KR20200114023A - 마전자 추출물을 포함하는 구강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마전자 추출물을 유효성분으로서 포함하는 구강용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 충치 예방 및 개선용 조성물로서, 더욱 자세하게는 구강세균의 바이오필름 형성 억제 효과를 갖는 마전자 추출물을 유효성분으로 포함하는 충치 예방 및 개선용 구강 조성물에 관한 것이다.

Description

마전자 추출물을 포함하는 구강용 조성물{Oral composition containing Nux-Vomica extracts}

본 발명은 마전자 추출물을 포함하는 구강용 조성물에 관한 것이다.

바이오필름(Biofilm)이란, 미생물에 의해 형성된 다양한 폴리머 물질로 싸인 미생물 복합체로 생물막 또는 균막이라고도 불린다. 이러한 바이오필름은 미생물이 다양한 환경에 적응하는데 도움을 주는 보호막의 역할을 하며 바이오필름 내의 균체들은 서로 대사(metabolism)을 공유하기도 하고, 유전자 전달(gene transfer)을 통해 생존에 유리한 성질들을 획득하기도 한다. 따라서 바이오필름을 형성한 균체들은 일반적인 부유균 상태로 존재할 때보다 가혹한 환경과 항생제에 대해 훨씬 강한 저항력을 가지며, 장기에 형성된 바이오필름은 다양한 병증을 야기한다. 이러한 병증이나 발병 위치를 예로 들면, 충치(dental caries), 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 중이염(otitis media), 인공후두(voice prostheses), 뇌수종(hydrocephalus hunts), 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 심내막염(valvular endocarditis), 인공심장판막(prosthetic heart valves), 중심정맥관(central venous catheter), 인공고관절(prosthetic hip joint), 인공슬관절(prosthetic knee joint), 만성 세균성 전립선염(chronic bacterial prostatitis), 자궁내 장치(intrauterine devices), 요도관(urinarycatheter) 등을 들 수 있다.

한편, 구강은 약 1,000여종의 세균이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이에 서식하는 많은 세균은 구강 바이오필름을 형성한다. 그 중 초기 구강 바이오필름 형성과 관련된 세균으로는 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.)이 알려져 있다. 이들 스트렙토코커스 종은 치아표면의 초기 부착균으로, 특히 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 충치의 원인이 되는 구강 바이오필름의 형성이 시작되는데 중요한 역할을 한다. 따라서 충치 발생을 억제 함에 있어 충치균으로 불리우는 뮤탄스균을 제어하고자 하는 노력이 지속되고 있다.

충치의 발생을 예방하기 위한 노력으로 클로로헥시딘 글루코네이트, 세틸피리디움 클로라이드, 생귀나린 및 트리클로산과 같은 항균제가 개발되어 양치액 및 치약과 같은 구강제품에 적용되어 왔으나, 아직까지도 충치의 발생은 근본적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다. 또한 이러한 합성 항생제는 장기간 사용할 경우, 구강 내 점막을 자극할 뿐만 아니라, 정상균도 파괴시켜 오히려 구강내 병원균에 대한 내성을 증가시키며, 치아착색 및 미각을 해치는 등의 인체에 대한 부작용이 크다.

한편, 다양한 천연 물질들도 바이오필름 형성을 조절하는데 효과적인 것으로 알려져 있으며, 바이오필름 억제에 천연 물질을 사용할 경우, 합성 화합물들에 비해서 독성이 낮고 특이성이 높다는 장점이 있다.

따라서 합성 화합물을 사용하는 기존제품들의 문제점을 극복할 수 있는, 천연 항균제를 포함하는 충치 예방용 구강제품이 요구된다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기한 바와 같이 종래 기술의 단점 및 문제점을 개선하기 위한 것으로서, 부작용이 없고 항균성이 높은 천연 물질 추출물을 포함하는 구강질환 예방 및 개선용 구강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 충치 예방, 완화 및 개선에 효과가 있는 구강용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 이루기 위하여 본 발명의 일 측면은 마전자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물을 제공한다.

