KR101183095B1

KR101183095B1 - 어류의 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101183095B1
Application number: KR20100030571A
Authority: KR
Inventors: 권문경; 박명애; 김명석; 정승희; 김진우; 조미영; 김이청; 최희정; 이남실; 이덕찬; 김병관; 원경미
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-04-02
Filing date: 2010-04-02
Publication date: 2012-09-27
Also published as: WO2011122843A3; KR20110111154A; WO2011122843A2

Abstract

본 발명은 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 균주 및 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 11634BP) 균주를 포함하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 이를 이용하여 어류를 면역시키는 방법에 대한 것이다.

Description

어류의 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 그 제조방법{COMBINED INACTIVATED VACCINE AGAINST STREPTOCOCCAL DISEASE IN FISH AND PREPARING METHOD THEREOF}

본 발명은 어류의 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 그 제조방법에 관한 것이다.

연쇄구균증은 해산 어류에 나타나는 질병으로, 어류의 안구 돌출이나 아가미 뚜껑 내측의 적변화 등을 특징을 나타낸다. 사육수나 생사료를 통해 이러한 연쇄구균이 어류에 옮겨 가서 어류를 감염시키며, 주로 여름에서 가을 사이에 나타난다.

양식 넙치(광어)의 세균성 질병 조사 결과, 비브리오균(Vibrio), 연쇄구균, 포토박테리움균(Photobacterium damselae), 에드와드시엘라 탈다(Edwardsiella tarda), 및 슈도모나스균(Pseudomonas)이 전체 세균성 질병의 65.3%를 차지하였으며, 그 중 연쇄구균은 16.4%로 두 번째로 높은 검출률을 나타내었다.

양식 넙치(광어)의 연쇄구균증의 원인균은 스트렙토코커스( Streptococcus sp.)이다. 넙치의 연쇄구균증 감염 증상을 보면, 먹이 섭취가 불량하고 바닥에 흩어져 있으며, 완만한 유영을 하고 있어 쉽게 잡을 수 있게 된다. 또한 몸체를 반대로 뒤집고 머리를 올려 입을 열고 있는 경우도 있다. 그리고 체색흑화, 안구의 돌출, 백탁, 충혈, 두부 및 상하턱의 발적, 아가미 뚜껑 및 아가미 뚜껑 내측의 발적, 및 탈장 등이 나타나는 것도 있다. 연쇄구균증에 감염된 넙치를 해부해 보면, 간장의 울혈이나 퇴색, 장관의 발적, 복수가 차는 현상, 신장과 비장의 비대가 나타난다.

이와 같은 연쇄구균증에 걸린 양식 넙치를 치료하기 위해 항생제를 투여해오고 있다. 그러나 항생제에 대한 내성도가 높게 나타나고 있어서 항생제 사용에 의한 치료는 어려워지고 있는 실정이다(김종훈 등, 한국수산학회지, 36: 654-660, 2003). 게다가 항생제 투여에 따른 경제적 손실 및 넙치의 성장률 저하로 인해 관련 업계는 이중고를 겪고 있다.

연쇄구균증은 일단 발병하면 치료가 어렵기 때문에 질병의 예방이 매우 중요하지만, 사육환경 및 사육관리의 개선만으로는 질병 발생을 억제하는데 한계가 있다. 따라서 보다 근본적인 예방 대책으로서 백신의 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 경제적이고 효과적인 연쇄구균증 예방 방법에 대하여 연구를 계속하여 감마-용혈성 스트렙코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)와 베타-용혈성 스트렙코커스 이니애(Streptococcus iniae)의 혼합 백신을 발명하기에 이르렀다.

본 발명은 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 및 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 11634BP) 균주를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 항원 및 상기 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 11634BP) 항원을 포함하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혼합 불활성화 백신을 어류에 투여하여 어류를 면역시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284 및 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024 균주를 제공한다.

상기 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284 및 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024는 연쇄구균증에 감염된 제주도 양식 넙치로부터 분리된 것으으로, 2010년 2월 5일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 각각 KCTC 11633BP 및 KCTC 11634BP로 기탁되었다.

