KR101603714B1 - 스트렙토코커스 파라우베리스 균주 유래의 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신 및 이를 이용한 어류의 세균성 질병 예방 방법 - Google Patents

스트렙토코커스 파라우베리스 균주 유래의 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신 및 이를 이용한 어류의 세균성 질병 예방 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 넙치로부터 분리된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164 균주(KCTC 11980BP) 균주 및 이를 이용한 어류의 세포성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신에 관한 것으로서, 본 발명의 백신은 1회 투여로 3 종류의 세균에 의한 질병을 효과적으로 그리고 경제적으로 예방할 수 있으므로, 어류의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

스트렙토코커스 파라우베리스 균주 유래의 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신 및 이를 이용한 어류의 세균성 질병 예방 방법{COMBINED INACTIVATED VACCINE AGAINST BACTERIAL DISEASES IN FISH COMPRISING ANTIGEN ORIGINATED FROM STREPTOCOCCUS PARAUBERIS AND PREVENTION METHOD OF BACTERIAL DISEASES IN FISH USING IT}
본 발명은 신규 스트렙토코커스 균주 및 이를 이용한 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 스트렙토코커스 균주, 종래 알려진 균주의 항원 및 몬타나이드(Montanide) ISA35 또는 Gel01을 보조제로서 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신에 관한 것이다.
어류에서 세균성 질병은 무수히 많은 세균의 감염으로 발생하며, 대표적인 양식 어류인 넙치(광어)의 경우, 비브리오균(Vibrio ), 연쇄구균, 포토박테리움균(Photobacterium damselae) 및 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)가 전체 세균성 질병의 90%를 차지하며, 그 중 연쇄구균이 19%로 두 번째로 높은 검출률을 나타내며, 에드워드시엘라 타르다가 18%로 세 번째로 높은 검출률을 나타낸다.
연쇄구균증은 해산 어류에 나타나는 질병으로, 어류의 안구 돌출이나 아가미 뚜껑 내측의 적변화 등을 특징을 나타낸다. 사육수나 생사료를 통해 이러한 연쇄구균이 어류에 옮겨 가서 어류를 감염시키며, 주로 여름에서 가을 사이에 나타난다.
양식 넙치(광어)의 연쇄구균증의 원인균은 스트렙토코커스(Streptococcus sp.)이다. 넙치의 연쇄구균증 감염 증상을 보면, 먹이 섭취가 불량하고 바닥에 흩어져 있으며, 완만한 유영을 하고 있어 쉽게 잡을 수 있게 된다. 또한 몸체를 반대로 뒤집고 머리를 올려 입을 열고 있는 경우도 있다. 그리고 체색흑화, 안구의 돌출, 백탁, 충혈, 두부 및 상하턱의 발적, 아가미 뚜껑 및 아가미 뚜껑 내측의 발적, 및 탈장 등이 나타나는 것도 있다. 연쇄구균증에 감염된 넙치를 해부해 보면, 간장의 울혈이나 퇴색, 장관의 발적, 복수가 차는 현상, 신장과 비장의 비대가 나타난다.
이와 같은 연쇄구균증에 걸린 양식 넙치를 치료하기 위해 항생제를 투여해오고 있다. 그러나 항생제에 대한 내성도가 높게 나타나고 있어서 항생제 사용에 의한 치료는 어려워지고 있는 실정이다(김종훈 등, 한국수산학회지, 36: 654-660, 2003). 게다가 항생제 투여에 따른 경제적 손실 및 넙치의 성장률 저하로 인해 관련 업계는 이중고를 겪고 있다.
연쇄구균증은 일단 발병하면 치료가 어렵기 때문에 질병의 예방이 매우 중요하지만, 사육환경 및 사육관리의 개선만으로는 질병 발생을 억제하는데 한계가 있다. 따라서 보다 근본적인 예방 대책으로서 백신의 개발이 시급한 실정이다.
넙치에서 에드워드병은 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)라는 그람음성 단간균에 의하여 발병되며 치어에서 성어에 이르기까지 모든 사육단계에서 발생된다. 이 균은 배지(BHIA)에 배양하면 광택이 있는 원형의 소형집락(1mm 전후)을 형성하며 선택배지인 SS 한천 배지에서 가장자리가 반투명하고 중심부가 검은 집락이 형성된다. 병의 진행은 비교적 늦기 때문에 외관적으로 어느 정도의 특징적인 증상을 관찰할 수 있다. 외부증상으로는 안구의 돌출, 백탁, 농양이 형성되고, 복부가 팽만하며 발적된 장이 항문에서 돌출되어 나타나는 것이 많다. 해부해보면 부패한 냄새를 동반한 출혈성 복수가 고여 있고 간, 비장 및 신장의 비대와 결절이 형성되어 있는 것을 볼 수 있다. 넙치의 성장에 따라 사육밀도가 높아지고 먹이를 많이 주게 되어 수질이 악화되면 에드워드균이 급격히 증식하여 질병을 유발하는데 일단 양식장에서 에드워드병이 발생하면 치료가 어렵고 장기간에 걸쳐 지속적으로 폐사가 일어난다. 병어는 먹이를 잘 먹지 못하고 체색이 검어지고 표층을 힘없이 유영하기도 하고 중앙 배수 파이프 근처에서 수류를 따라 빙빙 돌거나 배수 파이프에 붙어서 죽기도 한다. 에드워드병은 주로 수온이 23℃ 이상이 되는 5월에서 10월 사이에 유행되지만 해수를 가온시키는 순환수조에서는 연중 발생되는 경우도 있다. 이 병은 만성적으로 발병하기 때문에 장기간에 걸쳐 일어나 누적폐사율이 높으며, 최근에는 연쇄구균증과의 합병증으로 발병하는 경우가 많으므로 사육관리에 더욱 주의를 요한다.
