KR101159763B1

KR101159763B1 - 어류의 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법

Info

Publication number: KR101159763B1
Application number: KR1020100056588A
Authority: KR
Inventors: 김명석; 박명애; 서정수; 권문경; 김진우; 조미영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-06-15
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2012-06-27
Also published as: KR20110136515A

Abstract

본 발명은 비브리오 하베이 감염증에 감염된 넙치로부터 분리된 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN (미생물 기탁번호 KCTC 11705BP) 균주를 항원으로 포함하는 비브리오 하베이 감염증 불활성화 백신, 이의 제조방법 및 투여방법에 대한 것이다.

Description

어류의 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법{INACTIVATED VACCINE AGAINST VIBRIO HARVEYI INFECTIOUS DISEASE IN FISH, PREPARING METHOD THEREOF AND ADMINISTRATING METHOD THEREOF}

본 발명은 어류의 비브리오 하베이 감염증 예방용 혼합 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법에 관한 것이다.

비브리오증의 원인체 중에 하나인 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)는 그람음성 간균으로, 해수에 상존하고 있고 넙치에서 많은 폐사를 일으키는 균이다. 또한 비브리오 하베이는 전신성 질병의 원인 병원체로 알려져 있으며, 국내의 양식 어류에서도 생육하고 있다.

그리고 비브리오 하베이는 무척추 동물인 새우류에 감염되는 루미네선스 비브리오(luminescence Vibrio)로 알려져 있으며, 치어 및 자어에 감염되어 100% 폐사를 시키는 심각한 질병 중에 하나로 알려져 있다(Sunaryanto et al., Bull, Brackishwater Agriculture 8:105-112, 1986; Lavilla-Pitogo et al., Agriculture, 91:1-13, 1990).

특히 수요자들에게 많이 소비되는 양식 넙치와 관련하여, 양식 넙치의 세균성 질병을 조사한 결과, 비브리오균(Vibrio spp.), 연쇄구균(Streptococcus), 포토박테리움균(Photobacterium damselae), 에드와드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 및 슈도모나스균(Pseudomonas)이 전체 어류 세균성 질병의 65%를 차지하였다.

비브리오균 중에 하나인 비브리오 하베이에 의한 감염증은 여름철 양식 넙치에서 흔히 발병하는 질병으로, 비브리오 하베이에 감염된 넙치는 복부팽만, 탈장, 지느러미 갈라짐 등의 외부 증상과 출혈성 복수, 간장출혈, 비장위축 등의 내부증상을 보인다(Soffientino et al., Dis . Aquat . Org , 38: 201-210, 1999). 그리고 비브리오 하베이 감염증은 우리나라의 양식 넙치에 감염되어 높은 어류 폐사를 일으킨다(원경미 등, 한국어병학회지, 19:119-126, 2006).

따라서 비브리오 하베이에 의한 감염증의 예방이 매우 중요하나, 사육 환경 및 사육 관리의 개선만으로는 질병 발생을 억제하기 어려운 실정이다. 현재로서는 세균성 질병으로 인한 어류의 폐사를 방지하고 치료하기 위해, 백신이나 항균제가 사용되고 있다.

세균성 질병을 치료를 위한 수산용 항균제는 2001년에서 2007년 사이에 매년 평균 220톤 이상 사용되었고, 우리나라에서 사용이 허가된 수산용 항균제에는 약 28종 성분, 317개 품목이 있다. 수산용 항생제로서 옥시테트라사이클린, 옥소린산, 에리스로마이신 등이 많이 사용되고 있으며, 항균제의 사용은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다.

그리하여 1980년대 후반부터, 우리나라의 어패류에서 분리된 항균제 내성균에 대한 내성의 경향이 매년 변화하고 있는 실정이다. 항균제에 대한 내성의 변화로 인한 내성균의 출현은 어패류의 세균성 질병 치료와 예방을 더욱 어렵게 만드는 주요 원인이 된다. 따라서 수산용 항균제가 어류의 세균성 질병을 치료하는 궁극적인 방법이 될 수 없다.

결국 보다 근본적인 예방 대책으로서 백신의 개발이 시급한 실정이다. 이에 따라 항생제 보다 안정한 세균성 질병 예방용 백신에 대한 관심이 높아지고 있다.

백신에 대한 높아진 관심으로 인해, 최근에 질병을 예방하기 위한 백신의 항원으로서, 세균의 외막 단백질의 역할에 대한 연구가 활발히 진행되어 오고 있다.

연구 결과, 이러한 세균의 표면 구성은 안정적이지 않고, 시험관 내(in vitro)에서 배양된 세균의 외막 단백질은 생체 내(in vivo)에서 배양된 세균의 외막 단백질과 차이가 있다고 알려졌다. 또한 일반적으로 세균성 질병을 예방하기 위한 백신은 배양된 세균을 불활화시켜 항원으로 사용하므로, 생체 내와 유사한 배양조건에서 세균을 배양하여야 세균의 항원성을 증대시킬 수 있다고 알려졌다.

이처럼 양식 어류에 발생하는 주요 세균성 질병을 예방하기 위한 백신의 개발이 꾸준히 수행되어 오고 실정이다.

