的连续排列的三个或更多个氨基酸的氨基酸的聚合物。术语“多肽”包括蛋白、蛋白片段、蛋白类似物、寡肽等。术语“多肽”涵盖如以上定义的多肽，其由核酸编码，通过重组技术(从适当来源诸如鸟分离)生成或为合成的。术语“多肽”还涵盖如以上定义的多肽，其包含化学修饰的氨基酸或共价地或非共价地连接至标签配体的氨基酸。

如本文使用的术语“片段”指核酸(例如，cDNA)，所述核酸指人工(例如，通过化学合成)构建的主题核酸，或通过使用限制性内切核酸酶或机械剪切切割天然产物为多片的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域熟知的任何其他聚合技术合成，或通过本领域技术人员熟知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸的部分。如本文使用的术语“片段”还可指多肽的分离的部分，其中所述多肽的部分从天然存在的多肽由至少一种蛋白酶通过溶蛋白性裂解而切割，或是由本领域技术人员熟知的化学方法合成的天然存在的多肽的部分。

如本文使用的术语“基因(gene)”或“基因(genes)”指编码用于合成整个RNA、整个蛋白、或这样的整个RNA或整个蛋白的任何部分的遗传信息的核酸序列(包括RNA或DNA两者)。不是特定生物体的基因组的天然部分的基因称为“外来基因”、“异源基因”或“外源基因”，且是特定生物体的基因组的天然部分的基因称为“内源基因”。术语“基因产物”指由该基因编码的RNA或蛋白。“外来基因产物”是由“外来基因”编码的RNA或蛋白，且“内源基因产物”是由内源基因编码的RNA或蛋白。“异源基因产物”是通过“外来、异源或外源基因”编码的RNA或蛋白，并因此，不在细胞中天然地表达。

如本文使用的术语“微生物组”指微生物在宿主生物体内的生存环境。如本文使用，“微生物组”通常指微生物(例如，细菌)生活在宿主生物体内，诸如在宿主生物体的口腔内的群落。术语“微生物群落”同样指生活在微生物组内的集体生物体，这些术语可在本公开内容中互换使用。术语天然微生物组还指未通过(或在改变之前)施用意图改变天然细菌群落的组成的药物(例如抗生素或益生菌)或程序改变的宿主的细菌群落。宿主的天然细菌群落可由于各种天然和合成的原因(例如，疾病、饮食习惯的改变、药物、医疗程序，等)随着时间的推移发生变化。

如本文使用的术语“分类范畴”或“分类类别”或“类别”指将生物体分类为科学确定的分类范畴，其中它们已被分配(例如，界、门、纲、目、科、属、种、品系)，或在先前未经确认的生物体的情况下，它们将可能基于遗传学或特征的相似性根据确定的科学程序分配的分类。“分类范畴”可以是广泛的范畴(例如，门、纲)或更窄的类别(例如，属、种)，且分类的行为可涉及多个生物体或仅一个。“类别”还可涉及将个体基于相似特征分组为范畴的行为，但通常，在本公开内容中“分类”指分类类别，除非上下文另有指示。

如本文使用的“品系”是指在物种水平内的分类学亚分组，其中品系是在物种内的遗传变异体或亚型。在本公开内容中，“品系”可指具有与已知物种紧密序列同一性(例如，约95％序列同一性，约99％序列同一性等)，但可在一个或更多个特性方面不同，诸如，但不限于，某些环境条件中的ADS活性水平的临床分离株。

“分离的细菌菌株”或“细菌分离株”指已由从天然、异质环境(例如，宿主口腔)或微生物群体分离的细菌生物体生成并通过已知微生物学技术从它的起源环境中的其他微生物群落分开的细菌菌株或培养物。然后分离的菌株可生长在培养基中。分离的细菌菌株或分离的细菌菌株的培养物不一定不含所有可能的杂质，但它是细菌分离株的基本上同质的培养物，并且可以从微生物的天然存在的、异质组区分开。

如本文使用，“益生菌”指通常被医学界认为非致病性并赋予宿主健康益处的细菌。例如，表现为具有高的ADS活性并因此促进具有龋齿的减少的发生的口腔环境，并对宿主无毒的细菌将是本公开内容中的益生菌的非限制性实例。

如本文使用“ADS活性”指细菌菌株经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成呈氨的形式的碱的能力。“ADS活性水平”指细菌菌株可经由ADS系统生成氨的量。在实施方案中，ADS活性水平被确定为生成的瓜氨酸的纳摩尔(分钟x mg蛋白)^-1。“表达ADS的活性”或“表达足够ADS的活性”指一些细菌菌株在标准生长条件下，或在一个或更多个不利环境因素诸如，但不限于，非酸性pH、低环境精氨酸、高碳水化合物条件(例如，在葡萄糖的存在下)、或有氧条件(例如，氧气的存在)下生长经由ADS代谢精氨酸的能力。在实施方案中，在相同环境测定条件(例如，在“标准生长条件”或生长条件的一些其他变化)下，相对于已知的、良好表征的ADS阳性菌株(例如，戈登链球菌DL1)的ADS活性确定菌株表达ADS活性的能力。在实施方案中，如果在相同测定条件下，相对于戈登链球菌DL1，菌株表达大约相同的活性、更大的活性、或ADS活性的一个设定百分比，则菌株“表达足够ADS活性”。在其他实施方案中，在一定环境条件下，菌株表达ADS活性的能力可相对于相同菌株的ADS活性来确定。在一些这样的实施方案中，如果，与该菌株在标准生长条件下的ADS活性比较，其具有一定百分比的ADS活性(例如，至少约25％ADS活性，至少约40％ADS活性，至少约50％ADS活性，至少约75％ADS活性等)，则称菌株在环境测定条件下“表达ADS活性”。在本公开内容中，“标准生长条件”是包含25mM半乳糖和10mM补充精氨酸的TY培养基(胰蛋白胨-酵母提取物肉汤)，在5％CO₂下，在37℃下至在OD600+0.5-06下的光密度。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。具体地，有益的或期望的临床结果包括，但不局限于，症状的缓解、疾病的程度的降低、疾病的稳定化(例如，不恶化)、疾病进程的延迟、减慢或阻止、疾病的基本上阻止传播、疾病状态的减低、改善或缓和、以及缓解(部分的或全部的)，无论是可检测的或不可检测的。另外，“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还可以是在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的副作用方面的疗法。关于龋齿，“治疗”包括减少龋齿损伤的外观和减缓或阻止龋齿损伤的进展(例如，减缓或停止损伤的生长或严重性)。“治疗”还包括“预防”/“预防性治疗”。如本文所用，术语“预防”、“预防性治疗(prophylactically treat)”或“预防性治疗(prophylactically treating)”指在宿主中完全地、基本上、或部分预防疾病/状况或其一种或更多种症状。同样地，“延迟状况的发作”还可以包含在“预防性治疗”中，并指增加状况在易患状况的患者中实际发作前的时间的行为。关于龋齿，“预防”或“预防性治疗”可包括预防宿主中新龋齿损害的外观。

“施用”意指将本公开内容的化合物引入进受试者；其还可指向受试者提供本公开内容的组合物的行为(例如，通过处方)。本公开内容的组合物的施用的优选的途径是口服。然而，可使用将有助于组合物治疗宿主的口腔状况的任何施用途径。

术语“生物体”、“受试者”或“宿主”指需要治疗的任何活的实体，包括人、哺乳动物(例如，猫、狗、马、鸡、猪(pigs)、阉猪(hogs)、牛和其他家畜)，以及需要治疗的其他活的物种。特别是，该术语“宿主”包括人。如本文使用，术语“人宿主”或“人受试者”通常用于指人宿主。在本公开内容中，术语“宿主”通常指人宿主，所以当在本公开内容中单独地使用时，该词“宿主”指人宿主，除非上下文清楚地指明意图指示非人宿主。“易患”状况的宿主可定义为不显示这些状况的一个或更多个的明显症状，但在遗传上、生理上或以其他方式处于发展这些状况的一个或更多个的风险的宿主。

