CN106794191A - 含d‑半乳糖的群体感应抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及D‑半乳糖在抑制群体感应，和/或预防和/或治疗口腔细菌性疾病中的应用，并且提供了一种含D‑半乳糖的群体感应抑制剂和一种用于预防和/或治疗口腔细菌性疾病的组合物。

Description

含D-半乳糖的群体感应抑制剂
技术领域
本公开涉及D-半乳糖在抑制群体感应，和/或抑制和/或治疗口腔细菌性疾病中的应用。具体地，本公开提供了一种用于抑制群体感应的组合物，和一种用于预防和/或治疗口腔细菌性疾病的组合物，上述组合物包括D-半乳糖。
背景技术
龋齿和牙周病是典型的口腔疾病，并且是导致拔牙的主要原因。已经对有效预防和治疗这些疾病进行了很多尝试，但仍然存在许多局限性。
抗生素起到直接去除细菌引起的龋齿和牙周病的作用，但也会杀死有益细菌，并且抗生素因为耐药性等问题而难以长期使用。如在一些国家用作牙周病治疗剂的谷物不皂化部分提取物等材料对中度至重度牙周病具有的实质效果是难以预期的，而且它们的功效仍然是有争议的。与抗生素类似，在世界范围内使用的洗口液具有非特异性抗菌作用并且还含有醇，因此存在引起口腔癌和口干燥的风险。
最近的实验结果报道了龋齿以及牙周病不是由单一种类的微生物引起的，而是由多种微生物之间的信号转导系统介导的。当细菌分泌的信号传导分子的数量达到临界值即法定数量(Quorum)时，细菌觉察到诱导生物膜形成和毒性的群体感应(Quorum Sensing,QS)分子。目前已知的群体感应分子是自体诱导物-1(AI-1)、自体诱导物-2(AI-2)和寡肽。AI-1用于种内的信息交流，而AI-2是种间信息交流的通用信号，在生物膜形成和毒性因子表达中起到重要作用。
当利用毒性细菌的这些特征时，可开发出口腔疾病的治疗剂，以有效控制龋齿和牙周病。换句话说，开发出能有效抑制诱导生物膜形成和毒性的群体感应、而不直接杀死细菌的药物，以提供对目前的治疗药剂没有损害的预防药剂或治疗药剂。
因为群体感应抑制剂不直接杀死细菌，因此不会出现耐药性，从而使它们的长期使用是可能的。此外，因为群体感应抑制剂不作用于特定细菌，而是干扰细菌之间的信息交流，因此示出了广泛的应用。当群体感应抑制剂与抗生素一起使用时，它们有助于抗生素发挥作用。因此，尽管抗生素使用量少，但能获得极好的效果。由于群体感应抑制剂的这些优点，它们可能是能有效控制牙周病的下一代预防药剂或治疗药剂。
目前可用的群体感应抑制剂可选自：使用如呋喃酮或高丝氨酸内酯等先导化合物合成的化学品，肽样模拟物和一类糖(D-核糖)。但是，在医用药物或产品中还没有用作群体感应抑制剂的材料。对于群体感应抑制剂的工业化，尽管群体感应抑制剂能长期使用，但仍必须证明它们基本抑制人体中的群体感应的功效和对人体无害的安全性。合成的化学品显示出对群体感应优异的抑制功效，但在一些情况中，它们的安全性在毒性测试、动物测试和临床测试中还没有得到保证。一类糖D-核糖没有安全问题，因为D-核糖已经经过了长时间使用，但它的抑制功效比合成化学品的抑制功效低很多。
因此，需要开发出对群体感应具有优异的抑制功效且还确保安全性的群体感应抑制剂。
发明内容
技术问题
本发明提供了D-半乳糖的与群体感应抑制活性有关的应用。
具体地，实施方式提供了一种用于抑制细菌群体感应的组合物，所述组合物包括药学上有效量的D-半乳糖。
另一实施方式提供了一种用于抑制细菌群体感应的方法，所述方法包括向需要抑制细菌群体感应的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。
又一实施方式提供了D-半乳糖在抑制细菌群体感应中的应用。
又一实施方式提供了D-半乳糖在生产细菌群体感应抑制剂中的应用。
又一实施方式提供了一种用于抑制细菌生物膜形成的组合物，所述组合物包括药学上有效量的D-半乳糖。
又一实施方式提供了一种用于抑制细菌生物膜形成的方法，所述方法包括向需要抑制细菌生物膜形成的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。
又一实施方式提供了D-半乳糖在抑制细菌生物膜形成中的应用。
又一实施方式提供了D-半乳糖在生产细菌生物膜形成抑制剂中的应用。
又一实施方式提供了一种用于预防和/或治疗口腔细菌性疾病的药物组合物，所述组合物包括药学上有效量的D-半乳糖。
又一实施方式提供了一种用于预防和/或改善口腔细菌性疾病的食物组合物，所述组合物包括D-半乳糖。
又一实施方式提供了一种用于预防和/或治疗和/或改善口腔细菌性疾病的方法，所述方法包括向需要预防和/或治疗或改善口腔细菌性疾病的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。
又一实施方式提供了D-半乳糖在预防和/或治疗和/或改善口腔细菌性疾病中的应用。
又一实施方式提供了D-半乳糖在制备预防和/或治疗和/或改善口腔细菌性疾病的组合物中的应用。
在用于预防和/或治疗的上述组合物、方法和/或应用中，所述口腔细菌性疾病可以是龋齿或牙周病(例如牙周炎、齿龈炎等)。
技术方案
D-半乳糖是在奶中发现的一种糖。乳糖构成约奶的2～8％，并且分解成单糖，葡萄糖和D-半乳糖。D-半乳糖是已经过长时间使用的天然物质，一旦证明了它的功效，则它的工业化是可能的。本说明书证明了D-半乳糖的群体感应抑制功效比已知具有群体感应抑制功效的D-核糖高两倍，从而提出了D-半乳糖作为群体感应抑制剂的应用。
群体感应(QS)是细菌细胞与细胞的信息交流过程，这一过程不仅诱导生物膜形成，还增加毒性。群体感应抑制剂是克服了目前抗生素的局限性，并且有效控制如龋齿、牙周感染等口腔疾病的有希望的下一代抗生素。因此，本说明书提出了D-半乳糖作为口腔细菌性疾病(或口腔炎症性疾病)的治疗药剂的应用，其中D-半乳糖具有群体感应抑制剂的效果，从而克服了抗生素的局限性。
首先，一个方面提供了一种用于抑制细菌群体感应的组合物，所述组合物包括药学上有效量的D-半乳糖。
另一方面提供了一种用于抑制细菌群体感应的方法，所述方法包括向需要抑制细菌群体感应的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。
又一方面提供了D-半乳糖在抑制细菌群体感应中的应用。
又一方面提供了D-半乳糖在生产细菌群体感应抑制剂中的应用。
所述细菌可以是口腔致病细菌。所述口腔致病细菌可以是选自由以下细菌组成的组中的一种或多种，例如一种、两种或更多种，或三种或更多种：引起牙周病的细菌，如属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌(例如核粒梭形杆菌Fusobacterium nucleatum等)，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌(例如牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis等)，属于坦纳菌Tannerella属的细菌(例如福赛斯坦纳菌Tannerella forsythia等)，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌(例如伴放线菌凝聚杆菌Aggregatibacteractinomycetemcomitans等)，属于密螺旋体Treponema属的细菌(例如牙垢密螺旋体Treponema denticola等)，属于普氏菌Prevotella属的细菌(例如中间普氏菌Prevotellaintermedia等)；和，致龋菌，如属于链球菌Streptococcus属的细菌(例如变异链球菌Streptococcus mutans、表兄链球菌Streptococcus sobrinus等)。
