JP2017512487A - 新たなバクテリオファージ及びこれを含む組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は新たなバクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）及びこれを有効成分として含む組成物に関するものである。また、本発明は前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）又は前記組成物を利用し人間以外の動物の腸管毒素性大腸菌による感染性疾病を予防及び／又は治療する方法に関するものである。【選択図】図１

Description

本発明は、腸管毒素性大腸菌(ETEC)に特異的な死滅能を表す新たなバクテリオファージ、これを含む組成物、及び前記新たなバクテリオファージ又は前記組成物を利用し、動物の感染性疾病を予防又は治療する方法に関するものである。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下において「Ｅ．ｃｏｌｉ」という）は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属するグラム陰性の短桿菌であり、哺乳動物をはじめ多様な動物の腸管内に存在する正常細菌叢の一つである。大腸菌は大体非病原性であり日和見感染を誘発し得るが、一部の高病原性の菌株は人間を始め動物内で様々な腸疾患及び敗血症などを誘発すると知られている。

大腸菌の種類には、腸管毒素性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ， ＥＴＥＣ）、腸病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ， ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ， ＥＨＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ， ＥＡＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｃｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ， ＥＩＥＣ）、腸管外病原性大腸菌（Ｎｅｃｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ， ＮＴＥＣ）などがあり、これらの中で特に腸管毒素性大腸菌は養豚に大腸菌感染性疾病を誘発すると知られている。

現在、養豚産業の大規模な集団飼育の傾向に従って豚の大腸菌症は養豚場において最も多く、また問題となる疾病として台頭している。最近、韓国で豚の大腸菌症発生が増加し下痢による幼い豚の成長遅延及びへい死のせいで、飼育農家の大きな経済的損失をもたらしている状況である。

この豚大腸菌症を予防及び治療するため従来には豚に色々な抗生剤を使用してきたが、抗生剤を誤乱用した場合、豚に耐性を誘発したり抗生剤が豚体内に残留する可能性があって、現在世界的に抗生剤の投与に多くの制限が置かれている。

一方、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は特定細菌を感染し、感染された細菌の成長を抑制・阻害する細菌特異的ウイルスを意味する。バクテリオファージは、抗生剤に比べて宿主特異性が強いだけでなく、最近抗生剤の使用に対する耐性菌出現の問題が深刻となることで、その活用に対する関心が高まっている。

そして、世界諸国でバクテリオファージに対する研究が活発に行われており、バクテリオファージに関する特許出願と、これを活用した組成物をもって米食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）の承認などを取得しようとする取り組みが増加している状況である。

しかし、養豚を始めとする畜産業において重要な問題となっている腸管毒素性大腸菌による感染性疾病を予防、及び／又は、治療するためのバクテリオファージ関連技術はいまだに足りない状況であり、したがってこのようなバクテリオファージ及びその関連技術の開発が要求されている。

本発明者らは、抗生剤使用による耐性菌の出現及び抗生剤の肉類内残留問題などを解決し、大腸菌感染性疾病を効率的に予防及び治療するための研究を重ねった結果、腸管毒素性大腸菌に対して特異的な死滅能を有する新たなバクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を自然界で分離することに至った。

また、前記新たなバクテリオファージの形態的、生化学的、遺伝的特性を同定し、前記バクテリオファージの耐酸性及び耐熱性などに優れていることを確認し、これを活用した抗生剤、消毒剤、飼料添加剤、その他の組成物などを開発し、更に大腸菌感染性疾病の予防又は治療用の組成物及びこれを利用した疾病の予防又は治療方法を開発した。

本発明は、腸管毒素性大腸菌に特異的な死滅能を有する新たなバクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）の提供を目的とする。

また、本発明は前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防及び／又は治療用の組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤又は洗浄剤を提供することを目的とする。

また、本発明は前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を利用し、人間以外の動物の腸管毒素性大腸菌の感染性疾病を予防及び／又は治療する方法を提供することを目的とする。

本発明の一様態によれば、腸管毒素性大腸菌に特異的な死滅能を有する、新たなバクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）が提供される。

本発明の他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用の組成物が提供される。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤又は洗浄剤が提供される。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を、人間以外の動物に投与する段階を含む、腸管毒素性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法が提供される。