如本文使用，以下术语具有归于它们的含义，除非另有说明。在本公开内容中，“基本上由......组成”或“基本上包括”或类似的，当应用于被本公开内容包括的方法和组合物时，指像本文公开的那些的组合物，但其可包含另外的结构基团、组合物组分或方法步骤(或其类似物或衍生物，如以上讨论的)。然而，与本文公开的相应组合物或方法的那些比较，这样的另外的结构基团、组合物组分或方法步骤等，实质上不影响组合物或方法的基本和新颖特征。“基本由......组成”或“基本上包括”或类似的，当应用于被本公开内容包括的方法和组合物时，具有归于美国专利法的含义，且术语是开放式的，允许比被提及的更多的存在，只要被提及的基本或新颖特征不被被提及的更多的存在改变，但不包括现有技术实施方案。具体地，关于本公开内容的精氨酸分解细菌菌株的混合物，“基本上由...组成”指示，除了具有列出的标准的那些以外，较少量的其他细菌菌株可以以较少量存在，但它们不影响混合物的总体功能，且不影响混合物的精氨酸分解活性。

讨论

本公开内容的实施方案包括益生、精氨酸分解口服组合物，制备用于口服用途的精氨酸分解细菌菌株的混合物的方法，用于在患者中治疗和/或预防口腔龋齿和减慢和/或阻止龋齿损伤的进展的方法，以及用于增加宿主的口腔中精氨酸分解细菌的量和增加宿主的口腔中氨生成的方法和组合物。本公开内容的实施方案包括包含精氨酸分解细菌菌株的混合物的组合物。在实施方案中，组合物是益生口服组合物。

支持碱生成在口腔生态和抑制口腔龋齿的作用的体外和临床观察的证据继续累积(Dawes和Dibdin,2001；Margolis等人，1988b；Nascimento等人，2009a；Peterson等人，1985；Shu等人，2007a；Wijeyeweera和Kleinberg,1989a)。口服精氨酸代谢和龋齿活跃的不存在之间的正相关性已在成人中(Nascimento等人，2009a)，且最近在儿童中被临床证实(Nascimento等人，2012)。具体地，与来自龋齿活跃受试者的那些比较，来自无龋齿受试者的牙菌斑的口腔细菌呈现较高的ADS活性。在个体间在氨生成速率方面存在高度变异性，在一些情况中大于1000倍。使用口腔链球菌的实验室菌株的在先研究表明，ADS基因的表达是底物可诱导的，对碳分解代谢物阻遏(CCR)敏感的，以及在低pH下和厌氧条件茁壮生长。特定和全局转录调节因子，多个双组分系统(TCS)和其他因素已显示通过转录和转录后机制来调节ADS活性(Burne,1991；Dong等人，2004；Liu和Burne,2009；Liu等人，2008)。体外研究表明，龋齿病菌变形链球菌的遗传修饰菌株的氨生成能力中少至五倍的减少导致通过糖酵解抵消环境酸化的能力的损失(Clancy等人2000)。因此，许多个体可缺乏足够的ADS活性，以中和禁食期间或在致龋挑战后的牙菌斑。因此，菌斑细菌的ADS活性可影响静止和碳水化合物挑战菌斑的pH曲线，并且因此，龋齿发展的风险。

口腔生物膜的微生物组成中的差异和ADS的差异表达是影响来自不同个体的口腔样品代谢精氨酸的能力的最可能的因素。在先临床研究中qPCR的使用(Nascimento等人，2009a)未揭示两种公认的精氨酸分解物种血链球菌和戈登链球菌的比例与成人龋齿状态之间统计上显著的相关。这些结果表明，与龋齿经历相关的ADS活性的减少可以不是简单由于减少已知ADS阳性细菌的比例，且还提高除了检查的那些以外的物种可有助于整体口腔ADS活性的可能性。环境条件和宿主因素支持在龋齿活跃与无龋齿受试者中ADS的差异表达也是可能的。因此，在本公开内容中，有助于口腔中精氨酸分解的生物体被更彻底地表征和研究。鉴于对口腔精氨酸分解细菌群落的基本微生物学和生态学以及其与口腔健康和口腔龋齿的关系的新的洞察，以下实施例显示来自无龋齿和龋齿活跃成人受试者的龈上牙菌斑的精氨酸分解细菌菌株的分离和表征，以及这些分离株对环境刺激的响应。

如以上简要和以下更详细讨论的，一些细菌具有经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨的能力。当在宿主(特别是宿主的口腔)中发现时，这样的“精氨酸分解”细菌，可有益于增加宿主的口腔中的氨生成，从而提供用于减少龋齿的发生的环境因素。在无龋齿个体的口腔生物膜中更普遍地发现了一些这样的细菌菌株。如以下所述，实施例中的研究鉴定能够ADS活性的多种细菌菌株并描述用于鉴定能够ADS活性的多种菌株的方法。另外，以下实施例中描述的研究进一步鉴定并描述在传统上与ADS活性减少相关的条件的存在下如何鉴定能够保持ADS活性的细菌菌株。许多这样的条件还与龋齿的较高发生率相关。因此，鉴定满足一定标准并在一定条件的存在下表达ADS活性的菌株的能力有益于增加宿主中这些细菌的水平，以及用于治疗、预防、减缓或阻止患者中龋齿的发生的方法。在实施方案中，鉴定为具有ADS活性并在一定条件下表达ADS活性的一些菌株可被包括在益生口服组合物中。这样的组合物可用于以下实施方案中：本公开内容的增加生成氨细菌在宿主的口腔中的量的方法，治疗或预防龋齿的方法，和/或减缓或阻止具有龋齿的患者中的龋齿损伤的进展的方法。

益生口服组合物：

因此，本公开内容提供了包含细菌菌株的混合物的益生口服组合物，其中该混合物包含至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株。混合物中至少两种分离的精氨酸分解细菌菌株的每个能够经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨，并且每个菌株满足至少一个ADS相关的标准。在实施方案中，ADS相关的标准包括但不限于，以下：在补充精氨酸的不存在下表达ADS活性(其中“补充精氨酸”是加入基本生长培养基的精氨酸(除了生长培养基中天然存在的精氨酸以外)，(例如，大于约5mM的精氨酸))，在葡萄糖的存在下表达ADS活性(例如，将葡萄糖加入至基本生长培养基)，在非酸性pH中表达ADS活性(例如，至少约7的pH)，在有氧条件下表达ADS活性(例如，在另外的氧气的存在下)，抑制与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株对生长的抑制。在本公开内容的益生口服组合物的实施方案中，以上标准的至少两个由细菌菌株的混合物来满足，并且混合物中的每个细菌菌株可满足多于一个的标准。

由于与口腔龋齿相关的大多数细菌物种不是精氨酸分解性的，在这样的物种之间将不可能存在大量的重叠。然而，为了澄清，在实施方案中，分离的精氨酸分解细菌菌株的混合物特别排除来自与口腔龋齿相关的细菌物种的任何细菌菌株(例如，变形链球菌等)。在本公开内容的口服组合物的组成的实施方案中，混合物由至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株组成，每个菌株能够经由ADS生成氨，且每个菌株满足以上列出的标准的至少一个。

本公开内容的益生组合物还可包括药学上可接受的口服载体，诸如，但不限于，水，其他药学上可接受的液体、凝胶、粉末，等。组合物可配制为口服制剂，诸如，但不限于，液体漱口水、口腔喷剂、凝胶剂、糊剂(例如，牙膏)，某些食品，糖果/薄荷糖、口香糖或咀嚼片，等。制备这样的制剂的方法是药理学和/或配料领域技术人员已知的。

