KR20160095124A - 생물활성제의 경구 전달을 위한 조성물 - Google Patents

생물활성제의 경구 전달을 위한 조성물 Download PDF

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모티 하렐
스위타 캄발라팔리
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어드밴스드 바이오뉴트리션 코포레이션
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Abstract

수생 종 또는 육생 종에 생물활성제의 경구 투여를 위한 조성물은 각각이 오일 점적에 분산된 생물활성제를 포함하는 입자를 포함하며, 오일 점적은 장용 코팅 폴리머를 포함하는 매트릭스에 분산되며, 입자 각각은 점막접착성 폴리머를 추가로 포함한다. 이러한 조성물을 제조하고 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

생물활성제의 경구 전달을 위한 조성물{COMPOSITION FOR ORAL DELIVERY OF BIOACTIVE AGENTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2013년 12월 6일자 출원된 미국 출원 제61/912,958호의 우선권을 주장한다.
약물 및 백신의 경구 투여는 여러 이점을 제공한다. 투여량은 대다수의 동물에게 음식 또는 물을 통해 최소한의 제약 및 노동으로 투여될 수 있다. 또한, 제약은 동물에게 스트레스를 주어 약물 또는 백신접종이 덜 효과적이게 하고, 전염병의 위험을 증가시킨다. 고기-생산 동물에 있어서, 경구 투여는 이것이 주사 부위 반응을 피한다는 점에서 또 다른 이점이 있다. 깨진 바늘, 주사 부위의 오염, 또는 고반응성 애주번트의 사용은 날고기 및 피부를 손상시키는 농양을 유발할 수 있다. 이들 반응은 도축시 동물의 가치를 감소시킨다. 이는 또한 어류가 어류의 탱크 또는 외해 가두리에서 거두어야 하고 개별적으로 주사해야 하는 어류 백신화 프로그램에서 문제이다. 구강 접종은 빠르고 효율적이며, 후속 부스터 접종을 투여하기 위한 동물들의 다수의 처리에 대한 필요성을 없앤다. 경구 투여 후 부작용 면역 반응 또한 일어날 가능성이 훨씬 낮고, 이에 따라 보다 안전하다.
경구 백신접종(oral vaccination)은 최소의 스트레스 또는 노동으로 어류 양식 시스템(fish aquaculture system)에서 한번에 다수의 어류를 백신접종하거나 처리하는 특히 비용면에서 효과적인 방식이다. 이는 백신의 경구 투여가 급식/음용의 과정 동안 섭취를 통해 수행될 수 있는 경우에 특히 그러하다. 추가로, 경구용 백신은 경구용 백신을 생성하는데 요구되는 소수의 정제 단계로 인해 주사가능 백신 제형보다 더욱 비용 효과적으로 제조될 수 있다. 또한, 구강 백신접종은 보다 적은 부작용, 예를 들어, 스트레스, 또는 그 밖의 주사에 대한 반응의 이점을 제공한다.
약물 및 특히 백신의 경구 투여 이점에도 불구하고, 적합한 백신 전달 시스템의 결여로 인해 기술 개발이 지연되어 왔다. 적합한 전달 시스템의 부재로, 대부분의 경구용 백신이 특히 저-pH 위 조건 하에서 위장(GI)관에서 분해가 일어나고, 이것이 제한된 흡수를 야기하고, 이것이 또한 불충분한 면역 반응을 야기한다.
통상적으로, 면역은 백신의 비경구 투여에 의한 체액의 면역성 유도에 의존한다. 그러나, 비경구 투여에 의해 유도된 항체가 대부분의 감염제의 도입 부위인, 점막 표면에 반드시 도달하는 것은 아니다. 항원의 점막 조직과의 접촉의 결과로서, 장, 폐, 입, 눈, 유선 및 비뇨생식기관, 및 또한 어류의 피부 및 아가미를 포함하는 점막 표면에서 발생하는 점막 면역성은 감염제에 대한 중요한 제1 방어선이다.
약물 또는 백신을 창자-점막 조직에 전달하기 위한 여러 비히클이 개발되었다. 항원의 경구 투여를 위한 조성물을 생성하기 위해 생분해성 폴리머, 예를 들어, 폴리-(DL-락타이드) 및 폴리-(DL-락타이드-코-글리콜라이드)가 사용되었다. 그러나, 이들 폴리머 입자의 생산은 깨지기 쉬운 항원에 손상을 줄 수 있는 용매 사용을 필요로 한다. 또한, 용매의 사용은 이들 조성물 내 약화된 살아있는 유기체, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아의 도입을 방해한다.
적절한 경구 전달 시스템 개발의 또 다른 과제는 식품 또는 사료 등급이고, 생분해성인 화합물 및 애주번트 만을 선택해야 하는 필요성 및 오래 지속되고, 강력한 면역 반응에 대한 필요성을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 각각이 오일 점적에 분산된 생물활성제(bioactive agent)를 포함하는 입자를 포함하고, 오일 점적이 장용 코팅 폴리머를 포함하는 매트릭스에 분산되고, 입자 각각이 점막접착성 폴리머를 추가로 포함하는, 수생 종 또는 육생 종에 생물활성제의 경구 투여를 위한 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 조성물을 동물에 경구 투여하는 단계를 포함하고, 생물활성제가 면역원인, 동물에 생물활성제의 후위 전달(post gastric delivery) 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 조성물을 수생 종 또는 육생 종에 경구 투여하는 단계를 포함하고, 조성물이 백신을 위한 전달 비히클인, 수생 종 또는 육생 종을 백신접종하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 순차적으로,
(a) 분산되거나 용해된 생물활성제를 포함하는 수성 혼합물을 형성시키는 단계;
(b) 오일 중에 단계 (a)의 수성 혼합물을 균질화시켜 오일 중의 수성 혼합물의 에멀젼을 형성시키는 단계;
(c) 장용 코팅 폴리머를 포함하는 수용액 중의 단계 (b)의 생성물의 슬러리를 형성시키는 단계; 및
(d1) 단계 (c)의 슬러리를 장용 코팅 폴리머를 우한 가교제를 함유한 수용액에 분사하거나, 떨어뜨리거나, 주입하여 입자를 형성시키되, 단계 (a)의 수성 혼합물이 점막접착성 폴리머를 추가로 포함하는 단계, 또는 (d2) 단계 (c)의 슬러리로부터 입자를 형성시키되, 단계 (b)가 수성 점막접착성 폴리머 중의 에멀젼의 점적을 형성시키고 점착접착성 폴리머를 가교시켜 중간체 입자를 형성시키는 것을 추가로 포함하는 단계 중 어느 하나를 포함한다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학적 및 기술적 전문용어는 당업자들에 의해 보편적으로 이해되고, 사용되는 의미를 가질 것이다. 또한, 본원에서, 그리고 청구범위에서 사용되는 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 동일한 의미를 가지며, 하나, 두개, 세개 또는 그 초과를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 조성물에서 성분들의 백분율 또는 부는 중량 기준이다. 용어 "분산된"은 현탁된 및/또는 용해된을 의미한다.
"경구 백신접종"은 병원체에 대한 특이적 면역 반응을 일으키기 위한 동물의 전신 면역계를 자극하는 면역원성 물질의 식이를 통한 경구 투여로서 정의된다.
