KR102196572B1

KR102196572B1 - 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 어류용 백신 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102196572B1
Application number: KR1020190125036A
Authority: KR
Inventors: 김광일; 정승희; 최혜승; 조미영; 김명석; 한현자; 민은영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2020-12-29

Abstract

본 발명은 불활화된 병원성 균체가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 어류용 경구 백신 조성물, 이의 제조방법 및 상기 어류용 경구 백신 조성물을 어류에 투여하는 것을 특징으로 하는 어류의 병원성 세균 감염에 대한 예방 또는 치료방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 경구 투여용 백신 조성물을 이용하면 손쉽게 백신을 어류에 투여할 수 있으며, 이를 통해 어류의 연쇄구균병을 효율적으로 예방하는데 기여할 수 있다.

Description

알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 어류용 백신 조성물 및 이의 제조방법{Composition for Fish Vaccine Containing Alginate Capsule and Preparing Method Thereof}

본 발명은 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 어류용 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 불활화된 병원성 균체가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 어류용 경구 백신 조성물, 이의 제조방법 및 상기 어류용 경구 백신 조성물을 어류에 투여하는 것을 특징으로 하는 어류의 병원성 세균 감염에 대한 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

2018년 한국 내 어류 양식 생산량은 80,485톤이며, 이 중 넙치의 생산량은 37,267톤으로 해산 어류 중 가장 높은 양식 생산량(전체 생산량의 46.3%)을 보이고 있다(어업생산통계, 통계청, 2018). 수산생물의 질병은 세균성, 기생충성 및 바이러스성 질병으로 분류할 수 있으며, 세균성 질병 중 연쇄구균병(Streptococcosis)은 전 세계적으로 넙치, 방어 등 해산어류뿐만 아니라 뱀장어, 틸라피아 등 담수어류에서도 감염으로 인한 피해를 유발하고 있다. 국내 양식 넙치의 경우 생산량의 약 30%(1만톤 이상)가 질병으로 인한 피해가 발생하고 있으며, 원인별로는 기생충성 질병인 스쿠티카병(44.5%), 여윔증(12%), 바이러스성 질병인 바이러스성 출혈성패혈증(10.6%), 세균성 질병인 연쇄구균병(9.8%)이 보고되고 있다(양식장 폐사현황 및 폐사체 처리방안연구, 2014~2016, 국립수산과학원). 특히, 넙치에서 폐사를 유발할 수 있는 대표적인 세균성 질병이 연쇄구균이며, 주 원인체로 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)가 알려져 있다.

어류의 연쇄구균병을 예방하기 위해서 균체 불활화 백신, 재조합 단백질 백신, 약독화 백신 등 다양한 연구가 진행되고 있으나, 현재 국내에서는 불활화 백신만 상용화되어 있다. 국내에서 상용화된 수산용 백신은 주사제 백신으로 백신 투여 전 대상 수산물을 절식시키고, 투여 과정 중 어류에 스트레스를 유발하거나 투여 후 부작용 발생 가능성, 치어에 투여하기 어려움 등의 문제점이 있다. 따라서 이러한 단점을 극복하고 양식장 내 대량의 어류에 효과적으로 백신을 투여하기 위해서는 효과적인 경구백신의 개발이 필요하다.

경구백신은 투여 단계에서 주사바늘을 사용하지 않기 때문에 통증이나 거부감이 없고 쉽게 투여할 수 있는 잇점을 가지고 있다. 또한, 주사제 백신과 비교하여 항원 특이적인 IgA를 생산하는 점막 면역 반응(mucosal immune response) 뿐만 아니라 IgG가 관여하는 전신 면역반응까지 동시에 유발할 수 있는 장점을 가지고 있다(Mutoloki et al., Frontiers in immunology, 6:519, 2015). 경구백신 기술에 있어서 가장 중요한 점은 항원을 캡슐화하는 과정과 이를 이용하여 백신 사료를 제조하는 방법이다. 캡슐화 형태는 어류의 특성, 항원의 형태를 고려하여 Microalgae, Microparticle, Nanoparticle, biofilm 등으로 나눌 수 있으며, 백신 사료는 사료 분말, spray형, 혼합형 등으로 구분할 수 있다(Masoomi Dezfooli et al., Reviews in Aquaculture, 11, 631-660, 2017). 현재까지 다양한 경구백신이 실험실 수준에서 효과를 보이고 있으나 생산 단가 문제, 안정성 및 효율성 등 문제로 상용화 단계에서 어려움을 겪고 있는 실정이다. 따라서 생산과정이 복잡하지 않고, 항원을 안정적으로 체내에 전달이 가능하며, 질병에 방어효능을 보일 수 있는 경구백신의 기술개발이 시급하다.

