KR100817599B1

KR100817599B1 - 치아우식증 예방용 치약조성물

Info

Publication number: KR100817599B1
Application number: KR1020060133030A
Authority: KR
Inventors: 유용욱; 유현희; 김강주; 권태호; 유강열; 정승일; 김주
Original assignee: 재단법인 전주생물소재연구소
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2008-03-31

Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 무탄스에 항균활성을 지닌 치아우식증 예방용 치약조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 독활추출물, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물은 각각 스트렙토코커스 무탄스의 성장과 유기산 생성을 억제할 뿐 아니라, 타액으로 도말된 히드록시아파타이트 비드에 대한 부착을 억제하며, 비수용성 글루칸 합성을 억제하여 우수한 치아우식증 예방용 치약조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

스트렙토코커스 무탄스, 독활, 컨틴엔탈릭엑시드, 스티그마스테롤, 백부자, 치아우식.

Description

치아우식증 예방용 치약조성물{Toothpaste composition for preventing dental caries}

도 1은 다양한 용매를 이용하여 독활을 분획화한 모식도이다.

본 발명은 독활추출물, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물에 관한 것이다.

치아우식증은 구강 내에 생존하는 200여종의 미생물 중 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans; S. mutans)를 비롯한 구강질환 유발균들이 생성하는 비수용성 글루칸과 미생물들 그리고 음식물 잔사 등이 서로 엉켜 치면에 치태라고 하는 치면세균막을 형성하고 이들 미생물들의 대사산물인 각종 유기산에 의해 구강 내 pH를 5.5 이하로 낮추어 치아의 법랑질층의 무기질 성분들이 탈회되어 발생하는 질환이다.

전통약제나 식물 등이 치아우식을 억제하는 효과가 있는데, 그 작용기전은 서로 다른 것으로 보고되어 있다. 예를들어, 황백 추출물과 황련 추출물은 스트렙토코커스 무탄스의 성장과 유기산 생성을 억제하는 것으로 알려져 있고, 으름덩쿨 추출물, 황련, 후박 및 구연산으로 구성된 혼합제제물은 스트렙토코커스 무탄스의 성장을 억제하며, 타액 도말된 히드록시아파타이트 비드(saliva-coated hydroxyapatite bead; S-HA)에 대한 부착을 감소시키는 것으로 알려져 있다.

또한, 괭생이모자반 추출물, 카모마일, 세이지오일(Sage oil), 라타니아(Rhatany) 및 몰약(Myrrh)도 스트렙토코커스 무탄스에 대한 항균작용이 있는 것으로 보고되고 있다.

또한, 차(Camellia sinensis)의 잎에서 추출한 폴리페놀은 스트렙토코커스 무탄스에 의한 비수용성 글루칸 합성을 억제하고, 우롱차잎의 추출물은 수용성 글루칸을 합성하는 스트렙토코커스 무탄스의 세포 유리(cell-free) 글루코트랜스퍼라아제(glucotransferase; GTFase)와 비수용성 글루칸을 합성하는 스트렙토코커스 소브리누스(S. sobrinus)의 GTFase-I의 활성을 억제하고, 프로폴리스 용액은 스트렙토코커스 무탄스와 구강에서 분리한 다른 세균에 대해 항균효과를 나타내어 치아우식을 억제한다고 연구되고 있다.

그리고, 치아우식증 예방을 위하여 치면세균막 형성의 원인균 퇴치에 페니실린과 에리스로마이신과 같은 항생제가 효과적인 역할을 하는 것으로 보고된 바 있지만, 장기간의 사용시 항생제에 대한 내성이 발생하므로 인해 임상에서 사용되지 못하고 있다. 그 외 불소 화합물의 이용법, 불소를 방출하는 여러 장치와 재료, 몇몇 자동 잇솔질 기구 등의 방법들이 개발되어 소개되어 왔다.

그러나, 아직까지도 치아우식이 주요한 치아상실의 원인으로 부각되는 것은 이러한 방법이 충분한 효과를 거두지 못하고 있다는 증거이다.