"가교" 및 이의 변이형은 하나 이상의 공유 및/또는 비공유 (예를 들어, 이온) 결합을 통해 본원에서 기술되는 것들 중 어느 하나를 포함하는, 둘 이상의 재료 및/또는 물질의 연결을 나타낸다. 가교는 자연적으로 (예를 들어, 시스틴 잔기의 디설파이드 결합) 또는 합성 또는 반합성 경로를 통해 수행될 수 있다. 하전된 폴리머의 가교는 반대 전하의 다가 상대이온과의 이온 결합에 의해 수행될 수 있다. 견고한 고체 구조체, 예를 들어, 하이드로겔은 이러한 가교에 의해 제조될 수 있다.
"위 보호"는 위 파괴 또는 활성 손실로부터 생물활성제 보호를 나타낸다.
본 발명의 조성물은 생물활성제 및 점막접착성 폴리머를 포함하는 미립 물질을 포함하며, 생물활성제는 오일 중에 분산된다. 오일 점적은 이어서 장용 코팅 폴리머의 외부 매트릭스 내에 임베딩되거나, 그에 의해 코팅된다. 외부 매트릭스는 오일 점적을 감싸고, 동물의 위내 낮은 pH 조건으로의 노출로부터 내용물을 보호하는데, 그 이유는 폴리머가 낮은 pH에서 불용성을 유지하고, 보호 코팅 또는 층으로서 손상되지 않은 채로 남아 있기 때문이다. 입자는 전형적으로 10 내지 5000 ㎛ 범위의 평균 기하학적 크기(때로는 직경으로서 언급됨)을 가지며, 밀링(milling), 그라인딩(grinding), 또는 그 밖의 수단에 의해 그러한 크기 범위로 직접 형성되거나, 또는 그러한 크기로 감소될 수 있다. 일반적으로, 입자는 100 ㎛ 미만, 바람직하게는 50 ㎛ 미만의 직경을 갖는다.
일부 구체예에서, 점막접착성 폴리머 및 생물활성제는 함께 혼합되고 상호 접촉으로 입자 내에서 함께 결합되고, 이어서 오일 점적으로 분산된다. 이들 입자 중 하나 이상은 단일 오일 점적 내에 존재하고, 하나 이상의 오일 점적들이 외부 매트릭스 내에 존재한다. 점막접착성 폴리머 및/또는 장용 코팅 폴리머는 가교되거나 가교되지 않을 수 있다.
다른 구체예에서, 생물활성제가 오일 점적 내에 상기와 같이 분산되고, 이후 이들이 점막접착성 폴리머에 임베딩된다. 형성되는 입자는 이어서 장용 코팅 폴리머의 외부 매트릭스 내에 임베딩된다. 점막접착성 폴리머 및/또는 장용 코팅 폴리머는 가교되거나 가교되지 않을 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 특정 질병에 대해 수생 및 육생 종의 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 경구 투여를 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 생물활성제로서 유효량의 항원을 포함한다. 본 조성물은 흡수 및 점막 면역성을 유도하기 위해 동물의 창자 점막과 접촉시키기 위한 생활성 물질을 제공하도록 설계된다. 본 발명에 따른 조성물은 전형적으로 사료 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 물(예를 들어, 동물 음용수), 정제, 캡슐, 볼루스(bolus) 투여형, 펠렛 사료와 함께 또는 조성물을 타깃된(targeted) 종의 창자에 운반하기 위한 식품 첨가제로서 경구적으로 투여된다.
본 발명의 조성물은 생물활성제를 피검체에 전달하는데 있어서 수개의 이점을 제공한다. 첫째, 전달 시스템을 제조하는 방법은 다른 방법에 의해 입자의 제조에 종종 요구되는 유기 용매 또는 고온 및 pH의 사용을 없앤다. 본 발명의 조성물의 제조를 통해 온건한 pH 조건 및 저온의 수성 환경을 유지함으로써, 민감한 생물활성제, 예를 들어, 살아있는 약화된 박테리아 또는 바이러스가 경구적으로 전달될 수 있다. 둘째, 장용 코팅 폴리머의 추가의 층이 위장관에서의 분해에 대해 생물활성제를 보호한다. 면역원의 경우, 이는 보다 소량의 항원/백신으로 동일한 면역 반응을 유도 가능하게 한다. 세째, 오일 분산물이 생물활성제를 둘러 싸서, 단백질, 펩티드, 및 약물과 같은 작은 생활성 분자가 제조 동안 뿐만 아니라 위 노출 동안 수성 환경으로 침출되지 않도록 한다. 또한, 점막접착성 폴리머 자체는 애주번트 효과를 제공한다. 마지막으로, 전달 시스템은 수생 종 및 육생 종 둘 모두에 대한 효율적인 전달을 위해 용이하게 제형화될 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 조성물을 제조하는데 사용되는 모든 성분은 식품 등급이고, 비독성이고, 생물분해성이며, 통상적으로 자연 발생 성분이다. 조성물을 제조하는데 유용한 물질의 설명이 하기 기재된다.
생물활성제( Bioactive agent)
생물활성제는 하나 이상의 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 효과를 직접적 또는 간접적으로 유도할 수 있는 자연 발생, 합성 또는 반합성 물질(예를 들어, 화합물, 발효물, 추출물, 세포 구조)일 수 있다. 생물활성제는, 예를 들어, 기생 유기체를 파괴하거나 질병 또는 이상의 효과를 제한함으로써 살아 있는 신체의 이상 및/또는 병리학적 상태를 예방하고/하거나, 경감시키고/시키거나, 치료하고/하거나, 치유할 수 있다. 효과 및/또는 이의 적용에 따라, 생물활성제는 약학적 작용제(예를 들어, 예방제 또는 치료제), 진단제, 및/또는 미용제일 수 있으며, 이는 백신, 약물, 프로드러그, 친화성 분자, 합성 유기 분자, 호르몬, 항체, 폴리머, 효소, 저분자량 분자의 단백질성 화합물, 펩티드, 비타민, 스테로이드, 스테로이드 유사체, 지질, 핵산, 탄수화물, 이들의 전구체, 및 이들의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 생물활성제는 또한 영양 보충제일 수 있다. 비제한적 영양 보충물은 단백질, 탄수화물, 수용성 비타민(예를 들어, 비타민 C, B-복합 비타민 등), 지용성 비타민(예를 들어, 비타민 A, D, E, K 등), 무기질, 및 본초 추출물을 포함한다. 생물활성제는 상업적으로 이용가능하고/하거나 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 생물활성제는 백신(백신은 또한 항원과 콜레라 독소 및 이의 B 서브유닛, 렉틴 및 애쥬번트의 컨쥬게이트인 면역-자극 복합체의 일부로서 전달될 수 있음), 항생제, 친화성 분자, 합성 유기 분자, 폴리머, 저분자량 단백질성 화합물, 펩티드, 비타민, 스테로이드, 스테로이드 유사체, 지질, 핵산, 탄수화물, 이들의 전구체, 및 이들의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 생물활성제는 또한 살충제, 예를 들어, 살서제일 수 있다.
생물활성제는 면역원, 즉, 동물에서 특정 면역 반응을 마운팅시킬 수 있는 물질일 수 있다. 면역원의 예는 항원 및 백신을 포함한다. 예를 들어, 면역원은 면역원성 펩티드, 단백질 또는 재조합 단백질, 예를 들어, 면역원성 펩티드 및/또는 단백질 및 박테리아(예를 들어, 박테린)를 포함하는 혼합물; 온전한 비활성의 약화된 감염성 바이러스 입자; 온전한 사멸되고 약화된 감염성 원핵생물; 온전한 사멸되고 약화된 감염성 원생동물, 예를 들어, 이의 임의의 생애 주기 단계, 및 온전한 사멸되고 약화된 감염성 다세포 병원체, 재조합 서브유닛 백신, 및 면역원성 단백질(예를 들어, DNA 백신)을 인코딩하는 유전자를 전달하고 발현하는 재조합 벡터를 포함할 수 있다.