이에, 본 발명자들은 이러한 문제점들을 극복하고, 스트렙토코커스 파라우베리스 항원이 안정적으로 어류 체내에 전달되어 연쇄구균병 예방 효과를 나타낼 수 있는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, 갈조류 추출 성분인 알긴산나트륨으로 항원을 캡슐화하고 사료와 혼합하여 어류에 경구투여 하는 경우, 연쇄구균병에 대한 방어효능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 불활성화된 병원성 균체가 포집된 어류용 경구 백신의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 어류용 경구 백신 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 어류용 경구 백신 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 병원성 세균 감염에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 알긴산나트륨과 계면활성제가 포함된 오일 용액에 불활성화된 균체를 추가하여 유화시켜 유화 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 유화 용액에 염화칼슘 수화물, 에탄올 및 아세트산을 포함하는 용액을 첨가하여 겔화시키는 단계; (c) 상기 겔화된 용액에 염화칼슘 용액을 첨가하여 고형화하여 불활성화된 균체가 포집된 캡슐을 생성시키는 단계; 및 (d) 고형화된 캡슐을 수득하고, 상기 캡슐을 아세트산나트륨과 겔잔이 포함된 용액을 처리하여 어류용 경구백신을 수득하는 단계를 포함하는 불활성화된 병원성 균체가 포집된 어류용 경구 백신의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 병원성 균체가 포집된 알긴산나트륨 캡슐과 겔잔을 포함하는 어류용 경구 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 어류용 경구 백신 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 병원성 세균 감염에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 경구 투여용 백신 조성물을 이용하면 손쉽게 백신을 어류에 투여할 수 있으며, 이를 통해 어류의 연쇄구균병을 효율적으로 예방하는데 기여할 수 있다.

도 1은 포르말린으로 불활성화된 균체(FKC, formline kiled cell)를 알긴산나트륨을 이용하여 캡슐화하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 경구 백신 조성물을 역상현미경에서 50배로 확인한 것이다.
도 3은 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 경구 백신 조성물의 pH 별 항원 방출 수준 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 경구 백신 조성물의 고형(좌), 액상형(우)별로 온도에 대한 안정성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 경구 백신 조성물과 상업용 사료를 혼합에 필요한 중합체(polymer) 조건을 분석하고자(도 5a) 겔잔(gelzan)의 농도 및 pH 별로 항원의 방출 수준, (도 5b) 겔잔의 농도 및 온도별 안정성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 경구 백신 조성물, 상업용 사료 및 겔잔을 혼합한 경구백신 사료를 넙치에 투여하여 백신 효능을 조사하는 과정을 도식화 한 것이다.
도 7은 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 경구 백신 조성물, 상업용 사료 및 겔잔을 혼합한 경구백신 사료를 넙치에 투여 후 1주, 3주 경과한 시점에서(도 6a) 장 점막 내 항체가, (도 6b) 혈청 내 항체가를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC가 포집된 알긴산나트륨 캡슐을 포함하는 경구 백신 조성물, 상업용 사료 및 겔잔을 혼합한 경구백신 사료를 넙치에 투여 후 3주 경과한 시점에서 넙치 연쇄구균 인위 감염 후 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 병원성 세균 항원을 안정적으로 어류의 체내로 전달하여 어류의 병원성 세균 감염을 효율적으로 예방할 수 있는 경구 투여용 백신 조성물을 제조하는 방법을 개발하고자 하였다. 이에, 갈조류 추출성분으로, 점성을 가지고, 식품첨가물로써 식품의 점착성 및 점도를 증가시키는 데 이용되고 있는 알긴산나트륨을 이용하여 캡슐을 제조하고자 하였으며, 알긴산나트륨이 금속이온과 결합 시 겔화되는 반응을 이용하여, 불활성된 균체(FKC)가 포집된 캡슐 및 이를 포함하는 경구 백신용 조성물을 제조하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 알긴산나트륨과 계면활성제가 포함된 오일 용액에 불활성화된 균체를 추가하여 유화시켜 유화 용액을 수득하는 단계;