E. tarda는 독성 균주 및 비독성 균주 모두 세포 내에 침입할 수 있고 대식세포의 식작용에 의하여 세포내로 들어가게 되면 세포 내에서 빠르게 증식하는 특성이 있어 치료가 어려운 이유가 되고 있다. 에드워드병은 수온 20℃ 이상에서 잘 발생하는데 고수온으로 갈수록 피해율은 증가하게 된다. 양식 넙치에 발생하는 세균성 질병의 치료를 위해서 항생제를 사용하고 있는데 항생제는 세균을 제거할 수 있는 가장 강력한 무기이다. 어류가 세균에 감염되면 건강한 상태와 다른 약물의 흡수와 배설의 경향을 나타내는데 E. tarda에 인위감염된 어류에 옥솔린산(oxolinic acid)을 경구와 약욕의 방법으로 투여하였을 때 각 조직내의 약물 분포 및 농도의 변화는 건강어에 비해 구별되어 간, 신장, 근육, 혈청에서 옥솔린산의 최고농도는 정상어보다 낮아졌고 배설반감기는 길어져 지연된 배설속도를 보여 주었다(김 등, 1998). 그리고 어병세균이 항생제에 대해 내성을 갖게 되면 항생제를 투여하여도 치료효과를 기대할 수가 없게 된다. 이러한 내성균은 주로 항생제 감수성 검사를 하지 않고 사용된 항생제와 부적절한 투약방법, 항생제의 과다 사용 등에 의해 생기는데 양식 산업 초기에 많이 사용되고 현재도 많이 사용되고 있는 옥시테트라사이클린의 경우 에드워드병의 치료에 있어 치료효과를 더 이상 기대하기 어려울 정도이다. 또한 항생제 내성 세균은 R-플라스미드(plasmid)를 통해 다른 세균으로 항생제 내성이 전달되기도 하고 여러 항생제에 내성을 보이는 다제내성의 비율도 증가하고 있다.
이에 본 발명자들은 어류 양식에 큰 문제가 되고 있는 세균성 질병을 예방할 수 있는 방법에 관해 연구하던 중, 신규 스트렙토코커스 균주를 동정하였고, 종래 알려진 에드워드 균주를 이용한 혼합 백신이 어류의 세균성 질병의 예방에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 세균성 질병에 감염된 넙치로부터 분리된 신규 스트렙토코커스 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 및 종래 알려진 균주의 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 스트렙토코커스 균주, 종래 알려진 균주의 항원 및 몬타나이드(Montanide) ISA35 또는 Gel01을 보조제로서 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신을 이용하여 어류를 면역시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 넙치로부터 분리된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164 균주(KCTC 11980BP)를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불활성화된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164(KCTC 11980BP) 항원; 불활성화된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(KCTC 11634BP) 항원; 및 불활성화된 베타-용혈성 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) FP2018(KCTC 11145BP) 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신을 제공한다.
본 발명은 상기 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백신은 혼합 불활성화 백신 1회 투여로 3 종류의 세균에 의한 질병을 효과적으로 그리고 경제적으로 예방할 수 있으므로, 어류의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 분리된 균주 및 표준 균주의 단백질 패턴을 보여주는 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다: M은 마커를 나타내고, 레인 1 내지 8은 각각 1: FPA4162, 2: FPA4164, 3: FPA4166, 4: FPA4167, 5: FPA4169, 6: FPA4171, 7: FP2284 및 8: KCTC3651을 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 분리된 균주 및 표준 균주의 용혈 타입 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 혼합 백신을 넙치에 투여한 후 스트렙토코커스 이니애에 대한 응집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 혼합 백신을 넙치에 투여한 후 스트렙토코커스 파라우베리스에 대한 응집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 혼합 백신을 넙치에 투여한 후 에드워드시엘라 타르다에 대한 응집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 혼합 백신을 넙치에 투여한 후 SOD(superoxide dismutase) 활성을 측정한 그래프로서, A는 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)을, B는 1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et)을, C는 1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et)을, 그리고 D는 대조구를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 혼합 백신 투여에 따른 병리조직학적 검사 결과를 나타내 것으로서, A는 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)을, B는 1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et)을, C는 1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et)을, 그리고 D는 대조구를 나타낸다.
도 8은 보조제 혼합 백신 투여에 따른 스트렙토코커스 이니애에 대한 응집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 보조제 혼합 백신 투여에 따른 스트렙토코커스 파라우베리스에 대한 응집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 보조제 혼합 백신 투여에 따른 에드워드시엘라 타르다에 대한 응집항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 보조제 혼합 백신 투여에 따른 4주 및 8주째의 3종 세균 공격 실험에 대한 평균 상대생존율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 보조제 혼합 백신 투여에 따른 라이소자임 활성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 보조제 혼합 백신 투여에 따른 SOD 활성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 보조제 혼합 백신 투여에 따른 1주째의 병리조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 보조제 혼합 백신 투여에 따른 6주째의 병리조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 넙치로부터 분리된 베타-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164 균주를 제공한다.
상기 균주는 16S rDNA의 염기서열 분석 결과, 스트렙토코커스 파라우레리스 JJIS1 균주와 99%의 상동성을 나타내며, 종래 공지된 스트렙토코커스 파라우베리스 종에 비해 높은 병원성, 즉 폐사율을 나타낸다. 또한, 알칼라인 포스파타아제, 에스터라아제 리파아제, 류신 아릴아미다아제, 발린 아릴아미다아제 및 산 포스파타아제에 대해 활성을 나타내며, 종래 공지된 스트렙토코커스 파라우베리스 종과는 다른 단백질 패턴을 나타낸다.
본 발명에 따른 상기 신규 균주는 2011년 7월 8일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 KCTC 11980BP로 기탁되었다.
