BR112016012838B1 - Composição para a administração oral de um agente bioativo incluindo partículas que compreendem um agente bioativo e um polímero mucoadesivo em uma solução aquosa, e, método de preparação da composição - Google Patents

Composição para a administração oral de um agente bioativo incluindo partículas que compreendem um agente bioativo e um polímero mucoadesivo em uma solução aquosa, e, método de preparação da composição Download PDF

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Abstract

COMPOSIÇÃO PARA A ADMINISTRAÇÃO ORAL DE UM AGENTE BIOATIVO INCLUINDO PARTÍCULAS QUE COMPREENDEM UM AGENTE BIOATIVO E UM POLÍMERO MUCOADESIVO EM UMA SOLUÇÃO AQUOSA, E, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a uma composição para a administração oral de um agente bioativo a espécies aquáticas ou terrestres, a qual inclui partículas, cada uma das quais inclui um agente bioativo disperso em gotas de óleo, em que as gotas de óleo são dispersas em uma matriz que inclui um polímero de revestimento entérico, em que cada uma das partículas também inclui um polímero mucoadesivo. Também são providos os métodos de produção e uso da composição.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO
[0001] O presente pedido de patente reivindica o benefício da prioridade do Pedido de Patente U.S. no. 61/912.958, depositado em 06 de dezembro de 2013, cuja totalidade é incorporada no presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A administração oral de fármacos e vacinas oferece diversas vantagens. As dosagens podem ser administradas a um grande número de animais através da ração ou da água com confinamento e trabalho mínimos. O confinamento também estressa os animais, o que torna o fármaco ou a vacinação menos eficaz e aumenta o risco de doença infecciosa. Para animais produtores de carne, a administração oral tem uma outra vantagem, uma vez que evita reações no local da injeção. As agulhas quebradas, a contaminação do local da injeção ou o uso de adjuvantes altamente reativos podem induzir a abscessos que danificam a carcaça e as peles. Essas reações diminuem o valor do animal no abate. Este também é um problema nos programas de vacinação de peixes onde os peixes precisam ser colhidos de seus tanques ou gaiolas a mar aberto e ser injetados individualmente. A inoculação oral é rápida e eficiente e elimina a necessidade da manipulação múltipla dos animais para administrar inoculações de reforço subsequentes. As reações imunológicas adversas que seguem a administração oral também têm muito menos probabilidade de ocorrer e, portanto, mais seguras.
[0003] A vacinação oral é uma maneira particularmente econômica para vacinar ou tratar um grande número de peixes de uma vez em sistemas de aquicultura de peixes, com stress ou trabalho mínimo. Isto é especialmente verdadeiro quando a administração oral da vacina pode ser realizada através de ingestão durante a alimentação/bebida. Além disso, as vacinas orais podem ser manufaturadas de modo mais econômico do que as formulações vacinais injetáveis por causa do menor número de etapas de purificação necessárias para gerar uma vacina oral. A vacinação oral também oferece a vantagem de poucos efeitos colaterais tais como o stress ou outras reações à injeção.
[0004] Apesar das vantagens da administração oral dos fármacos e em particular das vacinas, o desenvolvimento da tecnologia foi retardado pela falta de sistemas de aplicação de vacina adequados. Na ausência de sistemas de aplicação apropriados, a maior parte das vacinas orais é sujeita à degradação no trato gastrointestinal (GI), especialmente sob condições de estômago de baixo pH, resultando em uma absorção limitada, o que resulta por sua vez em respostas imunonológicas insuficientes.
[0005] Historicamente, a imunização vem sendo baseada na indução de imunidade humoral mediante a administração parenteral de vacinas. Os anticorpos induzidos por administrações parenterais, no entanto, alcançam necessariamente as superfícies de mucosa, os sítios de entrada da maioria dos agentes infecciosos. A imunidade da mucosa, que se desenvolve em superfícies de mucosa incluindo o intestino, o pulmão, a boca, o olho, a glândula mamaria e o trato geniturinário, e também a pele e a guelra nos peixes, em consequência do contato do antígeno com tecidos da mucosa, é uma primeira linha de defesa importante contra os agentes infecciosos.
[0006] Vários veículos foram desenvolvidos para a aplicação de fármacos ou vacinas aos tecidos da mucosa do intestino. Polímeros biodegradáveis, tais como poli-(DL-lactide) e poli-(DL-lactide-co- glicolide), têm sido usados para produzir composições para a administração oral de antígenos. No entanto, a produção dessas partículas de polímero requer o uso de solventes que podem danificar antígenos frágeis. Além disso, o uso de solventes impede a incorporação de organismos vivos atenuados, tais como vírus ou bactérias, dentro dessas composições.
[0007] Outros desafios do desenvolvimento de sistemas de aplicação oral adequados incluem a necessidade de selecionar apenas os compostos da classe de alimento ou ração e biodegradáveis e adjuvantes, e a necessidade de uma resposta imunológica de longa duração e robusta.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] Em um aspecto, a invenção provê uma composição para a administração oral de um agente bioativo a espécies aquáticas ou terrestres, incluindo partículas em que cada uma delas inclui um agente bioativo disperso em gotas de óleo, em que as gotas de óleo são dispersas em uma matriz que inclui um polímero de revestimento entérico, em que cada uma das partículas inclui ainda um polímero mucoadesivo.
[0009] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de aplicação pós-gástrica de um agente bioativo a um animal, o qual inclui uma etapa de administração oral ao animal de uma composição tal como descrito acima, em que o agente bioativo é um imunógeno.
[0010] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de vacinação de espécies aquáticas ou terrestres, o qual inclui uma etapa de administração oral à espécie de uma composição tal como descrito acima, em que a composição é um veículo de aplicação para uma vacina.
[0011] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de preparação de uma composição. O método inclui, em sequência: (a) a formação de uma mistura aquosa que inclui um agente bioativo disperso ou dissolvido; (b) a homogeneização da mistura aquosa da etapa (a) em óleo para produzir uma emulsão da mistura aquosa no óleo; (c) a formação de uma pasta do produto da etapa (b) em uma solução aquosa que inclui um polímero de revestimento entérico; e tanto (d1) a aspersão, vazamento ou injeção da pasta da etapa (c) em uma solução aquosa que contém um agente de reticulação para o polímero de revestimento entérico para formar as partículas, em que a mistura aquosa da etapa (a) também inclui um polímero mucoadesivo, quanto (d2) a formação das partículas da pasta da etapa (c), em que a etapa (b) também inclui a formação de gotas da emulsão no polímero mucoadesivo aquoso e a reticulação do polímero mucoadesivo para formar partículas intermediárias.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0012] A menos que esteja definido de alguma outra maneira no presente documento, as terminologias científicas e técnicas empregadas na presente invenção terão os significados que são normalmente compreendidos e usados por um elemento versados no estado da técnica. Além disso, tal como usado no presente documento e nas reivindicações, os termos "pelo menos um" e "um ou mais" têm o mesmo significado e incluem um, dois, três ou mais. A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, as porcentagens ou partes dos componentes nas composições são em uma base em peso. O termo "disperso" significa suspenso e/ou dissolvido.
