JP6712222B2 - 生物活性剤の経口送達用組成物 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月６日に提出された米国特許出願第６１／９１２，９５８号に対する利益を主張し、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

薬剤及びワクチンの経口投与は、いくつかの利点を提供する。投与量は、最小限の拘束と労働を伴って、食料又は水を介して、多数の動物に投与することができる。拘束は、また、動物にストレスを与え、薬剤又はワクチンをより効果的でないものとし、感染症のリスクを増加させる。食肉生産動物に関して、経口投与は、注射部位反応を避けるという他の利点を有する。折れた針、注射部位の汚染、又は高反応性アジュバントの使用は、枝肉及び皮膚に損傷を与える膿瘍を誘導する可能性がある。これらの反応は、食肉処理での動物の価値を低下させる。これは、また、魚のワクチンプログラムにおいて重要な問題であり、ここで魚は、それらの水槽、又は外海の生簀から捕獲し、そして個別に注射する必要がある。経口接種は、素早くそして効果的であり、そして後の追加接種を投与するための動物の複数の処理の必要性を取り除く。経口接種後の起こり得る有害な免疫反応も、また少なく、従って、より安全である。

経口ワクチン接種は、魚の養殖システムにおいて、一度に多数の魚を、最小限のストレス又は労働で、接種し又は処置するために、特に費用効率が高い方法である。これは、ワクチンの経口投与が、摂食／飲水の過程の間の摂取で達成される場合、特に事実である。さらに、より少ない精製工程で経口ワクチンを生産することができるので、経口ワクチンは、注射用ワクチン製剤よりも、より費用効率良く製造することができる。経口ワクチンは、また、副作用、例えば、注射のストレス、又は他の反応などがより少ないという利点を提供する。

薬剤及び特にワクチンの経口投与の利点にもかかわらず、技術の開発は、適切なワクチン送達システムの欠如により遅れている。適切な送達システムの不存在下では、大部分の経口ワクチンは、胃腸（GI）管での分解を受け、特に、低ｐＨの胃条件では、制限された吸収に終わり、そしてそれは、不十分な免疫応答につながる。

歴史的には、免疫付与は、ワクチンの非経口の投与による液性免疫の誘導に依存してきた。しかしながら、非経口投与により誘導される抗体は、必ずしも粘膜面、大部分の感染性因子の侵入部位に達するとは限らない。粘膜免疫は、粘膜組織と抗原の接触の結果であり、そしてそれは、魚の腸、肺、口、眼、乳腺、及び尿生殖路、そしてまた皮膚及び鰓で生じ、感染性因子に対する重要な最前線の防御である。

さまざまなビヒクルが、腸粘膜組織に薬剤又はワクチンを送達するために開発されてきた。生分解性ポリマー、例えば、ポリ‐（ＤＬ‐ラクチド）及びポリ‐（ＤＬ‐ラクチド‐コ‐グリコリド）は、抗原の経口投与用組成物を製造するために使用されてきた。しかしながら、これらのポリマー粒子の製造は、不安定な抗原に悪影響を及ぼす可能性がある溶媒の使用を必要とする。さらに、溶媒の使用は、これらの組成物中で、弱毒化した生物、例えば、ウイルス又は細菌などの組み込みを妨げる。

適切な経口送達システムの開発の他の課題は、食品又は飼料の等級及び生分解性化合物及びアジュバントを選択する必要性と、持続時間の長い安定な免疫応答の必要性とを含む。

１つの態様では、本願発明は、油滴中に分散された生物活性剤を粒子それぞれが含む粒子を含み、油滴が腸溶コーティングポリマーを含むマトリックス中に分散され、そしてここでそれぞれの粒子が、さらに粘膜付着性ポリマーを含む、水生又は陸生（動物）種への生物活性剤の経口投与のための組成物を提供する。

他の態様では、本願発明は、動物への生物活性剤の胃以降への送達方法であって、上述したような組成物を動物に経口投与する工程を含み、そしてここで、生物活性剤が、免疫原である、方法を提供する。

他の態様では、本願発明は、水生又は陸生種をワクチン接種するための方法であって、上述したような組成物を種に経口投与する工程を含み、そしてここで、組成物がワクチン用送達ビヒクルである、方法を提供する。

他の態様では、本願発明は、組成物を調製するための方法を提供する。本方法は、順番に以下の工程：
（ａ）分散された又は溶解された生物活性剤を含む水性混合物を形成させ；
（ｂ）油中で工程（ａ）の水性混合物を均質化して、油中で水性混合物のエマルジョンを産生させ；
（ｃ）水溶液中で、腸溶コーティングポリマーを含む、工程（ｂ）の産生物のスラリーを形成させ；そして
（ｄ１）腸溶コーティングポリマーのための架橋剤を含む水溶液中に、工程（ｃ）のスラリーを、噴霧し、滴下し、又は注入して、粒子を形成させる、ここで工程（ａ）の水性混合物が、粘膜付着性ポリマーをさらに含む、又は
（ｄ２）工程（ｃ）のスラリーから粒子を形成させる、ここで工程（ｂ）が、水性粘膜付着性ポリマーにおいてエマルジョンの液滴を形成させ、そして粘膜付着性ポリマーを架橋させて、中間体粒子を形成させることをさらに含む
ことを含む、方法を提供する。

本願明細書中で他に定義しない限り、本開示において使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解されそして使用される意味を有する。また、本願明細書中及び特許請求の範囲において使用されるように、用語「少なくとも１つ（at least one）」及び「１つ以上の（one or more）」は、同じ意味を有し、そして、１つ、２つ、３つ以上を含む。他に示さない限り、組成物中の構成成分のパーセンテージ又は部は、重量基準である。用語「分散された（dispersed）」は、懸濁（された）及び／又は溶解（された）を意味する。「経口ワクチン接種（oral vaccination）」は、抗原に対する特的な免疫応答を生じるために、動物の全身免疫系を刺激するための免疫原性の物質の食事を介した経口投与として定義される。

「架橋（crosslink）」及びその変異形は、本願明細書中で開示される任意のものを含む、２つ以上の物質及び／又は材料の、１つ以上の共有及び／又は非共有（例えば、イオン）結合を介した、結合を意味する。架橋は、天然に生じてもよく（例えば、システイン残基のジスルフィド結合）、又は合成若しくは半合成経路を介してもよい。荷電ポリマーの架橋は、反対の荷電の多価対イオンとのイオン会合のより達成することができる。フィルム、固体構造、例えば、ヒドロゲルは、そのような架橋により調製することができる。