(b) 상기 유화 용액에 염화칼슘 수화물, 에탄올 및 아세트산을 포함하는 용액을 첨가하여 겔화시키는 단계;

(c) 상기 겔화된 용액에 염화칼슘 용액을 첨가하여 고형화하여 불활성화된 균체가 포집된 캡슐을 생성시키는 단계; 및

(d) 고형화된 캡슐을 수득하고, 상기 캡슐을 아세트산나트륨과 겔잔이 포함된 용액을 처리하여 어류용 경구백신을 수득하는 단계를 포함하는 불활성화된 병원성 균체가 포집된 어류용 경구 백신의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 불활성화 균체(항원)는 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 당해 기술분야에 알려진 불활성화제를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 포르말린 처리에 의해 불활성화시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 알긴산나트륨은 갈조류(brown algae)에서 추출된 저점도(low viscosity) 등급(Sigma-Aldrich, cat. no. A1112, 4~12 cps) 및 1~10%(v/v)의 농도 조건에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 2~5%(v/v)의 농도조건에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 염화칼슘 수화물:에탄올:아세트산의 중량비는 0.1~10:5~50:1인 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는 1~3:10~20:1 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 고형화된 캡슐을 수득하는 단계는 예를 들면, 멤브레인 여과막으로(2 ㎛ pore)로 진공 필터하여 불활성화된 균체가 포함된 캡슐을 수득할 수 있으며, 그외 공지의 방법을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 용액은 pH 2~5의 조건인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 pH 4인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 용액의 겔잔은 0.01~0.5%(v/v) 농도인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용한 겔잔은 겔잔 검(Gellan Gum)의 일종으로 수용성이며, 용액을 겔화시킬 수 있는 생체고분자(biopolymer)로 한천(Agar) 대체제로 알려져 있으며, 미생물 분석 또는 세포 배양 등에 활용되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 병원성 균체는 연쇄구균인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 연쇄구균은 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), S difficile (스트렙토코커스 디피실), L piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 제조되고, 병원성 균체가 포집된 알긴산나트륨 캡슐과 겔잔을 포함하는 어류용 경구 백신 조성물에 관한 것이다.

어류에서 경구 백신의 효율성을 높이기 위해서는 캡슐화된 항원이 체내로 안정적으로 전달되는 기술이 중요하다. 어류의 위(stomach)의 pH는 2~4이고, 장관(intestine)의 pH는 6 이상으로 알려져 있기 때문에 위에서는 캡슐 내 항원을 보존하고 장에서는 캡슐이 분해되어 항원을 전달하는 것이 무엇보다 중요하다. 본 발명에서는 포르말린으로 불활성화된 스트렙토코커스 균체가 포함되는 알긴산나트륨 캡슐을 아세트산나트륨 용액(0.05M, pH4)으로 용해하여 역상현미경으로 관찰한 결과, 30~100um 크기의 캡슐 내 항원이 포집된 것을 확인하였다(도 2). 또한, 상기의 아세트산나트륨 용액으로 용해된 캡슐을 pH 2, pH 4, pH6 및 pH 8 조건에서 단백질 방출량을 측정한 결과 pH 6이상에서 유의적으로 항원이 방출되는 것으로 나타났다. 이를 통해 넙치의 위장관(pH 2~4)에서는 캡슐이 분해되지 않고 장관 내(pH 6~8)에서 캡슐이 분해되면서 항원이 방출되어 체내에 전달될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 3).