在实施方案中，用于混合物的细菌菌株可选自被鉴定或能够通过在下面描述的显示ADS活性的本公开内容的方法鉴定的任何ADS阳性细菌。在实施方案中，精氨酸分解细菌菌株可选自，诸如，但不限于，在显示ADS活性的以下表1和2中鉴定的那些菌株。在实施方案中，ADS活性是至少约225单位(mg蛋白)^-1、至少约250单位(mg蛋白)^-1、至少约275单位(mg蛋白)^-1、至少约300单位(mg蛋白)^-1，等，如通过ADS测定法在标准生长条件下，诸如下面实施例1中所述的ADS测定测量的。简言之，ADS测定的实施方案包括通过监测从精氨酸生成的谷氨酸来测量活性，如在下面实施例1中所述的。细胞通过离心收获，用10mM Tris-马来酸盐缓冲液(pH6.8)洗涤并使用在同样的缓冲液中的1/10原培养物体积重新悬浮。细胞通过用甲苯涡旋它们来透化，并通过以18,000x g离心来收集。将上清液丢弃，并将沉淀重悬于10mM Tris-马来酸盐缓冲液中，并用于在包含20nM精氨酸、10mM己酸、和50mM Tris-马来酸盐缓冲液(pH 6.0)的反应混合物中测量AD活性。确定每个测定中使用的蛋白的浓度，如实施例1中所述。

在一些实施方案中，ADS活性与在标准生长条件下良好表征的实验室菌株戈登链球菌DL1(戈登链球菌(Streptococcus gordonii)(菌株Challis/ATCC 35105/CH1DL1/V288))在标准生长条件下的ADS活性至少约相同。在一些实施方案中，ADS活性是在标准生长条件下至少约300nmol的瓜氨酸(分钟x(mg的蛋白))^-1(见表1:约339.3+/-33.0的戈登链球菌DL1的ADS活性)。在一些实施方案中，用于混合物的细菌菌株具有戈登链球菌DL1在标准生长条件下的活性的约50％至约100％的ADS活性。在一些实施方案中，细菌菌株的ADS活性小于戈登链球菌在标准生长条件下的ADS活性，但大于戈登链球菌在其他环境条件下的ADS活性，如在下面更详细描述的。

在本公开内容的益生口服组合物的一些实施方案中，细菌菌株选自来自以下物种的细菌的精氨酸分解菌株：包括，但不限于，副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、戈登链球菌、澳大利亚链球菌、血链球菌、和嵴链球菌(Streptococcus cristatus)。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99％的序列相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PTO10(登录号GU561390.1)、中间链球菌C270(登录号CP003858.1)、戈登链球菌str.Challis sbustr.CH1(登录号AB690250.1)、戈登链球菌str.Challis sbustr.CH1(登录号NR_074516.1)、戈登链球菌ATCC 10558(登录号AY485606.1)、澳大利亚链球菌Al-1(登录号JX861483.1)、血链球菌JCM 5708(登录号AB596946.1)、和嵴链球菌F0329(登录号AY005047.1)。在一些实施方案中，益生口服组合物包括选自在下面表1(实施例1)中鉴定的以下菌株的细菌菌株：副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A7、戈登链球菌A8、戈登链球菌A9、戈登链球菌A10、戈登链球菌A11、澳大利亚链球菌A12、澳大利亚链球菌A13、血链球菌A41、和嵴链球菌A55。

在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在葡萄糖(例如，葡萄糖(例如，约25mM葡萄糖)代替生长培养基中的半乳糖)的存在下表达ADS活性。在实施方案中，为混合物选择的在葡萄糖的存在下表达ADS活性的细菌菌株具有相同葡萄糖条件下戈登链球菌DL1的ADS活性的至少大约水平、或更大，或在相同葡萄糖条件下戈登链球菌的ADS活性的至少约50％、至少约75％、至少约90％、至少约100％。在一些实施方案中，在加入的葡萄糖条件(例如，25mM葡萄糖代替半乳糖加入至生长培养基)下混合物中表达ADS活性的至少一种菌株具有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至少约25％。在实施方案中，在加入的葡萄糖条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至少约40％、至少约50％、至少约75％、等等。在实施方案中，在葡萄糖的存在下表达ADS活性的菌株选自来自以下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链球菌、和澳大利亚链球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99％的序列相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PTO10(登录号GU561390.1)、中间链球菌C270(登录号CP003858.1)、戈登链球菌str.Challis sbustr.CH1(登录号AB690250.1)、戈登链球菌str.Challis sbustr.CH1(登录号NR_074516.1)、戈登链球菌ATCC10558(登录号AY485606.1)、和澳大利亚链球菌Al-1(登录号JX861483.1)。在葡萄糖的存在下表达大于DL1(例如，ADS>约52.5单位)的ADS活性的一些代表性细菌菌株包括但不限于以下菌株：副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A7、戈登链球菌A8、戈登链球菌A9、戈登链球菌A10、戈登链球菌A11、澳大利亚链球菌A12、和澳大利亚链球菌A13。

在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在非酸性pH(例如，pH至少约7)中表达ADS活性。在实施方案中，为混合物选择的在非酸性pH下表达ADS活性的细菌菌株具有相同pH条件下与戈登链球菌DL1的ADS活性至少大约水平、或更大，或在相同pH条件下戈登链球菌DL1的ADS活性的至少约75％。在实施方案中，在相同pH条件下细菌菌株具有戈登链球菌DL1的ADS活性的至少约50％。在一些实施方案中，混合物中在非酸性pH下表达ADS活性的至少一种菌株具有相同菌株在标准生长条件下，或在约5.7的酸性pH下的ADS活性的至少约50％。在实施方案中，在非酸性葡萄糖条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下，和/或具有约5.7的酸性pH下的ADS活性的至少约40％、至少约50％、至少约75％等。在实施方案中，在非酸性pH下表达ADS活性的菌株选自来自以下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链球菌、和澳大利亚链球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99％的序列相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PTO10(登录号GU561390.1)、中间链球菌C270(登录号CP003858.1)、戈登链球菌str.Challis sbustr.CH1(登录号NR_074516.1)、和澳大利亚链球菌Al-1(登录号JX861483.1)。在非酸性pH下表达大于DL1:(ADS>约344.5单位)的ADS活性的一些代表性细菌菌株包括，但不限于以下菌株：副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、戈登链球菌A8、和澳大利亚链球菌A12。

在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在补充精氨酸(例如，少于约5mM精氨酸加入至生长培养基)的不存在下表达ADS活性。在实施方案中，在补充精氨酸的不存在下表达ADS活性的细菌菌株在相同精氨酸缺乏条件下具有如戈登链球菌DL1的ADS活性的至少水平、或更大，或具有在相同精氨酸缺乏条件下戈登链球菌DL1的ADS活性的至少40％、至少50％、至少75％等。在实施方案中，在补充精氨酸的不存在下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至少约60％。在实施方案中，在补充精氨酸的不存在条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至少约40％、至少约50％、至少约75％等。在实施方案中，在环境精氨酸的不存在下表达ADS活性的菌株选自来自以下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链球菌、和澳大利亚链球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99％的序列相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PTO10(登录号GU561390.1)、中间链球菌C270(登录号CP003858.1)、戈登链球菌str.Challis sbustr.CH1(登录号NR_074516.1)、和澳大利亚链球菌Al-1(登录号JX861483.1)。在环境精氨酸的不存在下表达大于DL1(ADS>约232.5单位)的ADS活性的一些代表性菌株包括，但不一定限于以下：副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12和澳大利亚链球菌A13。

在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在有氧条件(例如，在O₂的存在下，例如由搅拌诱导的通气，诸如旋转振动器)下表达ADS活性。在实施方案中，在有氧条件下表达ADS活性的细菌菌株具有相同氧合处理下戈登链球菌DL1的ADS活性的至少水平、或更大，或在相同氧合处理下具有戈登链球菌DL1的ADS活性的至少60％、75％、90％等。在实施方案中，在有氧条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下无通气(例如，在厌氧室中)的ADS活性的至少约60％。在实施方案中，在有氧条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下无通气的ADS活性的至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％等。在实施方案中，在有氧条件下表达ADS活性的菌株选自来自以下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链球菌、澳大利亚链球菌、血链球菌、和嵴链球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99％的序列相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PTO10(登录号GU561390.1)、中间链球菌C270(登录号CP003858.1)、戈登链球菌str.Challis sbustr.CH1(登录号NR_074516.1)、澳大利亚链球菌Al-1(登录号JX861483.1)、血链球菌JCM 5708(登录号AB596946.1)、和嵴链球菌F0329(登录号AY005047.1)。在有氧条件下表达ADS活性大于DL1(例如，ADS>14.4单位)的代表性细菌菌株包括，但不限于以下：副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12、血链球菌A41、和嵴链球菌A55。