本発明のバクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）は腸管毒素性大腸菌を特異的に死滅する効果がある。

また、本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）は耐酸性及び耐熱性に優れていて様々な温度及びｐＨ範囲で腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用物質として活用できる。また、前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤又は洗浄剤などに活用される効果がある。

また、本発明は前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）又はこれを有効成分として含む抗生剤を提供し、従来の抗生剤に比べて腸管毒素性大腸菌に対する特異性が非常に高く、益菌は殺さずに特定病原菌のみ死滅することができ、薬物耐性を誘導しないため、従来の抗生剤に比べて製品寿命が延長される効果がある。

また、本発明は前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を人間以外の動物に投与すると、腸管毒素性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療できる効果がある。

図１は、新たなバクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）（以下、「ΦＣＪ２８」）の電子顕微鏡写真である。 図２は、新たなバクテリオファージΦＣＪ２８のＰＦＧＥ結果を表したものである。 図３は、新たなバクテリオファージΦＣＪ２８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を表したものである。 図４は、新たなバクテリオファージΦＣＪ２８の耐酸性実験結果を表したグラフである。 図５は、新たなバクテリオファージΦＣＪ２８の６０℃における耐熱性実験結果を表したグラフである。

以下、本発明に関してより詳しく説明する。本明細書に記載されなかった内容は当該技術分野又は類似分野の熟練者なら十分に認識・類推できるため、その説明は省略する。

本発明の一様態は、腸管毒素性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ＥＴＥＣ）に特異的な死滅能を有する新たなバクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）（以下、「ΦＣＪ２８」）を提供する。

腸管毒素性大腸菌はグラム陰性の桿菌であり、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を分解し酸とガスを生成する好気性又は通性嫌気性菌である。腸管毒素性大腸菌は普段の培地でもよく育ち約７℃ないし４８℃の温度で発育が可能であり、発育最適温度は約３５℃ないし３７℃であり得る。また、腸管毒素性大腸菌はｐＨ４．５〜ｐＨ９の範囲で発育が可能である。

腸管毒素性大腸菌はコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）と類似な毒素を生産するため、腸管毒素性大腸菌に感染すると、コレラに感染した場合と類似な病状を表すことがある。生産される前記毒素は大別して易熱性毒素（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、ＬＴ）及び耐熱性毒素（ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、ＳＴ）の二つに分けられる。前記易熱性毒素は約６０℃で約１０分間加熱した場合に活性を失う毒素であり、前記耐熱性毒素は約１００℃で約３０分間加熱しても活性を失うことなく耐性を表す毒素を称する。

腸管毒素性大腸菌は小腸の上部で増殖し、腸管毒素性大腸菌の濃度が腸液の単位体積（１ｍｌ）当たり約１０^７ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）〜１０^８ｃｆｕに達した場合、大腸菌症を始めとする大腸菌感染性疾病を誘発することができる。

バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は特定の細菌に感染し当該細菌の成長を抑制・阻害する細菌特異的ウイルスであり、単一あるいは二重鎖のＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を遺伝物質として含むウイルスを意味する。

具体的に、本発明の一様態のバクテリオファージΦＣＪ２８は、腸管毒素性病原性大腸菌を選択的に感染する種特異性を有するバクテリオファージであり、正二十面体ヘッド（ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｃａｐｓｉｄ）を有し、収縮性のあるテール（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｔａｉｌ）が観察される構造を有し、形態学上ミオビリダエ（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するバクテリオファージである（図１参照）。

バクテリオファージΦＣＪ２８の塩基配列と他のバクテリオファージの解読塩基配列の相同性を比較した結果は［表１］に示した。バクテリオファージΦＣＪ２８の耐酸性においてｐＨ３．０からｐＨ５．０まで活性を失うことなく安定的であり（図４）、耐熱性においては６０℃で３０分間露出されたときまで約１ログ以下の活性減少を示し、同一温度で露出６０分からは３ログ以上の活性が減少された（図５）。バクテリオファージΦＣＪ２８のＤＮＡ塩基配列は、フリーテキスト上の配列番号１である。

前記バクテリオファージΦＣＪ２８は、本発明者らが新たに分離したバクテリオファージであり、２０１３年１０月２５日に韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１４６６Ｐで寄託した。