如上所述，当细菌分泌的信号传导分子的数量达到临界值，即细菌感应到(群体感应，QS)的法定数量(Quorum)时，细菌分泌并检测群体感应自体诱导物(AI)，从而形成生物膜并产生毒性。因此，当抑制群体感应自体诱导物时，可抑制群体感应，从而抑制生物膜形成和毒性。群体感应自体诱导物可选自用于种内信息交流的自体诱导物-1(AI-1)，用于种间信息交流(即，作用于不同物种)以及种内信息交流(即，作用于同一物种)的自体诱导物-2(AI-2)，肽类群体感应自体诱导物，等等。在这些群体感应自体诱导物中，AI-2是作用于种间信息交流以及种内信息交流的通用信号，在生物膜形成和毒性因子表达中起到重要作用。
如在本说明书实施例7中所证明的，D-半乳糖对AI-2活性具有优异的抑制效果。
因此，又一方面提供了一种用于抑制细菌群体感应自体诱导物的组合物，所述组合物包括药学上有效量的D-半乳糖。
又一方面提供了一种用于抑制细菌群体感应自体诱导物的方法，所述方法包括向需要抑制细菌群体感应自体诱导物的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。
又一方面提供了D-半乳糖在抑制细菌群体感应自体诱导物中的应用。
又一方面提供了D-半乳糖在生产细菌群体感应自体诱导物抑制剂中的应用。
所述群体感应自体诱导物可以是自体诱导物-1(AI-1)、自体诱导物-2(AI-2)或它们的混合物，例如可以是AI-2。所述群体感应自体诱导物可来源(分离)于口腔致病菌。例如，所述群体感应自体诱导物可来源(分离)于选自由以下细菌组成的组中的一种或多种，例如一种、两种或更多种，或三种或更多种：引起牙周病的细菌，如属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌(例如核粒梭形杆菌Fusobacterium nucleatum等)，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌(例如牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis等)，属于坦纳菌Tannerella属的细菌(例如福赛斯坦纳菌Tannerella forsythia等)，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌(例如伴放线菌凝聚杆菌Aggregatibacteractinomycetemcomitans等)，属于密螺旋体Treponema属的细菌(例如牙垢密螺旋体Treponema denticola等)，属于普氏菌Prevotella属的细菌(例如中间普氏菌Prevotellaintermedia等)；和，致龋菌，如属于链球菌Streptococcus属的细菌(例如变异链球菌Streptococcus mutans、表兄链球菌Streptococcus sobrinus等)。在一个实施方式中，所述群体感应自体诱导物可以是来源于核粒梭形杆菌Fusobacterium nucleatum的AI-2，但并不限于此。
如上所述，可通过抑制群体感应自体诱导物来抑制细菌生物膜形成。
因此，又一方面提供了一种用于抑制细菌生物膜形成的组合物，所述组合物包括药学上有效量的D-半乳糖。
又一方面提供了一种用于抑制细菌生物膜形成的方法，所述方法包括向需要抑制细菌生物膜形成的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。
又一方面提供了D-半乳糖在抑制细菌生物膜形成中的应用。
又一方面提供了D-半乳糖在生产细菌生物膜形成抑制剂中的应用。
所述生物膜可由选自由以下细菌组成的组中的一种或多种，例如一种、两种或更多种，或三种或更多种形成：引起牙周病的细菌，如属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌(例如核粒梭形杆菌Fusobacterium nucleatum等)，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌(例如牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis等)，属于坦纳菌Tannerella属的细菌(例如福赛斯坦纳菌Tannerella forsythia等)，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌(例如伴放线菌凝聚杆菌Aggregatibacter actinomycetemcomitans等)，属于密螺旋体Treponema属的细菌(例如牙垢密螺旋体Treponema denticola等)，属于普氏菌Prevotella属的细菌(例如中间普氏菌Prevotella intermedia等)；和，致龋菌，如属于链球菌Streptococcus属的细菌(例如变异链球菌Streptococcus mutans、表兄链球菌Streptococcus sobrinus等)。
因为细菌的生物膜形成与毒性有关，因此可通过对生物膜形成的抑制效果来降低病原性细菌的毒性，并且可预防和/或治疗与病原性细菌相关的口腔细菌性疾病。
因此，又一方面提供了一种用于预防和/或治疗口腔细菌性疾病的药物组合物，所述组合物包括药学上有效量的D-半乳糖。
又一方面提供了一种用于预防和/或改善口腔细菌性疾病的食物组合物，所述组合物包括D-半乳糖。所述食物组合物可以是选自由各种食物、饮品、食物添加剂等组成的组中的一种或多种。
又一方面提供了一种用于抑制引起口腔细菌性疾病的细菌的方法，所述方法包括向需要抑制引起口腔细菌性疾病的细菌的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。所述对象可以是需要降低引起口腔细菌性疾病的细菌的毒性的对象，并且所述抑制方法可以是降低引起口腔细菌性疾病的细菌的毒性的方法。
又一方面提供了一种用于预防和/或治疗和/或改善口腔细菌性疾病的方法，所述方法包括向需要预防和/或治疗和/或改善口腔细菌性疾病的对象给药药学上有效量的D-半乳糖。
又一方面提供了D-半乳糖在预防和/或治疗和/或改善口腔细菌性疾病中的应用。
又一方面提供了D-半乳糖在制备预防和/或治疗和/或改善口腔细菌性疾病的组合物中的应用。