[0013] "Vacinação oral" é definida como a administração oral através da dieta do material imunogênico para estimular o sistema imunológico sistêmico de um animal para desenvolver uma resposta imunológica específica a um patógeno.
[0014] "Reticulação" e as suas variantes referem-se à ligação de dois ou mais materiais e/ou substâncias, que incluem qualquer um daqueles divulgados no presente documento, através de uma ou mais associações covalente e/ou não covalentes (por exemplo, iônicas). A reticulação pode ser efetuada naturalmente (por exemplo, ligações bissulfeto de resíduos de cistina) ou através de vias sintéticas ou semissintéticas. A reticulação de polímeros carregados pode ser efetuada pela associação iônica com um contraíon polivalente de carga oposta. Estruturas sólidas firmes, por exemplo hidrogéis, podem ser preparadas por tal reticulação.
[0015] "Proteção gástrica" refere-se à proteção de um agente bioativo contra a destruição gástrica e a perda de atividade.
[0016] As composições da invenção incluem materiais particulados que compreendem um agente bioativo e um polímero mucoadesivo, em que o agente bioativo é disperso em um óleo. As gotas de óleo são por sua vez inseridas em, ou revestidas por, uma matriz externa de um polímero de revestimento entérico. A matriz externa circunda as gotas de óleo, protegendo o conteúdo contra a exposição às condições de baixo pH no estômago do animal, uma vez que o polímero permanece insolúvel a um pH baixo e permanece intacto como um revestimento ou uma camada protetora. As partículas têm tipicamente um tamanho geométrico médio (indicado às vezes como diâmetro) em uma faixa de 10 a 5.000 μm, e podem tanto ser formadas diretamente nessa faixa de tamanho quanto ser reduzidas a esse tamanho por meio de trituração, moagem ou outros meios. Normalmente, as partículas têm um diâmetro menor do que 100 μm, de preferência menor do que 50 μm.
[0017] Em algumas modalidades, o polímero mucoadesivo e o agente bioativo são misturados um ao outro e em contato mútuo, associados um ao outro dentro das partículas que são por sua vez dispersas na gota de óleo. Uma ou mais dessas partícula estão presentes dentro de uma única gota de óleo, e uma ou mais gotas de óleo estão presentes dentro da matriz externa. O polímero mucoadesivo e/ou o polímero de revestimento entérico podem ou não ser reticulados.
[0018] Em outras modalidade, o agente bioativo é disperso tal como acima dentro das gotas de óleo, e estas são então inseridas no polímero mucoadesivo. As partículas resultantes são por sua vez inseridas na matriz externa do polímero de revestimento entérico. O polímero mucoadesivo e/ou o polímero de revestimento entérico podem ou não reticulados.
[0019] Em algumas modalidades, a invenção provê uma composição para a administração oral de uma vacina para estimular uma resposta imunológica em espécies aquáticas e terrestres contra doenças específicas. A composição compreende uma quantidade eficaz de um antígeno como agente bioativo. As presentes composições são projetadas para apresentar o material bioativo para o contato com a mucosa do intestino do animal para estimular a absorção e a imunidade da mucosa. As composições de acordo com a presente invenção são administradas oralmente, tipicamente com uma ração ou um veículo farmaceuticamente aceitável, que inclui, por exemplo, a água (por exemplo, água de beber do animal), comprimidos, cápsulas, formas de dosagem de bolus, pelotas de ração ou como um aditivo de alimento para conduzir a composição até o intestino da espécie visada.
[0020] As composições da invenção propiciam diversas vantagens na aplicação de um agente bioativo a um indivíduo. Em primeiro lugar, o método de produção do sistema de aplicação elimina o uso de solventes orgânicos ou temperatura e pH elevados que são requeridos frequentemente para a preparação de partículas por outros métodos. Ao manter um ambiente aquoso em condições de pH moderado e temperaturas baixas durante toda a preparação da presente composição, bioativos sensíveis tais como bactérias ou vírus atenuados vivos podem ser aplicados oralmente. Em segundo lugar, a camada adicional de polímero de revestimento entérico protege o agente bioativo contra a degradação no trato gastrointestinal. No caso de um imunógeno, isso permite a estimulação da mesma resposta imunológica com uma quantidade menor de antígeno/vacina. Em terceiro lugar, a dispersão de óleo inclui o agente bioativo, impedindo que as moléculas bioativas pequenas tais como proteínas, peptídeos e fármacos sejam lixiviadas a um ambiente aquoso durante a preparação, bem como durante a exposição gástrica. Além disso, o próprio polímero mucoadesivo confere um efeito adjuvante. Finalmente, o sistema de aplicação pode ser facilmente formulado para a aplicação eficiente a ambas as espécies aquática e terrestre.
[0021] Tipicamente, todos os componentes usados na preparação das composições da invenção são da classe de alimentos, atóxicos e biodegradáveis, e tipicamente de ocorrência natural. Segue uma descrição dos materiais úteis para preparar as composições.
Agente Bioativo
[0022] O agente bioativo pode ser um material natural, sintético, ou semissintético (por exemplo, compostos, fermentados, extratos, estruturas celulares) capaz de acarretar, direta ou indiretamente, um ou mais efeitos físicos, químicos e/ou biológicos. O agente bioativo pode ser capaz de impedir, aliviar de tratar e/ou de curar condições anormais e/ou patológicas de um corpo vivo, tal como aos destruir um organismo parasítico, ou ao limitar o efeito de uma doença ou uma anormalidade. Dependendo do efeito e/ou de sua aplicação, o agente bioativo pode ser um agente farmacêutico (tal como um agente profilático ou um agente terapêutico), um agente de diagnóstico e/ou um agente cosmético, e inclui, sem limitação, vacinas, fármacos, pró- fármacos, moléculas de afinidade, moléculas orgânicas sintéticas, hormônios, anticorpos, polímeros, enzimas, compostos proteináceos de moléculas de baixo peso molecular, peptídeos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides, lipídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, precursores dos mesmos, e derivados dos mesmos. O agente bioativo também pode ser um suplemento nutritivo. Os suplementos nutritivos não limitadores incluem proteínas, carboidratos, vitaminas solúveis em água (por exemplo, vitamina C, vitaminas do complexo B, e outras ainda), vitaminas solúveis em gordura (por exemplo, vitaminas A, D, E, K, e outras ainda), sais minerais, e extratos de ervas. O agente bioativo pode ser comercialmente disponível e/ou preparado por técnicas conhecidas.
[0023] Os agentes bioativos na presente invenção incluem, sem limitação, vacinas (as vacinas também pode ser aplicadas como parte de complexos imunoestimulantes, conjugados de antígenos com toxina de cólera e sua subunidade B, lectinas e adjuvantes), antibióticos, moléculas de afinidade, moléculas orgânicas sintéticas, polímeros, compostos proteináceos de baixo peso molecular, peptídeos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides, lipídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, precursores dos mesmos, e derivados dos mesmos. O agente bioativo também pode ser um pesticida, por exemplo, um raticida.