본 발명에 있어서, 경구 백신용 조성물인 상기의 불활성화된 균체를 포함하는 알긴산나트륨 캡슐을 0.05M 아세트산나트륨 용액(pH4)로 용해하는 것이 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발병에서는 상기의 경구 백신용 조성물의 안정성을 확인하고자 형태(고형, 액형) 및 온도별(4, 25, 35, 45℃) 단백질 방출량을 측정한 결과 고형 상태에서는 안정적으로 캡슐 형태가 유지되었으며, 35℃이상에서 캡슐이 분해되면서 항원이 유의적으로 방출됨을 확인할 수 있었다(도 4).

상기 경구 백신용 조성물인 캡슐을 넙치 체내로 효율적으로 전달하기 위해서 경구 백신용 조성물과 상업용 사료를 쉽게 혼합시킬 수 있는 중합체(polymer) 소재를 발굴하였다. 저농도 겔잔(gelzan)이 포함된 경구 백신용 조성물을 pH별(pH 2, 4, 6, 8) 및 온도별(4℃, 20℃, 37℃)로 안정성을 분석하였다. 전체 경구 백신용 조성물 용액량의 0.2% 저농도 겔잔이 포함될 경우 pH 2~4에서는 캡슐 형태가 안정적으로 유지되어 항원이 보존되었으며, pH6이상에서는 항원이 방출되고, 37℃이상일 경우 캡슐이 분해되어 항원이 유의적으로 방출되는 것으로 나타났다(도 5).

따라서, 본 발명의 알긴산나트륨으로 구성되고 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스가 균체가 포함된 캡슐은 넙치의 위장관(pH 2~4)에서는 캡슐이 분해되지 않고 장관 내(pH 6~8)에서 캡슐이 분해되면서 항원이 방출되어 체내에 전달될 수 있다.

본 발명에 있어서, 경구용 백신 조성물 전체 용량의 0.2%(v/v) 겔잔과 상업용 사료를 혼합하여 경구백신 사료를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 어류는 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 돔류, 볼락류 등의 해산어류 및 잉어류, 연어과어류 및 메기류로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, 상기 어류용 경구 백신 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 병원성 세균 감염에 대한 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서의 상기의 경구 백신용 조성물과 상업용 사료가 혼합된 경구백신용 사료를 넙치에 투여(어체 중 당 5% 사료 무게, 1일 투여 시 FKC 0.5mg/fish 농도; 도 6) 후 3주가 경과된 시점에서 혈청 내 항체가가 유의적으로 증가(약 3.5배)하고 장점막 내 항체가가 약 1.4배 증가하는 것으로 나타나 경구 백신용 조성물이 넙치의 전신 면역과 장점막 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 7).

또한, 상기의 경구백신용 사료를 넙치에 투여(FKC 0.5mg/fish/일, 2회/주, 격주 간격으로 투여) 3주 후 스트렙토코커스 파라우베리스를 인위 감염하여 상대생존율을 산출한 결과, 대조구(생리식염수)에 비해 50%의 상대생존율을 보이는 것으로 확인되어 연쇄구균병 방어효능을 확인할 수 있었다(도 8).