「胃保護（gastric protection）」は、胃破壊及び活性の喪失からの、生物活性剤の保護を意味する。

本願発明の組成物は、生物活性剤及び粘膜付着性ポリマーを含む、粒子状物質を含み、ここで、生物活性剤は、油中に分散される。油滴は、次に、腸溶コーティングポリマーの外部マトリックス中に埋め込まれるか、又は腸溶コーティングポリマーの外部マトリックスによって被膜される。外部マトリックスは、ポリマーが、低ｐＨで不溶性を維持し、そして保護用のコーティング又は層として無傷を維持するので、油滴を囲んで、内容物が、動物の胃中の低ｐＨ条件に曝露することから保護する。粒子は、典型的には、１０〜５０００μｍの範囲で、平均幾何学的サイズ（場合により、直径と呼ばれる）を有し、そしてその大きさの範囲内で直接形成されるか、又は製粉し、粉砕し、又は他の方法によりその大きさの範囲内へと縮小してもよい。通常、粒子は、１００μｍ未満、好ましくは、５０μｍ未満の直径を有する。

いくつかの実施態様では、粘膜付着性ポリマー及び生物活性剤は、一緒に混合され、そして相互接触で、次に油滴において分散される粒子内で一緒に結合される。これらの粒子の１つ以上が、１つの油滴内に存在し、そして１つ以上の油滴が、外部マトリックス内に存在する。粘膜付着性ポリマー及び／又は腸溶コーティングポリマーは、架橋していてもよく、又はしていなくてもよい。

他の実施態様では、生物活性剤は、上述したように油滴中に分散され、そしてそれらは、次に、粘膜付着性ポリマーに埋め込まれる。生じた粒子は、次に、腸溶コーティングポリマーの外部マトリックスに埋め込まれる。粘膜付着性ポリマー及び／又は腸溶コーティングポリマーは、架橋していてもよく、又はしていなくてもよい。

いくつかの実施態様では、本願発明は、特定の疾患に対する水生及び陸生種の免疫応答を刺激するためのワクチンの経口投与のための組成物を提供する。組成物は、生物活性剤として有効な量の抗原を含む。本願発明の組成物は、取り込み及び粘膜免疫を刺激する動物の腸粘膜と接触するための生物活性材料を提供するように設計される。本願発明の組成物は、典型的に、飼料又は医薬的に許容される担体、例えば、水（例えば、動物の飲料水）、錠剤、カプセル、ボーラス投与剤形、ペレット飼料、又は標的種の腸内に組成物を運ぶ食品添加物を含む、と共に経口投与される。

本願発明の組成物は、対象への生物活性剤の送達において、いくつかの利点を提供する。第一に、送達システムを生成するための方法は、他の方法による粒子の調製のためにしばしば必要とされる、有機溶媒、又は高温及びｐＨの使用を排除する。本願発明の組成物の調製を通して、穏やかなｐＨ条件及び低温で、水性環境を維持することにより、反応し易い生物活性剤、例えば、生弱毒化細菌又はウイルスを、経口送達することができる。第二に、腸溶コーティングポリマーの更なる層は、胃腸管での分解に対して生物活性剤を保護する。免疫原の場合、これは、より少ない量の抗原／ワクチンで、同じ免疫応答の刺激を可能にする。第三に、油分散（物）は、調製の間、及び胃曝露の間に、小さな生物活性分子、例えば、タンパク質、ペプチド、及び薬剤が、水性環境に溶出するのを妨げるように、封入する。さらに、粘膜付着性ポリマー自体は、アジュバント効果を提供する。最後に、送達システムは、水性及び陸生種の両方への効率的な送達のために容易に製剤化することができる。

典型的には、本願発明の組成物の調製において使用されるすべての成分は、食品グレード、非毒性及び生分解性であり、そして典型的には、天然である。本願発明の組成物を調製するために有用な材料について、以下に説明する。

生物活性剤
生物活性剤は、直接的又は間接的に、１つ以上の物理的、化学的、及び／又は生物学的効果を引き起こすことができる、天然、合成、又は半合成の材料（例えば、組成物、発酵物、抽出物、細胞組織）であってもよい。生物活性剤は、生体の異常な及び／又は病的な状態を、例えば、寄生生物を殺すことにより、又は疾患、又は異常な状態の影響を制限することにより、予防し、緩和し、処置し、及び／又は治療することができてもよい。効果及び／又はその適用に依存して、生物活性剤は、医薬品、（例えば、予防薬、又は治療薬）、診断薬、及び／又は化粧料であってもよく、そして限定されないが、ワクチン、薬剤、プロドラッグ、親和性分子、合成有機分子、ホルモン、抗体、ポリマー、酵素、低分子タンパク質性化合物、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイドアナログ、脂質、核酸、炭水化物、これらの前駆体、及びこれらの誘導体を含む。生物活性剤は、また、栄養補助剤であってもよい。栄養補助剤は、限定されないが、タンパク質、炭水化物、水溶性ビタミン（例えば、ビタミンＣ、Ｂ‐複合体ビタミンなど）、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ，Ｄ、Ｅ、Ｋなど）、ミネラル、及びハーブ抽出物を含む。生物活性剤は、市販及び／又は公知技術により調製されてもよい。

本願発明の生物活性剤は、限定されないが、ワクチン（ワクチンは、免疫刺激複合体の一部、抗原とコレラ毒素及びそのＢサブユニット、レクチン及びアジュバントとの複合体（conjugate）としても送達することができる）、抗生物質、親和性分子、合成有機分子、ポリマー、低分子タンパク質性化合物、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイドアナログ、脂質、核酸、炭水化物、これらの前駆体、及びこれらの誘導体を含む。生物活性剤は、また、殺虫剤、例えば、殺鼠剤であってもよい。

生物活性剤は、免疫原、すなわち、動物において特異的な免疫応答を増加させることができる物質であってもよい。免疫原の例は、抗原及びワクチンを含む。例えば、免疫原は、免疫原性ペプチド、タンパク質、又は組み換えタンパク質を含んでもよく、免疫原性ペプチド及び／又はタンパク質及び細菌（例えば、バクテリン）；無傷の不活性、弱毒化、及び感染性ウイルス粒子；無傷の死んだ、弱毒化、及び感染性原核生物；無傷の死んだ、弱毒化、及び感染性原生動物（それらの任意のライフサイクル段階を含む）、及び無傷の死んだ、弱毒化、及び感染性多細胞病原体、組み換サブユニットワクチン、及び免疫原性タンパク質をコードする遺伝子を送達しそして発現させる組み換えベクター（例えば、ＤＮＡワクチン）を含んでもよい。