본 발명은 상기 균주를 이용한 불활성화 백신을 제공한다. 구체적으로 불활성화된 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 항원 및 불활성화된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 11634BP) 항원을 포함하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신을 제공한다.

상기 불활성화 백신은 이 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 불활성화 백신을 제조하기 위해서는 불활성화제를 사용해야 한다. 상기 불활성화제는 이 기술분야에 널리 공지된 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다.

상기 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284 항원과 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024 항원은 1:1의 비율로 혼합될 수 있다. 상기 비율로 혼합되는 경우, 연쇄구균증 예방 효과가 우수하다.

2종 이상의 불활성화 항원을 혼합시킬 경우에는 혼합에 의한 백신 부작용의 발생, 항원상호의 간섭-예를 들어 혼합시키기 전의 각 항원에 특이적인 항원성과 면역원성의 저하 등이 나타날 수 있다. 그러나 본 발명과 같이 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 FP2284 및 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024에서 유래하는 불활성화 항원을 혼합시킬 경우에는, 항원성과 면역원성이 확보되고 부작용이 관찰되지 않는다.

본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신에는 보조제(adjuvant)를 더 첨가할 수 있다. 상기 보조제는 이 기술분야에 알려진 것은 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 안정화제로서 당류나 아미노산류, 또한 보조제로서 광물유,식물유, 백반, 인산알루미늄, 벤토나이트, 실리카, 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신, 인터류킨 등을 이용할 수 있다.

이어서, 적당한 용적의, 예를 들어 약 10~500 ㎖ 부피의 바이알에 백신액을 나누어 주입하고 밀봉 후 백신으로 사용한다. 이러한 백신은 액상뿐만 아니라, 나누어 주입한 다음에 동결건조함으로써 건조제제로 사용할 수 있다. 또, 건조제제는 사용 직전에 첨가한 감균액으로 건조 물질을 완전하게 재용해하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신은 감염의 위험성이 있는 임의의 연령의 어류에 사용할 수 있다. 단, 양식 보전의 관점에서, 작은 물고기 내지 치어를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법을 제공한다. 상기 어류는 감염의 위험성이 있는 넙치 등의 어류를 포함하다.

본 발명의 불활성화 백신을 이용하여 어류를 면역시키는 방법은 본 발명의 백신을 복강내 투여 등을 이용하여 어류에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 혼합 불활성화 백신 1회 투여로 2 종류의 세균에 의한 연쇄구균증을 효과적으로 예방할 수 있는 효과를 제공한다. 따라서 본 발명은 효과가 우수하면서도 경제적인 백신을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 균주의 2-DE 프로필을 나타낸 것이다: (○)은 S. parauberis KCTC3651 균주에 비해 발현이 증가된 단백질체를 나타내고, (→)은 S. iniae FP5024 균주에 비해 발현이 증가된 단백질체를 나타냄.
도 2는 S. parauberis 감염어에서 관찰된 심외막염을 보여주는 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합 백신을 넙치에 주사 투여한 후의 응집항체가 변화를 나타낸 그래프이다:(a)는 S. iniae.에 대한 응집항체가를, (b)는 S. parauberis에 대한 응집항체가를 나타냄.
도 4는 본 발명의 혼합 백신을 침지 투여한 후의 응집항체가의 변화를 나타낸 그래프이다:(a)는 S. iniae에 대한 응집항체가를, (b)는 S. parauberis에 대한 응집항체가를 나타냄.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합 백신 처리 1일째 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직 염색 결과이다: 1은 1 ㎎(Si)+1 ㎎(Sp)/fish, 2는 2 ㎎(Si)+ 2 ㎎(Sp)/fish 시험구임.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합 백신 처리 1주일째 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직 염색 결과이다: 1은 1 ㎎(Si)+1 ㎎(Sp)/fish, 2는 2 ㎎(Si)+ 2 ㎎(Sp)/fish 시험구임.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합 백신 처리 4주일째 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직 염색 결과이다: 1은 1 ㎎(Si)+1 ㎎(Sp)/fish, 2는 2 ㎎(Si)+ 2 ㎎(Sp)/fish 시험구임.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 백신 균주의 분리 및 동정