所述口腔细菌性疾病可以是如龋齿或牙周病(例如牙周炎、齿龈炎等)等口腔细菌性疾病。所述引起口腔细菌性疾病的细菌可以是选自由以下细菌组成的组中的一种或多种，例如一种、两种或更多种，或三种或更多种：引起牙周病的细菌，如属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌(例如核粒梭形杆菌Fusobacterium nucleatum等)，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌(例如牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis等)，属于坦纳菌Tannerella属的细菌(例如福赛斯坦纳菌Tannerella forsythia等)，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌(例如伴放线菌凝聚杆菌Aggregatibacteractinomycetemcomitans等)，属于密螺旋体Treponema属的细菌(例如牙垢密螺旋体Treponema denticola等)，属于普氏菌Prevotella属的细菌(例如中间普氏菌Prevotellaintermedia等)；和，致龋菌，如属于链球菌Streptococcus属的细菌(例如变异链球菌Streptococcus mutans、表兄链球菌Streptococcus sobrinus等)。
在本说明书提出的组合物、方法和/或应用中，活性成分D-半乳糖的特征在于，它对(非病原性)正常口腔菌群不表现出抑制效果，如不表现出群体感应抑制、群体感应自体诱导物抑制和生物膜形成抑制。所述正常口腔菌群通常存在于口腔中，但是是非病原性的，并且在一些情况下参与口腔免疫。因此，在本说明书提出的组合物、方法和/或应用中，D-半乳糖用作活性成分来选择性抑制上述口腔致病细菌，而不抑制正常口腔菌群，从而保持口腔健康并且表现出预防和/或治疗口腔疾病的效果。所述正常口腔菌群可以是选自由口腔链球菌Streptococcus oralis、唾液链球菌Streptococcus salivarius和缓症链球菌Streotpcoccus mitis组成的组中的一种或多种。
在本说明书提出的组合物、方法和/或应用中，可依赖于可用形式、使用目的、应用对象的健康状况以及症状的类型和严重程度，来调节活性成分D-半乳糖的量(含量)。例如，所述组合物中的D-半乳糖的含量可以是0.001重量％～50重量％，0.001重量％～30重量％，0.001重量％～10重量％，0.001重量％～5重量％，或0.001重量％～1重量％，但并不限于此。
此外，活性成分的足够给药剂量可随对象的年龄、体重或性别，给药形式、健康状况和疾病严重程度的不同而不同。而且，根据医师或药剂师的判断，可一天给药一次或一天给药数次。例如，所述活性成分可以0.0001～100mg/kg或0.0005～50mg/kg的剂量使用。该使用剂量仅是平均剂量的示例，其可依赖于对象而增加或减少。
如本文所使用的，术语“药学上有效量”指显示出期望药理学效果的活性成分的含量或给药量，其可依赖于各种因素，如配制方法，给药方式，对象的年龄、体重和性别，病理状况，饮食，给药时间，给药频率，给药途径，排泄率和响应灵敏度来确定。
待给药活性成分D-半乳糖的对象可以是如人等哺乳动物，并且它可经由各种途径来给药。活性成分的给药方式可以是通常使用的任意给药方式，例如可以是口服给药、颊给药或非口服给药，如局部给药至损害处(例如，用于口腔如颊粘膜、牙齿、齿龈、舌等的外部给药)。根据通用方法，所述药物组合物可被配制成：口服配制剂，如粉剂、粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾剂等；肠胃外配制剂，如经皮制剂和可注射的无菌溶液；或，用于如颊粘膜、牙齿、齿龈、舌等口腔的外部配制剂，如溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、贴剂、气雾剂、软膏、喷雾剂等。
除了所述活性成分之外，所述组合物可进一步包括辅助物质，如药学上可接受的和/或营养学上可接受的和/或生理学上可接受的载剂、赋形剂和稀释剂。所述组合物所含的载剂、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。在配制时，可使用通用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、粒剂、胶囊等，这样的固体制剂可通过将所述活性成分与至少一种赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)混合来制备。另外，除了赋形剂之外，还可使用润滑剂，如硬脂酸镁和滑石。用于口服给药的制剂可以是悬浮液、内服的液体、乳剂、糖浆、软膏等，除了常用的简单稀释剂，如水、液体石蜡等之外，该制剂还可包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外给药或口腔外部给药的制剂可包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干的配制剂和经皮制剂中的至少一种。作为所述非水溶剂和悬浮液，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯)等。
作为包含在健康功能性食物中的活性成分，D-半乳糖的含量根据食物的类型、期望用途等而没有特殊限制，例如，基于食物的总重量，添加的D-半乳糖的量可以为0.01～15重量％，并且基于100ml健康饮品组合物，添加的D-半乳糖的量可以为0.02～10g，优选0.3～1g。
又一方面提供了一种包括D-半乳糖的口服产品。所述口服产品可具有预防和/或改善口腔细菌性疾病，例如龋齿、牙周病等的效果。所述口服产品可以是选自由牙膏、漱口水、口腔喷雾剂、口香糖、口腔软膏和口腔贴片组成的组成中的一种或多种。
所述口服产品可以与适当量的添加剂混合，该添加剂选自由按照应用的类型和目的通常使用的研磨剂、润湿剂、粘合剂、发泡剂、甜味剂、防腐剂、药剂、调味剂、酸度调节剂、增亮剂组成的组。
例如，研磨剂可以是选自由磷酸一氢钙、沉淀的氧化硅、碳酸钙、水合氧化铝、高岭土和碳酸氢钠(NaHCO3)组成的组中的一种或多种，并且研磨剂的含量可以是20～60重量％(基于产品的总重量，下文，同上)，但并不限于此。润湿剂可以是选自由甘油、山梨醇、非结晶山梨醇溶液、丙二醇、聚乙二醇和木糖醇组成的组中的一种或多种，并且基于组合物的总重量，以20～60重量％的量来使用，但并不限于此。粘合剂可以是选自由角叉菜胶、黄原胶、羧甲基纤维素钠、聚羧乙烯、海藻酸钠和合成锂皂石组成的组中的一种或多种，并且以0.1～3.0重量％，例如0.5～2.0重量％的量来使用，但并不限于此。作为发泡剂，可以使用选自由阴离子表面活性剂(如月桂基硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠等)和山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合聚合物组成的组中的一种或多种，并且发泡剂的含量可以是0.5～5.0重量％，例如0.5～3.5重量％，但并不限于此。作为甜味剂，可单独或以两种或更多种组合使用糖精钠、阿斯巴甜和甘草酸，并且甜味剂的含量可以是0.05～0.5重量％，但并不限于此。作为防腐剂，可单独或以两种或更多种组合使用对-羟基苯甲酸酯和苯甲酸钠。作为药剂，可混合氟化钠、单氟磷酸钠、氟化亚锡、氟化胺、氯己定、氨甲环酸、尿囊素、己酸、多聚磷酸盐、酶、草本提取物等。作为调味剂，可以适当比例混合薄荷油、留兰香油、薄荷醇、碳等。作为酸度调节剂，可使用磷酸、磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、琥珀酸、琥珀酸钠、酒石酸、酒石酸钠等，并且优选pH值是5～8。作为增亮剂，可以例如0.1～2重量％的量使用氧化钛，但并不限于此。