따라서 보다 효과적이고, 실용적이며, 안정성이 있는 치아우식증 예방 및 치료 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 독활추출물, 독활추출물로부터 동정된 컨틴엔탈릭엑시드 또는 스티그마스테롤, 백부자추출물 각각이 치아우식 원인균인 스트렙토코커스 무탄스의 성장과 유기산 생성을 억제하고, 타액 도말된 히드록시아파타이트 비드에 대한 부착을 억제하며, 비수용성 글루칸의 형성을 억제하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 독활추출물, 독활추출물로부터 동정된 컨틴엔탈릭엑시드 또는 스티그마스테롤, 백부자추출물 각각 또는 둘 이상을 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 컨틴엔탈릭엑시드 또는 스티그마스테롤을 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 독활추출물, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 컨틴엔탈릭엑시드를 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 2로 표시되는 스티그마스테롤을 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용한 독활(Aralia continentalis)은 오갈피나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생 초목인 땃두릅의 뿌리를 건조한 것으로, 뿌리의 바깥 면은 회백색, 회갈색이며, 세로주름과 잔뿌리의 자국이 있으며, 꺽은 면은 섬유성이고 엷은 황색의 수가 있고 질이 가볍고 엉성하다. 특이한 방향(芳香)이 있 고 맛은 처음에는 텁텁하고 약간 쓰다. 그 성분으로는 정유, 수지, 살리실산, 디테르펜산 등을 함유하며, 구리, 망간 등을 미량으로 함유한다.

본 발명에서는 독활을 C1 내지 C4의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 사용한다. 보다 바람직하게는 도 1에 개시된 바와 같이 독활을 메탄올로 추출한 독활 메탄올 추출물에 클로로포름을 가해 클로로포름 분획을 얻어 독활추출물로 사용한다.

이때, 상기 추출은 냉침, 환류 또는 초음파 등의 방법에 의할 수 있으며 초음파 추출인 것이 바람직하다.

특히, 상기 클로로포름 분획을 실리카겔 컬럼에 넣고 n-헥산-에틸아세테이트 용매계를 이용하여 용출시킴으로써 독활추출물의 활성성분인 컨틴엔탈릭엑시드 및 스티그마스테롤을 분리할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용한 백부자(Aconitum coreani R. RAYMOND)는 천남성과 (Fam. Araceae)에 속하는 독각련(Typhonium giganteum Engl)의 마른 괴경으로, 가을에 수집하여 섬유성 뿌리와 바깥 나무 껍질을 제거한 후, 끓인 황(sulfur)으로 1~2회 정도 그을린 후 햇빛에 말려서 얻는다. 백부자는 파상풍, 결핵, 신경통, 인플루엔자 감염 등의 질환에 항바이러스 효과 및 통증 완화와 해독 작용을 나타낸다고 알려져 있다.

본 발명에서는 백부자를 C1 내지 C4의 알코올 또는 이의 수용액으로 추출하여 사용하며, 바람직하게는 백부자를 에탄올로 추출하여 사용한다. 이때, 상기 추출은 냉침, 환류 또는 초음파 등의 방법에 의할 수 있으며 초음파 추출인 것이 바 람직하다.

본 발명에 따른 독활추출물, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물은 각각 농도의존적으로 유의성있게 치아우식증의 원인균인 스트렙토코커스 무탄스의 성장을 억제한다.

또한, 일반적으로 미생물 배양시 각 미생물은 탄소원을 자화하여 성장에 필요한 에너지와 중간대사산물로 이용하게 되며, 이 과정에서 유기산이라는 노폐물이 축척되어 배지의 수소이온농도를 증가시켜 pH를 떨어뜨린다. 특히, 스트렙토코커스 무탄스에 의해 생성되는 유기산은 치아우식증에 직접적인 영향을 미치는 중요한 요인인데, 본 발명에 따른 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물은 각각 대조군과 비교하여 농도의존적으로 유의성있게 유기산의 생성을 억제한다.

또한, 독활추출물, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물이 치아 표면에서 세균의 부착을 억제하는지 검토한 결과, 타액 도말된 히드록시아파타이트 비드에 관한 우수한 부착 억제효과를 확인하였다.

또한, 스트렙토코커스 무탄스는 GTFase를 생산하여 자당으로부터 포도당 다량체인 글루칸을 합성한다. 글루칸은 수용성 글루칸인 덱스트란과 비수용성 글루칸인 뮤탠으로 분류되며, 뮤탠은 비수용성 성질과 점성으로 인해 구강 내 세균이 치면과 구강 표면에 부착하는 것을 도와주며 세균의 응괴를 유도하게 되어 지속적인 세균증식을 가속화시킨다. 더불어, 부착 기전이 없는 다른 병원균들의 부착 및 증식을 유도하여 치주질환을 야기할 뿐 아니라 치주 치료 후의 유지기 동안에 재발 가능성을 증가시킨다.

본 발명에 따른 독활추출물, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물은 이러한 비수용성 글루칸의 합성을 억제한다.

따라서, 독활추출물, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물은 치아우식증의 원인균인 스트렙토코커스 무탄스의 성장을 억제하고, 유기산 생성을 억제할 뿐 아니라, 타액 도말된 히드록시아파타이트 비드에 대한 부착을 억제하며 비수용성 글루칸 형성을 억제함으로써 치아우식증 예방용 치약조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 치아우식증 예방용 치약조성물은, 조성물 총 100 중량부에 대하여 독활추출물이 1 내지 10 중량부, 바람직하게는 1 내지 5 중량부로 포함된다. 또, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드 또는 스티그마스테롤은 조성물 총 100 중량부에 대하여 0.001 내지 1 중량부로 포함된다. 또, 백부자추출물은 조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 5 중량부로 포함된다.