하나 이상의 생물활성제는 통상적으로 물을 제외하고 입자의 중량의 적어도 0.1%, 또는 적어도 1%, 또는 적어도 5%를 구성한다. 통상적으로, 이들은 최대 40%, 또는 최대 20%, 또는 최대 10%를 구성한다.
점막접착성 폴리머
점막접착성 폴리머는 점막 조직에 특이적으로 결합하고, 생물활성제를 점막에 근접하여 유지시키는 것을 도움으로써 투여를 개선시키는 폴리머가다. 적합한 예는 합성 폴리머, 예를 들어, 폴리(아크릴산), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리(메틸 아크릴레이트), 카르복실-작용화 폴리머, 설페이트-작용화 폴리머, 아민-작용화 폴리머, 및 이들의 유도체 또는 변형체, 뿐만 아니라 자연 발생 폴리머, 예를 들어, 카라기난(carrageenan), 히알루론산, 키토산, 양이온성 구아 및 알기네이트를 포함한다. 자연 발생 폴리머의 유도체화되거나 달리 변형된 형태가 또한 이용될 수 있고, 많은 상기 폴리머는 당 분야에 공지되어 있다. 비제한적인 예는 프로필렌 글리콜 알기네이트 및 펙틴, 카르복시메틸 키토산, 카르복시메틸키틴, 메틸 글리콜 키토산, 트리메틸 키토산 등을 포함한다.
바람직한 점막접착성 폴리머는 갑각류의 외골격의 주요 화합물인 키틴의 탈아세틸화를 통해 획득될 수 있는 키토산 및 변형되거나 유도체화된 키토산이다. 셀룰로스와 밀접하게 관련된 점액다당류인 키토산 [a-(1~4)-2-아미노-2-데옥시-β-D-글루칸]은 분자량, 탈아세틸화의 정도, 및 점도에 의해 결정되는 화학적 특성을 나타낸다. 키토산은 가교제, 예를 들어, 포스페이트 이온, 글루타르알데하이드 또는 설페이트 이온과의 화학 반응에 의해 많은 양의 항원에 결합할 수 있는 미세입자 및 나노입자를 형성할 수 있다.
키토산이 일부 바람직한 구체예에서 이용되나, 유사한 점막접착성 기능을 달성하기 위해 다른 폴리머가 이용될 수 있다. 이들은 젤라틴, 알기네이트, 덱스트란, 히알루론산, 아가, 및 저항 전분을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
하나 이상의 점막접착성 폴리머는 통상적으로 물을 제외한 입자의 중량의 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 15%를 구성한다. 통상적으로, 이들은 최대 50%, 또는 최대 30%, 또는 최대 20%를 구성한다.
오일
통상적인 전통적 제품에서, 생물활성제의 제조 동안 위 통과를 통해 입자를 침출시킴에 의해 특히 작은 분자 크기의 생물활성제, 예를 들어, 바이러스, 단백질, 약물, 항생제, 살충제 등과 같은 생물활성제의 유의한 양이 수성 환경에서 손실된다. 본 발명에서, 오일에 분산되거나 오일에 의해 코팅되는 작용제를 함유하는 별개의 입자, 도메인 또는 상에 의해 입자로부터의 생물활성제의 침출이 대부분 배제된다. 액체이거나 고체 형태의 식물성, 동물성 또는 합성 오일 및 지방, 또는 왁스를 포함하는 임의의 유형의 오일이 생물활성제 코팅에 이용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 식물 기원의 오일은 피마자유, 코코넛 오일, 코코 버터, 옥수수유, 면실유, 올리브유, 올리브 스쿠알란, 팜유, 땅콩유, 평지씨유, 잇꽃유, 참기름, 대두유, 해바라기유, 스테아레이트, 카나우바 왁스 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 사용되는 동물 기원의 오일은 생선 오일, 상어 스쿠알란, 유지방, 밀랍, 라놀린, 라드 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에서, 분산 오일은 올리브 또는 상어 스쿠알란과 임의의 다른 유형의 오일, 지방 또는 왁스의 혼합물이다. 통상적으로, 오일의 부피는 생물활성제와 점막접착성 폴리머의 조합 부피보다 크다.
통상적인 절차에서, 생물활성제 및 점막접착성 폴리머를 함유하는 수용액은 균일한 에멀젼이 생성될 때까지 1 중량부의 용액 대 1.1-5 중량부의 오일의 비로 오일을 이용하여 균질화된다. 균일하고 안정적인 에멀젼의 형성을 돕기 위해, 비이온성 계면활성제가 첨가될 수 있다. 적합한 비이온성 계면활성제는 에톡실화 지방족 알콜, 폴리옥시에틸렌 계면활성제 및 카르복실산 에스테르 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 안정적인 에멀젼이 형성된 후, 오일에 분산된 수성 비말은 점막접착성 폴리머의 화학적 또는 물리적 반응에 의해 응고된다. 예를 들어, 젤라틴 및 아가 폴리머는 온도를 낮추거나 에멀젼의 pH를 변화시킴으로써 응고되는 반면; 키토산은 에멀젼의 pH를 6.5 초과까지 상승시키고/시키거나 반대이온, 예를 들어, 소듐 트리폴리포스페이트(TPP)을 첨가함으로써 응고된다.
하나 이상의 오일은 통상적으로 물을 제외한 입자의 중량의 적어도 1.5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%를 구성한다. 통상적으로, 이들은 최대 40%, 또는 최대 30%, 또는 최대 25%를 구성한다.
장용 코팅 폴리머
점막접착성 폴리머를 함유하거나 이에 의해 코팅된 오일 분산액의 비말이 위 보호를 제공하고, 생물활성제의 위 방출 또는 전달 후, 즉 장에서의 방출에서 온전한 장용 코팅 폴리머의 혼합물에 분산된다.
예시적인 장용 코팅 폴리머는 충분히 높은 pH의 물에서는 가용성이나, 낮은 pH에서 불용성인 폴리머를 포함한다. 통상적으로, 이들은 5.0 초과의 pH에서 가용성이고, 4.0 미만의 pH에서 불용성이다. 적합한 폴리머는 생물활성 물질이 방출되어야 하는 동물의 장의 비교적 약한 pH 조건하에서 실질적으로 가용성이거나 소화될 수 있으나, 장용 코팅 폴리머의 외부 매트릭스가 민감한 생물활성제를 황폐로부터 보호하는 위에서는 불용성이고 소화되지 않는다. 일부 경우에, 장용 코팅 폴리머는 위에서의 용해 또는 분해를 예방하기 위해, 예를 들어, 이가 양이온과 가교된다.
적합한 장용 코팅 폴리머는, 예를 들어, 폴리아크릴산, 폴리(메트)아크릴레이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 및 수용성, 중성 또는 합성 다당류 검을 포함하는 다양한 친수성 폴리머 중 임의의 친수성 폴리머로부터 선택될 수 있다. 하나의 예시적 합성 장용 코팅 폴리머는 EUDRAGIT® FS30D(Evonik Industries)이다. 소듐 알기네이트 및 펙틴이 바람직한 수용성 검인데, 이는 이들의 가벼운 가교 조건 때문이다.