본 발명에 있어서, 상기 경구 백신 조성물로 넙치에 투여 시 항원 농도는 0.5mg/fish/일로 매주 2회로 격주 간격으로 2일간 투여하여 연쇄구균병을 예방할수 있는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 제공하는 알긴산나트륨으로 구성된 연쇄구균 균체를 포함하는 캡슐은 경구 백신용 조성물로써 활용이 가능하며, 이를 이용하여 상업용 사료와 혼합하여 어류에 투여할 경우 연쇄구균병 예방 또는 치료가 가능하다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 저점도 알긴산나트륨을 이용한 경구 백신용 캡슐의 제조
실시예 1-1: 포르말린으로 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스 균체 준비
동결 보존된 스트렙토코커스 파라우베리스(혈청형 Ia type, 연쇄구균에서 감염된 넙치에서 분리, FPa4365 균주로 기탁번호는 KCTC 13802BP)을 1.5%(v/v) NaCl이 첨가된 BHIA 배지에서 25℃에서 24시간 배양 후, 배양된 평판배지의 집락을 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB에 접종 후 교반 배양기에서 150rpm, 30℃, 24시간 배양하였다. 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린을 배양액의 0.5%(v/v)가 되도록 첨가하여 교반 배양기에서 150 rpm, 20℃, 24시간 불활성화하였다. 배양균의 불활성화 여부는 BHIA에 배양 시험을 통해 최종적으로 확인하였다. 포르말린으로 불활성화시킨 배양액은 8,000rpm, 20분간 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하고 펠릿을 수득하여 사용하였다.
실시예 1-2: 저점도 알긴산나트륨을 이용한 캡슐 제조
3.5%(v/v) 저점도 알긴산나트륨 용액(Low viscosity, Sigma-Aldrich, cat. no.A1112) 10mL, 1%(v/v) Span 80이 첨가된 Corn oil 60mL 및 실시예 1-1에서 불활성화시킨 스트렙토코커스 파라우베리스 균체(FKC) 1,000mg을 첨가한 뒤 교반기(stirrer)로 1,000rpm 속도로 10분간 혼합하여 알긴산나트륨을 유화하면서 항원을 포집하였다. 유화된 용액에 염화칼슘 수화물(calcium chloride dihyrate), 에탄올(ethanol), 아세트산(acetic acid)이 2:15:1 비율로 혼합된 용액 70mL을 첨가한 뒤 교반기로 1,000rpm 속도로 10분간 혼합하여 알긴산나트륨을 겔화(gelification)하였다. 겔화된 용액에 0.05M 염화칼슘 용액(pH 4)을 150mL 첨가한 뒤 교반기로 200~300rpm 속도로 5분간 혼합하여 알긴산나트륨을 캡슐로 고형화(sodification)하였다. 고형화된 캡슐을 멤브레인 여과막(2㎛ pore)으로 진공 하에서 필터하고 에탄올로 세척하여 캡슐을 수득하였다(도 1). 수득한 캡슐 내 항원 포집율은 아래의 식을 이용하여 산출하였다. 캡슐은 밀봉하여 4℃에서 보존하면서 경구 백신 조성물로 이용하였다.
항원 포집율 = [(FKC가 첨가된 캡슐 무게 - FKC가 첨가되지 않은 캡슐 무게)/FKC 무게] x 100