[0024] O agente bioativo pode ser um imunógeno, isto é, um material capaz de construir uma resposta imunológica específica em um animal. Os exemplos dos imunógenos incluem antígenos e vacinas. Por exemplo, os imunógenos podem incluir peptídeos imunogênicos, proteínas ou proteínas recombinantes, que incluem misturas que compreendem peptídeos e/ou proteínas e bactérias imunogênicos (por exemplo, bacterinas); partículas virais inativas, atenuadas e infecciosas intactas; procariotas mortos, atenuados e infecciosos intactos; os protozoários mortos, atenuados e infecciosos intactos que incluem qualquer de um se seus estágios de ciclo de vida, e patógenos multicelulares mortos, atenuados e infecciosos intactos, vacinas de subunidades recombinantes, e vetores recombinantes para aplicar e expressar os genes que codificam proteínas imunogênicas (por exemplo, vacinas de DNA).
[0025] Um ou mais agentes bioativos constituem tipicamente pelo menos 0,1% do peso das partículas, excluindo a água, ou pelo menos 1%, ou pelo menos 5%. Tipicamente, eles constituem no máximo 40%, ou no máximo 20%, ou no máximo 10%.
Polímero Mucoadesivo
[0026] O polímero mucoadesivo é um polímero que se liga especificamente aos tecidos de mucosa, e ajuda a reter o agente bioativo bastante próximo da mucosa, melhorando desse modo a administração. Os exemplos apropriados incluem polímeros sintéticos tais como o ácido poli(acrílico), a hidróxi propil metil celulose e o poli(acrilato de metila), polímeros com funcionalidade carboxila, polímeros com funcionalidade sulfato, polímeros com funcionalidade amina, e derivados ou modificações dos mesmos, bem como polímeros naturais tais como carragenina, ácido hialurônico, quitosana, guar catiônica e alginato. As versões derivatizadas ou então modificadas de polímeros naturais também podem ser usadas, e muitos de tais polímeros são conhecidos no estado da técnica. Os exemplos não limitadores incluem o alginato de propileno glicol e as pectinas, carbóxi metil quitosana, carbóxi metil quitina, metil glicol quitosana, trimetil quitosana, e outros ainda.
[0027] Um polímero mucoadesivo preferido é a quitosana e quitosana modificada ou derivatizada, as quais podem ser obtidas através da deacetilação de quitina, o composto principal dos exoesqueletos nos crustáceos. A quitosana [a-(1~4)-2-amino-2-deóxi- β-D-glucano], um mucopolissacarídeo relacionado bem próximo à celulose, exibe propriedades químicas que são determinadas pelo peso molecular, pelo grau de deacetilação e pela viscosidade. A quitosana pode formar micropartículas e nanopartículas que podem ligar grandes quantidades de antígenos pela reação química com agentes de reticulação tais como íons fosfato, glutaraldeído ou íons sulfato.
[0028] Embora a quitosana seja usada em algumas modalidades preferidas, outros polímeros podem ser usados para obter uma função mucoadesiva similar. Estes incluem, mas sem ficar a eles limitados, gelatina, alginato, dextrana, ácido hialurônico, ágar e amido resistente.
[0029] Um ou mais polímeros mucoadesivos constituem tipicamente pelo menos 1% do peso das partículas, excluindo a água, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%. Tipicamente, eles constituem no máximo 50%, ou no máximo 30%, ou no máximo 20%. Óleo
[0030] Em produtos tradicionais típicos, uma quantidade significativa de agente bioativo é perdida ao ambiente aquoso mediante a lixiviação da partícula durante a sua preparação e através da passagem gástrica, em particular agentes bioativos de tamanho molecular pequeno tais como vírus, proteínas, fármacos, antibióticos, pesticidas, e outros ainda. Na presente invenção, a lixiviação do agente bioativo da partícula é eliminada principalmente pelas partículas distintas, pelos domínios ou pelas fases que contêm o agente que está sendo disperso em, ou revestido por, um óleo. Qualquer tipo de óleo, que inclui óleos e gorduras vegetais, animais ou sintéticos na forma líquida ou sólida, ou ceras, pode ser usado para revestir o agente bioativo. Os óleos de origem vegetal usados na presente invenção incluem, sem limitação, óleo de rícino, óleo de coco, manteiga de coco, óleo de milho, óleo de caroço de algodão, azeite de oliva, esqualeno de oliva, óleo de palma, óleo de amendoim, óleo de semente de colza, óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de soja, óleo de girassol, estearato, cera de carnaúba e as misturas dos mesmos. Os óleos de origem animal usados na presente invenção incluem, sem limitação, óleos de peixes, esqualeno de tubarão, nata, cera de abelha, lanolina, banha e outros ainda. Em alguns casos, o óleo dispersante é uma mistura de esqualenos de azeitona ou de tubarão com qualquer outro tipo de óleo, gordura ou cera. Tipicamente, a massa de óleo é maior do que a massa combinada do agente bioativo e do polímero mucoadesivo.
[0031] Em um procedimento típico, uma solução aquosa que contém o agente bioativo e o polímero mucoadesivo é homogeneizada com óleo a uma razão de uma parte de solução para 1,1 a 5 partes de óleo em peso até que uma emulsão uniforme seja produzida. Para ajudar na formação de um emulsão uniforme e estável, um tensoativo não iônico pode ser adicionado. Os tensoativos não iônicos apropriados, sem limitação, incluem álcool alifático etoxilado, tensoativos de polioxietileno e ésteres carboxílicos, etc. Uma vez que uma emulsão estável é formada, as gotas aquosas dispersas no óleo são solidificadas por uma reação química ou física do polímero mucoadesivo. Por exemplo, polímeros de gelatina e ágar são solidificados ao reduzir a temperatura ou ao mudar o pH da emulsão; embora a quitosanas seja solidificada ao elevar o pH da emulsão até mais de 6,5 e/ou ao adicionar contraíons tais como o tripolifosfato de sódio (TPP).
[0032] Um ou mais óleos constituem tipicamente pelo menos 1,5% do peso das partículas, excluindo a água, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 20%. Tipicamente, eles constituem no máximo 40%, ou no máximo 30%, ou no máximo 25%.
Polímero de Revestimento Entérico
[0033] As gotas da dispersão de óleo, contendo ou então revestidas pelo polímero mucoadesivo, são dispersas em uma matriz de polímero de revestimento entérico que provê a proteção gástrica e a liberação pós-gástrica intacta ou aplicação do agente bioativo, isto é, a liberação no intestino.
[0034] Os polímeros de revestimento entéricos exemplificadores incluem os polímeros solúveis em água a um pH suficientemente alto, mas insolúveis a um pH baixo. Tipicamente, eles são solúveis a um pH de mais de 5,0, e insolúveis a um pH de menos de 4,0. Os polímeros apropriados são substancialmente solúveis ou digestíveis sob condições de um pH relativamente moderado do intestino de um animal, onde o material bioativo deve ser liberado, mas insolúveis e não digestíveis no estômago, onde a matriz externa do polímero de revestimento entérico protege o agente bioativo sensível contra a deterioração. Em alguns casos, o polímero de revestimento entérico é reticulado, por exemplo, com cátions divalentes, para impedir a dissolução ou a digestão no estômago.