이때, 각각의 유효성분이 상기 함량범위 미만인 경우에는 치아우식증의 원인균인 스트렙토코커스 무탄스의 성장 억제, 유기상 생성 억제 등의 치아우식증 예방효과가 미미하며, 상기 함량범위를 초과할 경우에는 사용량에 따른 치아우식증 예방효과가 미미한 문제가 있다.

본 발명에 따른 독활추출물의 사용량은 10 내지 40 mg/kg, 독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드의 사용량은 10 내지 40 ㎍/kg, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤의 사용량은 12.5 내지 200 ㎍/kg 및 백부자추출물의 사용량은 0.1 내지 1.25 mg/kg의 양으로 일일 1회 내지 수회 이용될 수 있다.

하지만, 이러한 사용량은 나이, 성별, 체중, 질병 유무 등에 따라 달라질 수 있기 때문에 상기 사용량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 치아우식증 예방용 치약조성물은 치약조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 연마제, 습윤제, 결합제, 기포제, 감미제, 향료 및 색소류로 이루어지는 군에서 선택된 한종 이상을 더 포함할 수 있고, 제형으로는 페이스트상, 분말상, 가글과 같은 액상, 분무상 등의 형태로 조제할 수 있다.

본 발명에 사용되는 상기 연마제로는 침강실리카, 실리카겔, 지르코늄실리케이트, 인산일수소칼슘, 무수인산일수소칼슘, 함수알루미나, 경질탄산칼슘, 중질탄산칼슘, 칼슘피로인산염, 불용성메타인산염 또는 알루미늄실리케이트 등을 사용할 수 있다.

상기 연마제는 조성물 총 100 중량부에 대하여 5 내지 50 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 또한, 지나친 연마에 의한 치아 마모가 없도록 최종 제품의 연마도가 30-100의 값을 나타내도록 하며, 입자 크기도 연마제의 종류에 따라 다르지만 평균입자경이 20 ㎛ 이하인 것을 사용한다. 일반적으로 연마도 값은 0에서 시작하여 표준 치약을 100으로 하여 상대 연마도를 나타내며, 일반적으로 대부분의 제품들이 200 이하의 값을 가진다.

본 발명에 사용되는 상기 습윤제는 연고상의 제형을 만드는데 필수적인 베이스 성분으로 치약이 공기 중에 노출될 때 건조, 고화되는 것을 방지하고 치약의 표면에 윤기를 제공할 뿐만 아니라, 종류에 따라서는 양치시 감미 효과를 주는 역할을 한다.

상기 습윤제로는 농글리세린(98%), 글리세린(85%), 소르비톨 수용액(70%), 비결정성소르비톨수용액(70%), 자일리톨, 폴리에틸렌글리콜류 또는 프로필렌글리콜 등을 사용할 수 있고, 조성물 총 100 중량부에 대하여 20 내지 70 중량부로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 상기 결합제는 고체인 분말 성분과 액체 성분이 분리되지 않게 하는 작용을 한다. 상기 결합제로는 수용성의 고분자 종류라면 어떤 것이든 사용할 수 있으며, 바람직하게는 나무의 셀룰로오스로부터 합성된 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 해조류로부터 추출된 카라기난류 또는 미생물의 대사로부터 얻어지는 잔탄검 등을 사용한다.

본 발명에 사용되는 상기 기포제는 제품의 사용감을 증진시키고 세정 작용을 도와주며, 기타 약효 성분의 분산 및 침투를 신속하게 하고, 계면장력을 감소시킴으로서 구강내 이물질을 쉽게 떨어지게 하는 작용을 한다.

상기 기포제로는 음이온성 계면활성제인 라우릴황산나트륨을 사용하는 것이 바람직하며, 제형의 특성에 따라 보조적으로 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌의 공중합체(폴록사머), 폴리옥시에틸렌경화피마자유 또는 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산에스테르 등의 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있다.

상기 향료, 감미제, 색소류 등은 치약 조성물의 사용감을 좋게 하는 작용을 한다.