１つ以上の生物活性剤、典型的には、少なくとも粒子の０．１重量％（水分を除く）、少なくとも１％、又は少なくとも５％である。典型的には、それらは、最大で４０％、最大で２０％、又は最大で１０％である。

粘膜付着性ポリマー
粘膜付着性ポリマーは、粘膜組織に特異的に結合するポリマーであり、そして粘膜に接近して生物活性剤を保持することを助け、それにより投与を改善する。適切な例は、合成ポリマー、例えば、ポリ（アクリル酸）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリ（アクリル酸メチル）、カルボン酸官能性ポリマー、硫酸官能性ポリマー、アミン官能性ポリマー、及びそれらの誘導体及び修飾、並びに天然ポリマー、例えば、カラギナン、ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性グアー及びアルギン酸塩（alginate）を含む。天然ポリマーの誘導体化又は他の修飾バージョンがまた、使用されてもよく、そして多くのそのようなポリマーは、当業者に知られている。非限定的な例は、アルギン酸プロピレングリコール及びペクチン、カルボキシメチルキトサン、カルボキシメチルキチン、メチルグリコールキトサン、トリメチルキトサンなどを含む。

好ましい粘膜付着性ポリマーは、キトサン、及び修飾又は誘導体化キトサンであり、そしてそれらは、キトサンの脱アセチル化を介して得ることができ、甲殻類における外骨格の主な化合物である。セルロースに密接に関連するムコ多糖である、キトサン［α‐（１〜４）‐２‐アミノ‐２‐デオキシ‐β‐Ｄ‐グルカン］は、分子量、脱アセチル化の程度、及び粘度によって決定される化学的特性を示す。キトサンは、架橋剤、例えば、リン酸イオン、グルタルアルデヒド、又は硫酸イオンとの化学反応によって、大量の抗原を結合することができる。

キトサンは、いくつかの実施態様において使用されるが、他のポリマーが、同様の粘膜付着性機能を達成するために使用されてもよい。これらは、限定されないが、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、ヒアルロン酸、アガー、及び難消化性デンプンを含む。

１つ以上の粘膜付着性ポリマーは、典型的には、少なくとも粒子の１重量％（水分を除く）、少なくとも１０％、又は少なくとも１５％である。典型的には、それらは、最大で５０％、最大で３０％、又は最大で２０％である。

油
典型的な従来の製品では、生物活性剤のかなりの量が、粒子から、その調製の間及び胃通過を通じて、特に、小さな分子サイズの生物活性剤、例えば、ウイルス、タンパク質、薬剤、抗生物質、殺虫剤などが浸出することにより、水性環境に失われる。本願発明では、粒子からの生物活性剤の浸出は、油中に分散された剤、又は油で被膜された剤を含む、離散粒子、ドメイン、又は層により、大幅に除去される。液体又は固体のいずれかの形態で、植物油、動物油、又は合成油及び脂肪、又はワックスを含む、任意の種類の油が、生物活性剤を被膜するために使用することができる。本願発明において使用される植物由来の油は、これらに限定されないが、ヒマシ油、ココナッツ油、ココアバター、コーン油、綿実油、オリーブ油、オリーブスクアラン、パーム油、ピーナッツ油、菜種油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、ヒマワリ油、ステアリン酸、カルナバワックス、及びこれらの混合物を含む。本願発明において使用される動物由来の油は、これらに限定されないが、魚油、サメスクアラン、乳脂肪、蜜蝋、ラノリン、ラードなどが含まれる。いくつかの場合では、分散油は、オリーブ又はサメスクアランと任意の他の種類の油、脂肪又はワックスとの混合物である。典型的には、油の質量は、生物活性剤及び粘膜付着性ポリマーの混合質量よりも大きい。

典型的な手順では、生物活性剤及び粘膜付着性ポリマーを含む水溶液は、油と、１重量部の溶液に対して１．１〜５重量部の油の割合で、均一なエマルジョンが生成されるまで、均質化される。均一で安定なエマルジョンの形成を補助するために、非イオン性界面活性剤が、添加されてもよい。適切な非イオン性界面活性剤は、これらに限定されないが、エトキシ化脂肪族アルコール、ポリオキシエチレン界面活性剤、及びカルボン酸エステルなどを含む。一旦、安定なエマルジョンが形成されると、油中に分散された水滴は、粘膜付着性ポリマーの化学的又は物理的反応によって固化される。例えば、ゼラチン及びアガーポリマーは、エマルジョンの温度低下又はｐＨの変化により固化するが、キトサンは、エマルジョンのｐＨを６．５超に上げる及び／又は対イオン、例えば、トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）を添加することにより固化される。

１つ以上の油は、典型的には、少なくとも粒子の１．５重量％（水分を除く）、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％である。典型的には、それらは、最大で４０％、最大で３０％、又は最大で２５％である。

腸溶コーティングポリマー
粘膜付着性ポリマー含有又は粘膜付着性ポリマー被膜のいずれかの、油分散の液滴は、胃保護及び無傷の胃以降での放出又は生物活性剤の送達、即ち、腸での放出を提供する腸溶コーティングポリマーのマトリックス中に分散される。

腸溶コーティングポリマーの例は、十分に高いｐＨで、水中で可溶性であるが、低いｐＨでは不溶性であるポリマーである。典型的には、それらは、５．０超のｐＨで可溶性であり、そして４．０未満のｐＨで不溶性である。適切なポリマーは、生物活性材料が放出される、動物の腸の相対的に穏やかなｐＨ条件下で、実質的に可溶性又は分解性であるが、腸溶コーティングポリマーの外部マトリックスが、劣化から反応し易い生物活性剤を保護する胃において、不溶性又は分解され難い。いつかの場合では、腸溶コーティングポリマーは、例えば、二価の陽イオンと架橋されて、胃中での溶解又は分解を阻止する。

適切な腸溶コーティングポリマーは、例えば、ポリアクリル酸、ポリ（メタ）アクリレート、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、及び水溶性、中性又は合成多糖類ガムを含む、任意の様々な親水性ポリマーから選択することができる。合成腸溶コーティングポリマーの１つの例は、オイドラギット（EUDRAGIT）（登録商標）ＦＳ３０Ｄ（Evonik Industries）である。アルギン酸ナトリウム及びペクチンは、それらの穏やかな架橋条件のため、好ましい水溶性ガムである。