백신 균주는 체색흑화, 안구돌출 및 백탁, 복수, 장출혈 등의 증상을 나타내는 제주도의 양식 넙치로부터 분리하였다. 구체적으로, 1.5% NaCl이 첨가된 BHIA(Difco, USA) 배지를 사용하여 병든 어류의 내부 장기 조직을 무균적으로 적출하여 도말한 후 30℃에서 24～48 시간 배양하여 분리하였다. 순수 분리한 콜로니 중 그람 양성 균주를, "FP2284" 및 "FP5024" 라 명명하였다. 상기 FP2284 및 FP5024는, 각각, Mata 등의 방법(Mata, A.I, 등, Appl. Environ. Microbiol., 68: 5177-5180, 2004)과 Zlotkin 등의 방법(1998)(Zlotkin, A.등, Appl. Environ. Microbiol., 64L 4065-4067, 1998)에 따라 표 1과 같은 프라이머를 이용, 멀티플렉스 PCR을 실시하여 증폭시켰다. 상기 FP2284 및 FP5024의 16S rDNA 염기서열은 각각 서열번호 1 및 2로 나타내었다.

Mata 등의 방법을 이용한 1차 동정 결과, 상기 FP2284는 S. parauberis로 동정되었으며, Zlotkin 등의 방법을 이용한 1차 동정 결과, 상기 FP5024는 에 S. iniae로 동정되었다. 상기 1차 동정 결과 S. parauberis로 동정된 것은 유니버셜 박테리아 프라이머(Bioneer, Korea)인, P27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 P1492r(5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3')를 사용하여 증폭 후 PCR 반응 산물은 AccuPrep PCR 정제 키트 kit(Bioneer) 및 AccuPrep PCR 플라스미드 익스텐션 키트(Bioineer)를 이용하여 시퀀싱을 실시하였다. FP2284의 염기서열 및 GenBank에 등록되어 있는 Streptococcus 속 세균의 유전 정보를 Clustal W 프로그램을 사용하여 멀티플 얼라인먼트를 실시하고 각 균종간의 상동성을 비교하였다. FP2284의 16S rRNA 유전자에 대한 염기서열 분석 결과, GenBank에 등록되어 있는 Streptococcus 속의 유사 균주와 비교한 결과 S. parauberis AF284579, AY584477, X89967 및 AY942572 등의 균주와 98%의 상동성을 나타내었다. 따라서 상기 FP2284는 S. parauberis로 판단되었다. 마찬가지로 상기 FP2284에서 사용한 프라이머와 시퀀싱 방법을 이용하여, FP5024의 16S rRNA 유전자에 대한 염기서열을 분석한 결과, Streptococcus iniae ATCC 29178 균주와 99%의 상동성을 보였다. 따라서 상기 FP5024는 S. iniae로 판단되었다.

상기 FP2284는 "스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284"로 명명되었고, 상기 FP5024는 "스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024"로 명명되었다. 이 두 균주, FP2284 및 FP5024는, 2010년 2월 5일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에, 각각, 미생물 기탁번호 KCTC 11633BP 및 미생물 기탁번호 KCTC 11634BP로 기탁되었다.

실시예 2: 백신 균주의 병원성

실시예 1의 백신용 균주의 LD 값은 아래 표 1과 같다. 상기 LD값 측정은 이 기술분야에서 널리 공지된 방법을 이용하였다(Hall, J.A. and Golding, L.A: Standard methods for whole effluent toxicity testing: development and application. Report No. MFE 80205. NIWA report for the ministry for environment, Wellington, New Zeland. 1998).

실시예 3: 백신 균주의 주요 항원 특성 분석

표준 균주인 S. parauberis KCTC 3651에 대한 토끼 항혈청을 이용한 슬라이드 응집반응 결과 S. parauberis는 모든 균주에서 응집반응을 나타냈으며 대부분 용혈성이 없는 것(감마-용혈성)으로 나타났고, S. iniae 용혈성 시험 결과 베타-용혈성을 나타내었다.