상기 향료는 식용가능한 것을 사용하는 것이 바람직하며, 그 예로는 페파민트 오일, 스피아민트 오일, 세이지, 유칼립톨, 메틸살리실레이트 또는 과일추출물 등이 있다. 또한, 상기 감미제는 삭카린나트륨을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 색소로는 식용색소를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치약조성물은 독활추출물 또는 백부추출물과 같이 원료물질이 한약재로 많이 사용되는 안전한 물질이므로, 인체에 안전하고, 경시안정성이 우수할 뿐만 아니라, 동시에 스트렙토코커스 무탄스의 성장과 유기산 생성을 억제할 뿐 아니라, 타액으로 도말된 히드록시아파타이트 비드에 대한 부착을 억제하며, 비수용성 글루칸 합성을 억제하여 우수한 치아우식증 예방효과를 나타내는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 독활추출물의 제조

독활은 원광대학교 대학한약국에서 구입한 후, 냉암소에 보관하여 사용하였다. 건조하고 세절한 독활 5kg을 100% 메탄올 25L로 상온에서 7일 동안 3회 추출하였다. 추출용액을 Whatman No.2 여과지로 여과한 다음 40℃에서 감압농축하여 메탄올 추출물 481.7g(9.6%)을 얻었다.

이러한 메탄올 추출물 250g에 증류수 1L을 가하여 용해시키고 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 각각 1L씩을 순차적으로 가하여 각각 유기용매층의 분획물을 얻어 감압농축하였다. 그 결과, 클로로포름 분획물 65g, 에틸아세테이트 분획물 9g, n-부탄올 분획물 75g 및 물 분획물 120g을 얻었다. 독활추출물의 분획화 공정은 도 1과 같다.

< 실시예 2> 독활추출물로부터 컨틴엔탈릭엑시드의 동정

실시예 1에서 얻어진 클로로포름 분획물을 클로로포름에 용해시킨 후 이 용액을 실리카겔(230-400 mesh, ASTM, Art No.9385, Merch, Germany, 200g, 3×80cm)에 가하여 활성물질을 흡착시켰다. n-헥산과 에틸아세테이트의 부피비율을 9:1(1L), 5:1(1L), 2:1(0.5L), 1:1(0.5L)으로 변화시키면서 실리카겔 컬럼크로마토그래피하여 용출액을 50mL 용기로 받았으며, n-헥산과 에틸아세테이트의 부피비율 5:1에서 용출되는 활성분획을 분리하였다.

얻어진 활성분획(No. CA-302)들을 합한 후 농축하여 prep-HPLC(1H column, 용매 CHCl₃, 유속 3 mL/min, 254 nm)를 실시하여 무색침상의 화합물인 컨틴엔탈릭엑시드를 얻었다. 이때, 수율은 독활 1kg당 127mg이었다.

이렇게 얻은 활성분획을 정제하여 화합물의 구조를 핵자기공명스펙트럼(Bruker 500 MHz)을 분석한 결과, 무색침상결정형태를 하고 있는 화합물로서, 분자식은 C₂₀H₃₀O₂이고 분자량은 302이고, 융점은 166-167℃이고, 클로로포름 및 메탄올에 가용성이며, 물에 불용성(0.1mg/ml 이하)인 이화학적 성질은 나타내었다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5.72 (1H, dd, J=17.5, 10.5Hz, H-15), 5.17 (1H, s. H-14), 4.96 (1H, dd, J=5.2, 1.5Hz, H-16β), 4.90 (1H, dd, J=10.5, 1.5Hz, H-16α), 1.29 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, s, H-17), 0.67 (3H, s, H-20).

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 184.6 (C-19), 147.4 (C-15), 138.1 (C-8), 128.2 (C-14), 113.1 (C-16), 56.3 (C-9), 50.8 (C-5), 44.3 (C-4), 39.4 (C-13), 38.7 (C-10), 38.2 (C-1), 36.6 (C-3), 36.0 (C-7), 31.8 (C-12), 29.6 (C-18), 29.4 (C-17), 24.3 (C-6), 19.8 (C-11), 19.4 (C-2), 14.0 (C-20).

< 실시예 3> 독활추출물로부터 스티그마스테롤의 동정

실시예 1에서 얻은 클로로포름분획물을 선택하여 실리카겔(230-400 mesh, ASTM, Art. 9385, Merch, Germany, 200 g, 3×80 cm)이 충진된 컬럼에 넣어 n-헥산-에틸아세테이트(9:1 (1 L), 5:1 (0.5 L), 2:1 (0.5 L), 1:1 (0.5 L)) 그리고 100% 에틸아세테이트 용매계로 단계적으로 극성을 높여 용출시켜 50 mL씩 94개를 얻은 TLC를 실시하여 7개의 소분획으로 나누었고, 그 중 분획3(fraction 3)으로부터 활성 성분을 규명하기 위해 계속해서 prep-LC(JAIJEL-1H column, 용매 CHCl₃, 유속 3 ml/min, 220 nm)를 시행하여 무색 침상의 화합물인 스티그마스테롤을 얻었다.

colorless amorphous solid, mp 164-165, [α]_D ²⁵ -48.3 (c 0.28, CHCl₃)

¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ: 3.53(1H, d, J=5.4Hz, H-6), 3.53(1H, m, H-3), 1.01 (3H, s, H-19), 0.67 (3H, s, H-18).