이에 본 발명자들은 경제적이고 효과적인 비브리오 하베이 감염증 예방방법에 대하여 연구하던 중, 새로운 비브리오 하베이 HN(Vibrio harvey HN) 균주를 발견하고 이를 항원으로 이용하여 제조한 백신을 어류에 투여함으로써 비브리오 하베이 감염증을 예방할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 비브리오 하베이 감염증에 걸린 넙치로부터 분리된 비브리오 하베이 HN 균주를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 비브리오 하베이 HN 항원을 포함하는 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혼합 불활성화 백신을 어류에 투여하여 어류를 면역시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN 균주를 제공한다. 상기 비브리오 하베이 HN 균주는 비브리오증에 걸린 양식 넙치로부터 분리된 것으로, 2010년 5월 28일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC 11705BP로 기탁되었다. 상기 균주는 백신 개발을 위하여 생화학적 및 유전학적 동정을 거쳐 확실한 균주의 동정이 이루어진 균주이다.

그리고 본 발명은 상기 균주를 이용한 불활성화 백신을 제공한다. 구체적으로 불활성화된 비브리오 하베이 HN 항원을 포함하는 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신을 제공한다.

상기 불활성화 백신은 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주를 더 포함할 수 있다. 불활성화된 비브리오 하베이 HN 균주에 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주 혼합한 불활성화 백신은 비브리오 하베이 감염증 예방 효과가 더욱 우수하기 때문이다.

상기 불활성화 백신은, 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)와 불활성화된 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN (미생물 기탁번호 KCTC 11705BP) 균주를 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 비율로 혼합되는 경우, 비브리오 하베이 감염증 예방 효과가 우수하기 때문이다.

상기 불활성화 백신은 이 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 불활성화 백신을 제조하기 위해서는 불활성화제를 사용해야 한다. 상기 불활성화제는 이 기술분야에 널리 공지된 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 포르말린, 글루타르알데히드 또는 β-프로피온락톤 등이 있으며, 백신 원액을 제조하기 전이나 후에 첨가한다. 포르말린을 사용하는 경우, 그 첨가량은 약 0.00003~0.7%(v/v), 불활성화 온도는 약 2~37℃, 그리고 불활성화 시간은 약 1~180일이다.

아울러 불활성화 백신에는 보조제(adjuvant)를 더 첨가할 수 있다. 상기 보조제는 이 기술 분야에 알려진 것은 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 안정화제로서 당류나 아미노산류, 또한 보조제로서 광물유, 식물유, 백반, 인산알루미늄, 벤토나이트, 실리카, 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신 또는 인터류킨 등을 이용할 수 있다.

한편, 적당한 용적의, 예를 들어 약 10~500 ㎖ 부피의 바이알에 백신액을 나누어 주입하고 밀봉 후 백신으로 사용한다. 이러한 백신은 액상뿐만 아니라, 나누어 주입한 다음에 동결 건조함으로써 건조제제로 사용할 수 있다. 또한 건조제제는 사용 직전에 첨가한 감균액으로 건조물질을 완전하게 재용해하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 불활성화 백신은 감염의 위험성이 있는 임의의 연령의 어류에 사용할 수 있다. 단, 양식 보전의 관점에서, 작은 물고기 내지 치어를 사용하는 것이 바람직하며 주사가 가능한 15 cm 이상의 어류에 사용하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 브리오 하베이 감염증에 걸린 넙치로부터 분리된 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN (미생물 기탁번호 KCTC 11705BP) 균주를 배양하고 불활성화시키는 단계를 포함하는, 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신의 제조방법을 제공한다.

상기 비브리오 하베이 HN 균주는 2,2’-디피리딜이 첨가된 TSB, BHIH 또는 LB 배지 중 선택된 1종 또는 2종 이상의 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 상기 TSB, BHIB 또는 LB는 SAPW, TCG, A1BFe-C 또는 A1-C 배지보다 비브리오 하베이 HN 균주 발현을 증대시킬 수 있어, 많은 양의 항원을 얻을 수 있기 때문에 상기 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 2,2’-디피리딜은 50 내지 200 μ㏖인 것이 바람직하다. 2,2’-디피리딜은 50 μ㏖ 미만이면, 비브리오 하베이 HN 균주의 성장에 미치는 효과가 미미하고, 200 μ㏖ 초과인 경우 비브리오 하베이 HN 균주의 성장 효율이 증가하지 않기에 경제적인 측면을 고려해 볼 때, 상기 범위 내에서 2,2’-디피리딜을 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 배양은 12 내지 72 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 배양 시간이 12 시간 미만인 경우 충분한 균주 배양이 이뤄지지 않고, 72 시간 초과인 경우 균주가 더 이상 배양되지 않기에 경제적인 측면을 고려하여 상기 범위 내에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 불활성화시키는 단계 이후, 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 백신은 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스와 불활성화된 비브리오 하베이 HN 균주를 1:1 내지 1:3으로 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 비율로 혼합되는 경우, 비브리오 하베이 감염증 예방 효과가 우수하기 때문이다.