상기 과제를 이루기 위하여 본 발명의 다른 측면으로 사용자가 편리하게 일상 생활 속에서 구강질환을 예방 및/또는 개선할 수 있도록, 마전자 추출물을 유효성분으로 하는 구강용 제품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 마전자 추출물을 포함하는 구강용 조성물은, 구강세균에 대한 항균활성 및 바이오필름 형성 억제 효과를 가짐으로써, 충치를 예방 및 개선할 수 있다.

또한, 천연물질로 이루어져서 합성 물질에 의한 부작용이나 위험도가 없는 인체에 안전한 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 인체에 안전하므로, 기능성 식품 조성물, 치약, 구강용 가글과 같이 인체에 직접 닿거나 심지어 인체에 들어가는 제품으로 다양하게 응용할 수 있다.

본 발명의 기술적 효과들은 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 충치균에 대한 마전자 추출물의 항균 효능 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2은 마전자 추출물을 처리하지 않은 것과 원지 추출물을 처리한 것의 바이오필름 형성 양상을 나타낸 사진이다.
도 3는 마전자 추출물을 처리하지 않은 것과 원지 추출물을 처리한 것의 하이드록시아파타이트 디스크에서의 바이오필름 형성 양상을 나타낸 그래프이다.
도 4은 구강점막세포에 대한 마전자 추출물의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적으로 기재한 것뿐이며, 본 발명의 범위는 청구범위를 기초로 해석된다.

본 발명은 마전자(Nux-Vomica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강용 조성물을 제공한다.

마전자(Nux-Vomica)는 마전과 식물인 마전(Strychnos nuxvomica)의 여문 씨를 말린 것으로 위경, 간경에 작용한다. 현재까지 마전자의 거담, 지해, 항암 작용 등의 효능에 대해서는 알려져 있으나, 마전자가 충치에 대하여 나타내는 효능에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 발명에서 "마전자 추출물"은 마전자를 추출 대상으로 하여 얻어지는 모든 형태의 추출물로서, 예를들어 식물을 압착하여 얻어지는 진액 추출물, 오일 추출물, 식물을 유기용매, 또는 물로 추출하여 얻는 추출물, 식물을 연소시킬 때 기체를 냉각하여 얻는 추출물 등을 모두 포함하는 것이다.

예를 들어, 상기 마전자 추출물을 식물을 분쇄한 후 추출 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출 용매의 비제한적 예로는, 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 클로로포름 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있다.

가장 바람직한 추출물로는 마전자의 에탄올 추출물이 사용될 수 있다.

상기 추출물의 제조방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 추출방법으로는 냉침 추출법, 온침 추출법 또는 열 추출법 등이 사용될 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파 분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상의 방법을 병용하여 수행할 수 있다.

또 다른 예에 의하면, 상기 마전자 추출물은 상기 유기용매 추출물을 감압하여 오일로 만든 것을 사용할 수도 있다.

상기 제조된 추출물은 여과하거나 농축 또는 건조하여 용매를 제거할 수 있으며, 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압 여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있고, 상기 건조는 일예로 동결 건조법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면 마전자 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질한 예방 또는 개선용 구강 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "구강질환"이란 구강영역에서 발생하는 여러 가지 질환을 말하며, 상기 구강영역은 앞쪽 입술로부터 뒤쪽 구협에서 인두와 연결되는 입 안의 공간을 의미한다. 본 발명에서 상기 구강 질환은 구강에 발생하는 질환이라면 그 병중에 관계없이 모두 포함하는 개념이며, 상기 구강질환의 비제한적인 예로는 구취, 시린이, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강 내 점막 궤양 및 치근단 질환 등을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는데 효과가 있다.