알기네이트는 특히 고체 겔 조성물을 형성시키는데 있어서의 이들의 사용 용이성으로 인해 위 민감성 생물활성제에 대한 바람직한 친수성 담체 매트릭스를 제공한다. 알기네이트 용액은 이가 양이온과 조합되거나 혼합되는 경우에 고체 겔을 형성한다. 그럼에도 불구하고, 일부 구체예에서, 알기네이트는 가교되지 않고, 위 환경에서 소화되지 않고 불용성인 채로 남아 있으며, 따라서 동물의 위의 낮은 pH 조건하에서 동안 입자 내용물을 보호한다.
알기네이트는 다양한 비율의 1,4-결합된 β-D-만누론산(M), α-L-글루론산(G), 및 교대(MG) 블록을 포함한다. 알기네이트 용액의 점도는 대부분 M/G 블록의 분자비에 의해 결정된다. 낮은 점도의 알기네이트는 통상적으로 최소의 50% 만누로네이트 단위를 함유하며, 이들의 점도는 20-200 mPa 범위이다. 중간 및 높은 점도의 알기네이트는 최소의 50% 글루론산 단위를 함유하고, 이들의 점도는 통상적으로 >200 mPas 초과이다.
일부 구체예에서, 매트릭스 형성 폴리머는 알기네이트, 펙틴 또는 이들의 혼합물이다. 저점도 등급 알기네이트 및 저 메톡시 펙틴이 바람직하다. 통상적인 낮은 메톡시 펙틴은 50% 미만의 메틸화 정도를 가지며, 이들은 통상적으로 이가 양이온, 예를 들어, Ba, Ca, Mg, Sr 또는 Zn과 가교된다.
하나 이상의 장용 코팅 폴리머는 통상적으로 물을 제외한 입자의 중량의 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%를 구성한다. 통상적으로, 이들은 최대 70%, 또는 최대 50%, 또는 최대 40%를 구성한다.
임의 성분
일부 구체예에서, 조성물은 주요 생물활성제에 추가하여 영양소, 뉴트라슈티컬, 섭취 유인물질 및/또는 맛 차폐 화합물을 임의로 포함한다. 강력한 면역 반응을 유도하고 점막 림프구에 의해 흡수되는 항원을 증가시키기 위해 침투 증진제 또는 애쥬번트도 포함될 수 있다. 예시적인 한 애쥬번트는 베타 글루칸이다.
조성물 제조
입자를 제조하는 첫 번째 일반적 방법은 다음과 같다. 분산된 생물활성제 및 점막접착성 폴리머를 포함하는 수성 혼합물을 오일과 균질화시켜 오일 중 수성 혼합물의 에멀젼을 생성한다. 통상적으로, 중량 기준으로 1부의 수성 혼합물 대 1.1-5부의 오일의 비가 에멀젼을 제조하는데 이용된다. 그 후 에멀젼을 장용 코팅 폴리머를 포함하는 수용액에서 슬러리화하고, 슬러리를 장용 코팅 폴리머에 대한 가교제를 함유하는 수용액으로 분무, 적하 또는 주입시켜, 입자를 형성한다.
두 번째 일반적 방법에서, 분산된 생물활성제를 포함하는 수성 혼합물을 오일과 균질화시켜 오일 중 수성 혼합물의 에멀젼을 생성한다. 통상적으로, 중량 기준으로 1부의 수성 혼합물 대 1.1-5부의 오일의 비가 에멀젼을 제조하는데 이용된다. 그 후 에멀젼의 점적을 수성 점막접착성 폴리머에 분산시키고, 이것을 가교시켜 가교 용액으로부터 임의로 분리될 수 있는 중간 입자를 형성한다. 분리되거나 분리되지 않은 중간 입자를 그 후 장용 코팅 폴리머를 포함하는 수용액에서 슬러리화한다. 분무 건조에 의해, 또는 동결 건조 및 분쇄에 의해 입자를 형성한다.
조성물을 제조하는 한 특수한 방법에서, 점막접착성 폴리머와 관련된 생물활성제의 분산된 입자를 함유하는 오일을 1 내지 3%의 저 메톡시 펙틴을 임의로 포함하는 저 점도 등급 소듐 알기네이트의 5 내지 15% 용액으로 슬러리화하고, 슬러리를 칼슘 클로라이드와 같은 이가 양이온의 수용액에 주입, 적하 또는 분무 세분화한다. 생성되는 매트릭스 입자의 크기는 칼슘 클로라이드 용액으로의 알기네이트 분산액의 전달 속도 및 방법에 의해 조정될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 슬러리는 알기네이트를 가교시키지 않으며, 당 분야에 공지된 임의의 건조 방법, 예를 들어 분무 건조 또는 진공 건조를 이용하여 건조된다. 통상적으로, 생성된 입자의 크기는 약 20 μm 내지 약 8 밀리미터, 보다 통상적으로 약 50 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 범위이다.
대안적인 특수한 방법에서, 0.5 내지 2%의 CaCO3와 같은 이가 양이온의 불용성 공급원을 소듐 알기네이트 용액 중 생물활성제-함유 오일 점적의 슬러리에 첨가한 후, 칼슘 이온과 같은 양이온을 천천히 방출시키기 위해 글루코노-델타-락톤 (GDL)과 같은 0.5 내지 1%의 약 유기산을 산화제로서 첨가한다. 양이온은 알기네이트를 가교시켜 고체 케익 젤을 형성하고, 이것은 작은 조각 또는 입자로 절단되거나 분쇄될 수 있다. 전형적으로, 생성된 조각 또는 입자 크기는 약 50 ㎛ 내지 약 10 밀리미터, 보다 전형적으로 약 100 내지 약 5000 ㎛의 범위이다. 숙련된 의사는 다른 천연 또는 합성 폴리머, 바람직하게는 음이온성 폴리머가 본 조성물의 기초를 형성하는, 이온성 상호작용-기반 친화성을 이용하여 활용될 수 있음을 인지할 것이다.
조성물의 이용
본 발명의 조성물은 수성 현탁액으로 저장될 수 있거나 당 분야에 공지된 임의의 건조 방법에 의해 건조될 수 있고, 현저한 활성 손실 없이 긴 시간의 기간 동안 탈수된 상태로 저장될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 식수의 성분으로서, 식품 첨가제로서, 또는 약학적으로 허용되는 담체 및 임의의 애쥬번트를 함유하는 백신 제형의 일부로서 경구 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 다른 표준 경구 투여 형태에 포함될 수 있다. 당분야 숙련자는 표적으로 하는 동물에 조성물을 전달하기에 적합한, 광범하게 다양한 당해 분야-인지된 식품, 사료, 뉴트라슈티컬 또는 약학적 투여 형태 및 약학적 담체가 존재함을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 투여는 단일 또는 다중 용량 프로토콜로 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 면역원성 조성물은 약 3일 내지 약 10일 또는 더 긴 기간 동안 투여되는 다중 용량 프로토콜로 투여되며, 표적 종이 면역 손실을 입증함에 따라 주기적으로 반복될 수 있다.
돼지, 가금류, 소 또는 수생 동물에 사용되는 식수에서의 이용을 위해, 추가 오일 또는 비활성 폴리프로필렌 또는 폴리에스테르 입자를 조성물에 포함시켜 부양성을 증가 (즉, 밀도 감소)시킴으로써, 어류 양식 탱크에서의 전달을 위한 급수 장치가 본 발명의 조성물을 전달하는데 이용될 수 있었다.