또한 본 발명은 상기 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법을 제공한다. 상기 어류는 감염의 위험성이 있는 모든 어류를 포함한다. 구체적으로, 넙치, 조피볼락 및 감성돔 등을 포함하며 이중에서 넙치가 가장 바람직하다.

본 발명의 불활성화 백신을 이용하여 어류를 면역시키는 방법은 본 발명의 백신을 복강내 투여 등을 이용하여 어류에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 어류, 특히 양식 넙치의 비브리오 하베이 감염증을 효과적으로 예방하여 비브리오 하베이 감염증으로 인한 어류의 폐사를 현저하게 줄일 수 있는 효과를 가진다. 이에 따라 본 발명은 어류의 생산성 증대는 물론, 항생제 사용으로 인한 비용을 절감시킬 수 있다.

또한 본 발명은 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 백신을 사용함으로써, 항생제를 사용하지 않은 건강한 어류 생산을 가능하게 하여, 양식업의 발전에 이바지하고 어류 소비를 크게 향상시킬 수 있다.

도 1은 넙치에 대해 HN 균주의 병원성을 테스트하여 그래프로 나타낸 것이다: (-●-)는 비브리오 하베이 HN 균주로서 시험구를, (-□-)는 비브리오 하베이 KCCM40866 균주로서 대조구를 나타냄.
도 2는 HN 균주에 인위 감염된 넙치의 주요 증상을 나타낸 사진이다: (a)는 넙치의 복부 팽만과 탈장의 외부증상을, (b)는 넙치의 내부 장기의 출혈 증상을 나타냄.
도 3은 HN 균주의 전체 단백질과 외막 단백질의 단백질 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 것이다: M은 단백질 크기 마커(protein size marker)를, 1은 비브리오 하베이 HN 균주의 전체 단백질을, 2는 HN 균주의 외막 단백질을 나타냄.
도 4는 넙치의 복강에 HN 균주의 생체 내 배양을 위해 투석막 삽입의 과정을 보여주는 사진이다:(a)는 넙치 복강의 개복을, (b)는 투석막의 복강내 삽입을, (c)는 넙치의 복강을 봉합을, (d) 투석막이 삽입된 넙치를 나타냄.
도 5는 넙치의 생체 내 배양된 HN 균주의 외막 단백질의 (a) 단백질 전기영동 및 (b) 웨스턴 블랏팅 수행 결과이다: M은 단백질 크기 마커(protein size marker)를, 1은 넙치의 생체 배양된 비브리오 하베이 HN, 2는 펩톤수 배지(salt alkaline peptone water)에서 배양된 비브리오 하베이 HN을 나타냄.
도 6은 비브리오 하베이 분리 균주의 외막 단백질 유전자를 유형별로 분리한 계통도이다: (a)는 ompK(outer membrane protein K)를, (b)는 ompU(outer membrane protein U)를, (c)는 ompV(outer membrane protein V)를, (d)는 ompW(outer membrane protein W)를 나타냄.
도 7은 배양배지 종류에 따른 HN 균주량의 변동을 나타낸 그래프이다.
도 8은 2, 2’-디피리딜의 농도에 따른 sTSB 배지에서 배양된 HN 균주의 외막 단백질의 (a) 전기영동 및 (b) 웨스턴 블랏팅 수행 결과이다: M은 단백질 크기 마커(protein size marker)를, 1은 sTSB를, 2는 50 μ㏖ 2, 2’-디피리딜 첨가된 sTSB를, 3은 200 μ㏖ 2, 2’-디피리딜 첨가된 sTSB를, 4는 400 μ㏖ 2, 2’-디피리딜 첨가된 sTSB 배지를 나타냄.
도 9는 2, 2’-디피리딜 첨가된 TSB 배지에서 2, 2‘-디피리딜 농도에 따른 HN 균주 성장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10은 배양 시간을 달리하여 배양된 HN 균주 외막 단백질의 (a)전기영동 및 (b) 웨스턴 블랏팅 수행 결과이다: M은 단백질 크기 마커(protein size marker), 1은 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB 배지에서 24 시간, 2는 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB 배지에서 48 시간, 3은 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB 배지에서 72 시간의 배양 조건을 나타냄.
도 11은 50 kDa 이상의 HN 균주의 외막 단백질을 넙치에 투여한 후, 3주 후 넙치의 누적폐사율 측정하여 HN 균주에 대한 방어력을 나타낸 그래프이다: (-■-)는 50 kDa 이상의 HN 균주의 외막 단백질를 투여하지 않은 넙치(대조구)의 누적 폐사율을, (-○-)는 50 kDa 이상의 HN 균주의 외막 단백질을 투여한 넙치(시험구)의 누적 폐사율을 나타냄.
도 12는 HN 항원을 포함한 백신을 넙치에 주사 투여한 후, 항원의 농도에 따른 넙치의 누적폐사율을 나타낸 그래프이다: (-●-)는 백신을 투여하지 않은 넙치(대조구)의 누적폐사율을, (-□-)는 10 ㎎/㎏ b.w. 농도의 HN 항원이 포함된 백신을 투여한 넙치(시험구)의 누적폐사율을, (-△-)는 20 ㎎/㎏ b.w. 농도의 HN 항원이 포함된 백신을 투여한 넙치(시험구)의 폐사율을 나타냄.
도 13은 백신 처리 1 주일째 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직 염색 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 백신 균주의 분리 및 동정