여기서 "미생물"이란 본 발명의 조성물이 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는데 특히 효능이있는 모든 세균, 진균, 효모 및 조류를 포함하는 개념이다. 따라서, 하기 실시예 및 실험에서 직접적으로 바이오필름 형성 억제가 확인된 미생물 이외에도 당업자가 통상의 능력 범위 내에서 본 명세서가 개시한 바를 기초로 바이오필름 형성을 억제할 것으로 예상되고 확인될 수 있는 모든 미생물이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 구강용 조성물은 스트렙토코커스(streptococcus)속 또는 포피로모나스(Porphyromonas) 속에 항균 효과가 있다.

구체적으로 본 발명에 따른 구강용 조성물은, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 라티(Streptococcus ratti), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 안지노서스(Streptococcus anginosus), 악티노바실러스 악티노미세템코 미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans),포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 퓨소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 파비모나스 미크라(Parvimonasmicra; Peptostreptococcus micros) 및 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinobacillus actinomycetemcomitans)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 미생물에 대해 항균 효과가 있다.

본 발명에 따른 마전자 추출물은 바이오필름 형성을 억제할 수 있는 한 그 사용되는 제품에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 통상적으로 본 발명에 따른 마전자 추출물은 구강용 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.001~5.0 중량%, 바람직하게는 0.125~2.0 중량%로 포함될 수 있다.

상기 조성물은 충치 유발균에 대한 항균 활성을 가지며, 치아 표면에 바이오필름이 형성되는 것을 억제함으로써 충치 예방 및 개선 효과가 우수하다.

본 발명에서 충치(dental caries)는 치아 우식증이라고도 하며, 치아 표면에 생성된 세균막에 존재한는 세균에 의해 입 안에 남아있는 설탕이나 전분등이 분해되면서 발생하는 산이 치아면의 법랑질을 공격하여 손상시키는 질환을 의미한다.

본 발명에 따른 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물은 인간을 포함하는 동물에 직접 적용할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물은 마전자 추출물외에 사용방법 및 사용 목적에 따라 다양한 성분들을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구강용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 치약, 구강세정제, 구강청정제, 껌, 캔디류, 구강스프레이, 구강용 연고제, 구강용 바니쉬, 구강양치액 및 잇몸 마사지 크림 등의 제형을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

하나의 예로서, 본 발명의 구강용 조성물이 치약의 제형일 경우, 보습제, 연마제, 결합제, 기포제, 향미제, 감미제, 착색제, 보존제, 약효성분, 용제, pH 조절제 등을 포함할 수 있다.

상기 보습제는 치약제 성분 중 분말이 페이스트상이 되게 하고 치약제가 공기 중에 굳는 것을 방지하기 위한 것으로 글리세린, 솔비톨, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 조성물 총 중량 중 1 ~ 60 중량%, 구체적으로는 10 ~ 50 중량%를 사용할 수 있다.

상기 기포제는 치약제를 구강 중에 확산시켜 청소효과를 높이고, 계면활성제로서 작용하여 구강 오염을 세정하는 것으로 라우릴황산나트륨, 라우릴 사르코신산 나트륨, 알킬 설포호박산 나트륨, 자당 지방산 에스테르 등의 계면활성제를 단독 혹은 2종 이상 혼합하여 조성물 총 중량 중 0.5 ~ 10 중량%, 구체적으로는 0.5 ~ 5 중량%를 사용할 수 있다.

상기 결합제는 치약제중의 분말과 액체 성분 간의 분리를 방지하는 것으로 카복시메틸셀룰로오스나트륨, 메틸셀룰로오스, 하이드록시 프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체와 알긴산나트륨, 카라기난, 잔탄검 등을 단독 혹은 2종 이상 혼합하여 조성물 총 중량 중 0.1 ~ 5 중량%, 구체적으로는 0.3 ~ 2 중량%를 사용할 수 있다.