따라서, 조성물은 이들의 매일 사료 성분으로서 또는 이들의 식수 성분으로서 동물에 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1a
본 발명의 조성물의 제조
본 발명의 조성물은 다음과 같이 제조되었다. 3 그램의 점막접착성 폴리머 (키토산, FMC Biopolymers Inc.)를 50℃에서 100 ml의 0.5N 빙초산 용액에 용해시켰다. 용액의 pH를 소듐 하이드록사이드로 5.8로 조정하고, 용액이 실온으로 냉각되게 하였다. Tween 80 (0.2%, Sigma, St Louis, MO) 및 소포제 (0.5%, Sigma, St Louis, MO)를 첨가하고, 사용시까지 키토산 용액을 4℃에서 유지시켰다. 300 mg의 오브알부민 ("OVA", 모델 백신)을 함유하는 30 ml의 용액을 키토산 용액에 첨가시켜 혼합물을 생성하였다. 생성된 용액을 5% Span-80 (Sigma)을 함유하는 195 g의 올리브유에 첨가하고, 얼음조에서 10,000 rpm으로 30분 동안 균질화시켜 유중수 에멀젼을 형성하였다. 20 ml의 수성 소듐 트리폴리포스페이트 (5%) 및 0.5N NaOH를 연속 오일상에 오브알부민 및 가교된 키토산 미세입자를 함유하는 생물활성제 에멀젼에 혼합시키며 천천히 첨가하였다. 입자가 적어도 2시간 동안 경화되게 하였으나, 오일상에서 제거하지 않았다.
오일 중 입자의 분산액을 66 g의 올리고사카라이드 (인스턴트 이눌린, Cargill, Minneapolis, MN), 10 g의 레시틴 및 3 g의 Tween-80을 또한 함유하는 330 ml의 저 점도 등급 소듐 알기네이트 (FMC Biopolymers Inc.)의 9% 수용액으로 교반시켰다. 생성된 수성 분산액을 5% CaCl2를 함유하는 가교 용액에 주입시켜, 각각이 다수의 오일 점적을 함유하고 결국 각각이 오브알부민 및 가교된 키토산의 미세입자를 함유하는 알기네이트 매트릭스 비드를 형성하였다. 비드를 동결 건조시키고, 크기가 150 μm 미만인 입자로 분쇄시켜 본 발명의 건조 조성물을 수득하였다.
실시예 1b
본 발명의 조성물을 형성하는 대안적인 방법은 오일 중 생물활성 수용액의 에멀젼을 활용한다. 100 mg의 오브알부민을 함유하는 10 ml의 수용액을 5% Span-80을 함유하는 15 g의 카놀라유와 합치고 균질화시켜 미세한 유중수 에멀젼을 형성하였다. 에멀젼을 100 ml의 3% 키토산 수용액과 혼합시키고, 분산액을 5% 트리폴리포스페이트 용액 (5% TPP)을 함유하는 가교 용액에 주입시켰다. 입자가 적어도 2시간 동안 경화되게 하였다. 생성된 가교된 고체 키토산 입자는 임베딩된 오일 점적을 함유하였고, 이러한 오일 점적 각각은 다시 10 ㎛ 보다 작은 분산된 수성 오브알부민의 점적을 함유하였다. 고체 입자를 여과에 의해 분리하고 400 ml의 9% 저 점도 등급 알기네이트의 수용액에 미세하게 분산시켰다. 생성된 수성 분산액을 5% CaCl2를 함유하는 가교 용액에 주입시켜 알기네이트 매트릭스 비드를 형성하였다. 비드를 동결 건조시키고 크기가 150 μm 미만인 입자로 분쇄시켜 본 발명의 건조 조성물을 수득하였다.
실시예 2
면역원성 조성물의 제조
키토산 (3 g, FMC Biopolymer)을 50℃에서 100 ml의 0.5N 빙초산 용액에 용해시켰다. 용액의 pH를 소듐 하이드록사이드로 5.8로 조정하고, 용액이 실온으로 냉각되게 하였다. 모델 백신으로서 100 mg의 오브알부민 (OVA)을 함유하는 10 ml의 용액을 50 mg의 면역-자극제 (베타 글루칸, AHD International, Atlanta, GA)와 혼합시키고, 키토산 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 5% w/w Span-80을 함유하는 150 g의 상어 스쿠알렌유 (Jedwards International)에서 10,000 rpm으로 30분 동안 에멀젼화시켜 연속 오일상 중 OVA, 키토산 및 베타 글루칸의 수성 점적의 에멀젼을 형성하였다. 에멀젼을 올리고사카라이드 (40g, 인스턴트 이눌린)를 또한 함유하는 0.5N NaOH 중 400 ml의 9% 저 점도 등급 소듐 알기네이트의 수용액에 교반과 함께 첨가하였다. 생성된 에멀젼을 5% CaCl2 용액에 주입시켜 알기네이트를 가교시킴으로써, 본 발명의 면역원성 조성물을 생성하였다. 조성물을 동결 건조시키고, 크기가 250 ㎛ 미만인 입자로 분쇄시켰다.
실시예 3
어류의 기생충 감염의 치료/예방을 위한 조성물의 제조
어류에서 기생충 감염의 치료를 위한 단백질 항원 또는 구충 화합물을 함유하는 조성물을 제조하였다. 10 mg의 생물활성제를 상기 실시예 2에 기재된 대로 10 ml의 3% 키토산 수용액에 용해시키고, 75% 올리브유, 20% 스쿠알렌유 및 5% Span-80을 함유하는 15 g의 오일 혼합물에서 에멀젼화시켰다.
1 ml의 수성 5% 소듐 트리폴리포스페이트, 0.5N NaOH 용액을 1 g의 올리브유에서 에멀젼화시키고, 생물활성제 에멀젼에 혼합시켜, 생물활성제 및 가교된 키토산을 함유하는 입자의 오일 중 분산액을 생성하였다. 분산액을 2시간 동안 정치시켜 가교된 키토산이 경화되게 하였다. 생성된 오일 중 입자의 분산액을 9% 저 점도 등급 소듐 알기네이트, 1% 저 메톡시펙틴, 30% w/w 인스턴트 이눌린 및 1% Tween-80을 함유하는 20 ml의 용액에 교반시키며 첨가하였다. 생성된 혼합물을 3% CaCl2를 함유하는 가교 용액에 주입시켜 각각이 결국 생물활성 및 가교된 키토산의 미세입자를 함유하는 임베딩된 분산된 오일 점적을 함유하는 알기네이트-펙틴 매트릭스의 비드를 형성하였다. 비드를 동결 건조시키고 150 ㎛ 미만으로 분쇄시켜 본 발명의 건조 조성물을 수득하였다.
실시예 4
약학적 약물을 함유하는 조성물의 제조
결장 질환의 치료를 위한 약학적 약물 (글루코코르티코이드 예컨대, 덱사메타손 또는 메틸 프레드니솔론)을 함유하는 조성물을 제조하였다. 약물을 상기 실시예 1 또는 2에 기술된 바와 같은 키토산 용액에 첨가하고, 95% 스쿠알란 오일 및 5% Span-80의 혼합물에 에멀젼화시켰다. 스쿠알란 오일에서 0.5N NaOH 중 5% 소듐 트리폴리포스페이트를 함유하는 알칼리 에멀젼을 제조하고 생물활성 에멀젼에 서서히 혼합시켜 (20% w/w) 키토산을 가교시키고, 혼합물을 적어도 2h 동안 방치하여 가교된 입자를 경화시켰다. 키토산 마이크로입자의 오일 분산액을 장용 코팅 폴리머 (30% w/w EUDRAGIT® FS30D, Evonik Industries)를 1:3 에멀젼/Eudragit 액체 비율로 함유하는 액체 내로 혼합하고 분무-건조시켜 본 발명의 건식 미립자 조성물을 형성시켰다.