본 발명은 상기 균주를 이용한 불활성화 백신을 제공한다. 구체적으로, 1) 불활성화된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164(KCTC 11980BP) 항원; 2) 불활성화된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(KCTC 11634BP) 항원; 및 3) 불활성화된 베타-용혈성 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) FP2018(KCTC 11145BP) 항원을 포함하는 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신을 제공한다.
상기 불활성화 백신은 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 당해 기술분야에 알려진 불활성화제를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신은 상기 3종의 세균을 억제함으로써 어류에서 가장 흔한 세균성 질병을 예방할 수 있다. 상기 세균성 질병의 구체적인 예로는 연쇄구균증, 에드워드병을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신에서, 각 균주의 항원은 제한없이 조합될 수 있으나, 동량, 즉 1:1:1의 비율로 혼합되는 것이 바람직하다.
3종 이상의 불활성화 항원을 혼합시킬 경우에는 혼합에 의한 백신 부작용의 발생, 항원상호의 간섭-예를 들어 혼합시키기 전의 각 항원에 특이적인 항원성과 면역원성의 저하 등이 나타날 수 있다. 그러나 본 발명과 같이 1) 불활성화된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164(KCTC 11980BP) 항원; 2) 불활성화된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(KCTC 11634BP) 항원; 및 3) 불활성화된 베타-용혈성 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) FP2018(KCTC 11145BP) 항원을 혼합시킬 경우에는, 항원성과 면역원성이 확보되고 부작용이 관찰되지 않는다.
본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신은 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 몬타나이드(Montanide) ISA35 또는 Gel01이 사용될 수 있다.
또한, 안정화제 또는 첨가제로서, 당류나 아미노산류, 광물유, 식물유, 백반, 인산알루미늄, 벤토나이트, 실리카, 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신, 인터류킨 등이 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 백신은 적당한 용적의, 예를 들어 약 10~500 ㎖ 부피의 바이알에 백신액을 분주한 다음, 밀봉하여 사용될 수 있다. 이러한 백신은 액상뿐만 아니라, 나누어 주입한 다음에 동결건조함으로써 건조 제제로 사용될 수도 있다. 상기 건조 제제는 사용 직전에 첨가한 감균액으로 건조물질을 완전하게 재용해하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신은 감염의 위험성이 있는 임의의 연령의 어류에 사용할 수 있다. 단, 양식 보전의 관점에서, 작은 물고기 내지 치어를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법을 제공한다. 상기 어류는 감염의 위험성이 있는 넙치 등의 어류를 포함하다.
본 발명의 불활성화 백신을 이용하여 어류를 면역시키는 방법은 본 발명의 백신을 복강내 투여 등을 이용하여 어류에 투여하는 단계를 포함한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규 스트렙토코커스 균주의 분리 및 동정
체색흑화, 안구돌출 및 백탁, 복수, 장출혈 등의 증상을 나타내는 제주도의 양식 넙치로부터 본 발명에 따른 신규 스트렙토코커스 균주를 분리하였다. 구체적으로, 1.5% NaCl이 첨가된 BHIA(Difco, USA) 배지를 사용하여 병든 어류의 내부 장기 조직을 무균적으로 적출하여 도말한 후 30℃에서 24~48 시간 배양하여 분리하였다. 순수 분리한 콜로니 중 6종의 그람 양성 균주를 분리하였고, 각각 FPA4162, FPA4164, FPA4166, FPA4167, FPA4169 및 FPA4171로 명명하였다. 상기 균주 중 예비 실험을 통해 가장 활성이 우수한 FPA4164를 선정하였다.
상기 FPA4164를 동정하기 위하여, Mata 등의 방법(Mata, A.I, 등, Appl . Environ. Microbiol., 68: 5177-5180, 2004)에 따라 FPA4164의 16S rDNA를 유니버셜 박테리아 프라이머(Bioneer, Korea)인 P27f(서열번호 1) 및 P1492r(서열번호 2)을 사용하여 멀티플렉스 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 증폭된 PCR 산물을 AccuPrep PCR 정제 키트(Bioneer) 및 AccuPrep PCR 플라스미드 익스텐션 키트(Bioineer)를 이용하여 염기서열의 분석을 실시하였다. 상기 FPA4164의 16S rDNA 염기서열을 서열번호 3으로 나타내었다. FPA4164의 16S rDNA의 염기서열 및 GenBank에 등록되어 있는 스트렙토코커스 속 세균의 유전 정보를 클러스탈(Clustal) W 프로그램을 사용하여 멀티플 얼라인먼트를 실시하고 각 균종간의 상동성을 비교하였다. FPA4164의 16S rRNA 유전자에 대한 염기서열을 분석한 결과, GenBank에 등록되어 있는 스트렙토코커스 파라우레리스 JJIS1 균주와 99%의 상동성을 나타내어, 상기 FPA4164는 스트렙토코커스 파라우베리스로 동정되었다.
상기 FPA4164를 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164로 명명하였고, 2011년 7월 8일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 미생물 기탁번호 KCTC 11980BP로 기탁되었다.
실시예 2: 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164 의 특성 분석
실시예 1에서 동정된 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164의 특성을 분석하기 위하여, 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164를 종래 알려진 스트렙토코커스 파라우베리스 표준균주 2종 및 실시예 1에서 분리된 콜로니로부터 얻은 그람 양성 균주 5종(FPA4162, FPA4166, FPA4167, FPA4169 및 FPA4171)과 비교하였다. 사용된 균주를 하기 표 1에 나타내었다.