상기 연마제는 치아표면을 상처내지 않고 치아표면의 부착물을 제거하고 치아 본래의 광택이 나도록 하는 것으로 탄산칼슘(CaCO3), 제2인산칼슘(CaHPO4, CaHPO42H2O), 무수규산(SiO22H2O), 수산화알루미늄(Al(OH)3), 피로인산카륨, 탄산마그네슘 등을 단독 혹은 2종 이상 혼합하여 조성물 총 중량 중 1 ~ 60 중량%, 구체적으로는 10 ~ 50중량%를 사용할 수 있다.

상기 향미제는 치약에 상쾌감과 냄새를 부여하여 사용감을 증진시키기 위한 것으로 페퍼민트오일, 아네톨, 멘톨, 오이게놀, 리모넨, 시트로네놀, 알파터피네올, 살리실메틸, 시네올, 리나롤, 이틸리나롤, 바닐린, 티몰, 스피아민트유, 세지유, 로즈마리유, 계피유 등을 단독 혹은 2종 이상 혼합하여 조성물 총 중량 중 1 ~ 60 중량%, 구체적으로는 0.01 ~ 5 중량%를 사용할 수 있다.

상기 감미제는 치약제 원료에 의한 불쾌한 맛이나 제거하고 청량감을 좋게 하기 위한 것으로 수크로오스, 락토오즈, 말토오즈, 크실리톨, 나트륨, 시클라메이트, 사카린산나트륨, 스테비오사이드, 아스파탐, 자일리톨, 감초산 등을 단독 혹은 2종 이상 혼합하여 조성물 총 중량 중 1 ~ 60 중량%, 구체적으로는 0.01~5중량%를 사용할 수 있다.

약효성분은 치우 우식증 예방, 치주질환 예방, 치통 예방, 시린이 예방, 구취 제거 등의 효과를 위한 것으로 불화물, 염화아연, 클로르헥시딘, 아미노카프론산, 트라넥사민산, 염화세틸피리디움, 염화피리독신, 트리클로산,초산토코페롤, 일불소인산나트륨 등을 단독 혹은 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 구강용 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 구강용 조성물과 중복하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 마전자 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 구체적으로, 본 발명은 마전자 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환, 보다 구체적으로는 시린이 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 구강질환을 예방하고 치료하기 위한 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화가 가능하다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등을 포함할 수 있다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 등과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 텍스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀루로오즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 플로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 이산화규소 등의 광물유 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 구강질환의 예방 및 개선용 약학적 조성물의 구체적인 투여량은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있으며, 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 마전자 추출물을 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공할 수 있으며, 예를 들어 식품 또는 음료 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 식품이란 영양소를 한가지 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공물을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 통상적 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하고자 하는 의도이며, 각종 식품, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합체, 기능성 식품 등이 있다.

본 발명에 있어서, "식품첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물이 페이스트 상 조성물일 경우에는 상기 점결제는 가라기닌, 각종 점증용 셀룰로오스 유도체, 잔탄검, 트라가칸트검 등의 검류, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리아크릴산/말레인산 공중합체, 카르복시비닐 폴리머 등의 합성 고분자 유도체 등의 유기계 점결제와 실리카, 라포나이트 등의 무기계 점결제 등을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 양치 용액인 경우에는 통상적인 용제에 마전자 추출물을 혼합하고, 양치용액으로 제형화하여 제조할 수 있으며, 하루 2 내지 10 회 구강을 세척하여 충치를 예방 및 치료할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실험예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실험예와 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

제조예 1: 마전자 추출물 제조

건조된 마전자를 분쇄하여 2배량의 에탄올에 침지시킨 상태로 초음파 장치에 30분간 노출시켰다. 24시간 침치 후 여과지에 거른 다음 회전감압농축기로 용매를 제거하여 추출물을 제조하였다.

실험예 1: 구강 균주 및 배양조건

균주는 KCTC 생물자원센터에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 균을 사용하였다.

상기 분양받은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 균을 BHI(brain heart infusion) broth 배지에 접종한 후 이를 37 ℃에서 정치배양하여 실험에 사용하였다.

실험예 2: 항균활성 확인

마전자 추출물의 구강균에 대한 항균활성을 측정하기 위해 MIC(minimal inhibitory concentration) 테스트를 진행하였다.