상기의 수득한 캡슐 내 항원량은 아래의 산식을 이용하여 산출한다.
캡슐 내 항원량 = (FKC가 첨가된 캡슐 무게 - FKC가 첨가되지 않은 캡슐 무게)x 항원 포집율
수득한 캡슐을 0.05M 아세트산나트륨 용액(pH 4)에 10mg/mL로 용해한 뒤 역광현미경으로 50배 및 200배 비율에서 관찰한 결과, 캡슐은 구형 형태이며 직경이 30~100㎛ 크기로 캡슐 내 항원이 포집된 것을 확인하였다(도 2). 상기 수득한 캡슐은 밀봉하여 4℃에서 고형형태로 보존하면서 경구 백신 조성물로 이용하였다.
실시예 2: 알긴산나트륨 캡슐의 pH 및 온도별 안정성 조사
실시예 1에서 제조한 불활성화된 균체가 포집된 캡슐의 pH 별 안정성을 조사하고자, 0.05M 아세트산나트륨 용액을 1N HCl 또는 1N NaOH 용액으로 pH 2, pH 4, pH 6, pH 8로 조절한 후 캡슐 50mg/mL 농도로 제조하였다. 제조된 용액을 교반기를 이용하여 25℃에서 300rpm 속도로 18시간 반응 후 캡슐 형태 및 단백질 방출량을 측정하였다. 또한, 제조한 캡슐의 온도별 안정성을 조사하고자, 상기에서 수득한 캡슐(고형, solid form) 및 0.05M 아세트산나트륨 용액(pH 4)에 캡슐 50mg/mL 농도로 용해한 액형 캡슐(liquid form)을 각각 Eppendorf heat block을 사용하여 4℃, 25℃, 35℃ 및 45℃ 온도 조건하에서 18시간 반응 후 캡슐 형태 및 단백질 방출량을 측정하였다. 단백질 방출량은 상용화된 BSA 키트를 사용하여 측정한 후, 결과 값은 two-way ANOVA test로 통계 분석하였다.
상기의 pH 별 캡슐의 안정성을 확인한 결과, pH 2~4에서는 캡슐의 형태가 구형으로 안정적이며 항원이 방출되지 않았으나, pH 6이상에서는 캡슐이 분해되면서 항원이 유의적으로 방출되는 것으로 나타났다(도 3). 온도별 캡슐 형태 및 항원 방출 수준을 분석한 결과 고형상태의 캡슐은 온도와 상관없이 캡슐 형태를 유지하고 항원을 방출하지 않는 것으로 나타났으나, 액형 상태의 캡슐은 35℃ 이상에서 캡슐이 분해되어 항원이 유의적으로 방출되는 것으로 나타났다(도 4). 이를 통해 상기의 알긴산나트륨으로 구성되고 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스가 균체가 포함된 캡슐은 넙치의 위장관(pH 2~4)에서는 캡슐이 분해되지 않고 장관 내(pH 6~8)에서 캡슐이 분해되면서 항원이 방출되어 체내에 전달될 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 상기의 캡슐을 0.05M 아세트산나트륨 용액(pH 4)로 용해할 경우 경구 백신용 조성물로 활용 가능한 것을 확인하였다.
실시예 3: 중합체(polymer)를 이용한 경구 백신용 사료 제조
실시예 1에서 제작한 캡슐을 넙치 체내로 효율적으로 전달하기 위해서 상용 사료와 쉽게 혼합시킬 수 있는 중합체(polymer) 소재의 조건을 조사하고자 하였다.실시예 1에서 제작한 불활화 균체 함유 캡슐을 젤라틴(gelatine, Sigma-Aldrich, cat no. G7041) 또는 겔잔(gelzan, Sigma-Aldrich, cat no. G1910)이 0.2%, 1% 및 2%(v/v) 농도로 포함된 0.05M 아세트산나트륨 용액(pH 4)에 50mg/mL 농도로 용해하여 캡슐의 형태를 역상현미경으로 관찰하였다. 단, 겔잔(gelzan)의 경우 최종 농도가 0.5% 이상일 경우 겔 형태로 되어 용해되지 않아 0.2%(v/v)만 실험에 사용하였다. 역상현미경으로 알긴산나트륨 캡슐의 형태를 관찰한 결과, 젤라틴이 포함된 아세트산나트륨 용액에 캡슐을 용해할 경우 캡슐이 모두 분해되는 것으로 나타났으나, 겔잔이 포함된 용액에 캡슐을 용해할 경우 캡슐의 형태가 유지되는 것으로 나타났다.
캡슐과 사료를 혼합하는 중합체 소재로써 겔잔의 활용가능성을 보다 상세하게 조사하고자, pH (pH 2, 4, 6, 8) 및 온도별(4℃, 20℃, 37℃)로 겔잔이 포함된 0.05M 아세트산나트륨 용액에 캡슐을 50mg/mL 농도로 용해(이하 경구 백신용 조성물)하여 캡슐의 형태 및 항원 방출량을 조사하였다. 그 결과, 전체 경구 백신용 조성물 용액량의 0.2% 저농도 겔잔이 포함될 경우 pH 2~4에서는 캡슐 형태가 유지되고 항원이 안정적으로 보존되는 것으로 나타났으며, pH 6이상에서는 항원이 유의적으로 방출되는 것으로 나타났다(도 5a). 또한, 37℃이상의 조건에서 경구 백신 조성물의 캡슐이 분해되어 항원이 유의적으로 방출되는 것으로 나타났다(도 5b). 따라서, 경구 백신 조성물 전체 용량의 0.2%(v/v) 겔잔과 상업용 사료를 혼합하여 경구백신 사료를 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: 캡슐 경구백신 사료 투여에 따른 넙치 면역형성능 및 방어효능 분석
실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨 캡슐을 겔잔 2%(v/v)가 포함된 0.05M 아세트산나트륨 용액(pH 4)에 혼합한 경구 백신 조성물과 상업용 사료를 1:4의 무게비가 되도록 교반기로 3~5시간 혼합하여 경구백신 사료를 제조하였다. 보다 상세한 경구백신용 사료 제조법은 아래와 같다. 1일 넙치에 투여되는 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC 0.5mg/fish 농도가 되도록 제조하였으며 2일/주 투여하였고, 2주 후 동일한 농도로 투여한 후 면역형성능 및 방어효능을 분석하였다.