균주 유래
표준 균주 스트렙토코커스 파라우베리스 KCTC3651 유방염 우유
스트렙토코커스 파라우베리스 FP2284(KCTC11633BP) 넙치(Paralichthys olivaceus )
분리 균주
(실시예 1)		 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4162 넙치
스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164 넙치
스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4166 넙치
스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4167 넙치
스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4169 넙치
스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4171 넙치
<2-1> 병원성 실험
상기 각 균주를 1.20× 106 cfu/fish가 되도록 복강주사법으로 인위 감염 후 2 주간 누적폐사율을 조사하였다. 조사 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
균주 누적폐사율(%)
1일 2일 3일 4일 5일 6일 7일 8일 9일 10일 11일 12일 13일 14일
FPA4162 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FPA4164 0 0 0 0 0 20 20 20 20 20 20 80 90 90
FPA4166 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 40 40
FPA4167 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 30 30
FPA4169 0 0 0 0 0 0 10 20 0 0 0 50 50 50
FPA4171 0 0 0 0 0 20 0 30 0 0 0 60 60 60
FP2284 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 40 40
KCTC3651 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 10
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164 균주는 주사 6일째부터 폐사가 나타나 14일째는 90%의 누적폐사율을 나타내어 상기 균주들 중 가장 높은 폐사율을 나타내었다.
<2-2> 효소활성 조사
상기 균주들의 효소활성을 API ZYM(Biomerieux)을 이용하여 키트 각각의 cupule에 65㎕씩 분주한 다음, 27℃에서 4시간동안 반응시켜 결과를 판정하였다. 효소 활성 조사 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112013067488449-pat00001
상기 표에서 보는 바와 같이, 균주에 따라 활성의 차이가 다소 나타났으나, 상기 균주들은 모두 알칼라인 포스파타아제, 에스터라아제 리파아제, 류신 아릴아미다아제, 발린 아릴아미다아제 및 산 포스파타아제에 대하여 활성을 나타내었다.
<2-3> 단백질 프로파일 분석
상기 분리 균주 및 참조 균주의 지질다당류(LPS)와 세포외 생성물(ECP) 단백질 프로파일을 Laemmli(1970)의 방법에 따라 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다.
지질다당류(LPS)는 Schill 등(1985)의 신속법(rapid method)으로 분리하였다. 즉, 배양된 균체를 멸균 PBS로 세척 및 현탁시킨 후 분광광도계를 이용하여 A525에서 0.5로 농도를 조정하였다. 상기 균체를 14,000g에서 3분간 원심분리하여 집균된 균체를 2×SDS-PAGE 시료 완충액과 동량으로 현탁시켜서 10분간 끓였다. 끓인 시료에 프로티나아제 K(Proease type ; Sigma, St Louis, MO, USA)를 첨가하여 60℃ 수조에서 1시간 동안 끓인 후 사용하였다.
세포외 생성물(ECP)은 Austin 등(1998)에 의한 셀로판 오버레이(cellophane overlay) 방법에 따라 분리하였다. 시험에 사용된 셀로판 막은 121 ℃, 15분간 멸균 후 미리 제작된 트립틱 대두 아가(TSA, Difco) 평판 배지 위에 깔고, 균을 접종하였다. 접종 후 균을 27℃에서 48시간 동안 배양한 다음, 셀로판 막 위의 배양균을 0.1M 멸균 인산 완충액(PBS, pH 7.2) 2㎖로 세척하여 회수하였다. 이 현탁액을 12,000g, 4℃, 15분간 원심 분리한 후 상징액을 0.45㎛ 공극 크기의 시린지 필터(Corning Inc.)로 여과 멸균하여 ECP 액으로 사용하였다. 준비된 LPS와 ECP를 14%(v/v) 분해용 겔(resolving gel)에 10㎕씩 로딩한 후 미니-프로테안(mini-protean) Ⅱ 시스템(BioRad)에서 40mA, 90분간 전기 영동한 다음, Coomassie brillant blue R-250 염색액으로 염색 및 탈색하여 확인하였다.
SDS PAGE 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 분리된 균주(1~6 레인)의 ECP에서는 40kDa 크기의 단백질 패턴이 확인되었으나 표준 균주에서는 관찰되지 않았다. 한편, LPS의 단백질 패턴에서는 균주 간에 차이가 보이지 않았다.
<2-4> 용혈능 조사
혈액한천 배지를 이용하여 용혈 타입을 조사하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보는 바와 같이, 표준 균주 및 분리 균주 모두 α-용혈을 나타내어 균주 간에 차이는 보이지 않았다.
실시예 3: 백신 제조용 균주의 준비
백신 제조를 위해, 하기 3종의 균주를 준비하였다: 1) 실시예 1에서 동정된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164(KCTC 11980BP); 2) 넙치에서 분리된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(KCTC 11634BP); 및 3) 넙치에서 분리된 베타-용혈성 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) FP2018(KCTC 11145BP). 상기 스트렙토코커스 이니애 및 에드워드시엘라 타르다는 이전의 백신연구에 사용 후 KCTC에 등록된 균주를 사용하였다.
실시예 4: 백신 제조용 균주의 병원성
상기 실시예 3의 백신용 균주의 LD 값을 당해 기술분야에 널리 공지된 방법(Hall, J.A. and Golding, L.A: Standard methods for whole effluent toxicity testing: development and application. Report No. MFE 80205. NIWA report for the ministry for environment, Wellington, New Zeland. 1998)을 이용하여 측정한 결과, 하기 표 4와 같았다.
균주 종류 분리 어종 LD50
스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164 넙치 1.20×106
스트렙토코커스 이니애 FP5024 넙치 1.49×104
에드워드시엘라 타르다 FP2018 넙치 3.9×105
실시예 5: 혼합 불활성화 백신의 제조 및 접종
<5-1> 백신의 제조
동결 보존된 스트렙토코커스 파라우베리스 FPA4164, 스트렙토코커스 이니애 FP5024 및 에드워드시엘라 타르다 FP2018을 1.5%(v/v) NaCl이 첨가된 BHIA 배지에서 30℃ 온도로 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 평판배지의 집락을 무균적으로 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB에 접종 후 교반 배양기(JS Research Inc.)에서 150 rpm, 30℃ 온도로 48 시간 동안 배양하였다. 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린(Merck, Germany)을 각 배양액의 0.5%(v/v)가 되도록 첨가하여 교반 배양기에서 150 rpm, 20℃로 24 시간 동안 불활화하였다. 배양균의 불활화를 BHIA 아가(Difco, USA)에서 최종 확인하였다. 불활화가 확인된 균액을 12,000 RCF로 원심분리한 다음, 멸균 생리 식염수로 3회 세척한 후 균체를 수거하고 최종적으로 습균체 무게를 측정하여 실험구에 따라 농도를 달리하여 현탁하였다(표 5). 백신액을 멸균된 유리병에 분주하여 4℃에 보관 후 실험에 사용하였다.
