KR101025886B1 - 택사추출물을 함유하는 충치억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 충치원인균으로 알려진 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대해 우수한 항균력을 나타내며 글루코실트랜스퍼라아제의 활성을 억제하여 플라그의 형성을 저해하는 안전성이 높은 택사 추출물을 함유하는 충치억제용 조성물에 관한 것이다.

택사, 스트렙토코커스 뮤탄스, 글루코트랜스퍼레이즈, 플라그, 충치

Description

택사추출물을 함유하는 충치억제용 조성물 {Oral care compositions containing Alismae Rhizoma extract for preventing tooth decay}

본 발명은 대표적인 충치원인균으로 알려진 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 우수한 항균력을 나타내고 글루코트랜스퍼레이즈의 활성을 억제하여 플라그의 형성까지 저해하며 세포독성이 낮아 인체에 안전하게 사용할 수 있는 택사추출물 및 이를 함유하는 충치억제용 구강용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 스트렙토코커스 소브리너스(S. sobrinus)와 함께 구강내에서 설탕을 젖산으로 분해하여 충치를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이는 젖산에 의해 유발된 산성환경이 미네랄로 축적된 치아의 법랑질을 약화시켜 탈광질화되기 쉬운 형태로 만들기 때문이다. 충치발생을 유발하는 또 다른 원인의 하나로 플라그 형성을 들 수 있는데 스트렙토코커스 뮤탄스가 설탕을 이용하여 세포외로 글루칸(glucan)이라는 끈적끈적한 다당류를 분비하면 이 다당류에 의해 균체들이 서로 엉겨 붙어 플라그를 형성하게 된다. 이는 스트렙토코커스 뮤탄스가 글라이코실트랜스퍼라아제(glucosyltransferase)라는 효소를 생산하기 때문이며 이 효소는 설탕을 기질로 다음과 같은 반응에 의해 글루칸[(glucose)n]이라는 다당류를 합성한다.

n (sucrose) → (glucose)n + n (fructose)