在本公开内容的益生口服组合物的实施方案中，其中细菌菌株抑制与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的生长，和/或抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种菌株对生长的抑制，与口腔龋齿相关的细菌菌株可以是，但不限于，变形链球菌的一种或更多种菌株。与口腔龋齿相关的其他细菌菌株包括，但不限于，远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、各种乳杆菌属物种、某些Scardovia物种和一些放线菌属物种。

在本公开内容的实施方案中，益生组合物还可包括一种或更多种化合物以增加细菌菌株的ADS活性。例如，这样另外的化合物可以是可改变口腔环境的一个方面，以使环境更有利于ADS活性的物质。在实施方案中，增加细菌菌株的ADS活性的一种或更多种化合物可包括，但不限于：半乳糖、精氨酸、包含精氨酸多肽类和蛋白(例如源于食品的那些)或酸性化合物。在本公开内容的实施方案中，益生组合物包括精氨酸。将理解，由于这些组合物将口服施用至宿主，组分应该是药学上和生物学上可接受的(例如，通常认为是安全、无毒的，等)。

其他组分可被括在本公开内容的口服益生组合物中，以改进组合物的性能或其他方面的(诸如味道、气味、口感等)。将理解，包括在本公开内容的组合物的实施方案中的细菌菌株是分离的菌株且不仅仅是从天然环境获得且直接放置在口腔组合物中的样品。

选择用于口服用途的精氨酸分解细菌菌株的方法：

本公开内容还提供了鉴定并选择精氨酸分解细菌菌株的方法以及制备用于在宿主中口服使用的精氨酸分解细菌菌株的混合物的方法。在实施方案中，方法包括获得从口腔样品(例如，从宿主，诸如无龋齿宿主采集的样品)分离的多个细菌菌株。由多个细菌菌株，进行测定以鉴定并分离能够经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨的精氨酸分解细菌菌株。这样的方法的实施方案描述在下面的实施例中。分离和选择ADS阳性菌株后，可进行一个或更多个另外的测定，以鉴定能够在通常不利于宿主中精氨酸生成和/或有利于龋齿的环境条件中表达ADS活性的精氨酸分解细菌菌株。在实施方案中，使用测定以模拟这样的环境条件用于鉴定和选择在这样的条件下表达ADS活性的细菌分离株。在实施方案中，环境测定条件包括，但不限于，环境精氨酸的不存在、葡萄糖的存在、非酸性pH、有氧条件、以及与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的存在。在实施方案中，与口腔龋齿相关的细菌菌株是变形链球菌。在实施方案中，为这样的条件，对在前述步骤中鉴定的ADS阳性细菌的菌株单独地进行一种或更多种测定。方法还包括，选择在环境条件测定步骤中鉴定的至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，以及使用选择的菌株制备在至少两种选择的环境条件下表达ADS活性的精氨酸分解细菌的混合物。

如前所述确定了菌株的ADS活性和菌株在各种条件下表达ADS活性的能力(例如，相对于相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的某一％和/或相对于实验室菌株戈登链球菌DL1在与选择的菌株相同的环境条件的ADS活性)。

选择菌株后，可制备在不同环境条件下具有ADS活性的菌株的各种混合物。然后这样的混合物可用于制备以上描述的本公开内容的益生口服组合物。混合物可与能够增加细菌菌株的ADS活性的一种或更多种化合物(例如，精氨酸、半乳糖、酸性化合物等)组合。

使用方法

以上描述的组合物可以影响宿主的口腔环境的多种方式使用。在实施方案中，组合物可用于增加生成氨的细菌在宿主的口腔中的量，以增加宿主的口腔中的氨生成，和/或以治疗患者，包括儿童和成人两者中的口腔龋齿。

例如，在实施方案中，本公开内容的组合物可施用至宿主，以增加生成氨的精氨酸分解细菌在宿主的口腔中的量。在实施方案中，可在当宿主的口腔环境最不可能有利于ADS活性时的时间期间施用组合物，以增加ADS活性的潜力和减少产生有利龋齿的环境的潜力。例如，可在餐(例如，高碳水化合物餐)后，或睡前施用组合物。在实施方案中，施用益生口服组合物增加生成氨的细菌的量至大于在施用组合物前宿主的口腔中存在的量。生成氨的细菌的增加的量可维持仅短的时间段(例如，几小时)，或其可持续较长时间(例如，几小时至几天)。时间长度可取决于组合物的制剂(例如，应用至口腔/牙齿表面的口腔清洗剂或口腔喷雾与耐唾液凝胶或糊剂或持久的口香糖或锭剂)。即使生成ADS的细菌的较高水平持续相对短的时间，以最佳时机，这应该仍足以在提供更健康的口腔环境以阻止龋齿生长方面向宿主提供益处。

在实施方案中，相对于在施用益生口服组合物之前氨生成的量，增加生成氨的细菌在宿主的口腔中的量的方法还增加了宿主的口腔中的氨生成。

在其他实施方案中，组合物可施用至已具有口腔龋齿的历史，或具有口腔龋齿的活跃情况的易患口腔龋齿的患者以帮助治疗或预防患者中的口腔龋齿。在实施方案中，组合物可施用至具有活跃口腔龋齿的宿主以减缓或阻止龋齿损伤的进展。

本公开内容的组合物可根据由他们的牙齿护理提供者所确定的方案施用至患者。在本公开内容的实施方案中，组合物可以以单一剂量施用或其可以以定期重复时间表施用。在一些实施方案中，组合物可在常规牙科就诊期间，诸如当用于预防时来施用。在又其他实施方案中，组合物可以以用于在定期的基础上施用持续时间段，诸如每日、每周，或一些其他定期时间表持续时间段诸如数周、数月等的自施用口服制剂的形式提供至患者。在一些实施方案中，这样的方案可实施用于具有活跃龋齿、龋齿的历史、或认为处于龋齿发展的风险的患者。本公开内容的组合物的量、时机、和给药可由患者的口腔健康提供者为每个患者来确定，或由口腔健康协会或指南建议。

在下面的实施例中提供了有关本公开内容的测试和方法的另外的详细内容。下面的具体实施例将被解释为仅说明性的，并不以任何方式限制本公开内容的其余部分。无需进一步详尽说明，认为本领域的技术人员可基于本文的描述，利用本公开内容至其最大程度。本文中列举的所有出版物通过引用以其整体并入本文。

应该强调，本公开内容的实施方案，特别是，任何“优选的”实施方案，仅是实施的可能示例，仅阐述用于本公开内容的原理的清楚理解。可对本公开内容的以上描述的实施方案进行许多变化和修改，而基本上不偏离本公开内容的精神和原则。所有这样的修改和变化意图在本文中被包括在本公开内容的范围内，并受以下实施方案保护。

提出以下实施例，以便对本领域普通技术人员提供如何进行本文公开的组合物和化合物的方法和用途的完整的公开内容和描述。已经做出努力以确保关于数字(例如量、温度等)的准确性，但应该考虑某些误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，温度是以℃，并且压力是在大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

应注意，比率、浓度、量和其他数值数据可以以范围格式在本文中表示。应该理解，为方便和简洁，使用这样的范围格式，并且因此，应该以灵活的方式解释为不仅包括明确列举作为范围的界限的数值，而且还包括在该范围内包括的所有单独的数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地列举。为了说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应被解释为不仅包括约0.1wt％至约5wt％的明确列举的浓度，而且还包括在指示的范围内的单独的浓度(例如，1％、2％、3％、和4％)以及子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％、和4.4％)。在一个实施方案中，术语“约”可根据数值的有效数字包括传统四舍五入。