96 well-plate에 최종 혼합액이 200 uL가 되도록 약 5x10^5 CFU/ml 농도의 세균 배양액에 각 농도에 따른 추출물을 처리하였다. 추출물의 경우 감압 농축된 마전자 추출물을 DMSO에 50 mg/mL의 농도로 녹인 것을 사용하여, 멸균된 액체배지로 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ug/mL 농도가 되도록 희석해서 사용하도록 했다.

세균 배양액, 추출물을 포함하는 상기 혼합액을 처리한 96 well-plate를 37 ℃에서 24 시간 배양하였다.

항균활성의 판정은 추출물 미처리 대조군 대비 실험군의 흡광도를 샘플 처리 직후와 24시간 배양 후 microplate reader를 이용하여 600 nm에서 측정하여 그 변화 값을 계산, 비교하여 진행하였다.

도 1은 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 마전자 추출물의 농도별 생육 억제도를 나타낸 것으로, 마전자 추출물의 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 MIC 값이 250 ug/mL 임을 확인하였다.

실험예 3 : 바이오필름 형성 억제능 측정-Microplate assay

마전자 추출물의 바이오필름 형성 억제능을 확인하기 위해 마이크로 플레이트를 이용한 실험을 진행하였다.

96 well-plate에 스트렙토코커스 뮤탄스 균 약 5x10^5 CFU/mL, 마전자 추출물을 각 500, 250, 125, 62.5, 31.25 ug/mL, 0.5 % sucrose를 포함하는 액체배지 200 uL을 처리하였다. 상기 96 well-plate를 37 ℃에서 24시간 동안 정치배양하였다.

24시간 배양 후, 배지를 제거하고 각 웰에 정제수 200 uL를 가하여 부유균과 바이오필름에 약하게 결합되어 있는 균들을 제거하는 작업을 3회 반복하였다. 이후, 각 웰에 0.1% crystal violet 염색 시약을 200 uL씩 첨가하여 15분간 상온에서 반응시켰다. 15분 후 잔여 염색약을 제거하기 위해 정제수를 이용하여 3회 washing하였다. 염색된 바이오필름을 상온에서 건조시킨 뒤 각 웰의 바이오필름 생성 정도를 육안으로 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 마전자 추출물을 처리한 실험군에서는 대조군과 비교하여 125 ug/mL 이상의 농도에서 바이오필름 형성을 억제하였음을 확인하였다.

실험예 4 : 바이오필름 형성 억제능 측정-하이드록시아파타이트 디스크(Hydroxyapatite disc)

마전자 추출물의 바이오필름 형성 억제능을 확인하기 위한 하이드록시아파타이트 디스크 실험을 진행하였다.

24 well-plate에 스트렙토코커스 뮤탄스 균 약 5x10^5 CFU/ml, 마전자 추출물을 각 250, 125, 62.5, 31.25 ug/mL으로 포함하는 액체배지 1 mL을 처리하고, 인공침(artificial saliva)으로 코팅된 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 디스크를 침지시킨다. 상기 24 well-plate를 37 ℃에서 24시간 정치배양하였다.

24시간 배양 후, 배지를 제거하고 각 웰에 정제수 1 mL를 가하여 부유균과 바이오필름에 약하게 결합되어 있는 균들을 제거하는 작업을 3회 반복하였다. 이후, 각 웰에 0.1% crystal violet 염색 시약을 1 mL씩 첨가하여 15분간 상온에서 반응시켰다. 15분 후 잔여 염색약을 제거하기 위해 정제수를 이용하여 3회 washing하였다. 염색된 바이오필름을 상온에서 건조시킨 뒤 95% 에탄올을 가하여 충분히 반응시켰다. 염색약이 녹아 나온 에탄올 100 uL를 96-well plate에 옮겨 microplate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 추출물을 처리한 실험군에서는 대조군과 비교하여 62.5 ug/mL 이상의 농도에서 바이오필름 형성을 억제하였음을 확인하였다.