<5-2> 백신의 접종
시험어로 넙치를 이용하였다. 넙치에 대한 백신 접종은 복강주사법으로 시험 백신을 어체당 0.1 ml씩 복강 주사하였으며 대조구는 멸균 생리 식염수를 동량씩 복강 주사하였다.
혼합 백신 복강주사를 위한 균액 농도(Si: S. iniae, Sp: S. parauberis , Et: Edwardsiella trada)
백신 실험구 스탁(stock) 용액 농도 혼합액량 최종
주사액
A 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)
/fish		 Si(100mg/ml)
Sp(100mg/ml)
Et(100mg/ml)		 Si 0.01ml+ Sp 0.01ml+
Et 0.01ml+PS 0.07ml		 0.1ml
B 1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et)/fish Si 0.01ml+ Sp 0.01ml+
Et 0.005ml+PS 0.075ml		 0.1ml
C 1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et)
/fish		 Si 0.015ml+ Sp 0.015ml+
Et 0.01ml+PS 0.06ml		 0.1ml
D 대조구 멸균 생리 식염수(PS) - 0.1ml
실시예 6: 혼합 불활성화 백신의 면역원성 시험
<6-1> 응집항체가 조사
실시예 5에 따른 혼합 백신 접종 후 1, 2, 3 및 4주째 시험어의 미부정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고, 마이크로타이터(microtiter)법으로 응집 항체가를 조사하였다. 즉, 96-웰 마이크로플레이트(Corning, USA)에서 넙치로부터 분리한 혈청을 멸균 생리 식염수로 단계 희석한 후 24시간 후 응집괴 형성 유무를 관찰하였다.
스트렙토코커스 이니애에 대한 응집항체가를 조사한 결과, 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish의 농도구에서는 백신 처리 2주째부터 응집항체가의 증가가 확인되었으며, 그 외의 시험구는 백신 처리 3주째부터 증가가 나타나 조사 4주째까지 지속적으로 유지되었다. 백신 처리 4주째에는 시험구 중에서 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish의 농도구에서 가장 높은 항체가를 나타내어 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish의 농도구가 가장 효과가 높은 것으로 판단되었다(도 3).
스트렙토코커스 파라우베리스에 대한 응집항체가 조사 결과는 스트렙토코커스 이니애와 유사한 경향으로 백신 처리 2주째에는 시험구 중에서 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 구에서만 약간의 항체가가 나타났으며, 백신 처리 4주째 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도구에서 가장 높은 항체가를 나타내어 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도구가 가장 효과적인 것으로 판단되었다(도 4).
에드워드시엘라 타르다에 대한 응집항체가 조사 결과는 모든 백신 처리구에서 백신처리 2주째부터 응집항체가의 증가가 나타나 조사 4주째까지 증가가 지속되었다. 백신농도 간에 유의적인 차이는 보이지 않았으며 백신 처리 4주째 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도구와 1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et)/fish가 다소 높게 나타났으나 투여되는 백신량을 고려시 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도구가 효과적인 것으로 판단되었다(도 5).
<6-2> 방어력 조사
시험 백신이 방어력에 미치는 효과를 조사하기 위하여 백신 접종 후 4주째 각 백신균주의 LD50 농도로 복강주사 후 생존율을 조사하였다. 즉 스트렙토코커스 이니애는 1.49×104 cfu/fish, 스트렙토코커스 파라우베리스는 1.20×106 cfu/fish, 에드워드시엘라 타르다는 3.9×105 cfu/fish가 되도록 복강주사법으로 인위 감염 후 2 주간 누적폐사율을 조사하였다. 상대생존율은 아래와 같이 계산하였다.
상대생존율(%)={1-(시험구의 누적폐사율/대조구의 누적폐사율)} × 100
방어력 조사 결과, 스트렙토코커스 이니애에 대한 백신접종구의 상대생존율은 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도구가 75%로 가장 높게 나타났으며, 스트렙토코커스 파라우베리스에 대해서는 모든 백신시험구의 상대생존율이 62.5%로 동일하게 나타났다. 한편, 에드워드시엘라 타르다에 대한 백신접종구의 상대생존율은 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도구가 77.8%로 가장 높게 나타났다. 따라서 상기 3종의 균주 모두에 대한 방어능은 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도의 백신처리구가 가장 효과적인 것으로 나타났다(표 6).
S. iniae , S. parauberis 및 E. tarda 균주에 대한 방어력
실험구
1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et) 1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et) 1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et) 대조군
S. iniae 누적폐사율(%) 20 40 30 80
상대생존율(%) 75 50 62.5
S. parauberis 누적폐사율(%) 30 30 30 80
상대생존율(%) 62.5 62.5 62.5
E. tarda 누적폐사율(%) 20 30 40 90
상대생존율(%) 77.8 66.7 55.6
실시예 7: 혈액생화학적 성상 조사
본 발명에 따른 백신의 접종이 혈액성상에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 글루코스, GOT, 총 단백질 및 총 콜레스테롤의 농도를 자동혈액분석기(Fuji Dri Chem 3500i, Fuji Film, Japan)를 이용하여 측정하였다. 각각의 측정 결과를 하기 표 7 내지 10에 나타내었다.