本発明の他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む、腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物が提供される。

前記バクテリオファージΦＣＪ２８は腸管毒素性大腸菌を特異的に死滅できる抗菌活性を表すため、腸管毒素性大腸菌による感染で誘発される疾病を予防・治療する目的として利用することができる。前記バクテリオファージΦＣＪ２８を利用した腸管毒素性大腸菌の感染性疾病の例として大腸菌症（Ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）を挙げることができ、具体的に、豚大腸菌症（Ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ ｉｎ ｐｉｇｓ）があるが、これらに制限されることではない。

前記「大腸菌症」は、動物に病原性大腸菌が感染して発生する疾病を意味し、その症状は敗血症、下痢（新生期下痢及び離乳後下痢）、毒血症（浮腫病及び脳脊髄血管症）などがある。この中で敗血症は生後２日〜３日以内の新生期に主に発生する急性の全身感染症であり、へい死率が非常に高い。下痢は１週〜２週齢以内の哺乳期及び離乳直後に多発する腸管感染症であり、へい死又は発育障害の原因となる。毒血症は離乳後８週ないし１２週齢の子豚に主に発病し浮腫及び神経症状を表して急死を起こすことが多い。

本発明で用いられる用語である「予防」は、前記バクテリオファージΦＣＪ２８及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物を動物に提供し、該当疾病を抑制すること又は遅延させることと発病を遅延させる全ての行為を意味する。

本発明で用いられる用語である「治療」は、前記バクテリオファージΦＣＪ２８及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物を動物に提供し、既に感染された該当疾病の症状を好転または改善させる全ての行為を意味する。

本様態の前記腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を５×１０^２〜５×１０^１２ｐｆｕ／mlで含み、具体的に、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を１×１０^６〜１×１０^１０ｐｆｕ／mlで含むことができる。

本様態の前記腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は薬学的に許容可能な担体を追加的に含むことができ、前記担体と共に製剤化され、食品、医薬品、飼料添加剤又は飲用水添加剤などに提供され得る。本発明で用いられる用語である「薬学的に許容可能な担体」は、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。

本様態で使用可能な前記担体の種類は、特に制限されず、当該技術分野で通常的に使用し薬学的に許容される担体ならいずれも使用することができる。前記担体の非制限的な例として、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、テキストローズ溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどがある。これらは単独または２種類以上を混合して使用することができる。

また、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び／又は静菌剤など他の通常の添加剤を添加して使用することができ、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び／又は潤滑剤などを付加的に添加し、水溶液、懸濁液、油濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は精製などで製剤化して用いることができる。

本様態の前記腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の投与方式は、特に制限されず、当該技術分野で通常的に使用する方式で行える。前記投与方式の非制限的例として、組成物を経口投与又は非経口投与方式で投与することができる。

前記経口投与用剤形の非制限的例として、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ローゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、錠剤、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調剤粉末、顆粒、エマルジョン、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップ又はエリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）などを挙げることができる。

本様態の組成物を錠剤又はカプセルなどの剤形に製剤化するため、ラクトース、サッカロース（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（Ｍａｎｎｉｔｏｌ）、デンプン、アミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）又はゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）などの結合剤；ジカルシウムホスフェート（ｄｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの賦形剤；トウモロコシデンプン又はサツマイモデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、ステアリン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、フマル酸ステアリルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｙｌ ｆｕｍａｒａｔｅ）又はポリエチレングリコールワックス（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｗａｘ）などの潤滑剤などを含ませることが可能であり、カプセル剤形の場合には上述した物質以外にも脂肪油などの液体担体などを更に含ませることができる。

本様態の組成物を非経口投与する方法として、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与又は局部投与などを利用することが可能であり、前記組成物を疾患部位に塗布又は噴霧する方法も利用することができるが、これらに制限されることはない。

前記非経口投与用の剤形として、例えば皮下注射、静脈注射又は筋肉内注射などの注射用形態；坐剤注入方式；又は呼吸器を通して吸入を可能とするエアロゾル剤などのスプレー用として製剤化することができるが、これらに制限されることはない。前記注射用剤形として製剤化するためには、本様態の組成物を安定剤又は緩衝剤とともに水で混合し溶液又は懸濁液として製造しこれをアンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）又はバイアル（ｖｉａｌ）の単位投与用で製剤化することができる。前記エアロゾル剤などのスプレー用として剤形化する場合、水分散された濃縮物又は湿潤粉末が分散できるように、推進剤などを添加剤とともに配合することができる。