实施例

现在已大体上描述了本公开内容的实施方案，以下实施例描述本公开内容的一些另外的实施方案。尽管本公开内容的实施方案结合以下实施例和相应的文字和附图进行描述，但不意图限制本公开内容的实施方案至本说明书。相反，意图覆盖在本公开内容的实施方案的精神和范围内包括的所有的替换、修改、以及等同物。

实施例1

人口腔生物膜的精氨酸分解微生物群落的表征

引言

本实施例描述了来自无龋齿和龋齿活跃受试者的精氨酸分解细菌物种的分离和表征。通常与口腔健康相关的口腔细菌的选择的组能够经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)以氨的形式生成碱，其具有对人口腔生物膜的pH的深远影响。口腔龋齿的增加的风险已与口腔生物膜中细菌的减少的ADS活性相关。在本实施例中，来自无龋齿(CF)和龋齿活跃(CA)成人的牙菌斑样品的精氨酸分解细菌菌株被分离和表征，以研究个体之间的菌斑ADS活性中的差异基础。五十种ADS阳性细菌菌株通过16S rRNA基因测序来鉴定，并在标准生长条件下比较它们的ADS活性水平。细菌的AD活性谱范围从45.2至688.0单位(mg蛋白)^-1。血链球菌是最普遍的物种/进化型。在诱导或抑制ADS基因表达的条件下使用27个ADS阳性菌株进行生物化学测定，显示响应pH、氧气、和碳水化合物或精氨酸的可用性的精氨酸分解活性中的差异。本研究揭示了，在临床分离株中观察到的广谱精氨酸分解表达的基础至少部分地可归因于物种内或之间的ADS的表达调控的差异。结果提供了对口腔生物膜的ADS能力中受试者间差异的微生物学基础的深刻理解，并提高我们对口腔龋齿为生态驱动疾病的理解，其中精氨酸代谢缓和菌斑pH且促进口腔健康，并且提供了用于鉴定用于益生组合物和用途的细菌的方法。

材料和方法

细菌菌株的分离。

从没有现在或过去龋齿经历的临床或报道的证据[腐烂、缺失和填充的牙齿(DMFT)＝0]的11个无龋齿(CF)受试者和具有至少四个活跃、形成空洞的(牙质水平)和未恢复的龋齿损伤(DT≥4,MFT≥0)的3个龋齿活跃(CA)受试者收集龈上牙菌斑，如Nascimento等人，(2009a)和Schulte等人，(2009)所述的。龋齿损伤的活性通过临床表现、菌斑停滞、和触觉来确定。为了获得多种可培养的微生物群落，菌斑样品通过外部超声处理(W375,Sonicator Heat Systems-Ultrasonics Inc，Farmingdale,NY,USA)15秒的2个循环来分散，在间隔期间在冰上冷却。然后样品以10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)连续地稀释，并且100μl的10^-4至10^-7稀释的样品在绵羊血琼脂(SheepBlood Agar)平板(包含5％的抗凝结绵羊血的哥伦比亚琼脂(ColumbiaAgar)，Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)上和脑心浸液(BHI)琼脂平板(Difco Laboratories，Detroit,MI,USA)上培养。平板在37℃下在厌氧罐(BBLGasPak^TM Systems,BD,Sparks,MD,USA)中温育3天，随后在37℃下在5％CO₂中有氧温育2天。温育阶段后，代表所有形态类型的临床分离株的菌落在相同培养基上再次培养直到获得纯的菌落。

ADS阳性菌株的筛选

以基于微量滴定的测定筛选细菌菌株从精氨酸释放氨的潜力(Schulte等人，2009)。简言之，菌株在包含具有2％半乳糖和10mM精氨酸的基于胰蛋白胨-维生素(TV)的肉汤的透明的聚苯乙烯微量滴定板(FisherScientific Inc.，USA)中生长。板在37℃下在厌氧条件(85％N₂、5％CO₂、10％H₂、80％相对湿度)下温育48小时。细菌细胞通过在冷冻微型离心机中以10,000x g离心板3min来收集，用10mM Tris-马来酸盐(pH 7.0)洗涤一次，并重悬于100μl的50mM Tris-马来酸盐缓冲液(pH 6.0)中。通过使用奈斯勒试剂(Sigma-Aldrich Inc.，USA)检测在37℃下在50mM盐酸精氨酸的存在下温育细菌2小时生成的氨来鉴定ADS阳性表型(图1)。用于背景和干扰的对照常规地包括在各反应中。ADS阳性菌株的文库存储在-80℃下用于进一步分析。从该文库，从在本研究中待通过16S rRNA基因测序来鉴定和表征的各种CF和CA受试者的菌斑随机选择56个ADS阳性菌株。

16S rRNA基因通过PCR的扩增和测序。

来自ADS阳性细菌的基因组DNA使用QIAamp DNA微型试剂盒(Qiagen Inc.，CA,USA)根据供应商的说明来分离。16S rRNA基因在标准条件下使用通用引物组来扩增(正向：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3’(SEQ ID NO:1)、反向5’-TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT-3(SEQID NO:2))。16S rRNA插入物的纯化的PCR产物使用ABI PCR条件来测序，数据分析如Aas等人，(2005)；Paster等人，(2001)中描述的。将PCR序列与在人口腔微生物组数据库(Human Oral Microbiome Database)(HOMD)、核糖体数据库项目(Ribosomal Database Project)、和GenBank数据库储存的16S rRNA序列比较。本研究中生成的完整16S rRNA基因序列从EMBL、GenBank、和DDBJ核苷酸序列数据库进行电子检索可获得。

ADS活性、生长条件和试剂。

为确保新颖的进化型和以前未报道为ADS阳性的已知的细菌物种事实上能够代谢精氨酸，细菌分离株的ADS活性通过使用由Liu等人(2008)验证的方案监测来自精氨酸的瓜氨酸生成来测量。细菌分离株在BHI琼脂的新鲜培养物上保持，并在37℃下在胰蛋白胨-酵母(TY)提取物肉汤上接种24小时，然后用于确定ADS活性的生物化学测定。56个选择的并鉴定的ADS阳性菌株的ADS活性在以下标准生长条件下确定：包含25mM半乳糖和10mM精氨酸的TY培养基，在37℃下在5％CO₂下，持续24小时，Liu等人(2008)。蛋白的浓度使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Waltham,MA,USA)用牛血清白蛋白用作标准来确定。细菌分离株的ADS活性水平标准化为蛋白含量并定义为生成的瓜氨酸的nmol[分钟X(mg蛋白)]^-1。

为了监测AD表达作为已知诱导或抑制ADS的环境条件的函数，将不同细菌物种的27个代表生长在TY基础培养基中。对于比较响应于不同糖的ADS活性的测定，基础培养基还包含10mM精氨酸和25mM半乳糖或25mM葡萄糖(图2A和3A)。对于pH比较测定(图2B和3B)，基础培养基还包含25mM半乳糖和10mM精氨酸，其已用HCl被酸化至pH 5.7，或用50MM K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(TY/50mM KPB)在pH 7.0下缓冲。对于比较精氨酸的存在或不存在的测定(图2C和3C)，基础培养基还包含25mM半乳糖，带有或不带有10mM精氨酸。对于氧气比较测定(图2D和3D)，基础培养基还包含25mM半乳糖和10mM精氨酸，培养物在有氧或厌氧条件下温育。对于有氧生长，将细胞接种进250-ml包含补充了半乳糖和精氨酸的40ml的TY培养基的锥形瓶中并在旋转振荡器(50rpm)上在37℃下生长(Liu和Burne,2011)。对于厌氧生长，培养物在厌氧培养室(85％N₂、5％CO₂、10％H₂、80％相对湿度)中在37℃下温育24小时。所有细胞在OD600＝0.5-0.6下收集用于检测ADS活性。