有益效果
如上所述，暗示了D-半乳糖具有比D-核糖更优异的功效，已知在糖中，D-核糖作为群体感应抑制剂具有最优异的活性。D-半乳糖能有效阻止通过引起两种典型口腔疾病(牙周炎和龋齿)的细菌群体感应来形成生物膜。
附图说明
图1是示出结晶紫染色结果的柱状图，通过结晶紫染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn AI-2诱导的核粒梭形杆菌F.nucleatum(Fn)生物膜形成的抑制效果(*：示出与Fn生物膜(用‘Fn’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Fn添加AI-2形成的生物膜(用‘Fn/AI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图2是示出荧光染色结果的荧光图像，通过荧光染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn AI-2诱导的核粒梭形杆菌F.nucleatum(Fn)生物膜形成的抑制效果，其中活的细菌显示为浅灰色(横线：10μm)；
图3是对图2的荧光图像的荧光密度进行量化的柱状图(*：示出与单一Fn生物膜(用‘Fn’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Fn添加AI-2形成的生物膜(用‘Fn/AI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图4是示出结晶紫染色结果的柱状图，通过结晶紫染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn AI-2诱导的牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(Pg)生物膜形成的抑制效果(*：示出与单一Pg生物膜(用‘Pg’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Pg添加AI-2形成的生物膜(用‘Pg/AI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图5是示出荧光染色结果的荧光图像，通过荧光染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn AI-2诱导的牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(Pg)生物膜形成的抑制效果，其中活的细菌显示为浅灰色(横线：10μm)；
图6是对图5的荧光图像的荧光密度进行量化的柱状图(*：示出与单一Pg生物膜(用‘Pg’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Pg添加AI-2形成的生物膜(用‘Pg.FnAI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图7是示出结晶紫染色结果的柱状图，通过结晶紫染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn AI-2诱导的福赛斯坦纳菌T.forsythia(Tf)生物膜形成的抑制效果(*：示出与单一Tf生物膜(用‘Tf’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Tf添加AI-2形成的生物膜(用‘Tf/AI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图8是示出荧光染色结果的荧光图像，通过荧光染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn AI-2诱导的福赛斯坦纳菌T.forsythia(Tf)生物膜形成的抑制效果(横线：10μm)；
图9是对图8的荧光图像的荧光密度进行量化的柱状图(*：示出与Tf生物膜(用‘Tf’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Tf添加AI-2形成的生物膜(用‘Tf.FnAI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图10是示出结晶紫染色结果的柱状图，通过结晶紫染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn分泌物质诱导的牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(Pg)生物膜形成的抑制效果(*：示出与单一Pg生物膜(用‘仅Pg’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Pg添加Fn分泌物质形成的生物膜(用‘Fn/Pg/AI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图11是示出结晶紫染色结果的柱状图，通过结晶紫染色来检验群体感应抑制剂候选物对Fn分泌物质诱导的福赛斯坦纳菌T.forsythia(Tf)生物膜形成的抑制效果(*：示出与单一Tf生物膜(用‘仅Tf’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05)；#：示出与通过向Tf添加Fn分泌物质形成的生物膜(用‘Fn/Tf/AI-2’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图12是示出在经Fn AI-2和群体感应抑制剂候选物处理哈维弧菌V.harveyiBB170之后测量的生物发光的柱状图，其中较低的生物发光指示Fn AI-2较高的抑制活性；
图13是经D-gal处理或未经D-gal处理的核粒梭形杆菌F.nucleatum的生长曲线；
图14是示出结晶紫染色结果的柱状图，通过结晶紫染色来检验D-gal对变异链球菌S.mutans(Sm)生物膜形成的抑制效果(*：示出与单一Sm生物膜(用‘Sm’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))；
图15是示出荧光染色结果的荧光图像，通过荧光染色来检验D-gal对变异链球菌S.mutans(Sm)生物膜形成的抑制效果(横线：10μm)；
图16是对图15的荧光图像的荧光密度进行量化的柱状图(#：示出与变异链球菌S.mutans(Sm)相比具有统计学显著性(p<0.05))；和