[0035] Os polímeros de revestimento entérico apropriados podem ser selecionados de qualquer um de uma ampla variedade de polímeros hidrofílicos que incluem, por exemplo, ácido poliacrílico, poli(met)acrilatos, carbóxi metil celulose, metil celulose, ftalato acetato de celulose e gomas de polissacarídeos naturais ou sintéticas solúveis em água. Um polímero de revestimento entérico sintético exemplificador é EUDRAGIT® FS30D (Evonik Industries). O alginato de sódio e as pectinas são as gomas solúveis em água preferidas, por causa de suas condições de reticulação moderada.
[0036] Os alginatos provêm uma matriz de carreador hidrofílico preferida para agentes bioativo sensíveis gástricos, em particular devido à sua facilidade de utilização na formação de composições de gel sólidas. As soluções de alginato formam géis sólidos quando combinadas ou misturadas com cátions divalentes. No entanto, em algumas modalidades o alginato não é reticulado, mas permanece não digestível e insolúvel em um ambiente gástrico e, portanto, protetor do conteúdo das partículas quando sob condições de baixo pH do estômago de um animal.
[0037] Os alginatos compreendem proporções variáveis de ácido β-D-manur0nico (M), ácido a-L-gulurônico (G) ligados na posição 1,4 , e blocos alternantes (MG). A viscosidade das soluções de alginato é determinada principalmente pela razão molecular dos blocos M/G. Os alginatos de baixa viscosidade contêm tipicamente um mínimo de 50% de unidades de manuronato e a sua viscosidade varia de 20 a 200 mPa. Os alginatos de média e alta viscosidade contêm um mínimo de 50% de unidades de ácido gulurônico e a sua viscosidade é tipicamente de mais de > 200 mPas.
[0038] Em algumas modalidades, o polímero de formação da matriz é alginato, pectina ou uma mistura destes. Os alginatos do baixo grau de viscosidade e as pectinas de baixo teor de metóxi são os preferidos. As pectinas de baixo teor de metóxi típicas têm um grau de metilação abaixo de 50%, e estas são reticuladas tipicamente com um cátion divalente tal como Ba, Ca, Mg, Sr ou Zn.
[0039] Um ou mais polímeros de revestimento entérico constituem tipicamente pelo menos 10% do peso das partículas, excluindo a água, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%. Tipicamente, eles constituem no máximo 70%, ou no máximo 50%, ou no máximo 40%. Ingredientes Opcionais
[0040] Em algumas modalidades, a composição inclui opcionalmente nutrientes, nutracêuticos, iscas de ração e/ou compostos mascaradores do sabor, além do agente bioativo primário. Intensificadores ou adjuvantes de penetração também podem ser incluídos, para acarretar uma resposta imunológica forte e melhorar a absorção do antígeno por linfócitos de mucosa. Um adjuvante exemplificador é beta glucano.
Produção das Composições
[0041] Uma primeira maneira geral de produzir as partículas é tal como segue. Uma mistura aquosa que compreende um agente bioativo disperso e um polímero mucoadesivo é homogeneizada com óleo para produzir uma emulsão da mistura aquosa no óleo. Tipicamente, uma razão da mistura aquosa de 1 parte para 1,1 a 5 partes de óleo em peso é usada para produzir a emulsão. A emulsão é então transformada em pasta em uma solução aquosa que compreende um polímero de revestimento entérico, e a pasta é aspergida, vazada ou injetada em uma solução aquosa que contém um reticulador para o polímero de revestimento entérico, formando desse modo as partículas.
[0042] Em um segundo método geral, uma mistura aquosa que compreende um agente bioativo disperso é homogeneizada com óleo para produzir uma emulsão da mistura aquosa no óleo. Tipicamente, uma razão da mistura aquosa de 1 parte para 1,1 a 5 partes de óleo em peso é usada para produzir a emulsão. As gotas da emulsão são dispersas então no polímero mucoadesivo aquoso, o qual é reticulado para formar partículas intermediárias que podem opcionalmente ser separadas da solução de reticulação. As partículas intermediárias isoladas ou não isoladas são então transformadas em pasta em uma solução aquosa que compreende um polímero de revestimento entérico. As partículas são formadas por meio de secagem com aspersão, ou secagem com congelamento e moagem.
[0043] Em um método específico de produção das composições, um óleo que contém partículas dispersas do agente bioativo associadas com o polímero mucoadesivo é transformado em pasta em uma solução a 5 a 15% de alginato do sódio do baixo grau de viscosidade, incluindo opcionalmente 1 a 3% de pectinas com baixo teor de metóxi, e a pasta é injetada, vazada ou atomizada por aspersão em uma solução aquosa de cátions divalentes tais como o cloreto de cálcio. O tamanho das partículas da matriz resultante pode ser ajustado pela taxa e pelo método de aplicação da dispersão de alginato na solução de cloreto de cálcio. Em uma outra modalidade, a pasta é secada sem a reticulação do alginato, ao usar qualquer método de secagem conhecido no estado da técnica, por exemplo, secagem com aspersão ou secagem a vácuo. Tipicamente, as partículas resultantes variam no tamanho de cerca de 20 μm a cerca de 8 mm, mais tipicamente de cerca de 50 μm a cerca de 1.000 μm.
[0044] Em um método específico alternativo, de 0,5 a 2% de uma fonte insolúvel de cátions divalentes tais como CaCO3 são adicionados à pasta de gotas de óleo contendo agente bioativo na solução de alginato de sódio, seguidos pela adição de 0,5 a 1% de um ácido orgânico fraco tal como glucono-delta-lactona (GDL) como um acidificante para liberar lentamente os cátions, tais como íons cálcio. Os cátions reticulam o alginato para formar um gel de bolo sólido, o qual pode ser picado ou esmagado em pequenos nacos ou partículas. Tipicamente, os nacos ou as partícula resultantes variam no tamanho de cerca de 50 μm a cerca de 10 mm, mais tipicamente de cerca de 100 a cerca de 5.000 μm. O elemento versado no estado da técnica irá reconhecer que outros polímeros naturais ou sintéticos, de preferência polímeros aniônicos, podem ser utilizados ao usar a afinidade baseada na interação iônica, formando a base das presentes composições.
Uso das Composições
[0045] As composições da presente invenção podem ser armazenadas em uma suspensão aquosa ou secadas por qualquer método de secagem conhecido no estado da técnica, e armazenadas em um estado desidratado por períodos de tempo longos sem uma perda significativa da atividade.
[0046] As composições de acordo com a invenção podem ser administradas oralmente como um componente da água de beber, como um aditivo de alimento, ou como parte de uma formulação de vacina que contém um veículo farmaceuticamente aceitável e adjuvantes opcionais. Alternativamente, as presentes composições podem ser incluídas em outras formas de dosagem oral padrão. Os elementos versados no estado da técnica irão apreciar que há uma ampla variedade de formas de dosagem de alimento, ração, nutracêuticas ou farmacêuticas reconhecidas no estado da técnica e veículos aceitáveis, apropriadas para a aplicação da composição ao animal visado.