백신 균주는 복부 팽만, 지느러미 갈라짐의 외부 증상과 출혈성 복수, 간 출혈, 장 출혈, 비장 위축 등의 내부 증상을 보이는 양식 넙치로부터 분리하였다. 구체적으로, 1.0%(v/v) 염화나트륨(NaCl)이 첨가된 TSA(Tryptic Soy Broth; BD, USA; 이하 ‘sTSA’) 배지를 사용하여 병든 어류의 내부 장기 조직을 무균적으로 적출하여 도말한 후 25℃에서 24 시간 배양하여 분리하였다. 순수 분리한 콜로니 중 그람 음성 균주를, “HN” 이라 명명하고, 16S rDNA 염기서열을 분석하여 동정하였다. 구체적으로, 유니버셜 박테리아 프라이머(Bioneer, Korea)인, 27f(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')및 1492r(5'-CGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하여 증폭 후 PCR 반응 산물은 AccuPrep PCR 정제 키트(Bioneer) 및 AccuPrep PCR 플라스미드 익스텐션 키트(Bioineer)를 이용하여 시퀀싱을 실시하였다. 그 결과 나타난 HN의 16S rDNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다. 이들 서열을 GenBank 서열 데이터로부터 얻은 유연 균주의 서열과 정렬시키고 상동성을 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 HN 균주는 비브리오 하베이로 동정되었으며, "비브리오 하베이(Vibrio harveyi ) HN"으로 명명되었고, 2010년 5월 28일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 미생물 기탁번호 KCTC 11705BP로 기탁되었다.

실시예 2: 백신 균주의 병원성

실시예 2-1

실시예 1의 백신용 균주의 LD₅₀ 값은 아래 표 1과 같다. 상기 LD(lethal dose)값 측정은 이 기술분야에서 널리 공지된 방법을 이용한다(Hall, J.A. and Golding, L.A: Standard methods for whole effluent toxicity testing: development and application. Report No. MFE 80205. NIWA report for the ministry for environment, Wellington, New Zeland. 1998). LD₅₀의 결과, 백신 균주는 어류를 폐사시키는 독성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

[표 1] 백신용 균주의 LD₅₀ 값

실시예 2-2

비브리오 하베이 KCCM40866 균주와 HN 균주의 병원성을 테스트하기 위해, 각각의 균주를 넙치의 혈청에서 배양하고 시간별로 균주의 수를 측정하였다. 측정한 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1에서 확인할 수 있듯이, HN 균주는 6 시간 후에 150배 이상, 24 시간 후에 70,000배 이상 균수의 증가를 나타냈으나, 비브리오 하베이 KCCM40866은 넙치 혈청 내에서 6 시간 후에 생존하지 않았다. 이러한 결과를 통해 HN 균주는 병원성이 있음을 재차 확인할 수 있다.

실시예 2-3

넙치의 HN 균주에 대한 감염 증상을 육안으로 관찰하고자, 넙치의 복강에 HN 균주를 복강주사법으로 인위적으로 감염시켰다. 그 결과, HN 균주에 감염된 넙치는 복부팽만, 탈장의 외부 증상과 출혈성 복수, 간, 장 출혈, 비장 위축 등의 내부 증상을 보였다.

도 2은 HN 균주에 인위 감염된 넙치의 주요증상을 나타낸 사진으로, (a)는 복부 팽만과 탈장의 외부증상을, (b)는 내부 장기의 출혈 증상을 나타낸 것이다.

실시예 3: 백신 균주의 주요 항원 특성 분석

HN 균주의 항원 단백질체 분석을 위하여 단백질 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 분석을 수행하였다. 상기 단백질 전기영동은, 3% 염화나트륨(NaCl)이 첨가된 BHIB 배지에 접종하여 25℃에서 24 시간 배양한 HN 균주를 생리식염수에 현탁하여 흡광도 600 nm에서 2.0으로 조절하여 균수를 일정하게 조절하였다. 30 초 간격으로 10분간 초음파를 쬐어 분쇄한 다음, 2×샘플 버퍼(0.12M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 5 mM 2-mercaptoethanol)와 1:1로 혼합 후 100℃에서 10분간 끊여서 준비하였다. 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 준비된 시료를 15 ㎕ 로딩하고 100 V에서 1시간 20분 동안 전기영동하였다. 전기영동 끝난 겔은 염료(coomassie brilliant blue R-250)로 염색하고 탈색하여 관찰하였다. 상기 단백질 전기영동 결과를 도 3에 나타냈다.

보다 상세하게, 도 3은 HN 균주의 전체 단백질(1) 및 외막 단백질(2)의 SDS-PAGE 수행 결과를 나타난 것으로, 약 10 내지 120 kDa까지 다양한 크기의 외막 단백질 (Outer Membrane Protein, 이하 omp)이 존재함을 확인할 수 있다. 또한 약 40 kDa 부근에 많은 양의 외막 단백질이 있음을 알 수 있다.