실시예 5
본 발명의 조성물에서 생물활성제의 캡슐화 효율
본 발명의 조성물에서 추가적인 오일 분산액 및 장용 코팅 폴리머 매트릭스의 효과를 전형적인 단백질 약물 또는 백신을 시뮬레이션하기 위한 오브알부민 (OVA)을 사용하여 평가하였다. 3개의 OVA (Sigma) 함유 조성물을 제조하였다. 조성물 1은 OVA 결합된 키토산 마이크로입자로 구성되며, 10 ml의 3% 키토산 용액에 100 mg OVA를 용해시키고 이 용액을 10% 수성 TPP에 주입하여 가교된 비드를 형성시킨 후, 2h 유지시켜 비드를 경화시키고 후속 냉동 건조시키고 분쇄하였다. 조성물 2는 3% Span-80을 함유하는 15 g의 스쿠알란 오일 중에 100 mg OVA를 함유하는 10 ml 수용액을 에멀젼화시키고 생성 에멀젼을 20 ml의 3% 키토산 용액에 혼합시킴으로써 제조하였다. 이어서, 생성 슬러리를 10% TPP 용액 내로 주입하여 비드를 형성시킨 후, 상기와 같이 경화시키고 냉동 건조시키고 분쇄하였다. 조성물 3은 실시예 2에서 제조된 본 발명에 따른 OVA 결합된 키토산 마이크로입자로 구성되었다.
3개 유형의 조성물에서 OVA의 캡슐화 효율을 하기와 같이 측정하였다. 오백 mg의 각 조성물을 10 ml RIPA 완충제에 분산시키고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 현탁액을 5분 동안 볼텍싱하고 이어서 3000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 하기와 같은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 OVA 함량에 대해 검정하였다.
웨스턴 블롯: 조성물을 상기 기술된 바와 같이 RIPA 완충제와 용해시키고 샘플당 12㎍의 단백질에 상응하는 계산된 양을 10% SDS-폴리아크릴아미드 구배 겔 (SDS-PAGE, Bio-Rad, Hercules, CA)에 로딩하였다. 단백질을 PVDF 막 (Bio-Rad) 상으로 옮기고 0.5% Tween-20 (PBS-T)을 함유하는 PBS 중의 5% 무지방 밀크로 1시간 동안 차단하였다. 블롯을 실온에서 적절한 1차 항체와 1:5000 희석비로 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T (3 x 10 mL, 각 5 분)로 세척 후, 막을 적절한 HRP-컨쥬게이팅된 2차 항체 (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)와 1:5000 희석비로 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T (3 x 10 mL, 각 5 min)로 세척 후, 화학발광 필름을 ECL 기재 (Amsheram Biosciences)로 현상하였다. OVA의 캡슐화 효율 (원래 양의 OVA의 보유 %)은 표 1에 제시되어 있다.
표 1
Figure pct00001
결과는 생물활성제의 단순 수성 환경으로의 침출 (손실)을 방지하는데 있어서 조성물 2 및 3 중의 오일 분산물의 보호 효과를 입증하였다. 그러나, 비교 조성물 2와 본 발명의 조성물 3 간의 현저한 차이가 실시예 7에서 하기 기술된 바와 같이 위 조건하에서 평가될 경우 발견되었다.
실시예 6
시뮬레이션된 위액에서 비보호된 단백질 항원 활성의 분해
전형적인 위 노출 후 단백질 항원의 활성 손실을 평가하기 위해, 비-캡슐화된 OVA (10 mg)를 0.08% 펩신을 함유하는 10 ml의 시뮬레이션된 위액 중에서 pH-2 및 37℃에서 2시간 동안 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 15분, 30분, 60분 및 120분 인큐베이션 시간에 배지를 제거하고 잔여량의 OVA를 상기 기술된 바와 같은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 분석하였다. 표 2는 모의된 위액에서 2시간 노출에 대한 OVA의 분해를 보여주며, 이는 노출전 활성과 비교한 잔여 활성 %로서 나타내었다.
표 2
Figure pct00002
이들 결과는 비보호된 단백질-기반 항원 또는 생물활성제의 활성이 동물 소화관에서 완전하게 분해될 것임을 입증하였다.
실시예 7
본 발명의 조성물에서 생물활성제의 위 보호
위 노출 후 단백질 항원의 잔여 활성을 평가하기 위해, 3개의 조성물을 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하였다. 오백 mg의 각 3개의 조성물을 0.08% 펩신을 함유하는 10 ml의 시뮬레이션된 위액에서 중에서 pH-2 및 37℃에서 2시간 동안 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 2시간 노출 말기에, 위 용액을 제거하고 조성물 중의 OVA의 잔여 활성을 실시예 5에 기술된 바와 같이 측정하였다. 표 3은 모의된 위액으로의 2시간 노출 후 각 조성물에서 OVA의 잔여 활성을 보여준다.
표 3
Figure pct00003
이들 결과는 종래 기술 조성물 1 및 2와 비교하여 본 발명의 조성물 3의 우세한 위 보호 효과를 명백히 입증하였다.
실시예 8
위 보호에 대한 조성물 중의 알기네이트 점도 등급의 효과
9% 저 등급 점도 알기네이트 (50cP), 6% 중 등급 점도 알기네이트 (300cP) 및 1% 고 등급 점도 알기네이트 (800cP)를 함유하는 3개 조성물을 상기 실시예 2에 따라 제조하였다. 3개 조성물을 실시예 7에 기술된 바와 같이 모의된 위액에 노출하고 조성물 중의 OVA의 잔여 활성을 실시예 5에 기술된 바와 같이 측정하였다. 표 4는 모의된 위액으로의 2시간 노출 후 각 조성물에서 OVA의 잔여 활성을 보여준다.
표 4
Figure pct00004
이들 결과는 더 낮은 점도 등급의 알기네이트를 함유하는 조성물이 시뮬레이션된 동물 소화관에서 단백질-기반 항원 또는 생물활성제의 더 높은 보호를 제공함을 입증하였다.
실시예 9
본 발명의 조성물의 최적의 입자 크기
본 실시예에서, 시뮬레이션된 위 환경에서 건조되고 분쇄된 본 발명의 조성물의 입자 크기의 보호 효과를 평가하였다. OVA 조성물을 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하고, 이어서 2가지 입자 크기로 건조 분말을 나누었다: 50 ㎛ 스크린을 통과한 작은 입자 및 50 ㎛ 스크린에서는 포획되나 100 ㎛ 스크린은 통과한 큰 입자. 표 5는 모의된 위액에서 2시간 노출 후 각 입자 크기의 조성물에서 OVA의 잔여 활성을 보여준다.
표 5
Figure pct00005
이 결과는 최적의 위 보호가 건조 조성물이 50 μm 초과의 입도로 밀링되는 경우에 제공된다는 것을 보여준다.
