CN103416598A

CN103416598A - 一种微囊包被卵黄源胆囊收缩素抗体的制备方法

Info

Publication number: CN103416598A
Application number: CN2013102800153A
Authority: CN
Inventors: 姚刚; 马蕾; 王金泉; 苏艳; 张晓红; 苏战强
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2013-07-04
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2033-07-04
Also published as: CN103416598B

Abstract

本发明提供的一种微囊包被卵黄源胆囊收缩素抗体的制备方法，通过羊源CCK与BSA交联后加弗氏完全佐剂制备抗原复合物免疫产蛋鸡，收取鸡蛋从中获得卵黄源CCK抗体，取海藻酸钠水溶液与卵黄源CCK抗体液进行均质乳化，再将乳化好的溶液滴入壳聚糖、CaCl2组成的成囊溶液中进行包被，包被后的成品保护了胆囊收缩素卵黄抗体的有效活性，具有肠溶性。本发明利用微胶囊技术，选用壳聚糖和海藻酸钠为包被材料为天然多糖，价格便宜、内服且无任何毒副作用。

Description

一种微囊包被卵黄源胆囊收缩素抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品的研制，制备一种微囊包被的反刍幼畜用促生长饲料的添加剂。

背景技术

胆囊收缩素（CCK）是一种重要的胃肠道多肽激素，CCK在胃肠道的主要作用是促进胆囊收缩及胰酶分泌，促进胰腺细胞生长，同时它被认为是一种重要的内源性生理饱感因子，参与摄食和体重调节，通过免疫中和技术，能部分消除内源性CCK引起的饱感作用，促进摄食，从而促进动物生长。卵黄抗体(IgY)是当前备受关注的生物制品，广泛应用于人类和动物的疾病防治、诊断和治疗。但是IgY在极强胃酸环境中易被腐蚀而分解失活，制约其在口服制剂中的实际应用，加之，反刍动物消化道结构功能较复杂，内部微生态环境中的微生物、酶的种类和功能更加多样，使得常规的口服制剂若不经过特殊处理，易在消化道内降解，从而减弱其生物学活性甚至完全消失。

文献检索披露：Smith和Gibbs首次报道，外源性CCK可以抑制动物摄食行为。CCK不但可以降低大鼠的采食量，而且还可以改变大鼠的摄食行为。Baile等研究报道，提取的CCK及人工合成的CCK-8均可以抑制真饲和假饲时动物的采食。CCK不但没有推迟或阻止摄食，而是缩短了动物每餐的摄食间隔及减少了摄食量，而且还表现出来正常的饱感行为。研究CCK影响反刍动物的生产性能的报道较少且存在分歧。Trout等对公羊主动免疫CCK-8，研究其对公羊胴体和采食量的影响，结果表明，CCK-8主动免疫公羊可以产生较高的抗体，并降低了动物胴体的脂肪含量，但是对胴体质量、平均日增重和采食量差异没有达到显著水平。

本发明利用微囊化技术，保护卵黄源胆囊收缩素抗体在胃酸环境中的口服活性，同时，保证IgY在胃中不释放，而在小肠中快速、持续的释放出完整的卵黄源胆囊收缩素抗体,从而发挥其生物学作用。

发明内容

本发明目的在于：研制的微囊包被的卵黄源胆囊收缩素抗体（CCK-IgY），用于反刍幼畜用促生长饲料的添加，效果极佳，具有重要的使用价值。

本发明目的是这样实现的：一种微囊包被卵黄源胆囊收缩素抗体的制备方法，分步实施；

步骤1胆囊收缩素抗原复合物的制备：将0.5mg CCK-8与6.5mg牛血清白蛋白溶于20ml0.1M PBS、pH7.0中，逐滴加入5ml戊二醛，室温搅拌4h，在4℃下用8000-14000Da的透析袋在pH7.0的0.005M PBS中进行充分透析过夜；上述混合物需透析3天，每8小时换液一次；取10ml CCK-BSA交联复合物加等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化后，配成含抗原复合物的油包水型油乳疫苗。

步骤2卵黄源胆囊收缩素抗体制备：将鸡蛋用6ml/L新洁尔灭浸泡20min后，取出晾干，在无菌条件下，分离蛋黄，取卵黄液与去离子水1:9混合，pH调至5.2，4℃反应过夜，在12000rpm,20min,4℃条件下离心，弃沉淀；上清过滤，加饱和硫酸铵至终浓度300g/L，在12000rpm,20min,4℃条件下离心，弃去上清，PBS溶解沉淀至原抗体水溶液体积的1/2，加饱和硫酸铵至终浓度190g/L，将上述混合物混和均匀，在12000rpm、20min、4℃条件下离心，弃上清液，用少量0.1M PBS溶液溶解沉淀，透析20-48h,每8h换液一次，4℃保存待用；