本様態の前記腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の適切な塗布、噴霧又は投与量は、前記組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び／又は投与経路と、投与対象となる動物の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、摂取する食べ物、排泄速度などの要因によって可変的であり、一般的に熟練した獣医師なら目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定して処方することができる。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む抗生剤が提供される。

本発明で用いられる用語である「抗生剤」は、薬剤の形態として人間を含む動物に提供され菌の死滅が可能な効能を有する製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤及び抗菌剤を総称する概念である。

本様態の前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む抗生剤は、従来の抗生剤に比べて腸管毒素性大腸菌に対する特異性が非常に高いため、益菌は殺さなく特定病原菌のみ死滅することができ、薬物耐性を誘導しないため従来の抗生剤に比べて製品寿命が延長される効果がある。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む、飼料添加剤又は飲用水添加剤が提供される。

本様態の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤は、前記バクテリオファージΦＣＪ２８又はこれを含む組成物を飼料添加剤又は飲用水添加剤形態として別に製造して飼料又は飲用水に混合する方式で使用するか、前記バクテリオファージΦＣＪ２８又はこれを含む組成物を、飼料又は飲用水を製造する際に、直接添加する方式で使用することができる。

本様態の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤として用いられる前記バクテリオファージΦＣＪ２８又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物は、液状又は乾燥状態であり、例えば、乾燥した粉末形態であり得る。

例えば、本発明のバクテリオファージΦＣＪ２８は粉末形態として飼料添加剤重量の０．０５〜１０重量％、具体的に０．１〜２重量％の割合で混合され得る。

本様態の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤を乾燥した粉末形態として製造するための乾燥方法は、特に制限されず、当該技術分野における通常的な方法を用いることができる。前記乾燥方法の非制限的例として、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などがある。これらは単独または二つ以上の方法を共に利用する方式で行うことができる。

本様態の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤には、非病原性の他の微生物を追加的に添加することができる。添加できる前記微生物の非制限的例として、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素及び／又は糖転換酵素の生産が可能である、バチルスズ・ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの枯草菌；牛の胃のような嫌気的条件で生理的活性及び有機物分解能を有するラクトバチルス菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）などの乳酸菌；家畜の体重と牛乳の産乳量を増加させ飼料の消化吸収率を高める効果があるアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などの糸状菌；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母；からなる群より選択され得る。これらは、単独または２種類以上を混合して使用することができる。

本様態の前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤は、必要に応じて他の添加剤をさらに含ませることができる。使用できる前記添加剤の非制限的例として、飼料又は飲用水の品質低下を防止するために添加する決着剤、油化剤、保存剤など；飼料又は飲用水の効用増大のため添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤又はオリゴ糖などがあり、その他飼料混合剤などが含まれ得る。これらは単独で使用されるか、２種類以上が共に添加され得る。

本発明の前記飼料添加剤は飼料１００重量部に対して、０．０５〜１０重量部で含まれることができ、具体的に、０．１〜２重量部で含まれ得る。本発明の前記飲用水添加剤は飲用水１００重量部に対して、０．０００１〜０．０１の重量部で含まれることができ、具体的に、０．００１〜０．００５重量部で含まれ得る。前記範囲内で腸管毒素性大腸菌に対するバクテリオファージΦＣＪ２８の活性が十分に発揮できる利点がある。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤を飼料又は飲用水に添加するか、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を飼料又は飲用水に直接添加して製造する飼料又は飲用水が提供される。

本様態で用いられる飼料は、特に制限されず、当該技術分野における通常的な飼料を用いることができる。前記飼料の非制限的例として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、フクベ類又は穀物副産物類などの植物性飼料；タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞タンパク質類、動物性フランクトン類又は飲食物などの動物性飼料などがある。これらは、単独または２種類以上を混合して使用することができる。