[0047] A administração das composições de acordo com a presente invenção pode ser efetuada em protocolos de uma só dose ou de múltiplas doses. Em uma modalidade, as composições imunogênicas são administradas em protocolos de múltiplas doses administradas por um período de cerca de 3 dias a cerca de 10 dias ou mais longos, e podem ser repetidas periodicamente à medida que a espécie alvo evidenciar perda da imunidade.
[0048] Para aplicações na água de beber para o uso em suínos, aves domésticas, gado ou animais aquáticos, óleo adicional ou partículas de polipropileno ou poliéster inertes podem ser incorporados na composição para aumentar a flutuação (isto é, diminuir a densidade) de modo que os dispositivos de alimentação da água para a aplicação nos tanques de cultura de peixes possam ser usados para aplicar as presente composições. Desse modo, as composições podem ser administradas aos animais tanto um como um componente da sua alimentação diária quanto como um componente da sua água de beber.
EXEMPLOS Exemplo 1a Preparação da composição da invenção
[0049] Uma composição da invenção foi preparada tal como segue. Três gramas de polímero mucoadesivo (Quitosana, FMC Biopolymers Inc.) foram dissolvidos em 100 ml de uma solução de ácido acético glacial 0,5 N a 50°C. O pH da solução foi ajustado em 5,8 com hidróxido de sódio e a solução foi colocada para resfriar até a temperatura ambiente. Tween 80 (0,2%, Sigma, St Louis, MO) e Antifoam (0,5%, Sigma, St Louis, MO) foram adicionados e a solução de quitosana foi mantida a 0°C até ser usada. Uma solução de 30 ml contendo 300 mg de ovalbumina ("OVA", uma vacina modelo) foi adicionada à solução de quitosana para produzir uma mistura. A solução resultante foi adicionada a 195 g de azeite de oliva contendo 5% de Span-80 (Sigma) e homogeneizada a 10.000 rpm por 30 minutos em um banho gelado para formar uma emulsão de água em óleo. 20 ml de tripolifosfato de sódio aquoso (5%) e NaOH 0,5 N foram adicionados lentamente com misturação à emulsão de agente bioativo contendo ovalbumina e micropartículas de quitosana reticulada em uma fase de óleo sólida. As partículas foram colocadas para endurecer por pelo menos para 2 horas, mas não foram removidas da fase de óleo.
[0050] A dispersão das partículas no óleo foi agitada em 330 ml de uma solução aquosa a 9% de alginato de sódio do baixo grau de viscosidade (FMC Biopolymers Inc.) que também continha 66 g de oligossacarídeos (inulina instantânea, Cargill, Minneapolis, MN), 10 g de lecitina e 3 g de Tween-80. A dispersão aquosa resultante foi injetada em uma solução de reticulação contendo 5% de CaCl2 para formar grânulos da matriz de alginato, cada um deles contendo múltiplas gotas de óleo cada uma das quais continha por sua vez micropartículas de ovalbumina e quitosana reticulada. Os grânulos foram secados por congelamento e moídos até tamanhos de partículas de menos de 150 μm para obter uma composição seca da presente invenção.
Exemplo 1b
[0051] Um método alternativo de formação de composições da invenção utiliza uma emulsão de uma solução bioativa aquosa em um óleo. Dez ml de uma solução aquosa que contém 100 mg de ovalbumina foram combinados com 15 g de óleo de canola contendo 5% de Span-80 e homogeneizados, para formar uma emulsão de água em óleo fina. A emulsão foi misturada com 100 ml de uma solução de quitosana aquosa a 3%, e a dispersão foi injetada em uma solução de reticulação contendo uma solução de tripolifosfato a 5% (5% de TPP). As partículas foram colocadas para endurecer por pelo menos 2 horas. As partículas de quitosana reticuladas sólidas resultantes continham gotas de óleo inseridas, e cada uma dessas gotas de óleo por sua vez continha dispersas gotas de menos de 10 μm da ovalbumina aquosa. As partículas sólidas foram isoladas por meio de filtração e dispersas finamente em 400 ml de uma solução aquosa de alginato do baixo grau de viscosidade a 9%. A dispersão aquosa resultante foi injetada em uma solução de reticulação contendo 5% de CaCl2 para formar grânulos de matriz de alginato. Os grânulos foram secados por congelamento e moído em partículas com tamanhos abaixo de 150 μm para obter uma composição seca da presente invenção.
Exemplo 2 Preparação de uma composição imunogênica
[0052] Quitosana (3 g, FMC Biopolymer) foi dissolvida em 100 ml de uma solução de ácido acético glacial 0,5 N a 50°C. O pH da solução foi ajustado em 5,8 com hidróxido de sódio e a solução foi colocada para resfriar até a temperatura ambiente. Uma solução de 10 ml contendo 100 mg de ovalbumina (OVA) como uma vacina modelo foi misturada com 50 mg de um agente imunoestimulante (beta glucano, AHD International, Atlanta, GA) e adicionada à solução de quitosana. A mistura resultante foi emulsionada em 150 g de óleo de esqualeno de tubarão (Jedwards International) contendo 5% em peso/peso de Span-80 a 10.000 rpm por 30 minutos para formar uma emulsão de gotas aquosas de OVA, quitosana e beta glucano em uma fase de óleo contínua. A emulsão foi adicionada com agitação a 400 ml de uma solução aquosa de alginato de sódio do baixo grau de viscosidade a 9% em NaOH 0,5 N que também continha oligossacarídeos (40 g, inulina instantânea). A emulsão resultante foi injetada em uma solução de CaCl2 a 5% para reticular o alginato, resultando em uma composição imunogênica da presente invenção. A composição foi secada por congelamento e moída como partículas com tamanhos de partículas de menos de 250 μm.
Exemplo 3 Preparação de uma composição para tratamento/prevenção de infecção parasítica de peixes
[0053] Uma composição contendo um antígeno de proteína ou um composto parasiticida para o tratamento da infestação de parasitas em peixes é preparada. Dez mg do agente bioativo são dissolvidos em 10 ml de uma solução de quitosana aquosa a 3% tal como descrito no Exemplo 2 acima, e emulsionados em 15 g da mistura de óleo contendo 75 de azeite de oliva, 20% de óleo de esqualeno e 5% de Span-80.
[0054] Um ml de um tripolifosfato de sódio aquoso a 5%, uma solução de NaOH 0,5N é emulsionada em 1 g de azeite de oliva e misturada na emulsão de agente bioativo, resultando em uma dispersão em óleo de partículas que contêm o agente bioativo e quitosana reticulada. A dispersão é mantida em repouso por 2 horas para endurecer a quitosana reticulada. A dispersão resultante das partículas em óleo é adicionada com agitação a 20 ml de uma solução que contém alginato de sódio do baixo grau de viscosidade a 9%, 1% de pectina com baixo teor de metóxi, 30% em peso/peso de inulina instantânea e 1% de Tween-80. A mistura resultante é injetada em uma solução de reticulação contendo 3% de CaCl2 para formar grânulos de uma matriz de alginato-pectina que contem gotas de óleo dispersas inseridas, cada uma delas contendo por sua vez micropartículas de quitosana bioativa e reticulada. Os grânulos são secados por congelamento e moídas até menos de 150 μm para obter uma composição seca da presente invenção.