步骤32.5%的海藻酸钠水溶液配制：称取2.5g海藻酸钠溶于100ml去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至溶解，待用；

步骤4成囊溶液的配制：称取10g壳聚糖，加10%醋酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1L，配制成1%壳聚糖溶液，其中成囊溶液的pH为4.5-6.5；使用前，将1%壳聚糖溶液稀释成0.4%壳聚糖溶液，并加入3%CaCl₂使之溶解，真空脱气，待用；

步骤5将卵黄抗体液1-4：1缓慢加入到步骤3的海藻酸钠水溶液中，在高速匀浆机中均质乳化30min；

步骤6将步骤5制成的卵黄抗体液与海藻酸钠水溶液滴入到步骤4成囊溶液中进行包被，滴加速度30r/min，磁力搅拌器上反应28-32min，用去离子水洗净自然晾干，获得微囊包被的卵黄源CCK抗体产品。

本发明机理与作用：通过羊源CCK与BSA交联后加弗氏完全佐剂制备抗原复合物免疫产蛋鸡，收取鸡蛋从中获得卵黄源CCK抗体，取海藻酸钠水溶液与卵黄源CCK抗体液进行均质乳化，再将乳化好的溶液滴入壳聚糖、CaCl2组成的成囊溶液中进行包被，经锐孔凝固浴法获得微囊包被的卵黄源CCK抗体经去离子水洗净晾干，包被后的成品保护了胆囊收缩素卵黄抗体的有效活性，在模拟人工胃液中2h内未完全溶解，可抵抗胃酸、胃蛋白酶及胃内微生物的降解，而在模拟人工肠液中15min便可释放，保证在小肠中快速、持续的释放，具有肠溶性。

本发明利用微胶囊技术，选用壳聚糖和海藻酸钠为包被材料，包被材料均为天然多糖，资源丰富、价格便宜、可内服且无任何毒副作用，柔韧性好，外观呈半透明球形，粒径分布在950-1100μm；该方法可操作性强，彰显技术进步。

附图说明

本发明结合附图作进一步说明。

附图1为微胶囊在模拟胃液中的释放曲线图；

如图所示：微胶囊在模拟胃液中的前1h内，释放量很少，OD值小于0.1，但是1h后，释放量逐渐增加，但是OD值也小于0.2。在不同pH条件下的三种胃液中，随着pH的降低（酸度的增高），微胶囊的释放率逐渐升高。以上结果证明，以壳聚糖-海藻酸钠作为包被材料制得的微胶囊可以有效抵御胃酸作用，而不至于崩解。

附图2为微胶囊在模拟肠液中的释放曲线图；

如图所示：pH分别为8.4、7.6的模拟肠液在15min时，释放率达到最高，随后，释放量缓慢下降，逐渐趋于平稳，且pH越大，释放量越大。微胶囊在pH为6.8的模拟肠液中缓慢释放，到90min时释放完全，之后释放率开始下降。以上结果表明微胶囊在pH为8.4、7.6的模拟肠液中15min时已经开始崩解，具有肠溶性。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。

实施例

1）胆囊收缩素抗原复合物的制备：将0.5mg CCK-8与6.5mg牛血清白蛋白溶于20ml0.1M PBS、pH7.0中，逐滴加入5ml戊二醛，室温搅拌4h，在4℃下用8000-14000Da的透析袋在pH7.0的0.005M PBS中进行充分透析过夜；上述混合物需透析3天，每8小时换液一次；取10ml CCK-BSA交联复合物加等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化后，配成含抗原复合物的油包水型油乳疫苗。

2）卵黄源胆囊收缩素抗体制备：将0.5mg CCK-8与6.5mg牛血清白蛋白溶于20ml0.1M PBS（pH7.0）中，逐滴加入5ml戊二醛，室温温和搅拌4h，在4℃的温度下用8000-14000Da的透析袋在pH7.0的0.005M PBS中进行充分透析过夜，上述混合物透析3天，每8小时换液一次。取10ml CCK-BSA交联复合物加等量的弗氏完全佐剂，乳化后，与之配成含抗原复合物的油包水型油乳疫苗，对蛋鸡进行免疫，收集鸡蛋。用新洁尔灭（6ml/L）将收取的鸡蛋浸泡20min后，取出晾干;在无菌条件下分离取蛋黄，刺破卵黄膜，将卵黄液与去离子水1:9比例混合，pH调至5.2,4℃反应过夜;离心(12000rpm,20min,4℃)，弃沉淀，上清过滤,加饱和硫酸铵至终浓度300g/L，离心(12000rpm,20min,4℃)，弃去上清，PBS溶解沉淀至原抗体水溶液体积的1/2，加饱和硫酸铵至终浓度190g/L，离心(12000rpm,20min,4℃)弃上清液，用少量0.1M PBS溶液溶解沉淀，透析20-48h,每8h换液一次，4℃保存。最终获得浓度为14.14mg/ml卵黄源胆囊收缩素抗体。