图17是示出结晶紫染色结果的柱状图，通过结晶紫染色来检验D-gal对口腔链球菌S.oralis(So)生物膜形成的抑制效果(*：示出与单一So生物膜(用‘So’表示)相比具有统计学显著性(p<0.05))。
具体实施方式
实施例
下面，将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例仅用于说明本发明，而不构成对本发明的限制。
实施例1：细菌培养
将群体感应测试中待使用的引起牙周病的细菌核粒梭形杆菌F.nucleatum(ATCC25586)培养在消化培养基(6g胃消化的动物组织、6g脱水牛肉膏、5g氯化钠、14.5g胰腺消化酪蛋白、2.5g磷酸钠)中，将牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(ATCC 33277)培养在补充了血红素(10mg/ml)和维生素K(0.2mg/ml)的脑心浸液培养基中，并且将福赛斯坦纳菌T.forsythia(ATCC 43037)培养在补充了维生素K(0.2mg/ml)和N-乙酰胞壁酸(0.01mg/ml)的新口螺旋体(NOS)肉汤(ATCC Medium 1494)中。细菌在厌氧条件(5％H2、10％CO2和85％N2)下，37℃孵育2～4天。将AI-2报告株哈维弧菌Vibrio harveyi BB170(ATCC BAA-1117)和产生AI-2的菌株哈维弧菌V.harveyi BB152(ATCC BAA-1119)培养在30℃自体诱导物生物测定(AB)培养基(ATCC Medium 2746)中，直至OD660nm＝0.7。在37℃，有氧条件下，将致龋菌变异链球菌Streptococcus mutans(ATCC 25175)和正常口腔菌群之一口腔链球菌Streptococcus oralis(ATCC 9811)在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基(17g胰腺消化酪蛋白、3g豆粕酶消化物、2.5g右旋糖、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾)中培养24小时。
实施例2：群体感应(QS)抑制剂候选物的制备
准备作为自体诱导物-2(AI-2)群体感应(QS)抑制剂(AI-2Quorum SensingInhibitor，QSI)候选物的D-核糖(D-rib)、D-半乳糖(D-gal)、D-葡萄糖(D-Glu)、D-甘露糖(D-Man)和D-阿拉伯糖(D-ara)。D-核糖购自Tokyo Chemical Industry Co.(日本东京)，其它抑制剂候选物购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。此外，合成化合物(5Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮(呋喃酮化合物；Fur)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，准备作为QSI候选物(阳性对照)。
实施例3：测试对核粒梭形杆菌F.nucleatum(Fn)生物膜形成的抑制效果
核粒梭形杆菌F.nucleatum(Fn)是主要的牙周病原菌，在牙周病原菌生物膜形成中起到介体的作用并且在牙周病中起到重要作用。
为了测试Fn的生物膜形成，将Fn发酵液(2ml；阴性对照组，细菌数量：2×107/ml)，Fn发酵液(2ml)和核粒梭形杆菌F.nucleatum AI-2(使用C18Sep-Pak反相柱(Waters Co.,Milford,MA)纯化来自核粒梭形杆菌F.nucleatum发酵液的核粒梭形杆菌F.nucleatum的分泌物质；下文称为‘Fn AI-2’；相对于与Fn发酵液的混合物的总体积为10％(v/v))的混合物，或Fn发酵液(2ml)和Fn AI-2(相对于与Fn发酵液的混合物的总体积为10％(v/v))和各QSI候选物的混合物，添加到有盖玻片(圆形，12mm半径)的24孔板上，并且在厌氧条件下培养48～72小时。作为QSI候选物，使用量为2μM的糖(D-rib、D-gal、D-Glu、D-Man或D-ara)，并且使用量为2μM的呋喃酮化合物[(5Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮]。
使用10％结晶紫[三(4-(二甲氨基)苯基)甲基氯化物]对盖玻片上形成的生物膜染色10分钟，用PBS洗涤三次，使用1ml丙酮-醇(20:80，vol/vol)脱色。使用酶标仪(WallacVictor3microtiter,PerkinElmer Life Sciences,Waltham,MA)，测量含结晶紫的脱色液在590nm处的光密度。在590nm处测量的较小的光密度(OD590)表示对生物膜形成具有更强的抑制，即所使用的QSI候选物具有更高的群体感应抑制效果。
下面表1和图1中给出了Fn生物膜形成的结果。
[表1]
样品 OD590nm
无 0
Fn 0.46
Fn/AI-2(阴性对照) 1.5
Fn/AI-2/Fur 2μM 0.49
Fn/AI-2/D-gal 2mM 0.57
Fn/AI-2/D-rib 2mM 0.77
Fn/AI-2/D-glu 2mM 1.15
Fn/AI-2/D-man 2mM 1.16
Fn/AI-2/D-ara 2mM 1.37
如表1和图1所示，当仅向Fn添加AI-2时，生物膜形成是增强的。但是，在添加了如D-gal等QSI候选物之后，生物膜形成受到了抑制。该结果表明与阴性对照组相比，作为QSI候选物的所有糖都具有显著的QSI抑制效果，具体地，D-gal具有与呋喃酮化合物相等的优异的QSI抑制效果(对生物膜形成的抑制效果)。
此外，通过荧光染色检验了各QSI候选物对Fn AI-2诱导的Fn生物膜形成的抑制效果。使用2ml Fn发酵液(细菌数量：2×107/ml)，Fn AI-2以相对于与Fn发酵液的混合物的总体积相比为10％(v/v)的体积来使用。作为QSI候选物，使用200mM D-rib或D-gal，并且使用20μM呋喃酮化合物。使用live/dead-BacLight存活力试剂盒(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)，用荧光染料对盖玻片上形成的生物膜进行染色，并且使用共聚焦显微镜(CarlZeiss,LSM 700)观察。获得的荧光图像示于图2中。在荧光图像中，活的细菌经SYTO Green染色发出绿色荧光(在图2中显示为浅灰色)，死的细菌经碘化丙啶(PI)染色显示出红色荧光。获得的各荧光图像的荧光强度使用共聚焦显微镜的ZEN2010程序进行量化，并且示于图3中。
如图2和图3所示，形成的Fn生物膜经荧光染色，然后通过共聚焦显微镜进行分析。获得的结果与结晶紫染色的结果一致，当仅向Fn添加AI-2时，Fn生物膜形成是增强的，但是在向Fn添加如D-gal或D-rib等QSI候选物时，Fn生物膜形成受到了抑制。具体地，D-gal示出对Fn生物膜形成有非常优异的抑制效果。