统计分析。

对于描述性分析，当适当时，计算百分比和平均值的分布。student’s t检验或ANOVA用于检验连续变量的差异；且卡方检验用于分类变量。使用两比例Z检验(Two Proportions Z-test)，分析ADS阳性细菌菌株与总的可培养的生物体的比例和受试者的龋齿状态之间的相关性。显著水平确定在p<0.05。

结果

口腔生物膜的精氨酸分解细菌菌株。

总计2328个细菌菌株从14个参加的受试者(11个CF和3个CA；分离的166.3个菌株/受试者的比)的菌斑样品分离并通过检测ADS活性筛选精氨酸分解能力。这些2328个菌株的288个是ADS阳性的，其表示20.5个菌株/受试者，或15.8个菌株/CF受试者(在该龋齿组内的菌株5ADS+的最小值和51ADS+的最大值)，以及38个菌株/CA受试者(在该龋齿组内的菌株6ADS+的最小值和84ADS+最大值)的比。尽管在受试者内和龋齿组内鉴定的ADS阳性分离株的数目之间相当大的变化，存在测试的菌株跨受试者的公平或无偏的分布。在总的可培养的菌群中的ADS阳性菌株的比例与受试者的龋齿状态之间不存在显著相关性。

表1显示了从龈上牙菌斑分离的并由16S rRNA基因测序鉴定的精氨酸分解物种的多样性。鉴定的所有56种ADS阳性菌株与它们的指定的细菌类群具有大于99％的序列相似性。来自厚壁菌门(Firmicutes)门的总计6个不同的细菌类群检测如下：血链球菌(38％)、戈登链球菌(9％)、中间链球菌(9％)、嵴链球菌(9％)、澳大利亚链球菌(3％)和副血链球菌(S.parasanguinus)(2％)。

表1.ADS阳性分离株的鉴定和AD活性。

鉴定的56种ADS阳性菌株与它们指定的细菌类群具有大于99％的序列相似性。提供了数据库登录号。(⁺)来自人口腔微生物组数据库(HOMD)的人体口腔分类群ID(HOT)；(*)细菌菌株的ADS活性水平高于戈登链球菌DL1的ADS活性水平；ADS活性表示为生成的瓜氨酸的nmol[分钟x(mg的蛋白)]^-1；CF：无龋齿受试者和CA：龋齿活跃受试者；SD：标准偏差。

当细菌细胞在标准生长条件下温育时，细菌AD活性的谱范围从45.2至688.0单位(mg蛋白)^-1。在龋齿组之中的细菌ADS活性平均值之间不存在统计学差异。

ADS表达为环境刺激的函数。

为了检查ADS活性在高表达者中的调控，在已知影响ADS基因在口腔细菌中的表达的生长条件，包括低pH、氧气、精氨酸和碳水化合物的可用性下，测量AD酶活性。观察到ADS表达模式响应pH、氧气、以及精氨酸和碳水化合物的可用性中的实质变异，如图2和3中示出。图2C示出了，对于大多数菌株，包括实验室菌株戈登链球菌DL1，ADS的最佳表达强烈依赖于精氨酸的存在。然而，与戈登链球菌DL1比较，菌株诸如副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12、和澳大利亚链球菌A13显示了较高ADS表达，甚至在精氨酸的不存在下。还值得注意，精氨酸的可用性对呈现较低ADS活性水平的菌株的ADS表达没有明显效应，呈现较低ADS活性水平的菌株包括血链球菌A14、血链球菌A16、和血链球菌A20。

已知低pH环境提高戈登链球菌DL1中的ADS活性，然而副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、戈登链球菌A8、和澳大利亚链球菌A12能够表达ADS的高水平，甚至当在中性pH下培养细胞时(图2B)，具有在pH 5.7下观察到的较低倍诱导水平。

戈登链球菌DL1的ADS活性还对CCR非常敏感(Dong等人，2004)，与半乳糖中培养的细胞比较，在葡萄糖中的生长导致5倍更低的ADS活性(Dong等人，2004)，半乳糖比葡萄糖较不有效引发CCR。同样地，当与半乳糖中的生长比较时，葡萄糖可在许多ADS阳性菌株中将ADS活性降低了8至10倍(图2A)。然而，在副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A7、戈登链球菌A8、戈登链球菌A9、戈登链球菌A10、戈登链球菌A11、澳大利亚链球菌A12、和澳大利亚链球菌A13中没有检测到葡萄糖对ADS活性的可观察的抑制。

图2D示出了，戈登链球菌DL1的ADS表达被在有氧条件下的生长高度抑制，且在其他临床菌株中观察到类似的氧气抑制。然而，一些菌株，诸如副血链球菌A1、中间链球菌A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12、血链球菌A41、和嵴链球菌A55的ADS活性水平，对通气的条件中生长的抑制效应不敏感。

ADS表达和龋齿状态。

如表1中所示，在从CF和CA受试者的菌斑分离的相同物种的菌种之中观察到不同水平的ADS活性。例如，来自CF受试者的菌株血链球菌A24[45.2单位(mg蛋白)^‐1]和来自CA受试者的A48[221.3单位(mg蛋白)^‐1]在标准生长条件下呈现显著不同的ADS表达。为进一步探索口腔细菌的精氨酸分解能力是否与受试者的龋齿状态相关，将响应不同环境条件的ADS表达与从不同龋齿组分离的相同物种的临床菌株比较(图3)。选择的菌株包括与以下具有最高16S rRNA序列相似性的那些：戈登链球菌Challis substr.CH1(A7和A8)、戈登链球菌ATCC 10558(A10和A11)、血链球菌JCM 5708(A37、A41、A48和A50)。

戈登链球菌和血链球菌菌株的菌株显示了由葡萄糖对ADS表达的相似抑制(图3A)。在来自两种龋齿的戈登链球菌和血链球菌的菌株之中还观察到由酸性pH对ADS表达和诱导的相似模式(图3B)。图3C示出了，相同物种的大多数菌株呈现响应精氨酸的ADS表达中的可比较差异，独立于受试者的龋齿状态。例如，与精氨酸的不存在下的生长比较，在精氨酸的存在下，来自CA受试者的戈登链球菌A7和来自CF受试者的戈登链球菌A8两者显示2倍更高的ADS活性。大多数菌株显示ADS被氧气抑制(图3D)；除了CF受试者的血链球菌A41以外。

讨论

从口腔生物膜中的精氨酸代谢的对牙齿的酸攻击的短期缓和和对牙菌斑中可期望的细菌的持久性的长期效应的角度，它为开发新颖抗龋齿方法提供了机会。对于将要被用于开发策略以评价龋齿风险和控制龋齿的精氨酸分解，需要对ADS在健康和疾病中口腔生物膜中的分布、调控和功能的深刻理解。尽管基因组测序和其他分子技术已揭示致龋微生物群落和单独细菌物种的性质中的复杂性新水平(Aas等人，2008；Corby等人，2005；Crielaard等人，2011；Mager等人，2003；Russell,2008)，已作出有限的尝试(Sissons等人，1988a；Sissons等人，1988b；Sissons等人，1994)以鉴定和表征能够生成可潜在影响口腔生物膜的致龋性的碱的临床相关口腔生物体。在本实施例中，开发快速和简单的方案用于筛选从牙菌斑样品分离的可培养的精氨酸分解细菌。虽然鉴定的ADS阳性细菌物种的大多数是血链球菌和戈登链球菌的菌株，我们能够披露有助于整个口腔精氨酸分解的另外的可培养的分类群，诸如放线菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、和奈瑟氏菌属(Neisseria)的物种。连同证明在此鉴定的共生链球菌的人口腔生物膜的丰度的在先微生物学的研究(Aas等人，2008；Aas等人，2005；Corby等人，2005；Crielaard等人，2011；Dewhirst等人，2010；Gross等人，2010；Mager等人，2003)，这些实施例中的结果揭示了，这些丰富的链球菌可能对人口腔生物膜的精氨酸分解能力具有显著影响。重要地，本研究清楚地表明，事实上，临床菌株的ADS响应那些特定的环境因素被调控，所述特定的环境因素对龈上生物膜的组成和生物化学活性具有最大影响；例如碳水化合物的可用性和来源、低pH和氧气，其还是可影响龋齿的发展的环境因素。