경구 백신 사료 제조 방법

번호	내용	산출식
1	1일 투여에 필요한 경구백신 사료량	실험어류 평균 무게(g) x 마리수 x 5%
2	1일 투여에 필요한 상업용 사료량	1)에서 산출된 무게의 3/4 중량
3	겔잔 2%(v/v)이 포함된 0.05M 아세트산나트륨 용액(mL)	1)에서 산출된 무게의 1/4 중량
4	1일 투여에 필요한 캡슐 중량	(0.5mgx 실험어류 마릿수)+(0.5mg x 실험어 마리수)x(1-항원 포집율)
5	1일 투여에 필요한 경구백신 조성물	3)의 용액에 4)의 캡슐량을 용해한 액
6	최종 경구백신 사료	2)의 상업화 사료와 5)의 경구백신 조성물을 교반기로 혼합하여 제작

예시) 항원 포집율이 85%인 알긴산나트륨 캡슐을 이용하여 넙치 50마리(평균 전중 6.7g)에 경구백신 사료를 투여할 경우,
예 1) 1일 투여에 필요한 경구백신 사료량= 6.7g x 50마리 x 5% = 16.75g
예 2) 1일 투여에 필요한 상업용 사료량 = 예1)의 사료량 16.75g x 3/4 = 12.56g
예 3) 겔잔 2%(v/v)이 포함된 0.05M 아세트산나트륨 용액 = 예1)의 사료량 16.75g x 1/4 = 4.19 mL
예 4) 1일 투여에 필요한 캡슐 중량 = (0.5mg x 50) + (0.5mg x 50)x(1-0.85) = 28.5mg
예5) 1일 투여에 필요한 경구백신 조성물 = 예3)의 용액 4.19mL에 예4)의 캡슐 28.5mg을 용해한 액
예6) 최종 1일 투여에 필요한 경구백신 사료 = 예2)의 상업용 사료 12.56g에 예5)이 경구백신 조성물 액 4.19mL을 혼합
실시예 4-1: ELISA를 이용한 연쇄구균 특이 항체 형성능 분석
상기의 경구백신 사료 투여에 따른 연쇄구균 특이 항체 형성능을 분석하고자, 경구백신 사료를 넙치(평균 전중 6.7g)에 1차 투여(FKC 0.5mg/fish, 2일)하고, 2주후 동일 농도로 2차 투여를 실시하였다. 1차 경구백신 사료 투여 후 1주 및 3주 후 넙치 미부 정맥에서 채혈을 실시하였으며, 장관(instestine) 조직을 무균적으로 채취하였다. 혈액시료는 8,000rpm, 4℃, 10분간 원심분리 후 혈청(serum)을 분리하여 분석에 사용하였으며, 장 조직시료는 100mg/mL이 되도록 생리식염수(PBS)를 첨가하고 bead tube로 마쇄 후 0.2um syringe filter로 여과하여 ELISA 분석법으로 항체가를 분석하였다. ELISA법을 이용한 항체가 조사는 96 웰 플레이트에 스트렙토코커스 파라우베리스 FKC를 10㎍/well의 농도로 분주하고 4℃에서 하룻밤 반응시켜 플레이트 바닥에 항원을 부착하였다. 코팅된 항원을 제거하고 T-PBS로 각 well을 3회 세척 후, 3%(v/v) skim milk 용액을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 blocking 하고 다시 T-PBS로 각 well을 3회 세척한다. 1차 항체로써 상기의 넙치 혈청과 장 점액을 생리식염수로 20배 희석하여 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰다. T-PBS를 이용하여 3회 세척한 뒤 2차 항체로써 Anti-Janpanese flounder IgM Mab를 1000배 희석하여 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. T-PBS로 세척 후, AP-conjugated aniti-mouse IgG(whole molecule)를 2000배 희석하여 첨가 후 25℃에서 1시간 동안 반응시키고, 세척한 다음, 기질(PNPP substrate solution)을 첨가하여 20분 후 405nm에서 흡광도를 확인하였다. 경구백신용 사료를 투여한 넙치의 혈청에서 투여 후 3주가 경과된 시점에서 대조구에 비해 혈청 내 연쇄구균 항체가가 유의적으로 증가(약 3.5배) 증가하고, 장점막 내 항체가 약 1.4배 증가하는 것으로 나타나(도 7), 경구 백신사료가 넙치의 전신 면역과 장점막 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4-2: 넙치 인위감염을 통한 연쇄구균병 방어효능 분석
상기의 경구백신 사료 투여에 따른 연쇄구균 특이 항체 형성능을 분석하고자,