实施例4：测试对牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(Pg)生物膜形成的抑制效果
已知牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(Pg)是与如牙槽骨质丢失等牙周炎以及如动脉硬化等系统性疾病高度相关的细菌。
为了测试Pg的生物膜形成，以与实施例3相同的方式进行了测试。即，将Pg发酵液(2ml；阴性对照组，细菌数量：4×108/ml)，Pg发酵液(2ml)和Fn AI-2(相对于与Pg发酵液的混合物的总体积为10％(v/v))的混合物，或Pg发酵液(2ml)和Fn AI-2(相对于与Pg发酵液的混合物的总体积为10％(v/v))和D-gal(2mM)的混合物，添加到有盖玻片(圆形，12mm半径)的24孔板上，并且在厌氧条件下培养48～72小时。作为对比，使用2μM呋喃酮化合物[(5Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮]取代D-gal(2mM)进行了相同的测试。
使用10％结晶紫[三(4-(二甲氨基)苯基)甲基氯化物]对盖玻片上形成的生物膜染色10分钟，用PBS洗涤三次，使用1ml丙酮-醇(20:80，vol/vol)脱色。使用酶标仪(WallacVictor3microtiter,PerkinElmer Life Sciences,Waltham,MA)，测量含结晶紫的脱色液在590nm处的光密度。在590nm处测量的较小的光密度(OD590)表示对生物膜形成具有更强的抑制，即所使用的QSI候选物具有更高的群体感应抑制效果。
下面表2和图4中给出了Pg生物膜形成的结果。
[表2]
样品 OD590nm
无 0
Pg 0.66
Pg/AI-2(阴性对照) 2.00
Pg/AI-2/Fur 2μM 0.98
Pg/AI-2/D-gal 2mM 1.24
如表2和图4所示，D-gal对Pg生物膜形成具有与呋喃酮化合物相等的抑制效果。
此外，通过荧光染色检验了D-gal对Fn AI-2诱导的Pg生物膜形成的抑制效果。使用2ml Pg发酵液(细菌数量：4×108/ml)，Fn AI-2以相对于与Pg发酵液的混合物的总体积相比为10％(v/v)的体积来使用。使用200mM D-gal，并且作为对比，使用20μM呋喃酮化合物(而不是D-gal)进行相同的测试。使用live/dead-BacLight存活力试剂盒(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)，用荧光染料对盖玻片上形成的生物膜进行染色，并且使用共聚焦显微镜(Carl Zeiss,LSM 700)观察。获得的荧光图像示于图5中。在荧光图像中，活的细菌经SYTO Green染色发出绿色荧光(在图5中显示为浅灰色)，死的细菌经碘化丙啶(PI)染色发出红色荧光。获得的各荧光图像的荧光强度使用共聚焦显微镜的ZEN2010程序进行量化，并且示于图6中。
如图5和图6所示，形成的Pg生物膜经荧光染色，然后通过共聚焦显微镜进行分析。获得的结果与结晶紫染色的结果一致，当仅向Pg添加AI-2时，Pg生物膜形成是增强的，但是在向Pg添加如D-gal等QSI候选物时，Pg生物膜形成受到了抑制。发现D-gal对Pg生物膜形成具有与呋喃酮化合物相等的抑制效果。
实施例5：测试对福赛斯坦纳菌T.forsythia(Tf)生物膜形成的抑制效果
福赛斯坦纳菌T.forsythia(Tf)是在牙周组织中示出最高病原性的红色复合(red-complex)菌之一。
为了测试Tf的生物膜形成，以与实施例3相同的方式进行了测试。即，将Tf发酵液(2ml；阴性对照组，细菌数量：2×108/ml)，Tf发酵液(2ml)和Fn AI-2(相对于与Tf发酵液的混合物的总体积为10％(v/v))的混合物，或Tf发酵液(2ml)和Fn AI-2(相对于与Tf发酵液的混合物的总体积为10％(v/v))和D-gal(2mM)的混合物，添加到有盖玻片(圆形，12mm半径)的24孔板上，并且在厌氧条件下培养48～72小时。作为对比，使用2mM D-rib或2μM呋喃酮化合物[(5Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮]取代D-gal进行了相同的测试。
使用10％结晶紫[三(4-(二甲氨基)苯基)甲基氯化物]对盖玻片上形成的生物膜染色10分钟，经PBS洗涤三次，使用1ml丙酮-醇(20:80，vol/vol)脱色。使用酶标仪(WallacVictor3microtiter,PerkinElmer Life Sciences,Waltham,MA)，测量含结晶紫的脱色液在590nm处的光密度。在590nm处测量的较小的光密度(OD590)表示对生物膜形成具有更强的抑制，即所使用的QSI候选物具有更高的群体感应抑制效果。
下面表3和图7中给出了Tf的生物膜形成的结果。
[表3]
样品 OD590nm
无 0
Tf 0.32
Tf/AI-2(阴性对照) 0.48
Tf/AI-2/Fur 2μM 0.35
Tf/AI-2/D-gal 2mM 0.2
Tf/AI-2/D-rib 2mM 0.41
如表3和图7所示，D-gal和D-rib示出对Tf生物膜形成具有显著抑制效果，D-gal尤其示出对Tf生物膜形成具有优异的抑制效果。
此外，通过荧光染色检验了各QSI候选物对Fn AI-2诱导的Tf生物膜形成的抑制效果。使用2ml Tf发酵液(细菌数量：2×108/ml)，Fn AI-2以相对于与Tf发酵液的混合物的总体积相比为10％(v/v)的体积来使用。作为QSI候选物，使用200mM D-rib或D-gal，并且使用20μM呋喃酮化合物。使用live/dead-BacLight存活力试剂盒(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)，用荧光染料对盖玻片上形成的生物膜进行染色，并且使用共聚焦显微镜(CarlZeiss,LSM 700)观察。得的荧光图像示于图8中。在荧光图像中，活的细菌经SYTO Green染色发出绿色荧光，死的细菌经碘化丙啶(PI)染色显示出红色荧光。获得的各荧光图像的荧光强度使用共聚焦显微镜的ZEN 2010程序进行量化，并且示于图9中。
如图8和图9所示，形成的Tf生物膜经荧光染色，然后通过共聚焦显微镜进行分析。获得的结果与结晶紫染色的结果一致，当仅向Tf添加AI-2时，Tf生物膜形成是增强的，但是添加如D-gal或D-rib等QSI候选物时，Tf生物膜形成受到了抑制。具体地，发现D-gal对Tf生物膜形成具有最优异的抑制效果。
实施例6：使用迁移(Transwell)测试对核粒梭形杆菌F.nucleatum(Fn)分泌物质诱导的牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(Pg)或福赛斯坦纳菌T.forsythia(Tf)生物膜形成的抑制效果