アルギン酸塩は、特に固体ゲル組成物の形成におけるそれらの容易な使用のため、胃で反応し易い生物活性剤のための好ましい親水性担体マトリックスを提供する。アルギン酸塩溶液は、二価の陽イオンと組み合わせた又は混合した場合、固体ゲルを形成する。それにもかかわらず、いくつかの実施態様では、アルギン酸塩は、架橋されないが、胃環境下で分解されずそして不溶性であり、従って、動物の胃の低いｐＨ条件下の間、粒子の中身を保護することができる。

アルギン酸塩は、１，４‐結合β‐Ｄ‐マンヌロン酸（Ｍ）、α‐Ｌ‐グルロン酸（Ｇ）、及び交互（MG）ブロックの様々な割合を含む。アルギン酸塩溶液の粘度は、Ｍ／Ｇブロックのモル比によって、通常決定される。低粘度アルギン酸塩は、典型的には、最低５０％のマンヌロン酸ユニットを有し、そして２０〜２００ｍＰａの粘度範囲を有する。中又は高粘度アルギン酸塩は、最低５０％のグルロン酸ユニットを含み、そしてそれらの粘度は、典型的には、２００ｍＰａ超である。

いくつかの実施態様では、ポリマーを形成するマトリックスは、アルギン酸塩、ペクチン、又はそれらの混合物である。低粘度等級アルギン酸塩、及び低メトキシペクチンが、好ましい。典型的には、低メトキシペクチンは、５０％未満のメチル化度を有し、そしてそれらは、典型的には、二価の陽イオン、例えば、Ｂａ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｒ、又はＺｎと架橋される。

１つ以上の腸溶コーティングポリマーは、典型的には、粒子の重量の少なくとも１０％（水を除く）、少なくとも２０％、又は少なくとも３０％を構成する。典型的には、それらは、最大７０％、最大５０％、又は最大４０％である。

任意成分
いくつかの実施態様では、組成物は、主要な生物活性剤に加えて、任意により、栄養素、栄養補助物質、摂餌誘引物質、及び／又は味覚（taste）マスキング化合物を含む。浸透促進剤、又はアジュバントが、また、強い免疫応答を引き起こし、そして粘膜リンパ球による抗原取り込みを改善するために、含まれてもよい。アジュバントの１つの例は、ベータグルカンである。

組成物の製造
粒子製造の第一の一般的な方法は、以下の通りである。分散された生物活性剤、及び粘膜付着性ポリマーを含む水性混合物を、油と均質化し、油中で水性混合物のエマルジョンを生成する。典型的には、エマルジョンを生成するために、１重量部の水性混合物に対して１．１〜５重量部の油の割合で使用される。エマルジョンは、その後、腸溶コーティングポリマーを含む水溶液中で、スラリー化され、そしてスラリーは、腸溶コーティングポリマーのための架橋剤を含む水溶液中に、噴霧され、滴下され、又は注入されて、粒子を形成する。

第二の一般的な方法では、分散された生物活性剤を含む水性混合物は、油と均質化され、油中で水性混合物のエマルジョンを生成する。典型的には、エマルジョンを生成するために、１重量部の水性混合物に対して１．１〜５重量部の油の割合で使用される。エマルジョンの液滴が、次に、水性粘膜付着性ポリマー中に分散され、そしてそれは架橋され、任意により、架橋溶液から分離されてもよい、中間体粒子を形成する。分離された又は分離されていない中間体粒子は、その後、腸溶コーティングポリマーを含む水溶液中で、スラリー化される。粒子は、噴霧乾燥、又は凍結乾燥、及び粉砕により形成される。

組成物を製造するための１つの特定の方法では、粘膜付着性ポリマーと結合した生物活性剤の分散された粒子を含む油は、任意により１〜３％の低メトキシペクチンを含む、低粘度等級アルギン酸ナトリウムの５〜１５％溶液中にスラリー化され、そしてスラリーは、二価の陽イオン、例えば、塩化カルシウムの水溶液中に注入され、滴下され、又は噴霧される。生じたマトリックス粒子の大きさは、塩化カルシウム溶液中へのアルギン酸塩分散の送達割合、及び方法によって調節することができる。他の実施態様では、スラリーは、当業者に公知の任意の乾燥方法、例えば、噴霧乾燥又は真空乾燥を使用して、アルギン酸塩を架橋させずに乾燥させる。典型的には、生じた粒子は、約２０μｍ〜約８ｍｍ、より典型的には、約５０μｍ〜約１０００μｍのサイズに分布する。

代替的な特定の方法では、二価の陽イオン、例えば、ＣａＣＯ₃の０．５〜２％の不溶性源が、アルギン酸ナトリウム溶液中の生物活性剤含有油滴のスラリーに添加され、次に、酸性化剤として、０．５〜１％の弱い有機酸、例えば、グルコノデルタラクトン（GDL）を添加して、陽イオン、例えば、カルシウムイオンを徐々に放出させる。陽イオンは、アルギン酸塩を架橋して、固体ケーキゲルを形成し、そしてそれは、小さな塊、又は粒子に刻むか、又は粉砕することができる。典型的には、生じた塊、又は粒子は、約５０μｍ〜約１０ｍｍ、より典型的には、約１００μｍ〜約５０００μｍのサイズに分布する。当業者であれば、他の天然、又は合成ポリマー、好ましくは、アニオン性ポリマーが、イオン相互作用に基づく親和性を使用し、本願発明の主成分を形成するために、利用することができることを、理解するであろう。

組成物の用途
本願発明の組成物は、水性懸濁物中に貯蔵されるか、又は当業者に公知の任意の乾燥方法で乾燥させることができ、そして活性を顕著に失わずに、長期間、脱水状態で貯蔵することができる。

本願発明の組成物は、飲料水の成分として、食品添加物として、又は医薬的に許容される担体、及び任意により、アジュバントを含むワクチン製剤の一部として、経口投与することができる。あるいは、本願発明の組成物は、他の標準的な経口投与形態を含むことができる。当業者であれば、標的動物に組成物を送達するのに適した、様々な当該技術分野で認識される食品、飼料、栄養補助食品、又は医薬投与形態、及び許容される担体があることを理解するであろう。

本願発明の組成物の投与は、単回又は複数回投与プロトコールで行うことができる。１つの実施態様では、免疫原性組成物は、約３日〜約１０日以上の期間にわたって投与される複数回投与プロトコールにおいて投与され、そして標的種の免疫の喪失した時に、周期的に繰り返すことができる。

ブタ、家禽、ウシ、又は水性動物において使用するための飲料水での適用のために、追加の油、不活性のポリプロピレン又はポリエステル粒子が、水産養殖槽における送達のための給水装置が、本願発明の組成物を送達するために使用できるように、組成物中に組み込まれて、浮力（すなわち、密度の低減）を増加させることができる。