실시예 10
마우스에 대한 OVA 조성물의 경구 투여
면역 반응을 유발하는데 있어서 본 발명의 조성물의 효능을 시험하기 위해 마우스에게 오브알부민을 경구 투여하였다.
동물: 10 내지 12 주령된 암컷 BALB/C 마우스를 사용하였다. 마우스에게 자유식으로 먹이를 주었다. 각각의 실험군을 개별 케이지에 수용하였다.
오브알부민 조성물: 오브알부민 (1 mg/g의 오브알부민, Sigma(St. Louis, Mo))을 실시예 5에 기재된 바와 같이 본 발명의 조성물에 혼입하였다. 각각 4마리의 마우스의 3개의 군을 다음과 같이 접종하였다: 1) 조성물 중의 오브알부민 (OVA), 경구 투여, 2) OVA 용액, 피하 투여 (SC), 및 3) 항원 비함유 조성물, 경구 투여. 마우스를 0 및 3주에 접종하였다. 각각의 투여량의 투여에서 총 100 mg의 건조 조성물을 사료 펠릿 상에 코팅된 옥수수 오일과 1:2 w/w의 건조 조성물/오일의 비율로 혼합하였다. 4주에 각각의 마우스를 안락사시키고, 혈청 및 지라 세포를 채취하였다.
면역학적 검정: 혈청을 ELISA에 의해 IgG 및 IgA에 대하여 검정하였다. 폴리스티렌 플레이트에 흡수된 OVA를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 샘플을 혈청에 대하여 1:15 희석으로 3회 웰에 넣었다. 겨자무 과산화효소(horse radish peroxidase)와 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 항체에 이어서 오르토페닐렌디아민 기질(Sigma(St. Louis, Mo., U.S.A.))을 사용하였다. 마이크로타이터 플레이트 분광광도기에 플레이트를 넣고 490 nm에서 플레이트를 판독함으로써 각각의 웰의 광학 밀도를 측정하였다. 상술된 기술을 이용하여 OVA에 대해 특이적인 항체 분비 세포(antibody secreting cell: ASC)에 대하여 지라 세포를 시험하였다.
OVA 특이적 IgG 및 IgA 항체를 시간에 따른 광학 밀도의 증가를 측정함으로써 정량화하였다. OVA가 접종된 각각의 마우스에 대한 OVA 특이적 혈청 및 IgA IgG 및 ASC 분비 세포는 OVA가 주입되고 본 발명의 조성물이 경구 공급된 마우스와 동등하게 증가되는 것으로 예상되었다. 항원 비함유 조성물이 공급된 마우스에서는 어떠한 OVA 특이적 IgG 또는 IgA 항체도 검출되지 않은 것으로 예상되었다. 따라서, 조성물은 경구 투여시에 면역 반응을 유발하는데 있어서 효과적인 것으로 예상되었다.
실시예 11
닭에 대한 항원 함유 조성물의 경구 투여
살모넬라 엔테리티디스는 살란용 닭에서 질병의 주된 원인이다. 감염은 무리의 생산을 감소시키고, 사망률을 증가시킨다. 더욱이, 살모넬라 엔테리티디스는 달걀을 통해 갓깬 병아리에 통과되어 감염된 달걀을 먹은 차후 세대 또는 인간을 감염시킬 수 있다. 감염이, 장점막에 결합하고 이를 침입하는 이러한 세균에 의해 시작되고, 장기간 감염이 장내 림프 조직의 감염을 수반하기 때문에, 점막 면역의 자극은 이러한 질병을 제어하는데 있어서 필수적이다.
본 발명의 백신 조성물로 닭을 백신화하는 효능을 평가하기 위하여, 백신 에멀젼을 알칼리성 알긴산나트륨 상에서 1:2 w/w 비율로 혼합하고, 슬러리를 분무-건조시킨 점을 제외하고, 주요 면역원인 살모넬라 엔테리티디스의 플라젤린을 실시예 2에 따른 조성물 중에 혼입하였다. 건조 조성물을 사료 상에 탑-코팅시키고, 병아리에게 경구 투여하였다. 10주령된 닭에게 살모넬라 엔테리티디스 또는 보빈 혈청 알부민의 플라젤린 항원 300 μg이 투입된 조성물을 2주 간격으로 3회의 경구 투여량으로 제공하였다. 항원을 마지막 경구 투여한 지 1주 후에, 혈청 및 장액을 채취하고, ELISA에 의해 플라젤린 특이적 항체에 대하여 검정하였다. 결과는 경구 백신화된 새에서 혈청 중 플라젤린 특이적 항체가 유의하게 증가됨을 보여주는 것으로 예상되었다.
실시예 12
송아지에 대한 항원 함유 조성물의 경구 투여
송아지의 폐에서 면역 반응을 자극하는 본 발명에 따라 제조된 경구 투여된 오브알부민 함유 조성물의 효능을 입증하였다.
오브알부민을 실시예 1a에 기재된 바와 같이 조성물에 혼입하였다. 송아지에 대한 경구 투여를 위하여, mg 당 40 ㎍의 투여량의 오브알부민을 함유하는 조성물을 사료에 투입하였다. 실험 군 당 4마리의 송아지를 사용하고, 각각의 송아지에게 연이어 5일간 투여량 당 5 mg의 오브알부민을 제공하였다.
특이적 면역 반응을 유발하는 경구 투여된 오브알부민의 효능을 평가하기 위해 2개의 군의 송아지를 사용하였다. 그룹 1에 3주 간격의 피하 (SC) 주사로 불완전 프로인트 어쥬번트 중의 오브알부민을 2회 투여량으로 제공하였다. 이러한 군은 어떠한 백신에 대하여 일반적으로 사용되는 백신화 방법으로 비경구적 대조군으로서 역할을 하였다. 그룹 2에게 3주 간격의 오브알부민을 함유하는 조성물의 경구 방식을 제공하였다. 오브알부민에 대한 동종 항체 반응에 대하여 혈청을 평가하였다. 결과는 OVA-함유 조성물이 경구 공급된 송아지에서 상당량의 OVA 특이적 IgG 및 IgA가 생성됨을 보여주는 것으로 예상되었다. 예상된 매우 고수준의 혈청 IgA는 소의 전신 면역 반응을 자극하는데 있어서 높은 효과로 예측되었다.
실시예 13
어류에 대한 비브리오 항원을 함유하는 조성물의 경구 투여
비브리오 알기놀리티쿠스는 수산양식에서 심각한 세균 감염이고, 특히 무지개 송어에서 심각하다. 이는 현재 극심한 경제적 손실을 초래할 수 있는 모든 송어-생산 지역에서 고질적이다. 또한, 이는 주로 담수 성장 상에서 양식된 연어에서 점점 더 중요한 병원균이 되고 있지만, 마찬가지로 바다에서 손실을 초래하는 것으로 보고되었다. 백신화는 V. 알기놀리티쿠스가 연어과의 양식 사이클의 어떠한 스테이지에서 유의한 영향을 미치는 것을 예방할 수 있다. 전형적인 백신화 프로그램은 2-5 그램의 치어의 일차 백신화 및 일차 백신화의 4-6 개월 후의 경구 부스터 백신화를 포함한다. 그러나, 이상적인 백신화 프로그램은 전체 배양 기간에 걸쳐 어류 혈청에서 효과적인 항체 타이터를 유지하기 위해 어류에 주기적으로 제공된 단지 하나의 유형의 백신화를 포함할 것이다.