Exemplo 4 Preparação de uma composição que contém um fármaco farmacêutico
[0055] Uma composição que contém um fármaco farmacêutico (um glicocorticoide tal como dexametasona ou metil prednisolona) para o tratamento de doenças do cólon é preparada. O fármaco é adicionado à solução de quitosana tal como descrito no Exemplo 1 ou 2 acima, e emulsionado em uma mistura de 95% de óleo de esqualeno e 5% de Span-80. Uma emulsão de álcali contendo 5% de tripolifosfato de sódio em NaOH 0,5 N em óleo de esqualeno é preparada e misturada lentamente (20% em peso/peso) na emulsão bioativa para reticular a quitosana, e a mistura é mantida em repouso por pelo menos 2 horas para endurecer as partículas reticuladas. A dispersão de óleo de micropartículas de quitosana é misturada em um líquido que contém o polímero de revestimento entérico (30% em peso/peso de EUDRAGIT® FS30D, Evonik Industries) a uma razão de 1:3 de emulsão/Eudragit líquido e secada por aspersão para formar uma composição particulada seca da presente invenção.
Exemplo 5 Eficiência do encapsulamento de um agente bioativo na composição da presente invenção
[0056] O efeito da dispersão de óleo adicional e da matriz de polímero de revestimento entérico na composição da presente invenção foi avaliado ao usar ovalbumina (OVA) para simular um fármaco de proteína ou uma vacina típicos. Três composições contendo OVA (Sigma) foram preparadas. A composição 1 consistia em micropartículas de quitosana ligadas com OVA, preparadas ao dissolver 100 mg de OVA em 10 ml de uma solução de quitosana a 3% e ao injetar a solução em 10% de TPP aquosa para formar grânulos reticulados, seguido por um repouso por 2 horas para endurecer os grânulos e a secagem com congelamento e a trituração subsequentes. A composição 2 foi feita ao emulsionar 10 ml de uma solução aquosa contendo 100 mg de OVA em 15 g de óleo de esqualeno contendo 3% de Span-80, e ao misturar a emulsão resultante em 20 ml da solução de quitosana a 3%. A pasta resultante foi injetada então em uma solução de 10% de TPP para formar grânulos, seguido pelo endurecimento, secagem com congelamento e trituração tal como acima. A composição 3 consistia em micropartículas de quitosana ligadas com OVA de acordo com a invenção, preparada tal como no Exemplo 2.
[0057] A eficiência do encapsulamento de OVA nos três tipos de composição foi determinada tal como segue. Quinhentos mg de cada composição foram dispersos em 10 ml de tampão RIPA e incubados à temperatura ambiente por 30 minutos. As suspensões foram submetidas a um vórtice por 5 minutos e centrifugadas então a 3.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi ensaiado quanto ao teor de OVA ao usar a análise de Transferência Western, tal como segue.
[0058] Transferência Western: as composições foram lisadas com tampão RIPA tal como descrito acima, e uma quantidade calculada equivalente a 12 μg de proteína por amostra foi carregada em um gel de gradiente de 10% de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE, Bio-Rad, Hercules, CA). As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (Bio-Rad) e bloqueadas por 1 hora com 5% de leite desnatado contendo 0,5% de Tween-20 (PBS-T). As transferências foram incubadas com um anticorpo primário apropriado em diluições de 1:5000 por 1 hora à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS-T (3 x 10 ml, 5 minutos, cada), as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP apropriado (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA) a uma diluição de 1:5.000 por 1 hora. Após a lavagem com PBS-T (3 x 10 ml, 5 minutos, cada), películas quimioluminescentes foram reveladas com um substrato de ECL (Amsheram Biosciences). A eficiência do encapsulamento de OVA (% de retenção da quantidade original de OVA) é apresentada na Tabela 1.Tabela 1
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[0059] Os resultados demonstram o efeito protetor da dispersão de óleo nas composições 2 e 3 na prevenção da lixiviação (perda) do agente bioativo a um ambiente aquoso simples. No entanto, diferenças significativas entre a Composição comparativa 2 e a Composição de invenção 3 foram encontradas quando testadas sob condições gástricas, tal como descrito a seguir no Exemplo 7.
Exemplo 6 Degradação da atividade do antígeno de proteína não protegida em suco gástrico simulado
[0060] Para avaliar a perda da atividade de um antígeno de proteína depois de uma exposição gástrica típica, OVA não encapsulada (10 mg) foi incubada em 10 ml de um fluido gástrico simulado contendo 0,08% de pepsina a um pH 2 por 2 horas a 37°C em um agitador. O meio foi retirado em tempo de incubação de 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos, e a quantidade de OVA residual foi analisada ao usar a análise de Transferência Western tal como descrito acima. A Tabela 2 mostra a degradação de OVA em exposições de 2 horas no suco gástrico simulado, indicada como % da atividade remanescente em relação à atividade antes da exposição.Tabela 2
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[0061] Esses resultados demonstram que a atividade de antígeno à base de proteína desprotegida ou de agente bioativo será degradada completamente no trato digestivo animal.
Exemplo 7 Proteção gástrica de um agente bioativo na composição da presente invenção
[0062] Para avaliar a atividade remanescente de um antígeno de proteína após a exposição gástrica, três composições foram preparadas tal como descrito no Exemplo 5. Quinhentos MG de cada uma das três composições foram incubados em 10 ml de fluido gástrico simulado contendo 0,08% de pepsina a um pH 2 por 2 horas a 37°C em um agitador. No final de uma exposição de 2 horas, as soluções gástricas foram retiradas e a atividade remanescente da OVA nas composições foi medida tal como descrita no Exemplo 5. A Tabela 3 mostra a atividade remanescente de OVA em cada uma das composições depois de uma exposição de 2 horas ao suco gástrico simulado.Tabela 3
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[0063] Esses resultados demonstram claramente o efeito protetor gástrico superior da Composição da invenção 3 em relação às Composições 1 e 2 da técnica anterior.
Exemplo 8 O efeito do grau de viscosidade de alginato na composição na proteção gástrica
[0064] Três composições que contêm alginato de baixo grau de viscosidade de 9% (50 cP), alginato de médio grau de viscosidade de 6% (300 cP) e alginato de elevado grau de viscosidade de 1% (800 cP) foram preparadas de acordo com o Exemplo 2 acima. As três composições foram expostas ao suco gástrico simulado tal como descrito no Exemplo 7 e a atividade remanescente de OVA nas composições foi medida tal como descrito no Exemplo 5. A Tabela 4 mostra a atividade remanescente de OVA em cada uma das composições depois de uma exposição de 2 horas ao suco gástrico simulado.Tabela 4
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[0065] Esses resultados demonstram que as composições que contêm o alginato de grau de viscosidade mais baixo conferem uma proteção maior de um antígeno à base de proteína ou bioativo no trato digestivo animal simulado.