¹³C-NMR (75MHz, CDCl3) δ 141.2 (C-5), 138.7 (C-22), 129.7 (C-23), 122.1 (C-6), 72.2 (C-3), 56.6 (C-14), 56.4 (C-17), 51.6 (C-24), 50.5 (C-9), 42.7 (C-4), 42.6 (C-13), 40.9 (C-20), 40.2 (C-12), 37.7 (C-1), 36.9 (C-10), 32.3 (C-7, 8, 25), 32.0 (C-2), 28.7 (C-16), 25.8 (C-28), 24.7 (C-15), 21.5 (C-21), 19.8 (C-11, 27), 19.4 (C-19), 19.3 (C-26), 12.4 (C-29), 12.3(C-18).

< 실시예 4> 백부자추출물의 제조

백부자는 원광대학교 대학한약국에서 구입한 후, 냉암소에 보관하여 사용하였다. 건조하고 세절한 백부자 3kg을 100% 에탄올 6L로 상온에서 3일 동안 2회 추출하여 에탄올 추출물 59.37g을 얻었고, -20℃에서 보관하였다.

< 실험예 1> 스트렙토코커스 무탄스 성장억제 활성 검토

1) 균주 및 배양

본 발명에 사용한 균주는 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans ATCC 25175)로 Brain heart infusion (BHI, Difco, U.S.A.) 액체배지에 1-2차 계대배양 후 같은 배지에 식균하여 37℃의 항온기에서 24시간 배양하여 사용하였다.

2) 스트렙토코커스 무탄스의 성장 검토

1%의 글루코스(glucose)가 들어 있는 BHI 액체배지에 실시예 1에서 제조한 독활추출물의 각 분획물 0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/ml 첨가하거나, 실시예 2에서 얻은 컨틴엔탈릭엑시드 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ㎍/ml 첨가하거나, 실시예 3에서 얻은 스티 그마스테롤 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/ml 첨가하거나, 실시예 4에서 제조한 백부자 에탄올 추출물 0.0160, 0.0310, 0.0630, 0.1250 mg/ml 첨가한 후, 스트렙토코커스 무탄스를 1×10⁸CFU/ml(단, 백부자 에탄올 추출물의 경우에는 5×10⁵CFU/ml를 사용함)가 되게 접종하였다.

37℃의 항온기에서 24시간 배양한 후 BHI 배지를 기준으로 ELISA reader(Molecular Devices, C.F., U.S.A.)로 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 하기 표 1과 같이, 독활추출물 중 클로로포름 분획물이 스트렙토코커스 무탄스의 성장억제에 가장 효과적인 것으로 확인되었다.

독활추출물	최소억제농도(MIC, mg/ml)
메탄올 분획	<0.25
클로로포름분획	<0.25
에틸아세테이트분획	>2
부탄올분획	>2
물분획	>2

또한, 컨틴엔탈릭엑시드를 넣지 않은 대조군과 비교하여, 컨틴엔탈릭엑시드를 0.25, 0.5, 1, 2 및 4 ㎍/ml 첨가한 실험군에서 각각 36%, 40%, 50%, 81% 및 93%으로 농도의존적으로 유의성있는 스트렙토코커스 무탄스 성장억제 효과를 확인하였다(p<0.05).

또한, 스티그마스테롤을 넣지 않은 대조군과 비교하여, 스티그마스테롤을 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 ㎍/ml 첨가한 실험군에서 각각 5%, 18%, 77%, 100% 및 100%으로 농도의존적으로 유의성있는 스트렙토코커스 무탄스 성장억제 효과를 확인하였다(p<0.05).

마지막으로, 백부자 에탄올 추출물을 넣지 않은 대조군과 비교하여, 백부자 에탄올 추출물을 0.0160, 0.0310, 0.0630 및 0.1250 mg/ml 첨가한 실험군에서 각각 24%, 37%, 53% 및 95%으로 농도의존적으로 유의성있는 스트렙토코커스 무탄스 억제활성을 확인하였다.

< 실험예 2> 스트렙토코커스 무탄스의 유기산 생성억제 활성 검토

앞선 실험예 1과 같이 각 시료를 첨가하고 균 접종하며, 37℃의 항온기에서 24시간 배양한 후, pH meter(ORIONSA 720, U.S.A.)를 이용하여 pH를 측정하여 유기산 생성 억제 효과를 관찰하였다.