本様態で用いられる飲用水は特に制限されず、当該技術分野における通常的な飲用水を用いることができる。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む、消毒剤又は洗浄剤が提供される。前記消毒剤又は洗浄剤の剤形は特に制限されず、当該技術分野で知られた剤形で製造されて使用され得る。

前記消毒剤は腸管毒素性大腸菌を除去するために撒布することができ、動物の活動領域、屠畜場、へい死地域、調理場所又は調理設備などに撒布することができるが、これらに制限されることはない。

前記洗浄剤は腸管毒素性大腸菌に露出されたか、露出される可能性のある動物の皮膚表面又は身体の各部位などを洗浄する用途で用いられるが、これらに制限されることはない。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２８又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物を用いて腸管毒素性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法が提供される。

本様態の前記予防又は治療方法は具体的に、腸管毒素性大腸菌によって感染されたか感染される恐れがある人間以外の対象体に前記バクテリオファージΦＣＪ２８又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物を薬学的に有効な量で投与する段階を含む。前記バクテリオファージΦＣＪ２８又はこれを含む組成物の適切な１日当たりの総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で医師によって決定され、これは当該技術分野における通常の知識を有する者において自明なことである。

特定の動物に対する前記バクテリオファージΦＣＪ２８又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物の具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、該当個体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別又は食餌はもちろん、前記バクテリオファージΦＣＪ２８又はこれを含む組成物の投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間などを考慮して決定することが可能であり、同時又は異時において共に使用される薬物とその他の組成物の成分などを始めて多数の因子及び医薬分野においてよく知られている類似因子にしたがって可変的である。

本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２８又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物は、薬学的製剤の形態として動物に噴霧式鼻腔投与、動物の飼料又は飲用水に直接添加しこれを摂食させる方式で投与することが可能であり、飼料添加剤又は飲用水添加剤の形態で飼料又は飲用水に混合して投与することができる。

本様態の前記バクテリオファージΦＣＪ２８又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物の投与経路及び投与方式は、特に制限されず、目的とする該当組織に前記バクテリオファージΦＣＪ２８又はこれを含む組成物が到達できる限り、任意の投与経路及び投与方式で行うことができる。即ち、前記バクテリオファージΦＣＪ２８又は前記バクテリオファージΦＣＪ２８を有効成分として含む組成物は、経口又は非経口の様々な経路を介して投与することが可能であり、その投与経路の非制限的例として、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻側内又は吸入などで投与され得る。

以下、実施例をもって本発明をより詳しく説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることはない。

［実施例１］−腸管毒素性大腸菌に感染するバクテリオファージの分離

＜実施例１−１＞
バクテリオファージのスクリーニング及び単一バクテリオファージの分離
韓国忠清道洪城郡廣川地域のサムファウォンジョン農場地域の養豚糞便及び環境サンプルから得た試料５０mlを４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上澄液を０．４５μmフィルターで濾過して試料液を用意し、これを利用してソフトアガーオーバーレイ（ｓｏｆｔ ａｇａｒ ｏｖｅｒｌａｙ）方法を行った。前記ソフトアガーオーバーレイ方法は、トップアガー（ｔｏｐ−ａｇａｒ、０．７％の寒天を利用して固体培地の上に貼り付けたもの）で成長した宿主細胞を利用してバクテリオファージが溶菌することを観察する方法をいう。

具体的に、ソウル大学校獣医学科獣医伝染病学室で分離した腸管毒素性大腸菌（２６１８）の振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μlと１０×ＬＢ培地（トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏpaｎｅ）１０ｇ／ｌ；酵母抽出物５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）２mlに前記試料濾過液１８mlを混合し、これを３０℃で１８時間培養した後、前記培養液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離しその上澄液を０．４５μmフィルターで濾過した。その後、ＬＢ平板培地上に０．７％（ｗ／ｖ）寒天３mlと腸管毒素性大腸菌（２６１８）振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μlの混合液を注いで固まった後、その上に試料液１０μlを滴加し３０℃で１８時間培養し、溶菌斑の形成を確認した。