넙치 혈액 중의 글루코스 농도
시험구 1주 2주 3주 4주
1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et) 12.5±4.5 19.7±9 16.6±2.5 11.3±5.8
1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et) 11.8±5.6 26.6±6.4 29±11.9 13.3±6.4
1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et) 10.3±3.5 17±5.3 18.3±10.1 13.3±5.6
대조구 12±6.2 10±4.2 19.3±11.1 23±8.1
넙치 혈액 중의 GOT 농도
시험구 1주 2주 3주 4주
1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et) 13.6±3.7 9±5 11±7.9 15±2.6
1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et) 10.7±3 12±2 6.3±2.1 6.3±1.5
1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et) 8±1 9±1.4 11.0±2.6 15.3±2.3
대조구 5.7±3.6 8.3±2 5.3±1.2 27.3±7.8
넙치 혈액 중의 총 단백질 농도
시험구 1주 2주 3주 4주
1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et) 4.5±0.9 5.9±0.9 3.7±0.8 2.3±0.2
1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et) 3.7±1.1 5.5±1.1 2.7±0.9 2.4±0.5
1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et) 4.1±0.8 3.6±1.2 3.2±1.1 2.9±0.1
대조구 2.8±0.6 2.8±0.5 1.8±0.4 2.6±0.4
넙치 혈액 중의 총 콜레스테롤 농도
시험구 1주 2주 3주 4주
1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et) 122±35 168±47.6 105.3±26.2 73.7±19.6
1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et) 99±65.1 150.7±60.2 80.7±13.9 80±12.5
1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et) 107.7±44.9 96±11.3 80.7±39.6 114±16.5
대조구 102±46.4 139.7±39.2 62±16.1 123±67.8
상기 표 7 내지 10에서 보는 바와 같이, 혈액생화학적 성상 조사 결과 백신 처리 농도구와 대조구 간에 현저한 차이를 보이지 않아 백신 처리가 혈액성상에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.
실시예 8: 라이소자임 활성 결과
본 발명에 따른 백신이 접종된 넙치로부터 라이소자임 활성을 Parry 등(1965)의 비탁법(turbidimetric method)을 이용하여 측정하였다. 즉, 마이클로코커스 리소데익티쿠스(Micrococcus lysodeikticus ) 0.2㎎/㎖ 현탁액(pH 6.2) 950㎕와 혈청 50㎕를 혼합하여 25℃, 30초 및 4분 30초간 반응시킨 후 530nm에서 흡광도를 측정하였다. 라이소자임 활성은 units/㎖ 로 나타내었으며, 1unit은 흡광도 값이 0.001/분 감소한 양을 나타낸다(표 11).
라이소자임 활성(units/ml)
시험구 1주 2주 3주 4주
1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et) 1264.4±245.6 1263.3±202.4 1340±135.5 1233.4±73.8
1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et) 898.8±224.4 795.5±114.5 1216.6±258.5 1255.5±220.9
1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et) 1005±273.2 1177.7±365.5 1324.4±225.1 1274.4±187.6
대조구 634.4±135.5 735.5±224.3 855.5±110.3 848.8±146.5
상기 표 11에서 보는 바와 같이, 이소자임 활성 조사 결과, 조사 기간 동안 모든 백신구가 대조구에 비해 높은 활성을 나타내었고, 특히 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish 농도의 백신처리구가 다른 실험구에 비하여 높은 활성을 나타내었다.
실시예 9: SOD ( SuperOxide dismutase ) 활성 측정
백신처리 후 1주부터 4주째까지 백신처리구 및 대조구의 혈구를 대상으로 SOD 분석 키트-WST(Dojindo, Japan)를 이용하여 SOD 활성을 측정하고, units/ml로 나타내었다(도 6).
도 6에서 보는 바와 같이, SOD 활성 조사 결과, 시험구와 대조구간에 유의적인 차이는 보이지 않았지만, 모든 백신 처리구가 대조구에 비하여 높은 활성을 나타내었다.
실시예 10: 혼합 불활성화 백신 투여에 따른 안전성 조사
본 발명에 따른 백신 처리의 안전성 조사를 위하여, 백신 처리구 및 대조구의 병리조직학적 검사를 실시하였다. 즉, 백신 처리 1주일째부터 4주째까지 매주 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직을 10% 중성 포르말린에 고정 후 H&E 염색을 실시 후 검사하였다. 검사 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 백신 처리구의 모든 장기에서 정상적인 조직 소견이 관찰되었으며, 심장에서도 심외막염이 관찰되지 않아 본 발명에 따른 백신은 독성이 전혀 없는 것으로 확인되었다.
백신처리 후 1주 간격으로 병리조직학적 검사결과 실험구와 대조구간에 차이가 보이지 않아 백신처리에 의한 부작용은 없는 것으로 판단되었으며, 백신 처리구 중에는 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish의 농도가 가장 효과적인 것으로 판단되어 이를 보조제 백신 개발에 적용하였다.
실시예 11: 보조제 혼합에 따른 백신의 효능 조사
본 발명에 따른 백신에 화합물 보조제 혼합시 백신의 효능 변화를 살펴보기 위하여, 민감한 동물에 사용되는 4종의 보조제, 즉 몬타나이드(Montanide) ISA35, 760VG, Gel01 및 763AVG(Seppic 사)를 선정하여 용법에 따라 백신과 혼합하여 실험하였다(표 12).
실험구는 백신+보조제구(A~D), 백신 단독구(E) 및 생리식염수 대조구(F)로 나누었고, 백신은 SI 1mg+SP 1mg+ET 1mg을 혼합하여 각 보조제의 혼합농도에 따라 균질기를 이용하여 4,000 rpm에서 20분간 혼합한 후 실험에 사용하였다(표 13).
Figure 112013067488449-pat00002
Figure 112013067488449-pat00003
시험어로 넙치를 이용하였다. 넙치에 상기 백신을 어체당 0.1 ml씩 복강 주사한 후 실험 9주째까지 효능 및 부작용을 조사하였다.