그 결과, 표 2와 같이 컨틴엔탈릭엑시드의 pH는 컨틴엔탈릭엑시드를 넣지 않은 대조군의 pH에 비해 농도의존적으로 유의성있게 높아졌고(p<0.05), 특히 컨틴엔탈릭엑시드를 0.25 ㎍/ml 농도 이상으로 처리한 모든 실험군은 치아우식증에서 무기질 재광화가 일어나는 임계 pH 5.5 이상을 나타내었다.

또한, 표 2와 같이 스티그마스테롤의 pH는 스티그마스테롤을 넣지 않은 대조군의 pH에 비해 농도의존적으로 유의성있게 높아졌고(p<0.05), 특히 스티그마스테롤 5 ㎍/ml 농도 이상에서는 치아우식증에서 무기질 재광화가 일어나는 임계 pH 5.5 이상을 나타내었다.

또한, 표 2와 같이 백부자 에탄올 추출물의 pH는 백부자 에탄올 추출물을 넣지 않은 대조군의 pH에 비해 농도의존적으로 유의성있게 높아졌고(p<0.05), 특히 백부자 에탄올 추출물 0.0310mg/ml 농도 이상에서는 치아우식증에서 무기질 재광화가 일어나는 임계 pH 5.5 이상을 나타내었다.

실험군	농도	pH
컨틴엔탈릭엑시드(㎍/ml)	0	5.32±0.36
	0.25	5.89±0.19
	0.5	5.93±0.33
	1	5.97±0.11
	2	6.58±0.48
	4	6.64±0.10
스티그마스테롤(㎍/ml)	0	5.22±0.08
	1.25	5.22±0.07
	2.5	5.30±0.10
	5	5.94±0.04
	10	6.98±0.11
	20	7.14±0.11
백부자 에탄올 추출물(mg/ml)	0	5.33±0.02
	0.016	5.46±0.06
	0.0310	5.75±0.07
	0.0630	6.32±0.06
	0.1250	6.99±0.04

< 실험예 3> 타액으로 도말된 히드록시아파타이트 비드 부착 억제 활성 검토

1. 타액준비

타액은 건강한 성인 남자로부터 파라핀왁스로 자극하여 분비된 것을 냉각된 비이커에 채취한 다음, 채취된 타액을 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분)하여 상청액을 취한 다음, 분해효소를 불활성화시키기 위하여 60℃에서 30분간 처리한 후, -20℃에 보관하면서 사용하였다.

2. 타액으로 도말된 히드록시아파타이트 비드 부착 억제 활성 검토

히드록시아파타이트 비드(hydroxyapatite beads; Bio-Rad Lab., U.S.A.) 30mg을 증류수로 5회 세척하여 작은 입자를 제거한 후 37℃에서 건조시켜 사용하였다. 건조된 히드록시아파타이트 비드 30mg을 1ml의 타액으로 37℃에서 60분간 처리하여 타액을 비드에 코팅시켰다.

그 후 타액으로 도말된 히드록시아파타이트 비드(S-HA)를 0.1M 인산칼륨 완충액(KPB, pH 7.0)으로 3회 세척한 후 실시예 2에서 얻은 컨틴엔탈릭엑시드 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ㎍/ml 첨가하거나, 실시예 3에서 얻은 스티그마스테롤 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/ml 첨가하거나, 실시예 4에서 제조한 백부자 에탄올 추출물 0.0160, 0.0310, 0.0630, 0.1250 mg/ml 첨가하고, 스트렙토코커스 무탄스를 1×10⁷CFU/ml가 되게 접종한 다음 37℃의 흔들리는 배양기에서 90분 동안 S-HA에 부착시켰다.

그 후 0.1 M KPB (pH 7.0)로 3회 세척한 후 초음파 장치(50W, 30초)를 이용해 S-HA에 부착된 균을 떨어지도록 한 후, 균액을 희석하여 Mitis salivarius agar plate(Difco, U.S.A.)에 도말하여 37℃ 항온기에서 24시간 동안 배양시켜 집락수를 세었다.

그 결과, 표 3과 같이 컨틴엔탈릭엑시드의 부착하는 균수는 컨틴엔탈릭엑시드를 넣지 않은 대조군의 부착하는 균수에 비해 농도의존적으로 유의성있게 적었고(p<0.05), 대조군과 비교하여 각각 31%, 47%, 55%, 60% 및 71%의 부착억제율을 나타내었다.

또한, 표 3과 같이 스티그마스테롤의 부착하는 균수는 스티그마스테롤을 넣지 않은 대조군의 부착하는 균수에 비해 농도의존적으로 유의성있게 적었고(p<0.05), 대조군과 비교하여 각각 3%, 17%, 31%, 52% 및 54%의 부착억제율을 나타내었다.