백신 균주인 2종의 항원 단백질체 분석을 위하여 2-DE(Isoelectric focusing and SDS-PAGE) 분석을 수행하였다. 분석 결과, S. parauberis FP2284의 2-DE 맵에서, S. parauberis FP2284는 표준 균주인 S. parauberis KCTC 3651과 S. iniae FP5024에 비해 각각 13개 및 4개의 단백질 발현이 증가한 것으로 나타났다. 표준 균주에서 발현되지 않은 단백질을 Maldi-Ms/Ms로 추가 분석한 결과, 클래스-II 알돌레이즈(class-Ⅱ aldolase) 및 안티-튜머 글라이코프로틴(Anti-tumor glycoprotein)으로 동정되었다(도 1).

실시예 4: 백신 균주의 주요 항원 특성 분석

BHIA 배지(Brain Heart Infusion Agar, Difco, USA)에서 배양한 본 발명의 S. parauberis FP2284를 1.0×10⁵CFU/mL 농도로 희석하여 건강한 넙치의 복강에 0.1 mL씩 주사한 후 수온 20±1℃에서 사육하면서 내부 장기에서의 총균수를 조사하였다. 그 결과, S. parauberis FP2284는 3일째부터 비장과 신장에서 주사 농도와 동일한 수준의 세균수가 검출되었으며, 주사 후 8일째부터 폐사어가 관찰되었다. 병어는 외관상 체색 흑화, 복부 팽만 및 안구 주변의 미약한 출혈 증상을 나타내었으며, 해부 소견으로는 간 충혈, 맑은 복수, 내부 장기의 심한 빈혈 증상이 관찰되었다. 병어 내부 장기의 병리 조직 검사 결과, 비장 협조직의 광범위한 비후 및 다수의 MMC(melano-macrophage center), 심외막염 및 내부 장기의 막 조직에서 염증 소견이 관찰되었다(도 2).

실시예 5: 혼합 불활성화 백신의 제조 및 접종

동결 보존된 S. parauberis FP2284와 S. iniae FP5024를 1.5%(v/v) NaCl이 첨가된 BHIA 배지에서 30℃ 온도로 24 시간 배양하였다. 배양된 평판배지의 집락을 무균적으로 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB에 접종 후 쉐이킹 인큐베이터(JS Research Inc.)에서 150 rpm, 30℃ 온도로 48 시간 배양하였다. 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린(Merck, Germany)을 각 배양액의 0.5%(v/v)가 되도록 첨가하여 쉐이킹 인큐베이터에서 150 rpm, 20℃로 24 시간 불활화하였다. 배양균의 불활화를 BHIA 아가(agar)(Difco, USA)에서 최종 확인하였다. 불활화가 확인된 균액은 12,000 RPMD으로 원심분리 후 멸균 생리 식염수로 3회 세척한 후 균체를 수거하고 최종적으로 습균체 무게를 측정하여 실험구에 따라 농도를 달리하여 현탁하였다(표 2). 백신액은 멸균된 유리병에 분주하여 4℃에 보관 후 실험에 사용하였다.

시험어로 넙치를 이용하였다. 넙치에 대한 백신 접종은 복강주사법과 침지처리법의 두 가지 방법으로 수행하였다. 복강 주사의 경우, 시험 백신을 어체당 0.1 ml씩 복강 주사하였으며 대조구는 멸균 생리 식염수를 동량씩 복강 주사하였다. 침지처리법은 백신 혼합액에서 5분간 침지 처리하였으며, 대조구는 사육수에 5분간 침지 처리하였다.

실시예 6: 혼합 불활성화 백신의 면역원성 시험

6-1: 응집항체가 조사

실시예 5에 따른 혼합 백신 접종 후 2, 4, 6, 8주째 시험어의 미부정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하였으며, 응집 항체가는 마이크로타이터(microtiter)법으로 조사하였다. 즉, 96 웰 마이크로플레이트 웰(Corning, USA)에서 넙치로부터 분리한 혈청을 멸균 생리 식염수로 단계 희석한 후 24 시간 후 응집괴 형성 유무를 관찰하였다.