従って、本願発明の組成物は、動物に、それらの日常の試料の成分として、又はそれらの飲料水の成分としてのいずれかで、投与することができる。

実施例１ａ
本願発明の組成物の調製
本願発明の組成物を以下のように調製した。３ｇの粘膜付着性ポリマー（キトサン，FMC Biopolymers Inc.）を、１００ｍｌの０，５Ｎの氷酢酸溶液に、５０℃で溶解した。溶液のｐＨを、水酸化ナトリウムで５．８に調節し、そして溶液を、室温に冷却した。Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％，Sigma, St Louis, MO）及び消泡剤（０．５％，Sigma, St Louis, MO）を添加し、そしてキトサン溶液を、使用まで４℃に保持した。３００ｍｇのオボアルブミン（「OVA」，モデルワクチン）を含む３０ｍｌの溶液を、キトサン溶液に添加して、混合物を生成した。生じた溶液を、５％のＳｐａｎ‐８０（Sigma）を含む１９５ｇのオリーブオイルに添加し、そして１０，０００ｒｐｍで３０分間、氷浴中で均質化して、油中水型エマルジョンを形成させた。２０ｍｌの水性トリポリリン酸ナトリウム（５％）及び０．５ＮのＮａＯＨを、連続油相において、オボアルブミン及び架橋キトサン微粒子を含む生物活性剤エマルジョンに混合しつつ徐々に添加した。粒子を、少なくとも２時間、硬化させたが、油相から除去しなかった。

油中の粒子の分散物を、６６ｇのオリゴ糖（インスタント イヌリン，Cargill，Minneapolis，MN）、１０ｇのレシチン、及び３ｇのＴｗｅｅｎ８０も含む低粘度等級アルギン酸ナトリウム（FMC Biopolymers Inc.）の、３３０ｍｌの９％の水溶液中で撹拌した。生じた水性分散物を、５％のＣａＣｌ₂を含む架橋溶液中に注入して、それぞれ、オボアルブミン及び架橋キトサンの微粒子を含んだ複数の油滴をそれぞれ含む、アルギン酸マトリックスビーズを形成させた。ビーズを凍結乾燥させ、そして１５０μｍ未満の大きさの粒子に粉砕して、本願発明の乾燥組成物を得た。

実施例１ｂ
本願発明の組成物を形成するための代替方法は、油中の水性生物活性溶液のエマルジョンを利用する。１００ｍｇのオボアルブミンを含む１０ｍｌの水溶液を、５％のＳｐａｎ‐８０を含む、１５ｇのキャノーラ油を組み合わせ、そして均質化して、油エマルジョンにおける微細水粒を形成させた。エマルジョンを、１００ｍｌの３％キトサン水溶液と混合し、そして分散物を、５％トリポリリン酸溶液（５％ TPP）を含む架橋溶液中に注入した。粒子を、少なくとも２時間、硬化させた。生じた固体架橋キトサン粒子は、埋め込まれた液滴を含み、そしてこれらの油滴のそれぞれが、水性オボアルブミンの１０μｍより小さい液滴を分散していた。固体粒子を濾過により分離し、そして最後に、９％の低粘度等級アルギン酸塩の水溶液４００ｍｌ中に分散させた。生じた水性分散物を、５％のＣａＣｌ₂を含む架橋溶液中に注入して、アルギン酸マトリックスビーズを形成させた。ビーズを凍結乾燥させ、そして１５０μｍ未満の大きさの粒子に粉砕して、本願発明の乾燥組成物を得た。

実施例２
免疫原性組成物の調製
キトサン（３ｇ，FMC Biopolymer）を、０．５Ｎの氷酢酸の溶液１００ｍｌに、５０℃で溶解した。溶液のｐＨを、水酸化ナトリウムで５．８に調節し、そして溶液を、室温に冷却した。モデルワクチンとして１００ｍｇのオボアルブミン（OVA）を含む１０ｍｌの溶液を、５０ｍｇの免疫刺激剤（ベータグルカン，AHD International Atlanta，GA）と混合し、そしてキトサン溶液中に添加した。生じた混合物を、５％ ｗ／ｗのＳｐａｎ‐８０を含む、１５０ｇのサメスクアラン油（Jedwards International）中で、１０，０００ｒｐｍで、３０分間乳化して、連続油相において、ＯＶＡ、キトサン、及びベータグルカンの水滴のエマルジョンを形成させた。エマルジョンを、撹拌しつつ、オリゴ糖（４０ｇ，インスタント イヌリン）も含む、０．５ＮのＮａＯＨにおける、９％の低粘度等級アルギン酸ナトリウムの水溶液４００ｍｌに添加した。生じたエマルジョンを、５％のＣａＣｌ₂溶液に注入し、アルギン酸塩を架橋して、本願発明の免疫原性組成物を得た。組成物を凍結乾燥させて、そして２５０μｍ未満のサイズの粒子に粉砕した。

実施例３
魚における寄生虫感染の処置／予防のための組成物の調製
魚における寄生虫感染の処置のためのタンパク質抗原又は殺寄生虫化合物を含む組成物を調製する。１０ｍｇの生物活性剤を、上記実施例２に記載したような３％のキトサン水溶液１０ｍｌ中に溶解し、そして７５％のオリーブオイル、２０％のスクアラン油、及び５％のＳｐａｎ‐８０を含む、１５ｇの油混合物において乳化する。

１ｍｌの水性５％トリポリリン酸ナトリウム、０．５ＮのＮａＯＨ溶液を、１ｇのオリーブオイルにおいて乳化させ、そして生物活性剤エマルジョンに混合し、生物活性剤及び架橋キトサンを含む粒子の油における分散物を得る。分散物を２時間放置して、架橋キトサンを硬化させる。生じた油中の粒子の分散物を、撹拌しつつ、９％の低粘度等級アルギン酸ナトリウム、１％の低メトキシペクチン、３０％ ｗ／ｗのインスタント イヌリン、及び１％のＴｗｅｅｎ‐８０を含む、２０ｍｌの溶液に添加する。生じた混合物を、３％のＣａＣｌ₂を含む架橋溶液中に注入し、それぞれ、生物活性剤及び架橋キトサンの微粒子を含む、埋め込まれた分散された油滴を含む、アルギン酸‐ペクチンマトリックスのビーズを形成させる。ビーズを凍結乾燥させ、そして１５０μｍ未満に粉砕して、本願発明の乾燥組成物を得る。