실험 설계: 송어 혈청에서 면역 반응을 자극하는 경구 투여된 본 발명에 따라 제조된 ERM 백신 함유 조성물의 효능을 입증하였다.
감쇠 V. 알기놀리티쿠스를 실시예 lb에 기재된 바와 같은 조성물 중에 혼입하였다. 어류에 대한 경구 투여를 위하여, mg 당 2μg의 투여량의 V. 알기놀리티쿠스를 함유하는 조성물을 사료에 투입하였다. 실험 군 당 5g의 평균 크기의 20마리의 어류를 사용하고, 각각의 어류에게 연이어 5일간 급여량 중 1회 투여량의 V. 알기놀리티쿠스 백신을 제공하였다.
주사에 의한 표준 백신화에 대한 면역 반응을 유발하는 경구 투여된 V. 알기놀리티쿠스 백신의 효능을 평가하기 위해 3개의 어류 군을 사용하였다. 그룹 1을 주사 프로토콜에 의한 백신화를 사용하여 백신화시켰다. 이러한 군은 임의의 백신에 대하여 일반적으로 사용되는 백신화 방법으로 비경구 제어군으로서 역할을 하였다. 그룹 2에 V. 알기놀리티쿠스 백신을 함유하는 조성물의 하나의 경구 방식을 제공하였다. 그룹 3에 백신 비함유 조성물의 하나의 경구 방식을 제공하였다. 백신화 6주후의 V. 알기놀리티쿠스에 대한 동종 항체 반응에 대하여 혈청을 평가하였다. 결과는 y. a/g/no/)/t/쿠스-함유 조성물이 경구 공급된 어류에서 상당량의 V. 알기놀리티쿠스 특이적 IgA가 생성됨을 보여주는 것으로 예상되었다. 경구로 그리고 주사로 백신화된 어류의 혈청에서 면역 반응은 비슷한 것으로 예상되었다. 예상된 매우 고수준의 혈청 IgA는 어류의 전신 면역 반응을 자극하는데 높은 효과인 것으로 예측되었다.
실시예 14
조성물 함유 살서제 (Rodenticide)
와파린(Warfarin)은 랫트 및 마우스 침입을 제어하기 위해 사용되는 가장 통상적인 살서제이다. 와파린을 함유한 설치류 섭취 미끼는 15 내지 30분에 중독(poisoning)의 뚜렷한 증상을 나타내고, 1 내지 2시간에 의식을 잃게 된다. 그러나, 이의 빠른 작용 효과로 인하여, 설치류는 통상적으로, 치사량에 가까운 양의 와파린을 섭취하며, 회복은 8시간 내에 일어난다. 와파린의 캡슐화는 증상의 개시를 지연시켜, 전체 치사량의 소비를 가능하게 할 수 있다.
실험 방법: 10 내지 12주령의 암컷 BALB/C 마우스를 사용하였다. 마우스에 임의로 먹이를 제공하였다. 각 실험 그룹을 별도의 케이지에서 하우징하였다.
본 발명의 와파린 조성물: 와파린(400 mg/g의 조성물, Sigma, St. Louis, Mo.)을 일반적으로 실시예 3에 기술된 바와 같은 조성물에 도입하였다. 4 마리의 마우스의 3 그룹에 각각 임의로 하기와 같이 제공하였다: 1) 4% 와파린 활성으로 미끼에 혼합된 본 발명의 와파린 조성물, 2) 4% 활성으로 제공된 미끼에 혼합된 캡슐화되지 않은 와파린, 3) 와파린 또는 다른 생체활성물을 함유하지 않은, 실시예 3에서와 같은 조성물을 함유한 미끼. 마우스에 대한 사료 섭취 및 사망 효과(kill effect)를 모니터링하였다.
결과는, 그룹 1 및 그룹 3의 사료 섭취가 유사하였고 그룹 2에서의 사료 섭취(캡슐화되지 않은 와파린)가 25% 미만을 넘는다는 것을 나타낸다. 그룹 1에서의 모든 마우스가 사료공급하고 8시간 후에 사망하였고, 그룹 2 마우스가 사료공급하고 8시간 후에 살아 있을 것으로 예상된다.

Claims (21)

  1. 각각이 오일 점적에 분산된 생물활성제(bioactive agent)를 포함하는 입자를 포함하며, 상기 오일 점적이 장용 코팅 폴리머를 포함하는 매트릭스에 임베딩되거나 이에 의해 코팅되며, 입자 각각이 점막접착성 폴리머(mucoadhesive polymer)를 추가로 포함하는, 수생 종 또는 육생 종에 생물활성제의 경구 투여를 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 장용 코팅 폴리머가 가교된 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 장용 코팅 폴리머를 위한 가교제가 이가 금속 양이온을 포함하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 점막접착성 폴리머가 가교된 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 점막접착성 폴리머에서 가교가 트리폴리포스페이트와의 결합(association)에 의해 형성되는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 점막접착성 폴리머가 오일 점적에 분산된 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 점막접착성 폴리머 및 생물활성제가 결합된 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 입자의 직경이 50 ㎛ 보다 큰 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 생물활성제가 면역원(immunogen)인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 점막접착성 폴리머가 카라기난, 키토산, 히알루론산, 알기네이트, 이러한 것들 중 임의의 유도체 또는 변형체(modification), 카복실-작용화된 폴리머, 설페이트-작용화된 폴리머, 및 아민-작용화된 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리머인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 장용 코팅 폴리머가 폴리(메트)아크릴레이트, 알기네이트, 펙틴, 카복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리머인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 장용 코팅 폴리머 매트릭스가 저점도 등급의 알기네이트, 저 메톡시 펙틴, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 오일이 지방, 오일 및 왁스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 오일인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 오일이 식물성 오일 또는 동물 오일인 조성물.
  15. 순차적으로,
    (a) 분산되거나 용해된 생물활성제를 포함하는 수성 혼합물을 형성시키는 단계;
    (b) 오일 중에 단계 (a)의 수성 혼합물을 균질화시켜 오일 중의 수성 혼합물의 에멀젼을 형성시키는 단계;
    (c) 장용 코팅 폴리머를 포함하는 수용액 중의 단계 (b)의 생성물의 슬러리를 형성시키는 단계; 및
    (d1) 단계 (c)의 슬러리를 장용 코팅 폴리머를 위한 가교제를 함유한 수용액에 분사시키거나, 적하하거나, 주입하여 입자를 형성시키되, 단계 (a)의 수성 혼합물이 점막접착성 폴리머를 추가로 포함하는 단계, 또는 (d2) 단계 (c)의 슬러리로부터 입자를 형성시키되, 단계 (b)가 수성 점막접착성 폴리머 중의 에멀젼의 점적을 형성시키고 점착접착성 폴리머를 가교시켜 중간체 입자를 형성시키는 것을 추가로 포함하는 단계 중 어느 하나를 포함하는, 제1항의 조성물을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단계 (d1)이 수행되는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 단계 (d2)가 수행되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 입자를 형성시키는 단계가 단계 (c)의 생성물을 동결 건조시키고 밀링하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 입자를 형성시키는 단계가 단계 (c)의 생성물을 분무 건조시키는 것을 포함하는 방법.
  20. 동물에 제9항의 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하는, 동물로의 생물활성제의 후위 전달(post gastric delivery) 방법.
  21. 수생 종 또는 육생 종에 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하며, 조성물이 백신을 위한 전달 비히클인, 수생 종 또는 육생 종을 백신접종하는 방법.

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