与健康和疾病相关的口腔微生物群的多样性仅开始通过高通量方法来描述(Aas等人，2008；Corby等人，2005；Crielaard等人，2011；Gross等人，2010；Mager等人，2003)。虽然该物种或类群级别鉴定是非常有价值的(Dewhirst等人，2010)，它没有解决在口腔细菌的给定物种内存在显著异质性的事实。基于目前的测序工作，大部分ADS阳性口腔细菌物种是可培养的，而且大多包含丰富的口腔链球菌。不可培养的生物体也可有助于在口腔生物膜中测量的总的精氨酸分解活性。然而，该理论不由以上结果支持，其中生成碱的潜力与生物体不存在相关，所述生物体在本实施例中使用的条件下不可能生长以培养菌斑样品或通常被认为是不可培养的，例如某些螺旋体。因此，不可培养的生物体对总ADS的任何贡献很可能是微不足道的。与可培养的物种比较，不可培养的细菌物种不仅以低得多的量展现在菌斑中(Aas等人，2008；Corby等人，2005；Crielaard等人，2011；Gross等人，2010；Mager等人，2003)，而且许多或大多数不可培养的细菌不表现为携带ADS基因。本研究通过突出更丰富的物种在它们的调整口腔生物膜的pH并因此致龋齿潜力的能力的方面在口腔中的表型异质性提高了进行中的口腔微生物组的努力。本研究还提出了关于碱生成中异质性的分子基础的新颖概念，而同时生成将推进用于评估和理解口腔微生物组的致病潜力的现有方法的知识、菌株、探针和试剂。

在口腔生物膜中关于碱生成已知的比关于糖代谢已知的显著更少。由Stephan于1940年首次描述了由菌斑细菌的混合群的细菌糖代谢和酸生成之间的因果关系(Stephan,1940)。Stephan还指出，在糖挑战后检测到菌斑pH中的下降，随后是菌斑pH的逐渐上升，最终达到稳定水平。稍后，发现龋齿活跃菌斑的稳定水平、或静止pH比无龋齿菌斑的更酸(Margolis等人，1988a)，进一步支持酸生成和口腔龋齿之间的相关性。随后的研究表明，菌斑pH的升高主要由于由唾液和菌斑中存在的酸敏感生物体的子集从精氨酸或尿素的氨生成(Wijeyeweera和Kleinberg,1989b)。Marquis提出，来自口腔生物膜中氨生成的缓冲能力缓和pH下降的速度并允许生成碱的细菌调整它们的用于存活的生理机能的时间(Marquis,1995)。Kleinberg表明，碳水化合物饥饿的菌斑比浸在唾液中的菌斑更碱性，浸在唾液中的菌斑主要在较大唾液流的区域中(Kleinberg和Jenkins，1964)，所以提出，菌斑细菌从唾液基底生成氨比扩散力可从牙菌斑清除它们更快(Kleinberg和Jenkins，1964)。Kleinberg还表明，菌斑pH将通过菌斑生物体的酸碱代谢来确定，菌斑生物体的酸碱代谢转而可受菌斑厚度、生成酸和碱的生物体在菌斑中的比例、以及氮和碳水化合物底物的相对可用性影响(Kleinberg,1970)。

迄今的临床研究数据支持，龋齿易感性涉及碱生成中的缺陷，且不单独酸生成，如已被传统上假定的(Nascimento等人,2009b；Nascimento等人，2012；Shu等人，2007b)。在本实施例中，我们检查了口腔细菌菌株的异质性、ADS基因表达水平中的组成性差别、和/或ADS基因对由环境因素诱导或抑制的差别灵敏度，是否可说明在口腔健康中并且当龋齿活跃明显时检测到的碱生成中的高度可变性。尽管来自无龋齿受试者的ADS阳性菌株显示比从龋齿活跃受试者分离的那些轻微更高水平的ADS活性，在细菌ADS活性的水平和宿主的龋齿状态之间不存在显著相关。然而，本研究检查精氨酸分解菌斑细菌的集合，或更具体地，在密切相关的但生理多样的共生链球菌中的ADS活性，揭示了ADS响应多个环境刺激的相当的和令人惊讶的谱。在其中许多变量可影响微生物行为的口腔生物膜的复杂环境中，临床菌株的精氨酸分解表达可依赖于生长条件。因此，在无龋齿受试者和龋齿活跃受试者之间观察到精氨酸分解中的差异的基础可与以下因子的组合相关是可能的：(i)口腔生物膜中在ADS受环境因素的调节中具有固有差异的菌株的携带；和/或(ii)影响ADS体内表达的宿主和生物膜微型环境因素。例如，龋齿活跃受试者的生物膜表现为处于-有利于高ADS表达或提供降低ADS活性的一些抑制因素。因此，具有本质上高表达ADS表型的精氨酸分解临床菌株，和其中ADS表达对已知引起口腔龋齿的条件诸如糖可用性和酸性环境不敏感的那些，具有在益生疗法中预防和控制口腔龋齿的用途。

本研究揭示了，在口腔精氨酸分解中受试者内的变化的微生物基础比先前理解的更复杂；不仅口腔生物膜的精氨酸分解潜力可与细菌的某些菌株的携带相关，而且精氨酸分解物种显示一定范围的ADS活性作为环境因素的函数。在理解龋齿作为生态驱动的疾病的方面，结果是高度显著的，由支持，通过缓和菌斑pH并减少龋齿的风险，高表达ADS的菌株可协同地积极地影响菌斑生态。本研究扩大了对口腔生成碱细菌的多样性以及它们在口腔健康和疾病中的作用的知识。

实施例2

ADS活性和种间的拮抗作用

引言

本实施例描述确定精氨酸分解分离株对变形链球菌的拮抗性相互作用是否可与精氨酸分解潜力相关。

方法和材料

临床分离株及筛选。如以上对实施例1所述的获得样品和铺板。

细菌菌株、生长条件和试剂。如以上对实施例1所述的保持细菌菌株。

16S rDNA测序和生物化学测定。如以上对实施例1描述的测序和测定。

种间拮抗作用。为检查精氨酸分解分离株对致龋细菌变形链球菌的拮抗性相互作用，调整BHI肉汤培养基中的变形链球菌和ADS阳性分离株的过夜培养物至相同光密度(OD600＝0.5)。然后，将变形链球菌和ADS阳性分离株的6μl等份彼此相邻接种在TY-25mM半乳糖琼脂板上，如下：(i)首先接种ADS阳性分离株，24h后随后接种变形链球菌；(ii)首先接种变形链球菌，24h后随后接种ADS阳性分离株，和(iii)同时接种ADS阳性分离株和变形链球菌。将板培养另一个24h，在其间监测相互作用。细菌在37℃下伴随5％CO₂和95％空气生长。使用AlphaEaseFC软件测量生长抑制区域。

结果

种间拮抗作用。为了研究ADS活性与种间拮抗作用的相关性，使用板抑制测定(表2)检查由变形链球菌UA159与不同ADS活性分离株相互的拮抗作用。高度ADS活性分离株显示在变形链球菌的存在下存活的能力。重要地，戈登链球菌、澳大利亚链球菌和血链球菌的分离株显示了抑制变形链球菌UA159的生长的有效能力(表2和图4A-4D)。还值得注意的是，许多ADS阳性分离株的生长不受变形链球菌抑制(图4A-4D)。因此，不仅口腔生物膜的精氨酸分解潜力可与细菌的某些菌株的携带相关，而且精氨酸分解物种还显示抑制变形链球菌、以及被变形链球菌抑制的一系列能力。

表2:ADS阳性分离株对生长变形链球菌UA159的抑制效应。

(**)当精氨酸分解分离株首先接种(在变形链球菌之前)时，细菌菌株的拮抗活性水平比戈登链球菌DL1的更高；(-)精氨酸分解分离株受变形链球菌抑制；SD：标准偏差。