为了检验群体感应抑制剂(QSI)候选物对核粒梭形杆菌F.nucleatum(Fn)分泌物质诱导的牙周病原菌生物膜形成的功效，使用transwell系统进行了测试。在Fn分泌物质中含有Fn天然分泌的AI-2。因此，在使用transwell系统的测试中，没有向细菌直接添加FnAI-2，而是将Fn放置在上部小室中，将Pg或Tf放置在下部小室中。使用结晶紫，对存在或不存在QSI候选物的情况下培养和形成的生物膜进行染色，然后进行分析。这些条件是来评价Pg或Tf生物膜形成是否受非纯化的AI-2，Fn天然分泌的含AI-2的分泌物质的影响，并且评价如果之后形成了生物膜，如D-gal等QSI候选物是否能抑制该生物膜的形成。
更具体地，transwell系统(24孔)具有彼此通过0.4μm膜分离开的上部小室和下部小室。500μl核粒梭形杆菌F.nucelatum(Fn)发酵液(细菌数量：2×107CFU/ml)培养在上部小室中。盖玻片放置在下部小室中，然后将相同数量的牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis(Pg)或福赛斯坦纳菌T.forsythia(Tf)接种在1ml培养基中并且培养48～72小时。将相同的QSI候选物添加到上部和下部小室中。作为QSI候选物，使用2mM糖(D-rib或D-gal)，并且使用2μM呋喃酮化合物[(5Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮]。为了检验下部腔室中的细菌的生物膜形成是否受到Fn分泌物质和QSI候选物的影响，使用结晶紫对盖玻片上形成的生物膜进行染色，然后进行量化(参见实施例3至实施例5)。
在培养下部腔室中的Pg之后获得的结果示于表4和图10中。
[表4]
样品 OD590nm
无 0
仅Pg 0.30
Fn/Pg 0.57
Fn/Pg/Fur 2μM 0.30
Fn/Pg/D-gal 2mM 0.45
Fn/Pg/D-rib 2mM 0.58
此外，在培养腔室中的Tf之后获得的结果示于表5和图11中。
[表5]
样品 OD590
无 0
仅Tf 0.17
Fn/Tf 0.55
Fn/Tf/Fur 2μM 0.39
Fn/Tf/D-gal 2mM 0.36
Fn/Tf/D-rib 2mM 0.69
如在表4和表5以及图10和图11中所示，Fn分泌物质增加了Pg或Tf生物膜形成，但通过D-gal的处理抑制了该Pg或Tf生物膜形成。发现D-gal具有比D-rib明显优异的抑制效果。
实施例7：测试D-半乳糖对AI-2活性的抑制活性
在本实施例中，证明了在实施例3～实施例6中示出对生物膜形成具有最优异抑制效果的D-半乳糖不是通过杀死细菌或抑制细菌间的粘附以抑制细菌间聚集或生物膜形成来发挥效果的，而是通过抑制细菌间的群体感应来发挥效果的。
群体感应自体诱导物AI-2刺激哈维弧菌V.harveyi的荧光素酶操纵子(lux基因)以诱导荧光素酶表达，最终引起发光。因此，通过测量AI-2的生物发光来证实AI-2活性的抑制。使用AI-2报告株哈维弧菌V.harveyi BB170，确定由AI-2介导的生物发光。哈维弧菌V.harveyi BB170在AB培养基中，在30℃培养过夜，直至OD600nm＝0.7。细菌经新鲜的AB培养基洗涤，并且稀释至106细胞/ml的浓度。之后，哈维弧菌V.harveyi BB170发酵液(5ml)与部分纯化的核粒梭形杆菌F.nucleatum AI-2(‘Fn AI-2’)和D-gal(0或20mM)或D-rib(0或20mM)混合。使用C18Sep-Pak反相柱(Waters Co.,Milford,MA)部分纯化Fn发酵液，获得部分纯化的Fn AI-2。添加Fn发酵液或部分纯化的Fn AI-2，以便AI-2在混合物中的终浓度是10％(vol/vol)。10％(v/v)的Fn AI-2对应于1.9×108的Fn细菌数量。然后，在30℃培养1～8小时。使用光度计(GloMax1-Multi detection System,Promega,Madison,WI)测量生物发光。BB170是具有识别AI-2以示出生物发光的特征的哈维弧菌V.harveyi菌之一。因此，测量的较高的生物发光值表示较高的AI-2活性。
获得的结果示于表6和图12中。
[表6]
样品 生物发光
BB170 856873
Fn/AI-2 10712312
Fn/AI-2D-gal 20mM 1138752
Fn/AI-2D-rib 20mM 5481975
如表6和图12中所示，当添加D-gal时，明显降低了生物发光(为添加D-rib时生物发光的约20％)，表明D-gal是抑制AI-2活性的群体感应抑制剂。
群体感应是引起龋齿和牙周病的细菌的生物膜形成和毒性表达的必要过程。因此，在本实施例中，暗示了D-半乳糖是抑制AI-2活性的优异的群体感应抑制剂，通过这种作用抑制了生物膜形成和毒性表达，而且D-半乳糖还是超越了简单抑制Fn和几种细菌之间聚集的限制，能广泛控制生物膜形成和牙周病的材料。
实施例8：D-半乳糖对细菌生长的效果
在本实施例中，测试了D-半乳糖对细菌生长的效果，其中D-半乳糖在实施例3至实施例6中示出对生物膜形成具有最优异的抑制效果。
详细来讲，核粒梭形杆菌F.nucleatum在0mM(对照组)和100mM D-半乳糖的存在下，在37℃厌氧条件培养24～48小时，然后测定600nm处的光密度以测量细胞生长。
获得的结果示于图13中。如图13中所示，当添加D-gal时，细胞生长曲线示出与没有添加D-gal的对照组(Cont)类似的模式，这表明D-gal不直接杀死细菌，也不影响细菌生长。
实施例9：D-半乳糖对致龋菌生物膜形成的抑制功效
根据最近的报道，龋齿不是由单一物种变异链球菌S.mutans(Sm)(是已知的典型致龋菌)引起的，而是由具有类似特性的几种细菌(变异链球菌)形成的生物膜引起的。致龋菌Sm在其表面上表达促进细菌粘附至唾液薄膜包被的牙齿表面的葡萄糖转移酶和葡聚糖结合蛋白，并且还向周围区域分泌该葡萄糖转移酶和葡聚糖结合蛋白。因此，更大量的细菌与粘附至牙齿的Sm结合，形成生物膜，从而积累细菌代谢物乳酸。结果导致牙齿周围的pH降低至5.5或更低，引起蛀牙，从而产生龋齿。
在本实施例中，从上述已知的事实，推测出引起龋齿的生物膜形成和高酸性物质的分泌是由AI-2介导的，因此测试了之前发现抑制牙周病原菌生物膜形成的D-gal是否显示出它对龋齿菌的功效。
分别向唾液包被的盖玻片(圆形，12mm半径)添加2mL(2×107/ml)典型致龋菌变异链球菌S.mutans(Sm)的发酵液和2mL(2×107/ml)正常口腔菌群之一口腔链球菌S.oralis(SO)的发酵液，与0mM或2mM D-半乳糖一起培养以形成生物膜。使用结晶紫以与实施例3至实施例6相同的方式对形成的生物膜进行染色，以测试在D-半乳糖存在下的生物膜形成。此外，使用live/dead-BacLight存活力试剂盒(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)，用荧光染料对生物膜进行染色，然后进行分析。为了进行对比，使用2μM呋喃酮化合物取代D-半乳糖来进行相同的测试。
Sm的生物膜形成的结果示于下面的表7和图14中。
[表7]
样品 OD590nm
无 0
Sm 0.48
Sm/Fur 2μM 0.51
Sm/D-gal 2mM 0.37