한편 펩톤수 배지(Salt Alkaline Peptone Water, 이하 SAPW)에서 배양된 HN균주를 넣은 멸균된 투석막을 넙치 복강 안에 삽입하였다. 투석막이 삽입된 넙치를 25℃ 사육수조에서 48 시간 동안 사육한 후에 HN 균주를 회수하였다. 넙치의 복강에 HN 균주의 생체 내 배양을 위한 투석막 삽입 과정을 도 4에 나타냈다.

보다 상세하게, 도 4의 (a)는 넙치 복강의 개복을, 도 4의 (b)는 투석막의 복강내 삽입을, 도 4의 (c)는 넙치의 복강을 봉합을, 도 4의 (d)는 투석막이 삽입된 넙치를 보여주는 사진이다.

이렇게 회수된 HN 균주를 항원 단백질체 분석을 위하여 단백질 전기영동 및 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 상기 단백질 전기영동은 도 3의 결과를 얻기 위해 수행한 실험 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 상기 웨스턴 블랏팅의 수행 방법은 다음과 같다. 상기 단백질 전기영동한 겔에 나이트리 셀룰로오소 멤브레인 페이퍼(nitricelluolse menbrane paper, NC paper, Amersham Biosciences, Germany)를 얹어서 100 V에서 1 시간 동안 형질전환(transformation, BIO-RAD)시켰고, 그 후 NC 페이퍼를 트윈(Tween 20)이 포함된 PBS(T-PBS)로 5회 세척한 후 1% BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma)로 1시간 동안 블랏킹(blocking)하고 T-PBS로 5회 세척하였다. 한편, HN 균주와 FCA(Freund's Copmlete Adjuvant, Sigma)를 1:1로 혼합하여 농도를 50 ㎎/㎖로 맞춘 후 건강한 토끼의 피하에 2 ㎖ 주사 후, 2 주째에 HN 균주와 FIA(Freund's Incopmlete Adjuvant, Sigma)를 1:1로 혼합하여 농도를 50 ㎎/㎖로 맞춘 후 토끼의 피하에 2 ㎖ 주사하고 2주 후에 토끼의 심장에서 채혈한 후, 혈액을 실온에서 1 시간 유지하고 4 ℃에서 보관하고 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 토끼의 항혈청을 얻었다. 이렇게 얻은 토끼의 항혈청을 각 1/100로 희석하여 4℃에서 밤새 보관한 후 T-PBS로 5회 세척하였다. 2차 항체로는 항-토끼 IgG(Sigma)를 사용하였으며, 이를 1/5,000로 희석하여 1 시간 동안 반응시킨 후 T-PBS로 5회 세척하여 BICP(5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Phosphate, Sigma)와 NBT(Nitro Blue Terazolium, Sigma)를 첨가하여 발색시켜 관찰하였다.

상기 수행 결과를 도 5에 나타냈다. 보다 상세하게, 도 5의 (a)는 HN 균주의 외막 단백질의 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 수행한 결과이고, 도 5의 (b)는 HN 균주의 외막 단백질의 웨스턴 블랏팅(western blotting)한 결과이다.

도 5의 (a)를 통해, HN 균주에 감염된 사육수조에서 48 시간 동안 사육된 넙치로부터 회수된 HN 균주는 약 85 kDa의 외막 단백질을 더 포함하고 있음을 알 수 있었다. 그리고 도 5의 (b)의 웨스턴 블랏팅 결과를 통해, HN 균주가 항원-항체 반응에서 항원성이 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 백신 균주의 주요 항원 특성 분석

본 발명의 발명자들은 국내에서 분리된 비브리오 하베이 균주들의 외막 단백질 K(ompK) 유전자 분석한 결과, 비브리오 하베이는 3개의 유전형(genotype)으로 구분됨을 확인하였다.

도 6은 비브리오 하베이 표준균주들의 외막 단백질(outer membrane protein) 유전자를 유형별로 분리한 계통도이다. 보다 상세하게, 도 6의 (a)는 ompK(outer membrane protein K)를, 도 6의 (b)는 ompU(outer membrane protein U)를, 도 6의 (c)는 ompV(outer membrane protein V)를, 도 6의 (d)는 ompW(outer membrane protein W)를 나타낸 것이다.

도 6의 (a)를 통해, 본 발명의 HN 균주는 표준균주인 KCCM40866의 외막 단백질 K(outer membrane protein K), 중국에서 분리된 비브리오 하베이 EcGS020802 균주의 외막 단백질 K(ompK)(GenBank Accession No. AY332563) 그리고 비브리오 하베이 1017 균주의 외막 단백질 K(ompK)(GenBank Accession No. DQ279075)의 유전자와 유전자 유형이 상이한 것으로 보아, HN 균주가 상기 3가지 균주와 다른 균주임을 알 수 있다.

비브리오 하베이 HN 균주의 외막 단백질 W(outer membrane protein W) 유전자는 KCCM40866, EcGS020802, 1017 균주의 외막 단백질 W(outer membrane protein W) 유전자와 99% 이상의 상동성을 보였다.