Exemplo 9 Tamanho ideal de partícula da composição da invenção
[0066] Neste exemplo, o efeito de proteção do tamanho de partícula de uma composição da invenção secada e moída em um ambiente gástrico simulado foi avaliado. Uma composição de OVA foi preparada tal como descrito no Exemplo 5, seguido pela separação do pó seco em dois tamanhos de partículas: partículas pequenas que foram passadas através uma tela de 50 μm, e partículas grandes que foram capturadas na tela de 50 μm mas passaram através de uma tela de 100 μm. A Tabela 5 mostra a atividade remanescente de OVA em cada tamanho de partícula da composição depois de uma exposição de 2 horas no suco gástrico simulado.Tabela 5
Figure img0005
[0067] Esses resultados mostram que a proteção gástrica ideal é obtida quando a composição seca é moída até um tamanho de partícula acima de 50 μm.
Exemplo 10 Administração oral da composição de OVA a camundongos
[0068] A ovalbumina é administrada oralmente a camundongos para testar a eficácia das composições da invenção na indução de uma resposta imunológica.
[0069] Animais: São usados camundongos BALB/C fêmeas de dez a doze semanas de idade. Os camundongos são alimentados ad libitum. Cada grupo experimental é abrigado em uma gaiola separada.
[0070] Composição de ovalbumina: Ovalbumina (1 mg/g de ovalbumina, Sigma, St. Louis, Mo.) é incorporada na composição da invenção tal como descrito no Exemplo 5. Três grupos de 4 camundongos cada um são inoculados tal como segue: 1) ovalbumina (OVA) na composição, administrada oralmente, 2) solução de OVA, administrada subcutaneamente (SC), 3) composição livre de antígeno administrada oralmente. Os camundongos são inoculados a 0 e 3 semanas. Cada dose administra um total de 100 mg da composição seca misturada com óleo de milho a uma razão de 1:2 em peso/peso da composição seca/óleo, revestida em pelotas de ração. Na semana 4, cada camundongo é submetido à eutanásia e as células de soro e do baço são colhidas.
[0071] Ensaios imunológicos: O soro é ensaiado quanto a IgG e IgA por meio de ELISA. A análise ELISA é executada ao usar OVA absorvida em placas de poliestireno. As amostras são colocadas nos poços em triplicata a uma diluição de 1:25 para o soro. É usado o anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase de raiz forte, seguido por um substrato de ortofenileno diamina (Sigma, St. Louis, Mo., EUA). A densidade óptica de cada poço é determinada ao colocar a placa em um espectrofotômetro da placa de microtítulo e ao ler a placa a 490 nm. As células do baço são testadas quanto às células secretoras de anticorpo (ASC) específicas para OVA, ao usar as técnicas descritas previamente.
[0072] Os anticorpos IgG e IgA específicos de OVA são quantificados ao determinar o aumento na densidade óptica com o passar do tempo. O soro IgA e IgG específico de OVA e as células secretoras de ASC para cada camundongo inoculado com OVA devem ser aumentados igualmente nos camundongos injetados com OVA e alimentados oralmente com a composição da presente invenção. Nenhum anticorpo IgG ou IgA específico de OVA deve ser detectado livre na composição de antígeno alimentada aos camundongos. Desse modo, a composição deve ser eficaz na indução de uma resposta imunológica com a administração oral.
Exemplo 11 Administração oral de uma composição que contém antígenos a galinhas
[0073] A Salmonella enteritidis é uma causa preponderante da doença em galinhas poedeiras. A infecção diminui a produção e aumenta a mortalidade nos bandos. Além disso, a S. enteritidis pode ser passada através do ovo aos pintainhos bebê, infectando gerações subsequentes ou os seres humanos que consomem ovos infectados. Uma vez que a infecção começa quando essa bactéria se fixa na mucosa intestinal e invade a mesma, e a infecção de longa duração envolve a infecção de tecidos linfoides intestinais, a estimulação da imunidade da mucosa é imperativo para controlar essa doença.
[0074] Para avaliar a eficácia de galinhas vacinadas com as composições de vacina da presente invenção, a flagelina da Salmonella enteritidis, um imunógeno chave, é incorporada dentro da composição de acordo com o Exemplo 2, exceto pelo fato que a emulsão de vacina é misturado na fase alcalina do alginato de sódio a uma razão de 1:2 em peso/peso e a pasta é secada com aspersão. A composição seca é revestida em cima na ração e é administrada oralmente aos pintainhos. As galinhas com dez semanas de idade recebem 3 doses orais a intervalos de duas semanas da composição carregada com 300 μg de antígeno da flagelina de S. enteritidis ou albumina de soro bovino. Uma semana após a última dose oral do antígeno, o soro e o fluido intestinal são coletados e ensaiados quanto aos anticorpos específicos de flagelina por meio de análise ELISA. Os resultados devem mostrar que as aves vacinadas oralmente aumentaram de maneira significativa os anticorpos específicos de flagelina no soro.
Exemplo 12 Administração oral de uma composição que contém antígenos a bezerros
[0075] A eficácia da composição contendo ovalbumina administrada oralmente preparada de acordo com a presente invenção para estimular uma resposta imunológica nos pulmões de bezerros é demonstrada.
[0076] A ovalbumina é incorporada na composição tal como descrito no Exemplo 1a. Para a administração oral a bezerros, uma composição que contém uma dose de 40 μg de ovalbumina por mg é administrada na ração. Quatro bezerros são usados por grupo experimental e cada bezerro recebe 5 mg de ovalbumina por dose por 5 dias consecutivos.
[0077] Dois grupos de bezerros são usados para avaliar a eficácia da ovalbumina administrada oralmente para induzir uma resposta imunológica específica. O grupo 1 recebe 2 doses de ovalbumina em um adjuvante de Freund incompleto por meio de injeção subcutânea (SC) a um intervalo de 3 semanas. Esse grupo serve como controle parenteral, o método de vacinação usado rotineiramente para qualquer vacina. O grupo 2 recebe 2 regimes orais de uma composição que contém ovalbumina a um intervalo de 3 semanas. Os soros são avaliados quanto à resposta de anticorpo isotípico à ovalbumina. Os resultados devem mostrar que uma quantidade significativa de IgG e IgA específico de OVA é produzida nos bezerros alimentados oralmente com a composição contendo OVA. O nível muito elevado esperado do soro IgA prediz uma eficácia elevada na estimulação de uma resposta imunológica sistêmica no gado.