3）取2.5g海藻酸钠配成浓度为2.5%的海藻酸钠水溶液，然后向海藻酸钠水溶液中加入1:1或3:1或4:1的卵黄抗体液后进行均质乳化；

其中海藻酸钠水溶液配制：称取2.5g海藻酸钠溶于100ml去离子水中，磁力搅拌器上搅拌至溶解。

其中成囊溶液的配制：称取10g壳聚糖，加入少许10%醋酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1L，配制成1%壳聚糖溶液，临用前，稀释成0.4%壳聚糖溶液，并在0.4%壳聚糖溶液中加入3%CaCl₂,使之溶解，真空脱气，待用。

4）再将乳化好的卵黄源胆囊收缩素抗体+海藻酸钠溶液滴入壳聚糖、CaCl₂组成的成囊溶液中进行包被，反应30min后，滴加速度30r/min，磁力搅拌器上反应30min，用去离子水洗净自然晾干，获得微囊包被的卵黄源CCK抗体产品；其中成囊溶液的pH为4.5或5.5或6.5，壳聚糖浓度为0.4%，CaCl₂浓度为3%。

应用实施例

在模拟人工胃液中2h内未完全溶解，可抵抗胃酸、胃蛋白酶及胃内微生物的降解，而在模拟人工肠液中15min便可释放，保证在小肠中快速、持续的释放，具有肠溶性。

模拟人工胃液配置：取稀HCl16.4ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释至1000ml，分别调pH1.2、2.2、3.6即得。

模拟人工肠液配置：取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml溶解，用0.1mol/L NaOH溶液分别调节pH至6.8、7.6、8.4，取胰酶10g，加水使之溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml即得。

实验效果验证：

表3试验各阶段各组小鼠血液中CCK-IgYOD值

注：同列数据之间进行单因子方差分析，不同小写字母表示差异显著，不同大写字母表示差异极显著，不标注字母表示差异不显著

由上表数据得知：随着免疫次数的增加，各组小鼠血液中CCK抗体OD值均呈上升趋势，其中口服CCK-IgY-LD微囊组与对照组相比，试验中期OD值增加了0.16，试验后OD值增加了0.173。

本方法选用的CCK-8和弗氏完全佐剂购于美国Sigma公司；牛血清白蛋白和弗氏不完全佐剂、透析袋8000-14000Da、壳聚糖购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；戊二醛购于上海生物化工有限公司；硫酸铵、无水氯化钙采购于天津永晟精细化工有限公司；海藻酸钠（化学纯）购于天津市光复精细化工研究所。

Claims

1.一种微囊包被卵黄源胆囊收缩素抗体的制备方法，其特征在于：分步实施；

步骤1 胆囊收缩素抗原复合物的制备：将0.5mg CCK-8与6.5mg 牛血清白蛋白溶于20ml 0.1M PBS、pH 7.0中，逐滴加入5ml戊二醛，室温搅拌4h，在4℃下用8000-14000 Da的透析袋在pH 7.0的0.005M PBS中进行充分透析过夜；上述混合物需透析3天，每8小时换液一次；取10ml CCK-BSA交联复合物加等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化后，配成含抗原复合物的油包水型油乳疫苗；

步骤2 卵黄源胆囊收缩素抗体制备：将鸡蛋用6ml/L新洁尔灭浸泡20min后，取出晾干，在无菌条件下，分离蛋黄，取卵黄液与去离子水1:9混合，pH调至5.2，4℃反应过夜，在12000 rpm,20 min,4℃条件下离心，弃沉淀；上清过滤，加饱和硫酸铵至终浓度300 g/L，在12000 rpm,20 min,4℃条件下离心，弃去上清，PBS溶解沉淀至原抗体水溶液体积的1/2，加饱和硫酸铵至终浓度190 g/L，将上述混合物混和均匀，在12000 rpm、20 min、4℃条件下离心，弃上清液，用少量0.1M PBS溶液溶解沉淀，透析20-48h,每8h换液一次，4℃保存待用；

步骤3 2.5%的海藻酸钠水溶液配制：称取2.5g海藻酸钠溶于100ml去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至溶解，待用；

步骤4 成囊溶液的配制：称取10g壳聚糖，加10%醋酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1L，配制成1%壳聚糖溶液，其中成囊溶液的pH为4.5-6.5；使用前，将1%壳聚糖溶液稀释成0.4%壳聚糖溶液，并加入3% CaCl₂使之溶解，真空脱气，待用；

步骤5 将卵黄抗体液1-4：1缓慢加入到步骤3的海藻酸钠水溶液中，在高速匀浆机中均质乳化30min；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：选用实验材料均为市售产品。