실시예 5: 비브리오 하베이 HN 균주의 배양 조건

1%(v/v) 염화나트륨이 첨가된 TSB(Tryptic Soy Broth; BD, USA; 이하 sTSB), 1%(v/v) 염화나트륨이 첨가된 BHIB(Brain Heart Infusion Broth; 이하 sBHIB), 1%(v/v) 염화나트륨이 첨가된 LB(Luria-Bertani broth; BD, USA; 이하 sLB) 배양 배지에서 HN 균주를 배양하고, 각각의 HN 균주 배양액의 흡광도 값을 측정하였다. 이에 대한 결과를 그래프로 정리하여 도 7에 나타냈다.

도 7을 통해, 상기 sTSB, sBHIB 또는 sLB 배양 배지에서 자란 HN 균주의 성장 속도 및 배양액의 흡광도 값이 서로 유사함을 알 수 있었다.

또한 sTSB, sBHIB 또는 sLB의 배지에서 배양된 HN 균주 배양액의 흡광도 값이 SAPW, TCG, A1BFe-C 또는 A1-C 배지에서 배양된 HN 균주 배양액의 흡광도 값 보다 높은 것으로 보아, sTSB, sBHIB 또는 sLB의 배지가 HN 균주의 생장에 더욱 적합한 배지임을 알 수 있다.

상기 도 7의 실험 결과와 TSB의 판매 가격 등을 종합하여 고려하여 볼 때, TSB는 BHIB 또는 LB 배양 배지에 비해 가격이 저렴하기 때문에 TSB에서 균주를 배양하는 것이 가장 바람직하다.

한편, HN 균주를 sTSB에 킬레이트제인 2,2’-디피리딜(Dipyridyl)(Sigma, USA)을 농도를 달리 첨가하여 25℃에서 배양하였다. 이렇게 배양된 HN 균주의 외막 단백질의 전기영동과 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 도 8의 (a)는 전기영동 수행 결과이고, 도 8의 (b)는 HN 균주의 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다. 상기 단백질 전기영동 및 웨스턴 블랏팅 실험은 실시예 3의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 도 8을 통해, sTSB 배지에 킬레이트제인 2,2’-디피리딜이 포함되어 있을 때에도 항원 단백질의 발현이 증가하였음을 알 수 있다.

그리고 도 9는 2, 2’-디피리딜이 첨가된 TSB 배지에서 2, 2’-디피리딜 농도에 따른 HN 균주 배양액의 흡광도 값을 나타낸 그래프이다. 도 9를 통해, 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB에서 배양된 HN 균주는 2,2’-디피리딜이 첨가되지 않은 sTSB에서 배양된 HN 균주와 유사한 성장을 보이고 있음을 알 수 있다.

그리고 배양 초기에 50 μ㏖과 200 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB 배지에서 항원 단백질의 발현이 증가하였음을 알 수 있다. 아울러 200 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB 배지에서 배양된 HN 균주의 흡광도 값은 sTSB에서 자란 HN 균주의 흡광도 값 보다 약 50% 정도 수치가 작은 것으로 보아, 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB에서 HN 균주를 배양하는 것이 최적의 배양 조건임을 알 수 있다.

한편, HN 균주를 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB배지에서 배양 시간을 달리하여(24, 48 및 72 시간) 배양하였다. 도 10의 (a)는 배양 시간을 달리하여 배양된 HN 균주의 외막 단백질의 전기영동 수행한 결과를 나타낸 것이고, 도 10의 (b)는 배양 시간을 달리하여 배양된 HN 균주의 외막 단백질의 웨스턴 블랏팅 결과이다. 상기 단백질 전기영동 및 웨스턴 블랏팅 실험은 실시예 3의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

도 10을 통해, 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB에서, HN 균주를 48 시간 배양하였을 때에 24 시간 또는 72 시간 배양하였을 때 보다 면역단백질의 종류 및 양이 증가하였음을 알 수 있다. 따라서 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB 배지에서 HN 균주를 48 시간 배양하는 것이 바림직하다.

실시예 6: 백신 균주의 주요 항원 단백질 특성 분석

HN 균주를 넙치의 생체 내 배양하였을 때, 일반 배양 배지에서 배양하는 경우보다 많은 양의 50 kDa 이상의 외막 단백질이 발현되었다. HN 균주의 전기영동(SDS-PAGE)을 실시한 후, 50 kDa 이상의 외막 단백질을 폴리아크릴아마이드 겔(gel)에서 분리하였다. 분리된 50 kDa 이상의 외막 단백질을 FIA(Freud's incomplement adjuvant)와 1:1로 혼합하여, 투여량이 어체중 1 kg에 5 ㎍이 되도록 넙치에 복강 주사하였다(시험구). 그리고 3주 후에 비브리오 하베이를 인위적으로 감염시켜 넙치의 폐사를 관찰하였다. 비브리오 하베이에 감염되었으나 상기 외막 단백질을 투여하지 않은 넙치를 대조구로 이용하였다.