경구백신 사료를 넙치(평균 전중 6.7g)에 1차 투여(FKC 0.5mg/fish, 2일)하고, 2주후 동일 농도로 2차 투여를 실시하였다. 1차 투여 3주 후, 스트렙토코커스 파라우베리스 균체를 이용하여 넙치에 피하주사(subcutaneous injection)로 4x10⁷cfu/fish 농도로 인위감염 시키고 3주간 누적 폐사율을 측정하였다. 상대생존율은 아래와 같은 산식으로 산출하였다.
상대생존율(%) = [1-(시험구의 누적폐사율/대조구의 누적폐사율)] x 100
넙치 인위 감염 시 경구백신 사료를 투여한 실험구의 누적폐사율은 26.7%, 대조구(PBS)의 경우 53.3%의 누적폐사율로 나타났으며, 경구백신 투여구의 상대생존율은 50.0%로 대조구와 유의적인 차이(Log-rank test, P<0.05)를 보였다(도 8). 따라서, 상기의 경구백신 제조 및 투여가 넙치의 연쇄구균병 예방에 효과적임을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상 지식을 가진 자에 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 실시예일 뿐이며, 이에 의한 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 불활성화된 병원성 균체가 포집된 어류용 경구 백신의 제조방법:
(a) 알긴산나트륨과 계면활성제가 포함된 오일 용액에 불활성화된 균체를 추가하여 유화시켜 유화 용액을 수득하는 단계;
(b) 상기 유화 용액에 염화칼슘 수화물, 에탄올 및 아세트산을 포함하는 용액을 첨가하여 겔화시키는 단계;
(c) 상기 겔화된 용액에 염화칼슘 용액을 첨가하여 고형화하여 불활성화된 균체가 포집된 캡슐을 생성시키는 단계; 및
(d) 고형화된 캡슐을 수득하고, 상기 캡슐을 아세트산나트륨과 겔잔이 포함된 용액을 처리하여 어류용 경구백신을 수득하는 단계.
제1항에 있어서, (a) 단계의 알긴산나트륨은 1~10%(v/v)의 농도 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (b) 단계의 염화칼슘 수화물:에탄올:아세트산의 중량비는 0.1~10:5~50:1 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (d) 단계의 용액은 pH 2~5의 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (d) 단계의 용액의 겔잔은 0.01~0.5%(v/v) 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 병원성 균체는 연쇄구균인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 병원성 균체는 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), S difficile (스트렙토코커스 디피실), L piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법으로 제조되고, 병원성 균체가 포집된 알긴산나트륨 캡슐과 겔잔을 포함하는 어류용 경구 백신 조성물.
제8항에 있어서, 상기 병원성 균체는 연쇄구균인 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서, 상기 병원성 균체는 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), S difficile (스트렙토코커스 디피실), L piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 어류용 경구 백신 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 병원성 세균 감염에 대한 예방 또는 치료 방법.
제11항에 있어서, 상기 어류는 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 돔류, 볼락류 등의 해산어류 및 잉어류, 연어과어류 및 메기류로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 병원성 세균은 연쇄구균인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 병원성 세균은 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), S difficile (스트렙토코커스 디피실), L piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 투여는 사료와 함께 혼합하여 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.