Exemplo 13 Administração oral de uma composição contendo antígenos de vibrião a peixes
[0078] O vibrião alginolyticus é uma infecção bacteriana séria na aquacultura, particularmente grave na truta arco-íris. Agora é endêmico em todos os países que produzem trutas, onde pode causar sérias perdas econômicas. Também está se transformando em um patógeno mais significativo de salmões criados em cativeiro, principalmente na fase de crescimento na água doce, mas foi relatado que também causa perdas no mar. A vacinação pode impedir que o V. alginolyticus tenha um impacto significativo em qualquer estágio do ciclo de cultivo dos salmonídeos. Um programa típico de vacinação envolve uma vacinação primária de peixes novos de 2 a 5 gramas e uma vacinação oral de realçador 4 a 6 meses após a vacinação primária. No entanto, um programa ideal de vacinação deve envolver somente um tipo de vacinação provido periodicamente aos peixes a fim de manter um título eficaz de anticorpo no soro dos peixes durante todo o período de cultura.
[0079] Projeto experimental: A eficácia da composição contendo vacina de ERM oralmente administrada preparada de acordo com a presente invenção para estimular uma resposta imunológica no soro da truta é demonstrada.
[0080] V. alginolyticus atenuado é incorporado dentro de uma composição tal como descrito no Exemplo 1b. Para a administração oral aos peixes, uma composição que contém uma dose de 2 μg de vacina de V. alginolyticus por mg é administrada na ração. Vinte peixes a um tamanho médio de 5 g são usados por grupo experimental e cada peixe recebe 1 dose da vacina de V. alginolyticus na ração de alimentação por 5 dias consecutivos.
[0081] Três grupos de peixes são usados para avaliar a eficácia da vacina de V. alginolyticus oralmente administrada para induzir uma resposta imunológica em relação a um vacinação padrão por meio de injeção. O grupo 1 é vacinado ao usar uma vacinação pelo protocolo de injeção. Esse grupo serve como controle parenteral, o método de vacinação usado rotineiramente para qualquer vacina. O grupo 2 recebe um regime oral de uma composição que contém a vacina de V. alginolyticus. O grupo 3 recebe um regime oral da composição livre de vacina. Os soros são avaliados quanto à resposta do anticorpo isotípico ao V. alginolyticus 6 semanas depois da vacinação. Os resultados devem mostrar que uma quantidade significativa de IgA específico de V. alginoliticus é produzida nos peixes alimentados oralmente com a composição contendo V. alginolyticus. A resposta imunológica no soro de peixes vacinados tanto oralmente quanto injetados deve ser comparável. O nível muito elevado esperado do soro IgA prediz a eficácia elevada na estimulação de uma resposta imunológica sistêmica nos peixes.
Exemplo 14 Composição contendo um raticida
[0082] A Warfarina é o raticida mais comum usado para controlar infestações de ratos e camundongos. Os roedores que ingerem as iscas que contêm Warfarina exibem sintomas óbvios de envenenamento em 15 a 30 minutos e ficam inconscientes em 1 a 2 horas. No entanto, por causa de seu efeito ativo rápido, o roedor ingere tipicamente uma quantidade subletal de Warfarina e a recuperação ocorre dentro de 8 horas. O encapsulamento da Warfarina pode retardar o surgimento dos sintomas, permitindo o consumo de uma dose letal completa.
[0083] Métodos Experimentais: São usados camundongos BALB/C fêmeas de dez a doze semanas de idade. Os camundongos são alimentados ad libitum. Cada grupo experimental é abrigado em uma gaiola separada.
[0084] Composição de Warfarina da invenção: Warfarina (400 mg/g da composição, Sigma, St. Louis, Mo.) é incorporada em uma composição tal como descrito de modo geral no Exemplo 3. Três grupos de 4 camundongos cada um são alimentados ad libitum tal como segue: 1) A composição de Warfarina da invenção, misturada em iscas a 4% de atividade de Warfarina, 2) Warfarina não encapsulada, misturada em iscas alimentadas a 4% de atividade, 3) Uma isca que contém uma composição tal como no Exemplo 3, não contendo Warfarina nem um outro bioativo. A ingestão de ração e o efeito de mortandade nos camundongos são monitorados.
[0085] Os resultados mostram que a ingestão de ração dos grupos 1 e 3 é similar, ao passo que a ingestão de ração no grupo 2 (Warfarina não encapsulada) é mais de 25% menor. Espera-se que todos os camundongos no grupo 1 estejam mortos depois de 8 horas da alimentação, ao passo que todos os camundongos do grupo 2 permanecem vivos depois de 8 horas da alimentação.

Claims (16)

1. Composição para administração oral de um agente bioativo a espécies aquáticas ou terrestres, compreendendo partículas, cada uma das quais compreende um agente bioativo e um polímero mucoadesivo em uma solução aquosa, a dita solução aquosa sendo dispersa em gotas de óleo, as ditas gotas de óleo sendo embebidas em ou revestidas por uma matriz que compreende um polímero de revestimento entérico, caracterizada pelo fato de que o polímero mucoadesivo é um ou mais polímeros selecionados do grupo que consiste em carragenina, quitosana, ácido hialurônico, alginato, derivados ou modificações de qualquer um destes, polímeros com funcionalização carboxila, polímeros com funcionalização sulfato e polímeros com funcionalização amina e em que o polímero de revestimento entérico é um ou mais polímeros selecionados do grupo que consiste em poli(met)acrilatos, alginato, pectinas, carbóxi metil celulose, metil celulose e ftalato acetato de celulose.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polímero de revestimento entérico é reticulado.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o agente de reticulação para o polímero de revestimento entérico compreende cátions de metais divalentes.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polímero mucoadesivo é reticulado.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as reticulações no polímero mucoadesivo são formadas por meio da associação com tripolifosfato.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polímero mucoadesivo e o agente bioativo são associados.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as partículas têm um diâmetro maior do que 50 μm.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o agente bioativo é um imunógeno.
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a matriz do polímero de revestimento entérico compreende um alginato da classe de baixa viscosidade, uma pectina de baixo teor de metóxi ou uma combinação destes.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o óleo é um ou mais óleos selecionados do grupo que consiste em gorduras, óleos e ceras.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o óleo é um óleo vegetal ou animal.
12. Método de preparação da composição como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, em ordem: (a) a formação de uma mistura aquosa que compreende um agente bioativo disperso ou dissolvido; (b) a homogeneização da mistura aquosa da etapa (a) no óleo para produzir uma emulsão da mistura aquosa no óleo; (c) a formação de uma pasta do produto da etapa (b) em uma solução aquosa que compreende um polímero de revestimento entérico; e tanto (d1) a aspersão, vazamento ou injeção da pasta da etapa (c) em uma solução aquosa que contém um reticulador para o polímero de revestimento entérico para formar as partículas, em que a mistura aquosa da etapa (a) também compreende um polímero mucoadesivo, quanto (d2) a formação das partículas a partir da pasta da etapa (c), em que a etapa (b) também inclui a formação de gotas da emulsão no polímero mucoadesivo aquoso e a reticulação do polímero mucoadesivo para formar partículas intermediárias.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa (d1) é executada.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa (d2) é executada.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de formação das partículas compreende a secagem por congelamento e a trituração do produto da etapa (c).
16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de formação das partículas compreende a secagem por aspersão do produto da etapa (c).
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