2주 후에 최종적으로 넙치의 폐사율을 계산한 결과, 대조구가 66.7% 폐사율을 보인 반면에, 시험구는 100% 생존율을 보여 HN 균주에 대한 높은 면역원성을 나타냈다. 이는 도 11을 통해 확인할 수 있다.

실시예 7: 불활성화 백신의 제조 및 접종

동결 보존된 HN 균주를 sTSA에서 25℃ 온도로 24 시간 배양하였다. 배양된 평판배지의 집락을 무균적으로 50 μ㏖의 2,2’-디피리딜이 첨가된 sTSB 배지(이하 sTSB50)에 접종 후, 쉐이킹 인큐베이터(JS Research Inc., Korea)에서 150 rpm, 25℃ 온도로 48 시간 동안 배양하였다. 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린(Merck, Germany)을 각 배양액의 0.3%(v/v)가 되도록 첨가하여 쉐이킹 인큐베이터에서 150 rpm, 25℃로 1 시간, 4℃에서 23 시간 동안 쉐이킹하여 불활화 하였다. 그리고 배양균의 불활화 여부를 sTSA에서 최종 확인하였다. 불활화가 확인된 균액은 12,163 RCF로 원심분리 후 균체를 수거하고, 최종적으로 습균체 무게를 측정하여 100 mg/ml이 되도록 멸균 생리 식염수로 희석하여 멸균된 유리병에 분주하고, 4℃에 보관 후 실험에 사용하였다. 비브리오 하베이 감염증에 대한 백신은 “VH 백신”이라 약칭하였다.

시험어는 양식 넙치를 사용하였다. 실험어의 무게를 측정하여 어체중 1 kg당 시험 백신의 투여량을 달리하였다. 표 2는 백신의 투여량을 정리한 것이다.

아울러 넙치에 대한 백신 접종은 복강주사법을 통해 수행되었다. 복강 주사의 경우, 시험 백신을 어체당 0.1 ml씩 복강 주사하였으며 대조구는 멸균 생리 식염수를 0.1 ml씩 복강 주사하였다.

[표 2] 백신의 투여량

실시예 8: 불활성화 백신의 면역원성 시험

8-1: 응집항체가 조사

실시예 7에 따른 백신 접종 후 3주 후, 시험어의 미부정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하였으며 응집 항체가는 마이크로타이터(microtiter)법으로 조사하였다. 즉 넙치로부터 분리한 혈청을 96 웰 마이크로플레이트(Corning, USA)에서 멸균 생리 식염수로 단계 희석한 후, 24 시간 경과 후 응집괴 형성 유무를 관찰하였다. 백신 처리 3주 후의 시험구에 대한 항체가를 계산한 결과, 20 mg/kg b.w.의 농도구에서는 2^4.0의 항체가를, 10 mg/kg b.w.의 농도구에서는 2^3.8의 항체가를 나타냈다.

8-2: 방어력 조사

시험 백신이 방어력에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 백신 접종 3주 후 HN균주의 수를 6.7× 10⁷ cfu/ml로 조정한 후, 0.1 ml씩 넙치에 복강주사법으로 인위 감염시키고 2 주간 넙치의 누적폐사율을 조사하였다. 상대생존율은 아래와 같이 계산하여, 그 값을 표 3에 정리하여 나타냈다.

상대생존율(%)={1-(시험구의 누적폐사율/대조구의 누적폐사율)} × 100

표 3에서 알 수 있는 바와 같이, HN 균주에 대한 방어력 조사 결과, 백신 주사 후 모든 백신 접종구에서 63.6% 이상의 상대 생존율을 나타내었다. 백신 접종량을 고려하였을 때 10 mg/kg b.w.의 농도구가 우수한 것으로 판단된다.

도 12는 10 ㎎/kg b.w. 또는 20 ㎎/kg b.w. 농도의 HN 항원이 포함된 백신을 넙치에 복강 주사 투여한 후, 넙치의 누적 폐사율 나타낸 그래프로서, 이를 통해 10 ㎎/kg b.w. 농도의 HN 항원이 포함된 백신을 접종한 넙치의 폐사율이 현저하게 낮음을 알 수 있다. 따라서 비브리오 하베이 감염증을 예방하기 위해서는, 10 mg/kg b.w. 농도의 HN 항원을 포함하는 백신을 넙치에 투여하는 것이 바람직하다.

[표 3] 백신의 항원 농도에 따른 방어력

실시예 9 : 배양배지별 제작 백신의 효과

실시예 5의 세균 배양배지별로 제작된 백신을 FIA(Freuds' incomplement adjuvant)와 1:1의 비율로 혼합하고 어체중 1 kg에 20 mg이 되도록 실시예 7과 같이 넙치에 0.1 ml씩 복강 주사하였다(시험구). 대조구는 멸균 생리 식염수와 FIA를 1:1로 혼합하고 동량씩 넙치에 복강 주사 수행하였다. 백신 처리 3주 후, HN 항원에 대한 넙치의 응집 항체가를 측정한 결과, sBHIB에서 배양된 항원이 투여된 시험구(sBHIB+FIA)에서 2^8.7, sTSB50에서 배양된 항원이 투여된 시험구(sTSB50+FIA)에서 2^7.1, sTSB에서 배양된 항원이 투여된 시험구(sTSA+FIA)에서 2^7. ¹를 나타냈다. 표 4는 백신 복강주사를 위한 균액 농도를 정리하여 나타낸 것이다.