또한, 표 3과 같이 백부자 에탄올 추출물의 부착하는 균수는 백부자 에탄올 추출물을 넣지 않은 대조군의 부착하는 균수에 비해 농도의존적으로 유의성있게 적었고(p<0.05), 대조군과 비교하여 각각 0.6%, 23.5%, 46.3% 및 50.6%의 부착억제율을 나타내었다.

실험군	농도	균수(CFU/ml)
컨틴엔탈릭엑시드(㎍/ml)	0	133.33±7.64(×10⁴)
	0.25	92.33±8.74(×10⁴)
	0.5	70.67±6.03(×10⁴)
	1	60.33±2.52(×10⁴)
	2	53.00±4.58(×10⁴)
	4	39.00±6.08(×10⁴)
스티그마스테롤(㎍/ml)	0	135.33±2.08(×10⁵)
	1.25	131.67±1.53(×10⁵)
	2.5	113.00±2.00(×10⁵)
	5	93.67±4.01(×10⁵)
	10	64.33±2.08(×10⁵)
	20	62.67±1.58(×10⁵)
백부자 에탄올 추출물(mg/ml)	0	800±100(×10³)
	0.016	795±24(×10³)
	0.0310	612±35(×10³)
	0.0630	430±26(×10³)
	0.1250	395±38(×10³)

< 실험예 4> GTFase 에 의한 비수용성 글루칸 합성억제 활성 검토

1. GTFase(glucosyltransferase)의 준비

다음과 같은 방법으로 GTFase를 얻었다. 즉, 스트렙토코커스 무탄스를 BHI 액체배지 2L에 배양한 후, 원심분리(15,000rpm, 4℃, 20분)하여 상청액을 취한 후 60~70% 암모늄 설페이트를 넣은 후 다시 원심분리(15,000rpm, 4℃, 20분)하여 단백질을 가라앉혔다. 이 단백질에 0.1 M KPB(pH 6.0)를 갈아주며 4℃에서 24시간 동안 투석시킨 후 냉동보관(-80℃) 하였다가 사용하였다.

2. GTFase에 의한 비수용성 글루칸 합성억제 활성 검토

0.04% 소듐 아자이드(sodium azide)를 함유한 0.4 M KPB(pH 6.0)를 0.25ml 시험관에 넣은 후, 0.25ml의 0.4M 자당용액과, 0.25ml의 실시예 2에서 얻은 컨틴엔탈릭엑시드(0.25, 0.5, 1, 2, 4 ㎍/ml) 또는 0.25ml의 실시예 3에서 얻은 스티그마스테롤(1.25, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/ml) 또는 0.25ml의 실시예 4에서 제조한 백부자 에탄올 추출물(0.0160, 0.0310, 0.0630, 0.1250 mg/ml)을 각 농도별로 각각 첨가하고, GTFase을 넣어 최종 1ml이 되게 하였다.

37℃에서 18시간 배양한 후 증류수로 세척한 후 글루칸을 떼어내기 위하여 초음파장치(40W, 4초)를 이용하였다. 그 후 5% 페놀을 1ml, 진한 H₂SO₄를 5ml 넣고 30분간 반응시킨 후 ELISA leader(Molecular Devices, C.F., U.S.A.)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 4와 같이 컨틴엔탈릭엑시드의 글루칸 합성억제활성은 컨틴엔탈릭엑시드를 넣지 않은 대조군의 글루칸 합성억제활성과 비교하여 농도의존적으로 유의성있게 낮아졌고(p<0.05), 대조군과 비교하여 각각 22%, 13%, 7%, 3% 및 1%의 비수용성 글루칸 생성율을 나타내었다.

또한, 표 4와 같이 스티그마스테롤의 글루칸 합성억제활성은 스티그마스테롤을 넣지 않은 대조군의 글루칸 합성억제활성과 비교하여 농도의존적으로 유의성있게 낮아졌고(p<0.05), 대조군과 비교하여 각각 98%, 90%, 75%, 67% 및 54%의 비수용성 글루칸 생성율을 나타내었다.

또한, 표 4와 같이 백부자 에탄올 추출물의 글루칸 합성억제활성은 백부자 에탄올 추출물을 넣지 않은 대조군의 글루칸 합성억제활성과 비교하여 농도의존적으로 유의성있게 낮아졌고(p<0.05), 대조군과 비교하여 각각 28%, 24%, 0% 및 0%의 비수용성 글루칸 생성율을 나타내었다.