<11-1> 응집항체가 조사
백신 접종 후 9주째까지 매주 시험어의 미부정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하였으며, 실시예 <6-1>과 동일한 방법으로 응집 항체가를 조사하였다.
스트렙토코커스 이니애에 대한 응집항체가 조사 결과, 백신 단독구에 비하여 모든 보조제 혼합구에서 응집항체가가 높게 나타났으며 조사 9주째까지 지속적으로 높게 나타났다(도 8).
또한, 스트렙토코커스 파라우베리스에 대한 응집항체가 조사 결과는 스트렙토코커스 이니애와 유사한 경향으로 백신 단독구에 비하여 모든 보조제 혼합구에서 응집 항체가가 높게 나타났으며 조사 9주째까지 지속적으로 높게 나타났다(도 9).
나아가, 에드워드시엘라 타르다에 대한 응집항체가 조사 결과 보조제 혼합구가 백신 단독구에 비하여 높게 나타났으며, 스트렙토코커스 이니애 또는 스트렙토코커스 파라우베리스에 비하여 높은 항체가를 나타내었다(도 10).
<11-2> 방어력 조사
시험 백신이 방어력에 미치는 효과를 조사하기 위하여 백신 접종 후 4주째 및 8주째 각 백신균주의 LD50 농도로 복강주사 후 실시예 <6-2>와 동일한 방법으로 폐사율 및 상대생존율을 측정하였다. 측정결과를 하기 표 14 및 15에 나타내었다.
보조제 혼합백신 처리 4주째의 폐사율 및 상대생존율
실험구
A B C D E F
스트렙토코커스 이니애 누적폐사율(%) 20 30 40 40 40 90
상대생존율(%) 77.8 66.7 55.6 55.6 55.6 -
스트렙토코커스 파라우베리스 누적폐사율(%) 20 40 20 40 30 80
상대생존율(%) 75 50 75 50 62.5 -
에드워드시엘라 타르다 누적폐사율(%) 10 30 20 50 40 100
상대생존율(%) 90 70 80 50 60 -
백신 처리 4주째 방어력 조사 결과 모든 백신처리구가 대조구에 비하여 생존율이 높게 나타났다. 스트렙토코커스 이니애에 대해서는 A 시험구의 상대생존율이 77.8%로 다른 시험구에 비해 높게 나타났으며, 다음으로는 B 시험구가 66.7%로 높게 나타났다. 스트렙토코커스 파라우베리스에 대해서는 C와 A 시험구의 상대생존율은 75%, B와 D시험구는 50%로 나타났다. 에드워드시엘라 타르다에 대한 생존율은 A 시험구에서 90%로 가장 높았으며, 다음으로 C 시험구에서 80%의 생존율을 나타내었다.
보조제 혼합백신 처리 8주째의 폐사율 및 상대생존율
실험구
A B C D E F
스트렙토코커스 이니애 누적폐사율(%) 12.5 40 20 40 80 100
상대생존율(%) 87.5 60 80 60 20 -
스트렙토코커스 파라우베리스 누적폐사율(%) 25 50 30 55 90 100
상대생존율(%) 75 50 70 45 10 -
에드워드시엘라 타르다 누적폐사율(%) 20 30 40 50 100 100
상대생존율(%) 80 70 60 50 0 -
백신 처리 8주째 방어능 조사 결과, 모든 백신 처리구가 대조구에 비하여 생존율이 높게 나타났다. 스트렙토코커스 이니애에 대해서는 A 시험구의 상대생존율이 87.5%로 다른 시험구에 비해 높게 나타났으며, 다음으로 C 시험구에서 80%로 높게 나타났다. 스트렙토코커스 파라우베리스에 대해서는 A 시험구가 75%로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 C 시험구의 상대생존율은 70%로 높게 나타났다. 에드워드시엘라 타르다에 대한 생존율은 A 시험구에서 80%로 가장 높았으며, 다음으로 B 시험구에서 70%로 높게 나타났다.
한편, 백신 처리 4주째와 8주째 3종 세균의 공격실험에 대한 상대생존율의 평균을 조사한 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 백신 처리 4주째 A 시험구가 가장 높게 나타났으며, 그 외 백신 처리구 사이에서는 큰 차이가 없었다. 백신 처리 8주째 공격실험 결과 백신처리 4주째와 같은 결과로 A 시험구가 가장 높은 생존율을 나타내었으며, 다음으로 C 시험구가 높은 생존율을 나타내었다. 백신 처리 4주째와 8주째 공격실험 결과를 비교해보면 보조제를 혼합한 A, B, C 및 D 시험구의 상대생존율은 4주째와 8주째 거의 비슷한 값을 나타내고 있으나 보조제를 혼합하지 않은 E 시험구의 상대생존율은 59%에서 10%로 크게 감소하는 것을 알 수 있으며, 보조제 중에서는 A 시험구에 사용된 보조제가 가장 효과적인 것으로 나타났다.
<11-3> 혈액생화학적 성상 조사
보조제가 첨가된 백신이 혈액성상에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 넙치 혈액 내 글루코스, GOT 및 총 단백질의 농도를 실시에 7과 동일한 방식으로 측정하고, 각각의 측정 결과를 하기 표 16 내지 18에 나타내었다.
Figure 112013067488449-pat00004
Figure 112013067488449-pat00005
Figure 112013067488449-pat00006
글루코스 농도 조사 결과, 백신 단독구와 보조제 혼합구 사이에 유의적인 차이는 보이지 않았으며, 실험기간에 따른 차이도 보이지 않아 백신단독 접종 및 보조제 혼합 접종이 혈액 내 글루코스 농도에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다(표 16).
GOT 농도 조사 결과, 보조제 혼합구 중 B 시험구에서 백신 처리 5주째부터 대조구 또는 다른 시험구에 비하여 다소 높은 경향을 나타내어 B 시험구에 사용된 보조제가 간 기능에 나쁜 영향을 미치는 것으로 판단되었다(표 17).