표 5는 배양 배지종류를 달리하여 배양된 HN 항원이 포함된 백신의 NH 균주에 대한 방어력을 나타낸 것이다. 표 5를 통해, sBHIB+FIA 또는 sTSB50+FIA 배지에서 배양된 HN 항원이 포함된 백신이 sTSA+FIA에서 배양된 HN 항원이 포함된 백신 보다 HN 균주에 대한 방어력이 높았음을 알 수 있다. 따라서 백신 효과와 경제성을 고려시, sTSB50 배지를 사용하여 산업화하는 것이 적절할 것으로 판단된다.

[표 4] 넙치의 백신 복강주사를 위한 균액 농도

[표 5] 비브리오 하베이 HN 균주에 대한 방어력

실시예 10 : 백신 첨가물에 의한 효과

스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis , FP2284(KCTC 11633BP)의 포르말린 불활화 항원(formalin killed cell; 이하 FKC)과 실시예 7에서 제작된 시험 백신을 1:1로 혼합하여, 어체중 1 kg당 투여량을 달리하여(VH 10 mg+ SP 10 mg/kg b.w., VH 20 mg+SP 20 mg/kg b.w.) 넙치에 투여하였다(시험구). 대조구는 실시예 7의 시험 백신을 혼합하지 않고, 스트렙토코카스 파라우베리스의 포르말린 불활화 항원만을 어체중 1 kg당 20 mg을 넙치에 투여한 것을 이용하였다.

상기 불활성화 HN 균주와 불활성화 SP 균주를 혼합한 불활성화 백신의 투여량을 정리하여 표 6에 나타냈다. 백신 처리 3주 후, 시험구의 응집 항체가를 계산한 결과, 응집항체가는 VH 20 mg+ SP 20 mg/kg b.w.를 투여한 시험구에서 2^5. ⁷를, VH 10 mg+ SP 10 mg/kg b.w. 투여한 시험구에서 2^5. ⁷를 나타냈다. 따라서 불활성화 HN 균주와 불활성화 SP 균주를 1:1로 혼합하는 것이 바람직하다.

하기 표 7은 백신 투여량에 따른 넙치의 HN 균주에 대한 방어력를 나타낸 것으로, VH 10 mg+ SP 10 mg/kg b.w. 투여한 시험구에서 높은 방어력을 나타냄을 확인할 수 있다. 그리고 VH 20 mg+ SP 20 mg/kg b.w. 투여한 시험구와 VH 10 mg+ SP 10 mg/kg b.w. 투여한 시험구의 HN 균주에 대한 상대 생존율이 모두 88.2% 이상으로, HN 항원을 포함하는 백신에 불화성화된 스트렙토코카스 파라우베리스 균주를 혼합 투여시 백신 효능을 높일 수 있음을 알 수 있다.

[표 6] 백신 투여량(VH: Vibrio harveyi HN, SP: Streptococcus parauberis)

[표 7] 비브리오 하베이 HN 균주에 대한 방어력

실시예 11: 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신 투여에 따른 안전성 조사

본 발명에 따른 백신 처리의 안전성 조사를 위하여, 실시예 7의 백신 처리구 중 효과가 높게 나타난 어체중 1 kg당 10 mg을 투여한 시험구와 백신을 접종하지 않은 대조구에 대한 병리조직학적 검사를 실시하였다. 백신 처리 1주일째 시험구의 간장, 신장, 심장 및 아가미 조직을 10%(v/v) 중성 포르말린에 고정 후, 공지된 일반적인 방법에 따라, H&E(hematoxylin-eosin)염색을 실시한 후 현미경으로 검경하였다. 도 13에 나타난 것과 같이, 백신 처리구의 모든 장기에서 정상적인 조직 소견이 관찰되어 백신의 독성이 없음을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC11705BP

20100528

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불활성화된 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN(미생물 기탁번호 KCTC 11705BP) 균주를 항원으로 포함하는, 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신.
제 2항에 있어서, 상기 백신은 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신.
제 3항에 있어서, 상기 백신은 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)와 불활성화된 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN (미생물 기탁번호 KCTC 11705BP) 균주가 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신.
비브리오 하베이 감염증에 걸린 넙치로부터 분리된 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN (미생물 기탁번호 KCTC 11705BP) 균주를 2,2’-디피리딜이 50 내지 200 μ㏖의 농도로 첨가된 TSB, BHIB 또는 LB 배지에서 12 내지 72 시간 동안 배양하고 불활성화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신의 제조방법.
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제 5항에 있어서, 상기 불활성화시키는 단계 이후, 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주를 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 불활성화된 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주를 불활성화된 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) HN (미생물 기탁번호 KCTC 11705BP) 균주와 1:1 내지 1:3으로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 하베이 감염증 예방용 불활성화 백신의 제조방법.
제 2항의 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는, 어류를 면역시키는 방법.