一つの溶菌斑には一種類のバクテリオファージが存在すると知られているため、形成された前記溶菌斑から単一バクテリオファージを分離した。具体的に、前記溶菌斑を４００μlのＳＭ溶液（ＮａＣｌ ５．８ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ ２ｇ／ｌ；１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ml）に加えて室温で４時間放置しバクテリオファージ溶液を得た。続いて、前記バクテリオファージ溶液１００μlを０．７％（ｗ／ｖ）寒天５ml及び腸管毒素性大腸菌（２６１８）振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μlと混合し、１５０ｍｍ直径のＬＢ平板培地を利用したソフトアガーオーバーレ方法を行い、完全に溶菌するまで培養した。培養が終わった後、前記ＬＢ平板培地に５mlのＳＭ溶液を加えて室温で４時間放置しバクテリオファージ溶液を得た。

前記溶液を回収し、１％（ｖ／ｖ）クロロホルムを加えた後、１０分間混合し４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を得て、前記上澄液を０．４５μmフィルターで濾過し最終試料を得た。

＜実施例１−２＞
バクテリオファージの大量培養及び精製
実施例１−１で得た前記バクテリオファージを腸管毒素性大腸菌（２６１８）を利用して大量培養し、これからバクテリオファージを精製した。

具体的に、腸管毒素性大腸菌（２６１８）を振とう培養して１．０×１０^１０ｃｆｕとなるように分注し４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、これを４mlのＳＭ溶液に再浮遊させた。ここに前記バクテリオファージを１．０×１０^７ｐｆｕで接種しＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．００１で滴定した後、常温で２０分間静置した。続いて、これを１５０mlのＬＢ培地に接種し３０℃で５時間培養した。

培養が終了した後、最終体積の１％（ｖ／ｖ）となるようにクロロホルムを添加し、２０分間撹拌し、制限酵素であるＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅ Ａを各々最終濃度が１μg／mlとなるように添加し３０℃で３０分間静置した。その後、最終濃度が各々１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）となるように塩化ナトリウムとポリエチレングリコールを加えて４℃で３時間更に静置し、４℃と１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈殿物を得た。

得られた前記沈殿物を５mlのＳＭ溶液で懸濁させ２０分間室温で静置した後、クロロホルム１mlを加えて撹拌し、４℃と４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄液を得た。前記上澄液を０．４５μmのフィルターで濾過した後、グリセロール密度勾配法（密度：４０％、５％グリセロール）を利用した超遠心分離（３５，０００ｒｐｍ、１時間、４℃）を行ってバクテリオファージを精製した。

本発明者らは養豚糞から試料を採取し、腸管毒素性大腸菌に対する特異的死滅能を有する前記バクテリオファージを「ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅΦＣＪ２８」と命名し、２０１３年１０月２５日韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ号で寄託した。

＜実施例２＞
ΦＣＪ２８の形態観察
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２８を０．０１％のゼラチン溶液に希釈し、２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液で固定した。これを炭素コーティングした雲母板（ｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃａ ｐｌａｔｅ （ｃａ． ２．５ｍｍ×２．５ｍｍ））に滴加し１０分間適応させた後、滅菌蒸留水で洗浄した。炭素被膜（ｃａｒｂｏｎ ｆｉｌｍ）をカッパーグリッド（ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄ）に挟んで２％ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で６０秒間染色して乾燥した後、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−１０１１、８０ｋＶ、倍率×２００，０００）で検鏡した（図１）。

図１は、バクテリオファージΦＣＪ２８の透過電子顕微鏡写真を表したものであり、形態学的に正二十面体のヘッドを有し収縮性のテール（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｔａｉｌ）が観察され、ミオビリダエ（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）に属することが分かった。

＜実施例３＞
ΦＣＪ２８の全ゲノムＤＮＡのサイズ分析
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２８からゲノムＤＮＡを抽出した。

具体的に、精製されたバクテリオファージΦＣＪ２８の培養液に２０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、５０μg／mlのタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）‐Ｋ、及び０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を加えて、５０℃で１時間静置し、同一体積のフェノール（ｐＨ８．０）を加えて撹拌した後、室温に１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上澄液を得た。

前記上澄液を同一体積のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）と混合し、室温に１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上澄液を得た。前記上澄液を同一体積のクロロホルムと混合し室温に１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄液を得た。前記上澄液に３Ｍの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）を全体体積に１０％（ｖ／ｖ）となるように加えて混合し、２倍体積の冷たい９５％エタノールを加えて混合した後、−２０℃で１時間静置した。続いて、０℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した後上澄液を除去して沈殿物を得た後、これに５０μlのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて溶解させた。前記抽出したＤＮＡを１０倍希釈しＯＤ_２６０で吸光度を測定し濃度を測った。