총 단백질 농도 조사 결과, 백신 단독구와 보조제 혼합구 사이에 유의적인 차이는 보이지 않았으며, 실험기간에 따른 차이도 보이지 않아 백신단독 접종 및 보조제 혼합 접종이 혈액 내 총 콜레스테롤 농도에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다(표 18).
<11-4> 라이소자임 활성 측정
실시예 8과 동일한 방식으로 라이소자임 활성을 측정하여 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, 백신처리 후 3일째 백신 처리구가 대조구에 비하여 다소 높은 활성을 나타내었으나 보조제 종류에 따른 차이는 보이지 않았다.
<11-5> SOD 활성 측정
실시예 9와 동일한 방식으로 SOD 활성을 측정하여 도 13에 나타내었다. 측정 결과, 백신처리 3일째 다소 높은 활성을 나타낸 후 기간이 경과할수록 활성이 감소하는 경향을 나타내었으며, 시험구 중에서는 A 시험구가 가장 높은 활성을 나타내었다.
<11-6> 보조제 혼합 불활성화 백신 투여에 따른 안전성 조사
본 발명에 따른 백신의 안전성 조사를 위하여, 실시예 10과 동일한 방법으로 백신처리구 및 대조구의 병리조직학적 검사를 실시하였다. 검사 결과, 백신 처리 1주째 모든 보조제 혼합 백신구에서 넙치 복강에 보조제 혼합물이 관찰되었으며, B와 D구는 백신 처리 6주째 간장에 입자 형태로 유착된 것이 확인되었다. 병리조직학적 검사 결과 모든 실험구의 장, 심장 및 아가미에서는 변화가 관찰되지 않았으나, B와 D의 간장에서는 백신 처리 1주째부터 간외막염증이 나타나 6주째까지 증상이 지속되었으며, 신장에서는 6주째 세뇨관의 초자변성이 관찰되었다(도 14 및 15). 따라서 B와 D 시험구에 사용된 보조제는 어류 백신 면역 증강을 위한 보조제로서는 부적합한 것으로 판단되었으며, A와 C 시험구에 사용된 보조제가 어류에 안전한 것으로 판단되었다.
상기 연구결과들을 종합할 때, 보조제로서 ISA 35에 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)를 혼합한 백신이 어류 세포성 질병 예방에 가장 효과적인 것으로 판단된다.
한국생명공학연구원 KCTC11980BP 20110708
<110> Republic of Korea(National Fisheries Research & Development Institute) <120> NOVEL STREPTOCOCCUS STRAIN AND COMBINED INACTIVATED VACCINE AGAINST BACTERIAL DISEASES IN FISH USING THE STREPTOCOCCUS STRAIN AND MONTANIDE ADJUVANT <130> GNP130070 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial bacteria primer, P27f <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial bacteria primer, P1492r <400> 2 tacggctacc ttgttacgac 20 <210> 3 <211> 1510 <212> DNA <213> Streptococcus parauberis <400> 3 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac 60 gctgaagact ggtgcttgca ctagtcagat gagttgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt 120 aacctacctc atagcggggg ataactattg gaaacgatag ctaataccgc atgacaatta 180 agtactcatg tactaaattt aaaaggagca attgcttcac tatgagatgg acctgcgttg 240 tattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggccacg atacatagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttcgg caatgggggc aaccctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ttagagaaga acggtaatgg gagtggaaaa tccattacgt 480 gacggtaact aaccagaaag ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtctcgagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt atttaagtct 600 gaagttaaag gccgtggctc aaccatggtt cgctttggaa actggataac ttgagtgcag 660 aaggggagag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg 720 gtggcgaaag cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa 780 acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttaggccct 840 ttccggggct tagtgccgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca 900 aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc tctgaccgtc ctagagatag 1020 gactttcctt cgggacagag gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctattg ttagttgcca tcattaagtt 1140 gggcactcta gcgagactgc cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgagtcgcaa 1260 gccggtgacg gcaagctaat ctcttaaagc caatctcagt tcggattgta ggctgcaact 1320 cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt 1380 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg 1440 aggtaaccta ttaggagcca gccgcctaag gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa 1500 caaggtaacc 1510

Claims (8)

  1. 크리스틴 아릴아미다아제 및 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제 활성을 갖고, 넙치로부터 분리된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164 균주(KCTC 11980BP) 유래의 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 백신으로,
    상기 어류의 세균성 질병은 연쇄구균증 또는 에드워드병인, 어류의 세균성 질병 예방용 백신.
  2. 제1항에 따른 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류의 세균성 질병 예방 방법.
  3. 크리스틴 아릴아미다아제 및 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제 활성을 갖고, 넙치로부터 분리된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) FPA4164 균주(KCTC 11980BP) 유래의 항원; 불활성화된 베타-용혈성 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5024(KCTC 11634BP) 항원; 및 불활성화된 베타-용혈성 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) FP2018(KCTC 11145BP) 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신으로,
    상기 어류의 세균성 질병은 연쇄구균증 또는 에드워드병인, 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 세균성 질병은 스트렙토코커스 파라우베리스, 스트렙토코커스 이니애 및 에드워드시엘라 타르다로 구성되는 군으로부터 선택되는 세균의 감염으로 인하여 어류에서 발생하는 질병인 것을 특징으로 하는, 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신.
  5. 제 3항에 있어서,
    몬타나이드 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 몬타나이드 보조제는 몬타나이드(Montanide) ISA35 또는 Gel01인 것을 특징으로 하는, 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신.
  7. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류의 세균성 질병 예방 방법으로,
    상기 어류의 세균성 질병은 연쇄구균증 또는 에드워드병인, 어류의 세균성 질병 예방 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병 예방 방법.

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