S. iniae에 대한 응집항체가 조사 결과, 백신 처리 2주째부터 응집항체가의 증가가 확인되었으며 조사 8주째까지 지속적으로 유지되었다. 백신 처리 2주째에는 시험구중에서 5 ㎎(Si)+10 ㎎(Sp)/fish의 농도구에서 가장 높은 항체가를 나타내었으나, 백신 접종량 및 8주간의 응집항체가 전체적인 결과를 분석 시 1 ㎎(Si)+1 ㎎(Sp)/fish 2 ㎎(Si)+2 ㎎(Sp)/fish 및 5 ㎎(Si)+5 ㎎(Sp)/fish의 농도구가 우수한 것으로 판단되었다(도 3 (a)).

S. parauberis에 대한 응집항체가 조사 결과는 S. iniae와 유사한 경향으로 백신 처리 2주째에는 시험구중에서 5 ㎎(Si)+10 ㎎(Sp)/fish의 농도구에서 가장 높은 항체가를 나타내었으나, 백신접종량 및 8주간의 응집항체가 전체적인 결과 분석 시 1 ㎎(Si)+1 ㎎(Sp)/fish 2 ㎎(Si)+2 ㎎(Sp)/fish 및 5 ㎎(Si)+5 ㎎(Sp)/fish의 농도구가 우수한 것으로 판단되었다(도 3 (b)).

6-2: 방어력 조사

시험 백신이 방어력에 미치는 효과를 조사하기 위하여 백신 접종 후 4주째 S. iniae 및 S. parauberis를 1×10⁷ CFU/ml로 조정한 후, 0. 1ml씩 복강주사법으로 인위 감염 후 2 주간 누적폐사율을 조사하였다. 상대생존율은 아래와 같이 계산하였다.

상대생존율(%)={1-(시험구의 누적폐사율/대조구의 누적폐사율)} × 100

방어력 조사 결과, 혼합백신을 주사 후 각 균주에 대한 방어력 조사 결과, 모든 백신 접종구에서 66.7% 이상의 상대 생존율을 나타내었으며, 백신 접종량을 고려하였을 때 1 ㎎(Si)+1 ㎎(Sp)/fish의 농도구가 가장 우수한 것으로 판단되었다(표 3).

비교예: 침지처리법에 의한 효과

실시예 5의 혼합 백신을 침지법으로 처리하였을 때, Si 항원에 대한 응집항체가는 2주째에 100 ㎎+100 ㎎/㎖ 농도에서 유의적으로 높게 나타났으며, Sp 항원의 경우 4주째에 10 ㎎+10 ㎎/㎖ 농도에서 높게 나타나는 경향을 보였다(도 4). 또한 S. iniae 균주에 대한 방어력은 10 ㎎+10 ㎎/㎖ 농도에서 가장 높게 나타났다(표 4). 그러나 백신 접종량 및 효과를 고려하여 판다해보면, 주사처리법에 비하여 산업화에는 어려움이 있을 것으로 판단된다.

실시예 7: 혼합 불활성화 백신 투여에 따른 안전성 조사

본 발명에 따른 백신 처리의 안전성 조사를 위하여, 실시예 5의 혼합백신 처리구 중 효과가 높게 나타난 1㎎(Si)+1㎎(Sp)/fish, 2㎎(Si)+2㎎(Sp)/fish 복강주사구 및 대조구에 대한 병리조직학적 검사를 실시하였다. 백신 처리 1일, 1주일 및 4주일째 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직을 10% 중성 포르말린에 고정 후 상법에 따라 H&E염색을 실시 후 검경하였다. 그 결과, 백신 처리구의 모든 장기에서 정상적인 조직 소견이 관찰되었으며, 심장에서도 심외막염이 관찰되지 않아 백신의 독성이 없음을 확인하였다(도 5 내지 7).

한국생명공학연구원

KCTC11633

20100222

한국생명공학연구원

KCTC11634

20100222

서열목록 전자파일 첨부

Claims

삭제
삭제
불활성화된 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 항원 및 불활성화된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 11634BP) 항원을 1:1의 중량 비율로 포함하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신.
삭제
불성화시킨 감마-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FP2284(미생물 기탁번호 KCTC 11633BP) 균주와 불활성화시킨 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(미생물 기탁번호 KCTC 11634BP) 균주를 1:1의 중량 비율로 혼합시키는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신의 제조방법.
삭제
제3항의 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법.
제7항에 있어서, 상기 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는 어류를 면역시키는 방법.