结论

本研究揭示了，牙齿生物膜被多种精氨酸分解群落定殖，并且ADS表达在受试者间的变化的基础可能大部分是由于ADS的调控中菌株内的可变性。共同地，结果支持，表达高水平ADS的菌株通过缓和菌斑pH并直接拮抗已知龋齿病原菌的生长，可对菌斑生态具有积极和协同效应。

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以下是出现在本申请中的序列列表：

Claims

1.一种精氨酸分解益生口服组合物，所述精氨酸分解益生口服组合物包含：

分离的细菌菌株的混合物，所述混合物包含至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，每种菌株能够经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨并且每种菌株满足以下标准中的至少一个：在补充精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株对生长的抑制；和

药学上可接受的口服载体，

其中所述细菌菌株的混合物满足所述标准的至少两个。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述混合物包含：能够在补充精氨酸不存在下表达ADS活性的至少一种精氨酸分解细菌菌株，能够在葡萄糖的存在下表达ADS活性的至少一种精氨酸分解细菌菌株，能够在非酸性pH下表达ADS活性的至少一种精氨酸分解细菌菌株，能够在有氧条件下表达ADS活性的至少一种精氨酸分解细菌菌株，以及能够抑制与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的生长或能够抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株对生长的抑制的至少一种精氨酸分解细菌菌株。

3.如权利要求1或2所述的益生口服组合物，其中所述混合物不包含来自与口腔龋齿相关的细菌物种的细菌的任何菌株。

4.如权利要求1所述的益生口服组合物，其中所述混合物基本上由至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株组成，每种菌株能够经由所述精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨并且每种菌株满足以下标准中的至少一个：在补充精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株对生长的抑制。

5.如权利要求1-4的任一项所述的益生口服组合物，其中所述细菌菌株在任何所述标准下表达ADS活性的能力相对于戈登链球菌(S.gordonii)DL1在相同条件下的ADS活性水平来确定，其中在所述相同条件下比戈登链球菌DL1的活性大约相同或更高的ADS活性水平指示所述菌株在所述条件下表达ADS活性。

6.如权利要求1-5的任一项所述的益生口服组合物，其中与口腔龋齿相关的所述细菌菌株选自变形链球菌(Streptococcus mutans)和远缘链球菌(Streptococcus sorbrinus)、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、Scardovia物种、和放线菌属(Actinomyces)物种。

7.如权利要求1-6的任一项所述的益生组合物，所述益生组合物还包括一种或更多种化合物，相对于在所述化合物不存在下所述菌株的ADS活性，所述化合物能够增加所述细菌菌株的ADS活性。

8.如权利要求7所述的组合物，其中增加所述细菌菌株的ADS活性的所述一种或更多种化合物选自由以下组成的组：半乳糖、精氨酸、和酸性化合物。

9.如权利要求1-6的任一项所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的一种或更多种化合物：半乳糖、精氨酸、和酸性化合物。

10.一种用于制备用于口服用途的精氨酸分解细菌菌株的混合物的方法，所述方法包括：

(a)获得从口腔样品分离的细菌菌株的混合物；

(b)分离并鉴定能够经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨的精氨酸分解细菌菌株；

(c)进行一种或更多种单独的测定以鉴定能够在以下测定条件中的至少一个下表达ADS活性的精氨酸分解细菌菌株：在环境精氨酸不存在下，在葡萄糖的存在下，在非酸性pH下，在有氧条件下，以及在与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的存在下；

(d)选择至少两种不同的分离的在步骤(c)中鉴定的精氨酸分解细菌菌株以制备精氨酸分解细菌的混合物，其中所述混合物在所述条件中的至少两个下表达ADS活性。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述细菌菌株在任何所述测定条件下表达ADS活性的能力相对于戈登链球菌DL1在相同条件下的ADS活性水平来确定，其中在所述相同条件下比戈登链球菌DL1的活性大约相同或更高的ADS活性水平指示所述菌株在所述条件下表达ADS活性。

12.如权利要求10所述的方法，其中与口腔龋齿相关的所述细菌菌株是变形链球菌。

13.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括一种或更多种化合物，相对于能够在所述化合物不存在下所述菌株的ADS活性，所述化合物能够增加所述细菌菌株的ADS活性。

14.如权利要求13所述的方法，其中增加所述细菌菌株的ADS活性的所述一种或更多种化合物选自由以下组成的组：半乳糖、精氨酸、和酸性化合物。

15.一种预防或减少口腔龋齿在宿主中的发生的方法，所述方法包括：

向宿主施用包含以下的益生口服组合物：

分离的细菌菌株的混合物，所述混合物包含至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，每种菌株能够经由精氨酸脱亚胺酶系统(ADS)生成氨并且每种菌株满足以下标准中的至少一个：在环境精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株对生长的抑制；和

药学上可接受的口服载体，

其中所述细菌菌株的混合物满足所述标准的至少两个。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述细菌菌株在任何所述标准下表达ADS活性的能力相对于戈登链球菌DL1在相同条件下的ADS活性水平来确定，其中在所述相同条件下比戈登链球菌DL1的活性大约相同或更高的ADS活性水平指示所述菌株在所述条件下表达ADS活性。

17.如权利要求15所述的方法，其中与口腔龋齿相关的所述细菌菌株是变形链球菌。

18.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括一种或更多种化合物，相对于在所述化合物不存在下所述菌株的ADS活性，所述化合物能够增加所述细菌菌株的ADS活性，所述化合物选自由以下组成的组：半乳糖、精氨酸和酸性化合物。

19.一种减缓或阻止口腔龋齿损伤在宿主中的进展的方法，所述方法包括：

向宿主施用包含以下的益生口服组合物：

药学上可接受的口服载体，

其中所述细菌菌株的混合物满足所述标准的至少两个。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述细菌菌株在任何所述标准下表达ADS活性的能力相对于戈登链球菌DL1在相同条件下的ADS活性水平来确定，其中在所述相同条件下比戈登链球菌DL1的活性大约相同或更高的ADS活性水平指示所述菌株在所述条件下表达ADS活性。

21.如权利要求19所述的方法，其中与口腔龋齿相关的所述细菌菌株是变形链球菌。

22.如权利要求19所述的方法，所述方法还包括一种或更多种化合物，相对于在所述化合物不存在下所述菌株的ADS活性，所述化合物能够增加所述细菌菌株的ADS活性，所述化合物选自由以下组成的组：半乳糖、精氨酸和酸性化合物。

23.一种增加生成氨的细菌在宿主的口腔中的量的方法，所述方法包括：

向宿主施用包含以下的益生口服组合物：

药学上可接受的口服载体，

其中细菌菌株的所述混合物满足所述标准的至少两个，并且其中与在施用所述益生口服组合物之前生成氨的细菌在所述口腔中的量相比，所述益生口服组合物的施用增加生成氨的细菌在所述宿主的口腔中的量。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述细菌菌株在任何所述标准下表达ADS活性的能力相对于戈登链球菌DL1在相同条件下的ADS活性水平来确定，其中在所述相同条件下比戈登链球菌DL1的活性大约相同或更高的ADS活性水平指示所述菌株在所述条件下表达ADS活性。

25.如权利要求23所述的方法，其中与口腔龋齿相关的所述细菌菌株是变形链球菌。

26.如权利要求23所述的方法，所述方法还包括一种或更多种化合物，相对于在所述化合物不存在下所述细菌的ADS活性，所述化合物能够增加所述细菌菌株的ADS活性。

27.如权利要求26所述的方法，其中增加所述细菌菌株的ADS活性的所述一种或更多种化合物选自由以下组成的组：半乳糖、精氨酸、和酸性化合物。

28.如权利要求23所述的方法，其中，与在施用所述益生口服组合物之前氨生成的量相比，向所述宿主施用所述益生口服组合物增加所述宿主的口腔中的氨生成。