如表7和图14所示，呋喃酮化合物几乎不显示出对Sm生物膜形成的抑制效果，而D-gal显示出对Sm生物膜形成的显著抑制效果。
此外，通过荧光染色检验了D-gal对Sm生物膜形成的抑制效果。使用2ml(2×107/ml)Sm发酵液，使用200mM D-gal和20μM呋喃酮化合物。使用live/dead-BacLight存活力试剂盒(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)，用荧光染料对盖玻片上形成的生物膜进行染色，并且使用共聚焦显微镜(Carl Zeiss,LSM 700)观察。获得的荧光图像示于图15中。在荧光图像中，活的细菌经SYTO Green染色发出绿色荧光，死的细菌经碘化丙啶(PI)染色发出红色荧光。获得的各荧光图像的荧光强度使用共聚焦显微镜的ZEN 2010程序进行量化，并且示于图16中。
如图15和图16所示，形成的Sm生物膜经荧光染色，然后通过共聚焦显微镜进行分析。获得的结果与结晶紫染色的结果一致，通过D-gal处理抑制了Sm生物膜形成，D-gal对Sm生物膜形成的该抑制效果优于呋喃酮化合物。
此外，So的生物膜形成的结果示于下面的表8和图17中。
[表8]
样品 OD590
无 0
So 0.59
So/Fur 2uM 0.64
So/D-gal 2mM 1.07
So/D-rib 2mM 0.85
如表8和图17所示，与D-rib和呋喃酮化合物相比，D-gal不抑制反而增加了正常口腔菌群之一口腔链球菌Streptococcus oralis(So)的生物膜形成。
如表7和表8以及图14至图17所示，D-半乳糖显著抑制了致龋菌Sm的生物膜形成，而它不抑制反而增加了正常口腔菌群之一口腔链球菌Streptococcus oralis(So)的生物膜形成。为了保持口腔健康，保持而不抑制正常口腔菌群是很重要的。
实施例1至实施例9的结果表明，D-半乳糖对引起两种典型口腔疾病(牙周炎和龋齿)的细菌的生物膜形成具有优异的抑制功效，而且它不影响正常口腔菌群的生物膜形成。因此，D-半乳糖是能选择性施用于牙周病原菌的优异物质。

Claims (22)

1.一种用于抑制口腔致病细菌的群体感应的组合物，所述组合物包括D-半乳糖。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述细菌是选自由属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌，属于坦纳菌Tannerella属的细菌，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌，属于密螺旋体Treponema属的细菌，属于普氏菌Prevotella属的细菌，和变异链球菌Streptococcus mutans组成的组中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物不抑制非病原性正常口腔菌群的群体感应。
4.一种用于抑制口腔致病细菌的群体感应自体诱导物的组合物，所述组合物包括D-半乳糖。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述群体感应自体诱导物是自体诱导物-2(AI-2)，所述自体诱导物-2(AI-2)分离自选自由属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌，属于坦纳菌Tannerella属的细菌，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌，属于密螺旋体Treponema属的细菌，属于普氏菌Prevotella属的细菌，和变异链球菌Streptococcus mutans组成的组中的一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物不抑制非病原性正常口腔菌群的群体感应自体诱导物。
7.一种用于抑制口腔致病细菌的生物膜形成的组合物，所述组合物包括D-半乳糖。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述细菌是选自由属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌，属于坦纳菌Tannerella属的细菌，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌，属于密螺旋体Treponema属的细菌，属于普氏菌Prevotella属的细菌，和变异链球菌Streptococcus mutans组成的组中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中，所述组合物不抑制非病原性正常口腔菌群的生物膜形成。
10.一种用于预防或治疗口腔细菌性疾病的组合物，所述组合物包括D-半乳糖。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述口腔细菌性疾病是龋齿或牙周病。
12.一种用于预防或改善口腔细菌性疾病的口服产品，所述口服产品包括D-半乳糖。
13.根据权利要求12所述的口服产品，其中，所述口腔细菌性疾病是龋齿或牙周病。
14.根据权利要求12或13所述的口服产品，所述口服产品是牙膏、漱口水、口腔喷雾剂、口香糖、口腔软膏或口腔贴片。
15.D-半乳糖在用于抑制口腔致病细菌的群体感应或抑制口腔致病细菌的群体感应自体诱导物中的应用。
16.根据权利要求15所述的D-半乳糖的应用，其中，所述细菌是选自由属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌，属于坦纳菌Tannerella属的细菌，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌，属于密螺旋体Treponema属的细菌，属于普氏菌Prevotella属的细菌，和变异链球菌Streptococcus mutans组成的组中的一种或多种。
17.根据权利要求15或16所述的D-半乳糖的应用，其中，非病原性正常口腔菌群的群体感应不受抑制。
18.D-半乳糖在用于抑制口腔致病细菌的生物膜形成中的应用。
19.根据权利要求18所述的D-半乳糖的应用，其中，所述细菌是选自由属于梭形杆菌Fusobacterium属的细菌，属于卟啉单胞菌Porphyromonas属的细菌，属于坦纳菌Tannerella属的细菌，属于凝聚杆菌Aggregatibacter属的细菌，属于密螺旋体Treponema属的细菌，属于普氏菌Prevotella属的细菌，和变异链球菌Streptococcus mutans组成的组中的一种或多种。
20.根据权利要求18或19所述的D-半乳糖的应用，其中，非病原性正常口腔菌群的生物膜形成不受抑制。
21.D-半乳糖在用于预防、治疗或改善口腔细菌性疾病中的应用。
22.根据权利要求21所述的D-半乳糖的应用，其中，所述口腔细菌性疾病是龋齿或牙周病。
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