実施例４
薬剤を含む組成物の調製
結腸疾患を処置するための薬剤（グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン）を含む組成物を調製する。薬剤を、実施例１又は２で記載されたようなキトサン溶液に添加し、そして９５％のスクアラン及び５％のＳｐａｎ‐８０中で乳化させる。スクアラン油中の０．５ＮのＮａＯＨにおける５％のトリポリリン酸ナトリウムを含むアルカリエマルジョンを調製し、そして生物活性エマルジョンにゆっくりと混合し（２０％ｗ／ｗ）、キトサンを架橋して、混合物を少なくとも２時間放置して、架橋粒子を硬化させる。キトサン微粒子の油分散物を、腸溶コーティングポリマー（３０％ｗ／ｗのオイドラギット（EUDRAGIT）（登録商標）FS30D，Evonik Industries）を含む溶液に、１：３のエマルジョン／オイドラギット溶液で、混合し、そして噴霧乾燥させて、本願発明の乾燥粒子組成物を形成させる。

実施例５
本願発明の組成物中の生物活性剤のカプセル化効率
本願発明の組成物における追加の油分散物及び腸溶コーティングポリマーマトリックスの効果を、オボアルブミン（OVA）を使用して、典型的なタンパク質剤又はワクチンをシミュレートするために評価した。３つのＯＶＡ（Sigma）を含む組成物を調製した。ＯＶＡ結合キトサン微粒子からなる組成物１を、１００ｍｇのＯＶＡを３％のキトサン溶液１０ｍｌに溶解し、溶液を１０％の水性ＴＰＰに注入し、架橋ビーズを形成させて、次に2時間保持してビーズを硬化させて、続いて凍結乾燥させて、そして破砕することで調製した。組成物２を、３％のＳｐａｎ‐８０を含む１５ｇのスクアラン油中に１００ｍｇのＯＶＡを含む１０ｍｌの水溶液を乳化し、そして３％キトサン溶液２０ｍｌ中で、生じたエマルジョンを混合することにより生成した。上記のように、生じたスラリーを、次に、１０％ＴＰＰ溶液に注入し、ビーズを形成させ、続いて硬化させ、凍結乾燥させて、そして破砕した。本願発明のＯＶＡ結合キトサン微粒子からなる組成物３を、実施例２のように調製した。

３つの種類の組成物中のＯＶＡのカプセル化効率を、以下のように決定した。それぞれの組成物５００ｍｇを、１０ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液に分散させて、そして室温で３０分間、インキュベートした。懸濁物を５分間ボルテックスし、そして次に、３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。上清を、以下のように、ウェスタンブロッティングを使用して、ＯＶＡ含量をアッセイした。

ウェスタンブロッティング：組成物を、上記のように、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、そしてサンプルあたり１２μｇのタンパク質に相当する計算された量を、１０％のＳＤＳ‐ポリアクリルアミドグラジエントゲル（SDS-PAGE，Bio-Rad，Hercules，CA）にロードした。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad）に転写し、そして０．５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むＰＢＳ（PBS-T）における５％の脱脂乳で１時間ブロッキングした。ブロットを、室温で1時間、適切な一次抗体（１：５０００希釈）でインキュベートした。ＰＢＳ‐Ｔで洗浄した後（それぞれ、３×１０ｍｌ、５分）、膜を、１時間、適切なＨＲＰ‐コンジュゲート二次抗体（EMD Millipore Corporation，Billerica，MA，USA）（１：５０００希釈）でインキュベートした。ＰＢＳ‐Ｔで洗浄した後（それぞれ、３×１０ｍｌ、５分）、化学発光フィルムを、ＥＣＬ基質（Amsheram Biosciences）で、現像した。ＯＶＡのカプセル化効率（ＯＶＡの元の量の保持率（％））を、表１に示す。

結果は、単純な水性環境への生物活性剤の浸出（喪失）の阻止について、組成物２及び３における油分散物の保護効果を示す。しかしながら、以下の実施例７に記載のように、胃条件下で試験した場合、比較組成物２と本願発明の組成物３との間で、有意差を見出した。

実施例６
人工胃液における非保護タンパク質抗原の分解
典型的な胃曝露後のタンパク質抗原の活性の喪失を評価するために、非カプセル化ＯＶＡ（１０ｍｇ）を、振とう機で、ｐＨ２の、０．０８％のペプシンを含む人工胃液１０ｍｌ中で、３７℃で２時間、インキュベートした。媒体を、１５分、３０分、６０分、及び１２０分のインキュベーション時間で回収し、そして残存ＯＶＡの量を、上記のようにウェスタンブロッティングを使用して分析した。表２は、曝露前活性に対する残存活性（％）として示された、人工胃液に２時間曝露したＯＶＡの分解を示す。

これらの結果は、非保護タンパク質ベース抗原又は生物活性剤の活性が、動物の消化管で完全に低下することを示す。

実施例７
本願発明の組成物中の生物活性剤の胃保護
胃曝露後のタンパク質抗原の残存活性を評価するために、３つの組成物を、実施例５に記載したように調製した。それぞれ、５００ｍｇの３つの組成物を、振とう機で、ｐＨ２の、０．０８％のペプシンを含む人工胃液１０ｍｌ中で、３７℃で２時間、インキュベートした。２時間の曝露後、胃溶液を回収し、そして組成物中のＯＶＡの残存活性を、実施例５に記載のように測定した。表３は、人工胃液に２時間曝露後の、それぞれの組成物におけるＯＶＡの残存活性を示す。

これらの結果は、従来技術で調製された組成物１及び２と比べて、本願発明の組成物３が、優れた胃保護効果を有することを明確に示す。

実施例８
胃保護に与える組成物中のアルギン酸の粘度等級の効果
９％の低粘度等級アルギン酸（５０ｃＰ）、６％の中粘度等級アルギン酸（３００ｃＰ）、及び１％の高粘度等級アルギン酸（８００ｃＰ）を含む３つの組成物を、実施例２に従って調製した。３つの組成物を、実施例７に記載のように人工胃液に曝露し、そして組成物中のＯＶＡの残存活性を、実施例５に記載のように測定した。表４は、人工胃液に２時間曝露後のそれぞれの組成物中のＯＶＡの残存活性を示す。

これらの結果は、低粘度等級アルギン酸を含む組成物が、人工動物消化管において、タンパク質ベース抗原又は生物活性剤のより高い保護を提供することを示す。

実施例９
本願発明の組成物の最適な粒径
本実施例では、乾燥させそして破砕した本願発明の組成物の、人工胃環境での、粒径の保護効果を評価した。ＯＶＡ組成物を、実施例５に記載されたように調製し、続いて、乾燥粉末を２つの粒径：５０μｍのスクリーンを通過した小さな粒子、及び１００μｍのスクリーンは通過したが、５０μｍのスクリーンで捕えられた大きな粒子に分けた。表５は、人工胃液に２時間曝露後の、それぞれの粒径の組成物中のＯＶＡの残存活性を示す。