실험군	농도	글루칸생성율(%)
컨틴엔탈릭엑시드(㎍/ml)	0	100
	0.25	22.33±5.51
	0.5	13.00±3.61
	1	7.33±2.08
	2	3.33±1.53
	4	1.67±0.58
스티그마스테롤(㎍/ml)	0	100
	1.25	98.00±1.00
	2.5	90.00±1.00
	5	75.67±2.08
	10	67.00±2.00
	20	54.00±1.00
백부자 에탄올 추출물(mg/ml)	0	100
	0.016	28±5.7
	0.0310	24±3.9
	0.0630	0±4.8
	0.1250	0±16.75

이하, 본 발명에 따른 치아우식증 예방용 치약조성물의 제제예를 설명하지만, 이러한 제제예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1>

정제수에 습윤제로 소르비톨 수용액(70%) 55 중량%, 결합제로 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 0.6 중량%, 카라기난 0.5 중량% 및 첨가제로 향료 1.0 중량%, 삭카린 0.1 중량%를 투입하여 분산 혼합하였다. 그 다음 연마제로 침강실리카 18 중량%, 실리카겔 2.0 중량% 및 치아우식균에 항균작용을 나타하는 실시예 1에서 제조한 독활 메탄올 추출물 4.0 중량%를 투입한 후, 약 30 분간 교반하였다. 여기에 기포제로 라우릴황산나트륨 2.2 중량%를 투입하고 정제수로 총 100 중량%를 맞춘 후, 진공상태에서 20 분간 교반하여 치약조성물을 제조하였다.

<제제예 2>

정제수에 습윤제로 소르비톨 수용액(70%) 55 중량%, 결합제로 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 0.6 중량%, 카라기난 0.5 중량% 및 첨가제로 향료 1.0 중량%, 삭카린 0.1 중량%를 투입하여 분산 혼합하였다. 그 다음 연마제로 침강실리카 18 중량%, 실리카겔 2.0 중량% 및 치아우식균에 항균작용을 나타하는 실시예 2에서 얻은 컨틴엔탈릭엑시드 0.004 중량%를 투입한 후, 약 30 분간 교반하였다. 여기에 기포제로 라우릴황산나트륨 2.2 중량%를 투입하고 정제수로 총 100 중량%를 맞춘 후, 진공상태에서 20 분간 교반하여 치약조성물을 제조하였다.

<제제예 3>

정제수에 습윤제로 소르비톨 수용액(70%) 55 중량%, 결합제로 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 0.6 중량%, 카라기난 0.5 중량% 및 첨가제로 향료 1.0 중량%, 삭카린 0.1 중량%를 투입하여 분산 혼합하였다. 그 다음 연마제로 침강실리카 18 중량%, 실리카겔 2.0 중량% 및 치아우식균에 항균작용을 나타하는 실시예 3에서 얻은 스티그마스테롤 0.02 중량%를 투입한 후, 약 30 분간 교반하였다. 여기에 기포제로 라우릴황산나트륨 2.2 중량%를 투입하고 정제수로 총 100 중량%를 맞춘 후, 진공상태에서 20 분간 교반하여 치약조성물을 제조하였다.

<제제예 4>

정제수에 습윤제로 소르비톨 수용액(70%) 55 중량%, 결합제로 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 0.6 중량%, 카라기난 0.5 중량% 및 첨가제로 향료 1.0 중량%, 삭카린 0.1 중량%를 투입하여 분산 혼합하였다. 그 다음 연마제로 침강실리카 18 중량%, 실리카겔 2.0 중량% 및 치아우식균에 항균작용을 나타하는 실시예 4에서 제조한 백부자 에탄올 추출물 0.125 중량%를 투입한 후, 약 30 분간 교반하였다. 여기에 기포제로 라우릴황산나트륨 2.2 중량%를 투입하고 정제수로 총 100 중량%를 맞춘 후, 진공상태에서 20 분간 교반하여 치약조성물을 제조하였다.

앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 치아우식증 예방용 치약조성물은 치아우식증의 원인균인 스트렙토코커스 무탄스의 성장과 유기산의 생성을 억제할 뿐 아니라, 타액 도말된 히드록시아파타이트 비드에 대한 부착을 억제하며 비수용성 글루칸 합성을 억제함으로써 치태형성을 억제하여 치아우식증을 효과적으로 예방할 수 있다.

Claims

독활추출물로부터 얻어진 컨틴엔탈릭엑시드, 독활추출물로부터 얻어진 스티그마스테롤 및 백부자추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상을 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물.
제 1항에 있어서, 상기 독활추출물은 C1 내지 C4의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 치아우식증 예방용 치약조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 백부자추출물은 C1 내지 C4의 알코올 또는 이의 수용액으로 추출된 것을 특징으로 하는 치아우식증 예방용 치약조성물.
컨틴엔탈릭엑시드를 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물.
스티그마스테롤을 유효성분으로 함유하는 치아우식증 예방용 치약조성물.