실험예 5 : 구강점막세포에 대한 세포독성

구강점막세포에 대한 마전자 추출물의 독성을 측정하기 위해 MTT 실험을 진행하였다.

Primary Gingival Keratinocytes를 96 well plate에 약 1x10^4 cells/well로 처리한 다음 keratinocyte growth agent를 포함한 dermal cell basal 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 24시간 동안 배양하였다.

24시간 후 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 200, 100, 50, 25 ug/mL로 희석한 마전자 추출물을 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건으로 24시간 반응시켰다.

처리 후 각 웰 당 0.5 mg/mL MTT 용액을 200 uL 씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 후 상등액을 모두 제거하고 DMSO 150 uL 씩 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4와 같이 마전자 추출물은 200 ug/mL 이하에서 구강점막세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않았다.

실험예 6 : 마전자 추출물을 함유하는 치약 조성물 제조

실험예의 치약 조성물을 하기 표 1과 같은 성분 및 조성비로 제조하였다.

구강 조성물 중 치약 조성물의 제조순서는 습윤제인 비결정성 소르비톨액에 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 사카린나트륨 등 분말 소량 성분을 분산시키고 정제수로 묽힌 다음 혼합기에서 1차 혼합하고, 그 다음에 실리카 및 탄산칼슘 등의 연마제를 넣고 2차 혼합했다. 그리고 마지막으로 기포제, 안정제, 향료 등을 넣고 3차 혼합함으로써 치약 조성물을 제조하였다.

성 분 명	실시예(중량%)
실리카	20.0
농글리세린(98%)	30.0
비결정성 소르비톨액(70%)	30.0
라우릴황산나트륨	1.0
카르복시메틸셀룰로오스나트륨	0.5
잔탄검	0.3
불화나트륨	0.22
향료	1.0
사카린나트륨	1.0
구연산	적량
탄산수소나트륨	2.0
마전자 추출물	0.00625
정제수	To 100

실험예의 치약 조성물은 바이오필름 생성을 억제하는 최소 농도인 62.5 ug/mL의 마전자 추출물을 포함하여 제조하였다.

상기의 실험들로부터 마전자 추출물이 충치의 근본원인인 바이오필름 형성의 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세균막 형성을 억제시킴으로써 충치를 예방 또는 개선하는 천연소재임을 확인하였다.

Claims (12)

1. 마전자(Nux-Vomica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 구강질환 예방 또는 개선용인 구강용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 구강질환은 구취, 시린이, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강 내 점막 궤양 및 치근단 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 질환인 구강용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 마전자 추출물은 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산, 클로로포름, 또는 이들의 혼합 용매로 추출되거나, 또는 물로 추출된 추출물인 구강용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는데 효과가 있는, 구강용 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 스트렙토코커스(streptococcus)속 또는 포피로모나스(Porphyromonas) 속에 항균 효과가 있는, 구강용 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 라티(Streptococcus ratti), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 안지노서스
   (Streptococcus anginosus), 악티노바실러스 악티노미세템코
   미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans),포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 퓨소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 파비모나스 미크라(Parvimonasmicra; Peptostreptococcus micros) 및 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinobacillus actinomycetemcomitans)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 미생물에 대해 항균 효과가 있는 구강용 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 마전자 추출물은 상기 구강용 조성물의 전체 함량에 대하여0.001 내지 5.0 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 구강용 조성물을 포함하는 구강용 제품.
10. 제9항에 있어서, 상기 구강용 제품이 치약, 구강세정제, 구강청정제, 껌, 캔디, 구강스프레이, 구강용 연고제, 구강용 바니쉬, 구강양치액 및 잇몸 마사지 크림으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 제형인, 구강용 제품.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 구강용 조성물을 포함하는 구강질환 예방구강및 개선용 기능성 식품 조성물.
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 구강용 조성물을 포함하는 구강질환 예방구강 및 개선용 약학 조성물.

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