글루칸은 물에 잘 녹지 않고, 매우 점착성이 높기 때문에 플라그를 치아의 표면에 부착, 정체시키는 역할을 하고 있는 것으로 추정되고 있다. 또한 스트렙토코커스 뮤탄스는 치아표면에 고착되기 쉽게 하는 수용체를 가진 몇 안 되는 특이한 미생물 중의 하나이다. 결국 스트렙토코커스 뮤탄스는 자체 수용체에 의해 치아 표면에 부착하거나 설탕으로부터 글루칸을 형성하여 치아 표면에 고착하여 플라그의 형성하고 산생성이라는 복합적인 기작을 통해 충치를 유발시키게 된다. 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 충치원인균도 유산을 생산하지만 스트렙토코커스 뮤탄스에 의해 생산된 유산은 플라그 밖으로 방출되지 않고 치아의 표면위에 농축되어 축적되는 것으로 알려져 있어 현재는 각종의 충치원인균 가운데에서도 스트렙토코커스 뮤탄스가 가장 중요시되고 있다. 따라서 지금까지 충치억제를 위해 스트렙토코커스 뮤탄스의 성장을 억제할 수 있는 불소화합물이나 항생물질이 등이 주로 치약이나 구강세정제등 구강용 제품에 사용되어 왔다. 불소의 경우 충치원인균의 성장을 억제하는 효과는 있으나 매우 낮은 농도에서도 반상치(치아의 에나멜질에 흰반점이 생기는 현상), 강한 독성을 나타내는 단점이 있으며 충치억제용으로 사용되는 페니실린, 에리스로마신, 테트라사이클린과 같은 항생제의 경우 충치균 뿐 아니라 장내 세균총에 영향을 주는 등 부작용이 크고, 시클로로헥시딘은 충치형성을 저지하는 효과는 있으나 구강점막에 궤양이나 박리 등을 유발시키는 부작용이 큰 것으로 나타났다. 최근에 충치 유발능력을 가진 스트렙토코커스 뮤탄스의 세포의 전부 또는 일부 또는 그 균체의 효소를 항원으로 하는 충치 억제용 백신을 개발하거나(공개번호 특1985-0000982) 덱스트라네이즈(dextranase) 등의 효소로도 충치 억제를 시도하고 있으나 그 효과는 아직 불분명한 상황이다. 또한 각종 한약재 및 식물추출물의 항균 효과 및 플라그 형성 억제 효과를 특징으로 하는 발명들도 많이 보고되었다. 스트렙토코커스 뮤탄스의 글루코실트랜스퍼라아제에 대해 저해작용을 나타내는 녹차, 우롱차, 홍차 성분을 함유하는 구강용 조성물(JP 평1-190624(A)), 감초, 상백피 등의 한약재 성분을 함유하는 구강용 조성물(JP 84-134729(A)), 충치원인균 및 치주질환원인균에 대해 효과를 주장하는 몰약, 상백피, 승마, 녹차의 혼합식물추출물(대한민국 특1994-0006065) 등이 있다. 한약재를 비롯한 천연식물추출물들은 화학 항균제나 항생제에 비해 안전성이 높고 인체 친화적이라는 소비자의 인식으로 많은 제품에서 천연추출물들을 사용하고 있으나, 천연추출물이라고 항균활성이 높은 원료 중에는 강력한 세포독성시험을 보니는 것이 많은 것이 현실이며 문제점으로 부각되고 있다. 실제 강력한 항균효과를 보이는 상백피나 감초추출물 등의 경우 세포독성이 강한 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 한방에서 주로 사용되는 한약재 중 생리활성이 우수한 300여종을 선별하여 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 우수한 항균활성을 나타내고, 플라그 형성효소인 글루코실트랜스퍼라아제 억제효과도 있으면서 세포독성이 낮아 인체에 안전하게 사용할 수 있는 한약재를 스크리닝하는 연구를 수행한 후 이를 활용한 충치억제 효과가 우수한 구강용 조성물을 제공하고자 하였다.

본 발명의 택사추출물 및 이를 함유하는 조성물은 충치의 주 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스의 생육을 억제할 뿐만 아니라 충치유발효소인 글루코실트랜스퍼라아제의 활성을 억제하여 플라그의 형성까지 저해함으로 충치를 효과적으로 예방할 수 있는 조성물이다.

본 발명은 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 우수한 항균력을 나타내며 안전성이 높은 택사 추출물을 함유하는 충치억제용 조성물에 관한 것이다.

먼저 본 발명자들은 한의학에서 주로 사용되는 한약재 중 생리활성이 우수한 300여종을 선별하여 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 우수한 항균활성을 나타내면서도 세포독성이 낮아 인체에 안전하게 사용할 수 있는 한약재로서 최종적으로 택사를 선정하였다. 택사는 외떡잎식물 소생식물목 택사과의 여러해살이풀로서 한국·일본 ·중국·타이완 등지에 분포한다. 택사의 약효성분으로는 alisol 유도체들을 비롯해 sesquiterpenoid계의 alismol, orientaol 등이 보고되어 있다. 이중 alisol 유도체들은 이뇨작용과 콜레스테롤 저해작용이 보고되어 있으며 sesquiterpenoid계 물질들은 항염증, 동맥수축억제 작용 등이 알려져 있다. 한의학에서 택사는 주로 이뇨, 지갈약으로 소변불리, 구갈, 위내정수에 쓰며 신염에 의한 수종이나 장염에 의한 설사, 소변불리, 신우신염 치료에 이용되고 있다. 택사추출물에 대한 항균효과도 일부 보고되어 대장균 및 황색포도상구균에 대한 항균 효과 (생약회지, 27(4):378~382)와 비브리오균 등에 항균효과 (Korean Journal of Life Science(Vol 10, No.5, 524~528, 2000)가 일부 보고되기는 하였으나, 본 발명과 같은 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 우수한 항균효과 및 글루코트랜스퍼레이즈의 활성을 억제하여 플라그의 형성을 효과적으로 저해하는 효과를 확인하여 이를 충치억제용 구강용 조성물로 개발한 예는 없는 것으로 나타났다.