その後、１μgのＤＮＡを１％ＰＦＧＥ（ｐｕｌｓｅ−ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）アガロースゲルにロードし、バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）ＰＦＧＥシステム７番のプログラム（サイズ範囲２５ｋｂ〜１００ｋｂ；スイッチタイムランプ（ｓｗｉｔｃｈ ｔｉｍｅ ｒａｍｐ）０．４秒〜２．０秒、線形（ｌｉｎｅａｒ ｓｈａｐｅ）；順方向電圧 （ｆｏｒｗａｒｄ ｖｏｌｔａｇｅ）１８０Ｖ；逆方向電圧（ｒｅｖｅｒｓｅ ｖｏｌｔａｇｅ）１２０Ｖ）を利用して常温で２０時間展開させた（図２）。

図２は、バクテリオファージΦＣＪ２８のゲノムＤＮＡの電気泳動写真であり、バクテリオファージΦＣＪ２８のゲノムＤＮＡは９８ｋｂ以上であることを確認した。図２において、Ｍはサイズ測定の基準となるＤＮＡである。

＜実施例４＞
ΦＣＪ２８のタンパク質パターンの分析
１０^１０ｐｆｕ／mlタイター（ｔｉｔｅｒ）の精製されたバクテリオファージΦＣＪ２８溶液１５μlと５×ＳＤＳ試料溶液３μlを混合し５分間沸騰させた後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３）。

図３は、バクテリオファージΦＣＪ２８を対象として行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を表す電気泳動写真であり、約６７．９ｋＤａ、５０．８ｋＤａ及び６ｋＤａサイズの主要タンパク質を確認することができた。

＜実施例５＞
ΦＣＪ２８の遺伝的特性の分析
前記実施例１で精製されたバクテリオファージΦＣＪ２８の遺伝子的特性を調べるため、バクテリオファージΦＣＪ２８のＤＮＡを遺伝子分析機器であるＦＬＸチタニウムシークエンサー（ｔｉｔａｎｉｕｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて分析した。株式会社マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）でＧＳとデ・ノボアセンブリソフトウェア（ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて遺伝子の組換えを行った。オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）はＧｅｎｅＭＡｒｋ．ｈｍｍ、Ｇｌｉｍｍｅｒ ｖ３．０２及びＦＧＥＮＥＳＢソフトウェアを用いて行われた。ＢＬＡＳＴＰとインタープロスキャン（ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ）プログラムを用いてオープンリーディングフレームの名称を命名（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）した。

前記バクテリオファージの塩基配列は従来に報告されたバクテリオファージ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｐｈａｇｅ Ｂｐ７）の塩基配列と類似性を示したが、全てのフラグメントが１００％一致するバクテリオファージは存在しなかったことを確認した。これで、前記バクテリオファージは新たに分離されたバクテリオファージであることを確認することができた。

下表１は、バクテリオファージΦＣＪ２８の塩基配列と前記従来に報告されたバクテリオファージとの解読した塩基配列の相同性を比較した結果を表す。

前記製造されたバクテリオファージΦＣＪ２８のＤＮＡを遺伝子分析機器を用いて分析した塩基配列全体の結果は配列番号１である。

＜実施例６＞
ｐＨによるΦＣＪ２８の安定性の調査
バクテリオファージΦＣＪ２８が胃腸内の条件と同様に低いｐＨで安定性を保つことができるかを確認するため、様々なｐＨ範囲（ｐＨ２．０、３．０、４．０、５．０）で安定性の調査実験を行った。

実験のため様々なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．０及びｐＨ５．０）、クエン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ２．０及びｐＨ３．０）を各々０．２Ｍで製造した。

前記各ｐＨ溶液１８０μlと２．９×１０^９ＰＦＵ／mlタイターのバクテリオファージ溶液２０μlを混ぜて各ｐＨ溶液の濃度を１Ｍに合わせた後、２時間常温で静置した。対照群は同一方法で２．９×１０^９ＰＦＵ／mlバクテリオファージ溶液２０μlをＳＭ溶液１８０μlに混ぜた後、２時間常温で静置した。その後、これらを段階希釈しソフトアガーオーバーレイ方法を利用して各段階の希釈液を１０μlずつ落とした後、３０℃で１８時間培養し溶菌有無によってタイターを測定した（図４）。