これらの結果は、乾燥組成物が、５０μｍ以上の粒径に粉砕された場合、最適な胃保護が提供されることを示す。

実施例１０
マウスへのＯＶＡ組成物の経口投与
免疫応答の誘導における本願発明の効果を試験するために、オボアルブミンをマウスに経口投与する。

動物：１０週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用する。マウスを、自由摂餌で飼育する。それぞれの実験群を、個別のケージに入れる。

オボアルブミン組成物：オボアルブミン（１ｍｇ／ｇのオボアルブミン，Sigma，St．Louis，MO）を、実施例５に記載のように、本願発明の組成物中に組み込む。３群（各４匹）のそれぞれを、以下のように接種する：１）組成物におけるＯＶＡを経口投与、２）ＯＶＡ溶液を皮下（SC）投与、及び３）抗原を含まない組成物を経口投与。マウスを、０及び３週目で接種する。それぞれの投与量は、飼料ペレット上を被膜した、１：２ｗ／ｗの乾燥組成物／油の比率で、コーン油と混合した、全部で１００ｍｇの乾燥組成物を投与する。それぞれのマウスを４週で安楽死させ、そして血清及び脾臓細胞を採取する。

免疫学的アッセイ：血清を、ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＧ及びＩｇＡについてアッセイする。ＥＬＩＳＡを、ポリスチレンプレートに吸着させたＯＶＡを使用して行う。サンプルを、血清について１：２５希釈で、３連でウェルに入れる。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体、続いて、オルトフェニレンジアミン基質（Sigma，St．Louis，MO．USA）を使用する。それぞれのウェルの光学濃度を、マイクロタイタープレート分光光度計を置いて４９０ｎｍでプレートを読み取ることで決定する。脾臓細胞を、以前に記載した手法を使用して、ＯＶＡに特異的な抗体分泌細胞（ASC）について試験する。

ＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を、経時的に、光学濃度の増加を決定することにより、定量化する。ＯＶＡで接種されたそれぞれのマウスについて、ＯＶＡ特異的血清及びＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＡＳＣ分泌細胞が、ＯＶＡを注射されたマウス及び本願発明の組成物を経口的に摂取したマウスにおいて、同等に増加することが期待される。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ又はＩｇＡ抗体は、抗原を含まない組成物を摂取したマウスにおいて、全く検出されないはずである。従って、本願発明の組成物は、経口投与で、免疫応答を誘導するために効果的であるはずである。

実施例１１
ニワトリへの抗原を含む組成物の経口投与
サルモネラ エンテリティディス（Salmonella enteritidis）は、産卵鶏における疾患の主な原因である。感染は、群れにおいて、生産を低下させ、そして死亡率を増加させる。さらに、サルモネラ エンテリティディス（S. enteritidis）は、卵を経て初生雛に行くことができ、次の世代又は感染した卵を消費したヒトに感染することができる。感染は、腸粘膜に付着しそして侵入するこの細菌によって開始し、そして長期間の感染が、腸のリンパ組織の感染に関与するので、粘膜免疫の刺激は、この疾患を制御するために、不可欠である。

本願発明のワクチン組成物でのニワトリのワクチン接種の効率を評価するために、重要な免疫原である、サルモネラ エンテリティディスのフラジェリンを、ワクチンエマルジョンを、１：２ｗ／ｗの比率で、アルカリアルギン酸ナトリウム相中で混合し、そしてスラリーを噴霧乾燥させること以外、実施例２に従って、組成物中に組み込む。乾燥組成物を、飼料に上塗りし、そして雛鳥に経口投与する。１０週齢のニワトリは、３００μｇのサルモネラ エンテリティディスのフラジェリン抗原又はウシ血清アルブミンのいずれかを組み込んだ組成物を、２週間の間隔で、３回の経口投与を受ける。抗原の最後の経口投与の1週間後、血清及び腸液を採取し、そしてＥＬＩＳＡで、フラジェリン特異的抗体についてアッセイする。結果は、経口ワクチン接種されたトリが、血清において、フラジェリン特異的抗体を有意に増加させるはずである。

実施例１２
ウシへの抗原を含む組成物の経口投与
ウシの肺で免疫応答を刺激するための、本願発明に従って調製される、経口投与されるオボアルブミンを含む組成物の有効性を示す。

オボアルブミンを、実施例１ａに記載されたような組成物中に組み込む。ウシへの経口投与のために、１ｍｇあたり４０μｇのオボアルブミンの量を含む組成物を、飼料で投与する。１試験群あたり４匹のウシを使用し、そしてそれぞれのウシは、１投与あたり５ｍｇのオボアルブミンを、５日連続で与えられる。

２つの群のウシを使用し、特異的な免疫応答を誘導する経口投与されたオボアルブミンの有効性を評価する。
群１は、３週間隔で、皮下（SC）注射により、２投与量のフロイント不完全アジュバント中のオボアルブミンを与えられる。この群は、非経口対照、任意のワクチンのためにルーチンで使用されるワクチン接種の方法としての役割を果たす。群２は、３週間隔で、オボアルブミンを含む組成物の２つの経口投薬計画を受ける。血清を、オボアルブミンに対するアイソタイプ抗体応答のために評価する。結果は、有意な量のＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが、ＯＶＡ含有組成物で経口飼育されたウシにおいて、産生されることを示すはずである。期待された非常に高いレベルの血清ＩｇＡが、ウシにおける全身免疫応答の刺激において、非常に有効であると予測される。

実施例１３
魚へのビブリオ抗原を含む組成物の経口投与
ビブリオ アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）は、養殖における深刻な細菌感染であり、特に、ニジマスで深刻である。現在、すべてのマス生産国で流行しており、深刻な経済的損失を引き起こす可能性がある。主に、淡水での養殖段階で、養殖のサケのより重大な病原体となってきてもいるが、同様に、海において損失を引き起こすことが報告されている。ワクチン接種は、ビブリオ アルギノリチカス（V. alginolyticus）が、サケの養殖サイクルの任意の段階で、重大な影響を与えるのを防止することができる。典型的なワクチン接種プログラムは、２〜５ｇの稚魚の一次ワクチン接種、及び一次ワクチン接種の４〜６月後の追加経口免疫を含む。しかしながら、理想的なワクチン接種プログラムは、全ての養殖期間を通じて魚の血清中の有効な抗体力価を維持するために、魚に定期的に提供される１種類のみのワクチン接種を含む。