1. 택사추출물 및 기타 한약재 추출물의 제조

먼저, 택사 세정하고 분말화하여 약 10배량의 추출 용매에서 5일간 냉침한 후, 추출원액을 여과, 농축 및 동결건조 등의 방법에 의해 택사추출물의 건조분말을 얻었다. 이때 사용한 추출용매로는 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸 에테르 및 디클로로메탄으로 구성된 군중에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 용매를 혼합하여 사용하였다.

2. 택사 추출물 및 기타 한약재 추출물에 대한 스트렙토코커스 뮤탄스의 살균효과 평가

택사추출물 및 기타 한약재 추출물에 대한 항균력 측정법은 최소성장억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 측정법을 이용하였다. 각 시료를 BHI(brain heart infusion) 액상배지에 일정농도 간격으로 희석한 후 각 시험균주를 접종하여 배양한 다음, 시료농도별 균체의 성장정도를 관찰하여 균 성장을 억제하는 최소농도를 판정하였다. 균 성장 여부는 1% TTC (2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride) 용액을 첨가하여 색깔이 무색에서 붉은 색으로 변하면 균성장 양성(+), 변하지 않으면 균성장 음성(-)으로 판별하였다. TTC는 균 성장이 활발할 때 일어나는 산화환원 전위의 변화에 의해 원래의 산화된 상태에서 환원될 때 붉은색으로 변하는 염료이므로 미생물의 생육정도(viability)를 손쉽게 측정할 때 사용된다. 시험에 사용된 충치원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스는 공시균으로 KCTC 3065 균주를 사용하였다. 스트렙토코커스 뮤탄스는 선택적 혐기성균(facultative anaerobic)이나 호기적인 조건에서도 잘 성장하므로 37℃에서 1일간 배양한 후 각 한약재 추출물에 대한 MIC를 측정하여 표1에 나타내었다.

표1.

시 료	MIC(ppm)	시 료	MIC(ppm)
택사	40	상백피	320
계피	640	감초	320

표 1을 참조하면, 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 MIC 측정결과에서는 택사 추출물의 항균력이 화학합성 항균제인 트리클로산과 비슷하며, 기타 한약재 추출물에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다.

3. 택사추출물 및 기타 한약재 추출물에 대한 글루코실트랜스퍼라아제에 대한 억제효과 평가

택사추출물의 글루코실트랜스퍼라아제 활성 저해 효과를 알아보기 위하여 우선 BHI Broth 20ml에 스트렙토코커스 뮤탄스의 콜로니를 접종한 후 37℃에서 48시간동안 진탕(150rpm)하면서 호기적 조건에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 상등액을 글루코실트랜스퍼라아제 효소액으로 사용하였다. 효소의 활성 측정을 위하여, 0.2M 인산염완충용액(pH 7.0)에 수크로오스를 0.25M로 녹여 기질로 사용하였다. 기질 0.9ml에 0.1ml의 효소액을 넣어 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 다이니트로살리실산(DNS)법에 의해 분해된 환원당을 정량하였다. 우선 환원당의 양에 따른 표준곡선을 정하고 여기에 택사추출물 등을 첨가한 시료의 OD값을 아래의 식에 대입하여 환원당의 양을 정량한 후 잔존하는 환원당의 양으로서 글루코실트랜스퍼라아제의 저해율을 측정하였다.

Y = 2.2206X - 0.0123 ( Y: 0D값 X: 환원당의 양)

표2.

시 료	저해율(%)	시 료	저해율(%)
택 사	79.8	상백피	60.5
계 피	40.2	감 초	61.1

5. 구강 청정제 조성물의 제조 및 플라그 형성억제효과 평가

택사추출물 함유 구강청정제의 플라그 형성억제효과를 알아보기 위하여 하기 표 4에 기재된 성분과 함량에 따라 일반적인 종래의 단일상 구강 청정제 용액을 제조하였다. 제조한 비교예 및 실시예의 제품을 사용한 후 프라그 형성 억제 효과를 아래와 같이 임상평가 하였다.