図４は、バクテリオファージΦＣＪ２８の耐酸性実験結果を表したものである。図４に示した通り、対照群に比べてバクテリオファージΦＣＪ２８はｐＨ３．０からｐＨ５．０まで活性を失うことなく安定的であることが確認された。

＜実施例７＞
温度によるΦＣＪ２８の安定性の調査
バクテリオファージの製品剤形の中で飼料添加剤として利用した場合、バクテリオファージの剤形過程において熱が発生する可能性があり、熱に対する安定性確認するため下記の実験を行った。

具体的に、２．９×１０^８ＰＦＵ／ml濃度のバクテリオファージΦＣＪ２８の溶液２００μlを６０℃の温度条件で各々０分、３０分、６０分及び１２０分間静置した。その後、処理した前記実験培養液を段階希釈しソフトアガーオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μlずつ落とした後３０℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した（図５）。

図５は、バクテリオファージΦＣＪ２８の耐熱性実験結果を表したものである。図５に示した通り、バクテリオファージΦＣＪ２８は６０℃で３０分間露出されるまでには約１ログ以下の活性減少を示し、それ以上露出した場合６０分からは３ログ以上活性が減少されることが分かった。

＜実施例８＞
野生分離株の腸管毒素性大腸菌に対するΦＣＪ２８の感染範囲の調査
実験に用いられた腸管毒素性大腸菌（２６１８）以外に、ソウル大学校獣医科大学、建国大学校獣医科大学及び検疫院で分離した野生分離株の腸管毒素性大腸菌９９株に対してバクテリオファージΦＣＪ２８の溶菌活性有無を確認した。この分離株はＦ−血清型が、Ｆ４タイプ（ｔｙｐｅ）３７株、Ｆ５タイプ３０株、Ｆ６タイプ７株、Ｆ１８タイプ２０株、その他の菌株５株である。

具体的に、各菌株の振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μlを混ぜてソフトアガーオーバーレイ方法を行い、１０^９ｐｆｕ／mlタイターバクテリオファージΦＣＪ２８の溶液を１０μlずつ落とした後、３０℃で１８時間培養し、溶菌斑形成有無を観察した。

前記結果は下表２で表した。

前記表２で示した通り、バクテリオファージΦＣＪ２８は一般の養豚農家で豚下痢の原因菌として相当な部分を占めているＦ−血清型のＦ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ１８タイプに対する感染能を表し、現場で適用した場合優れた効率性を示すと期待される。

前記各ｐＨ溶液１８０μlと２．９×１０^９ＰＦＵ／mlタイターのバクテリオファージ溶液２０μlを混ぜて各ｐＨ溶液の濃度を０．２Ｍに合わせた後、２時間常温で静置した。対照群は同一方法で２．９×１０^９ＰＦＵ／mlバクテリオファージ溶液２０μlをＳＭ溶液１８０μlに混ぜた後、２時間常温で静置した。その後、これらを段階希釈しソフトアガーオーバーレイ方法を利用して各段階の希釈液を１０μlずつ落とした後、３０℃で１８時間培養し溶菌有無によってタイターを測定した（図４）。

Claims (12)

1. 腸管毒素性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的な死滅能を有する、 バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）。
2. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用の組成物。
3. 前記感染性疾病は、大腸菌症であることを特徴とする、請求項２に記載の腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用の組成物。
4. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、抗生剤。
5. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、飼料添加剤。
6. 請求項５の飼料添加剤を含む、飼料。
7. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、飲用水添加剤。
8. 請求項７の飲用水添加剤を含む、飲用水。
9. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、消毒剤。
10. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）を有効成分として含む、洗浄剤。
11. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２８（ＫＣＣＭ１１４６６Ｐ）又は請求項２の前記組成物を、人間以外の動物に投与する段階を含む、腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療方法。
12. 前記感染性疾病は大腸菌症であることを特徴とする、請求項１１に記載の腸管毒素性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療方法。