実験計画：マスの血清中で免疫応答を刺激するための、本願発明に従って調製される、経口投与されるＥＲＭワクチンを含む組成物の有効性を示す。

弱毒化ビブリオ アルギノリチカスを、実施例１ｂで記載されるような組成物中に組み込む。魚への経口投与のために、１ｍｇあたり2μｇのビブリオ アルギノリチカスワクチン量を含む組成物を、飼料において投与する。２０匹の５ｇの平均サイズの魚を、実験群ごとに使用し、そして魚それぞれに、５日連続で、１投与量のビブリオ アルギノリチカスワクチンを、飼料で与える。

３群の魚を、注射による標準的なワクチン接種と比較して、免疫応答を誘導する経口投与ビブリオ アルギノリチカスワクチンの有効性を評価するために使用する。群１は、注射プロトコールによるワクチン接種を使用して、ワクチン接種される。この群は、非経口対照、任意のワクチンのためにルーチンで使用されるワクチン接種方法としての役割を果たす。群２は、ビブリオ アルギノリチカスワクチンを含む組成物の１つの経口投薬計画を受ける。群３は、ワクチンを含まない組成物の１つの経口投薬計画を受ける。血清を、ワクチン接種６週間後、ビブリオ アルギノリチカスに対するアイソタイプ抗体応答について評価する。結果は、有意な量のビブリオ アルギノリチカス特異的ＩｇＡが、ビブリオ アルギノリチカス含有組成物で、経口で飼育された魚において産生されるはずである。経口及び注射でワクチン接種された両方の魚における免疫応答が、同等であることが期待される。期待された非常に高いレベルの血清ＩｇＡが、魚における全身免疫応答の刺激において、非常に有効であると予測される。

実施例１４
殺鼠剤を含む組成物
ワルファリンは、ラット及びマウスの侵入を制御するために使用される最も一般的な殺鼠剤である。ワルファリンを含む餌を摂取した齧歯類は、１５〜３０分で、明確な中毒症状を示し、そして１〜２時間で、意識不明になる。しかしながら、その即効性のために、齧歯類は、典型的に、致死未満量のワルファリンを摂取し、そして８時間以内に回復が起こる。ワルファリンのカプセル化は、症状の発症を遅らせることができ、十分な致死量を消費させることを可能にする。

実験方法：１０〜１２週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用する。マウスを、自由摂餌で飼育する。それぞれの実験群を、個別のケージに入れる。

本願発明のワルファリン組成物：ワルファリン（４００ｍｇ／ｇの組成物，Sigma，St．Louis，MO）を、実施例３で一般的に記載されたような組成物中に組み込む。３群（各４匹）を、以下のように自由摂餌する：１）４％のワルファリン活性で餌中に混合した、本願発明のワルファリン組成物、２）４％のワルファリン活性で餌中に混合した、非カプセル化ワルファリン、及び３）ワルファリン及び他の生物活性剤を含まない、実施例３に記載されたような組成物を含む餌。摂餌量及びマウスの殺効果を監視する。

結果は、群１及び３の摂餌量は同程度であるが、群２の摂餌量（非カプセル化ワルファリン）は、２５％以上少ない。群１の全てのマウスが、摂餌８時間後、死亡するが、群２の全てのマウスは、摂餌８時間後、生きているはずである。

Claims (14)

1. 水生又は陸生種への生物活性剤の経口投与のための組成物であって、粒子それぞれが水溶液中の生物活性剤及び粘膜付着性ポリマーを含む粒子を含み、前記水溶液は、油滴中に分散されており、前記油滴が、腸溶コーティングポリマーを含むマトリックス中に分散されるか、又は腸溶コーティングポリマーを含むマトリックスにより被膜され、油の質量は、生物活性剤及び粘膜付着性ポリマーの混合質量よりも大きく、
   ここで、前記粘膜付着性ポリマーは、カラギナン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、任意のこれらの誘導体又は修飾物、カルボン酸官能性ポリマー、硫酸官能性ポリマー、及びアミン官能性ポリマーからなる群から選択される１つ以上のポリマーであり、そしてここで、前記腸溶コーティングポリマーは、ポリ（メタ）アクリル酸、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、及び酢酸フタル酸セルロースからなる群から選択される１つ以上のポリマーである、組成物。
2. 前記腸溶コーティングポリマーが架橋されている、請求項１に記載の組成物。
3. 前記腸溶コーティングポリマーのための架橋剤が、二価の金属陽イオンである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記粘膜付着性ポリマーが架橋されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記粘膜付着性ポリマーにおける架橋が、トリポリリン酸との会合により形成される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記粘膜付着性ポリマー及び生物活性剤が結合している、請求項５に記載の組成物。
7. 前記粒子が、５０μｍ以上の直径である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記生物活性剤が免疫原である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記腸溶コーティングポリマーマトリックスが、低粘度等級アルギン酸、低メトキシペクチン、又はそれらの混合物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 油が、脂肪、油、及びワックスからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記油が、植物油、又は動物油である、請求項１０に記載の組成物。
12. 請求項１に記載の組成物を調製するための方法であって、前記方法が、順番に以下の工程：
    （ａ）分散された又は溶解された生物活性剤を含む水性混合物を形成させ；
    （ｂ）油中で工程（ａ）の前記水性混合物を均質化して、前記油中で水性混合物のエマルジョンを産生させ；
    （ｃ）水溶液中で、腸溶コーティングポリマーを含む、工程（ｂ）の産生物のスラリーを形成させ；そして
    （ｄ１）前記腸溶コーティングポリマーのための架橋剤を含む水溶液中に、工程（ｃ）の前記スラリーを、噴霧し、滴下し、又は注入して、粒子を形成させる、ここで工程（ａ）の前記水性混合物が、粘膜付着性ポリマーをさらに含む、又は
    （ｄ２）工程（ｃ）の前記スラリーから粒子を形成させる、ここで工程（ｂ）が、水性粘膜付着性ポリマーにおいてエマルジョンの液滴を形成させ、そして前記粘膜付着性ポリマーを架橋させて、中間体粒子を形成させることをさらに含む
    ことを含む、方法。
13. 非ヒト動物への生物活性剤の胃以降への送達方法であって、前記動物に、請求項８に記載の組成物を経口投与する工程を含む、方法。
14. 水生又は陸生の非ヒト種のワクチン接種方法であって、前記水生又は陸生種に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物を経口投与する工程を含み、ここで、前記組成物が、ワクチンのための送達ビヒクルである、方法。