① 피검자를 선별한 후 구강검진에 대한 설명을 해준다.

② 실시예 및 비교예 각각에 피검자를 무작위 30 명씩을 나누고 올바른 구강 청정제 사용 방법을 교육시킨 후 구강검진을 실시하여 치태지수(Quigley-Hein Index modified by Turesky)를 측정한다.

③ 실시예 전 치아에 대하여 스케일링을 실시한다.

④ 비교예 제품을 14일간 사용토록 한 후 구강검진을 실시하고, 이때 치태지수를 초기값으로 하였다.

⑤ 실시예 및 비교예 제품을 각 피검자에게 나누어 주고 1일 5회 3개월 사용하고 구강검진 을 1개월, 3개월에 실시하여 치태지수 및 치은염 지수를 점수화 하였다. 이때 사용 구강 청정제는 모두 동일 제품으로 사용하고 1일 3회 사용하도록 하였다.

⑥ 실험결과는 실시예의 초기 점수와 1개월, 3개월 사용 후 점수를 평가한 후 t-test로 통계적 유의성을 검정하였다.

비교예 및 실시예

이하 본 발명 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 제형으로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들을 한정되는 것으로 해석되어져서는 않된다.

표4.

		실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	비교예 1	비교예 2
약효성분	염화세틸피리디움	-	-	-	-	0.05	-	0.05
	택사추출물	0.01	0.1	1	10	0.10	-	-
가용화제	라우릴황산나트륨	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
	경화피마자유	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
기제	글리세린	5	5	5	5	5	5	5
pH조정제	구연산	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
	구연산 나트륨	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
향미제	사카린나트륨	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
	향	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
용매	에탄올	4	4	4	4	4	4	4
	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100

치태지수(플라그 지수)

비교예와 실시예의 구강청정 제품을 1개월과 3개월 사용 후 각각 치태지수를 측정하였으며 통계적으로 유의차 검정을 실시하여 표 5에 나타냈다.

표 5

실험군	초기치	1개월	3개월
실시예1	3.28 ± 0.15	3.13 ± 0.17	2.99 ± 0.13
실시예2	3.27 ± 0.14	3.07 ± 0.15	2.88 ± 0.11
실시예3	3.23 ± 0.14	3.00 ± 0.14	2.71 ± 0.17
실시예4	3.27 ± 0.18	2.96 ± 0.13	2.58 ± 0.20
실시예5	3.32 ± 0.12	2.85 ± 0.14	2.64 ± 0.10
비교예1	3.10 ± 0.16	2.96 ± 0.13	3.06 ± 0.23
비교예2	3.20 ± 0.19	3.00 ± 0.14	2.73 ± 0.16

표 5를 참조하면, 치태형성 억제 효과에 있어서 약효성분이 함유되지 않은 비교예 1에 비해 약효성분인 염화세틸피리디움 이나 택사추출물이 함유된 비교예 2 및 실시예 1 내지 5에서 사용전과 사용 후에서 플라그형성 억제면에서 유의한 효과가 있음(p<0.05)이 확인되었고, 택사추출물의 함량이 증가됨에 따라 플라그형성 억제력이 증가하고 있음을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 유효성분으로 택사 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하며, 충치원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 항균효과를 나타내고, 플라그 형성에 관여하는 글루코실트랜스퍼라아제의 활성를 억제하는 충치억제용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 택사 추출물의 건조분말을 0.01 내지 10 중량% 함유함을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물이 택사를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸 에테르 및 디클로로메탄으로 구성된 군 중에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 혼합용매에 냉침시킨 다음, 여과하고, 농축 및 동결건조시켜 수득한 추출물임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 액상, 크림상, 페이스트상 또는 고체상임을 특징으로 하는 조성물.
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