DK201600092U1 - Sammensætning til oral indgift af bioaktive midler - Google Patents

Abstract

Frembringelsen angår en sammensætning til oral indgift af et bioaktivt middel til vand- eller landlevende arter, hvilken sammensætning indbefatter partikler, der hver især indeholder et bioaktivt middel dispergeret i oliedråber, idet oliedråberne er dispergerede i en matrix indbefattende en enterisk overtrækspolymer, hvor partiklerne hver især yderligere indbefatter en slimhindetilhæftende polymer. Anvendelser af sammensætningen anvises også.

Description

Denne ansøgning påberåber sig prioritet fra den amerikanske patentansøgning No. 61/912,958, indleveret d. 6. december 2013, som gennem denne henvisning i sin helhed betragtes som indeholdt heri.

Oral indgift af lægemidler og vacciner frembyder flere fordele. Doser kan indgives til et stort antal dyr via foderet eller vand med minimal fiksering og arbejdsindsats. Fiksering belaster desuden dyrene og gør lægemidlet eller vaccinationen mindre virkningsfuld og forøger risikoen for infektionssygdom. For kødproducerende dyrs vedkommende har oral indgift den yderligere fordel, at injektionsstedreaktioner undgås. Knækkede nåle, kontaminering af injektionsstedet eller anvendelse af højreaktive adjuvanser kan forvolde abscesser, der beskadi-ger slagtekroppen og huderne. Disse reaktioner forringer dyrets slagteværdi. Dette er også et vigtigt punkt i fiskevaccinationsprogrammer, hvor fisk må indfanges fra deres tanke eller bure på åbent hav og injiceres hver for sig. Oral vaccination er hurtig og omkostningseffektiv og overflødiggør gentagen håndtering af dyrene med henblik på efterfølgende boostervaccinationer. Utilsigtede immunreaktioner efter oral indgift er også langt mindre sandsynlige, og denne indgiftsform er derfor sikrere.

Oral vaccination er en særlig omkostningseffektiv måde at vaccinere eller behandle et stort antal fisk på én gang i dam- eller havbrug med minimal belastning eller arbejdsindsats. Dette gælder navnlig, når oral indgift af vaccinen kan ske ved indtag i forbindelse med foder- eller væskeindtag. Endvidere kan orale vacciner fremstilles mere omkostningseffektivt end injicerbare vaccineformuleringer på grund af de færre oprensningstrin, der er nødvendige til opnåelse af en oral vaccine. Oral vaccination er også fordelagtig ved at have færre bivirkninger så som stress eller andre injektionsreaktioner.

På trods af fordelene ved oral indgift af lægemidler og navnlig vacciner, er udviklingen af teknologien blevet forsinket på grund af mangel på egnede vaccinefremføringssystemer. I fravær af passende fremføringssystemer nedbrydes de fleste orale vacciner i mave-tarm-systemet, navnlig ved lav pH-værdi i maven, med begrænset absorption til følge, hvilket på sin side resulterer i en utilstrækkelig immunreaktion.

Historisk har immunisering været afhængig af fremkaldelsen af humoral immunitet ved parenteral indgift af vacciner. Antistoffer fremkaldt ved parenteral indgift når dog ikke nødvendigvis slimhindeoverfladerne, som er indtrængningsstedet for de fleste smitstoffer. Slimhindeimmunitet, som udvikles på slimhindeoverflader, inklusive tarmene, lungerne, munden, øjet, brystkirtler, og det uroge nitale rør, og også hud og gæller hos fisk, som et resultat af kontakt mellem antigen og slimhindevæv, er en vigtig første forsvarslinje mod infektiøse midler.

Diverse fremføringsmidler er blevet udviklet for at fremføre lægemidler eller vacciner til tarmslimhindevæv. Bionedbrydelige polymerer, såsom poly-(DL-lactid) og poly-(DL-lactid-co-glycolid) har været anvendt til fremstilling af sammensætninger til oral indgift af antigener. Imidlertid kræver fremstilling af disse polymerpartikler anvendelse af opløsningsmidler, som kan beskadige følsomme antigener. Desuden forhindrer anvendelsen af opløsningsmidler inkorporering af svækkede levende organismer såsom vira eller bakterier i disse sammensætninger.

Andre problemer ved udviklingen af egnede orale fremføringssystemer er behovet for kun at udvælge forbindelser og adjuvanser, der er af fødevareeller foderkvalitet og er bionedbrydelige, og behovet for en langvarig og stærk immunreaktion.

I et første aspekt tilvejebringer frembringelsen en sammensætning til oral indgift af et bioaktivt middel til vand- eller landlevende arter, herunder partikler, der hver især indbefatter et bioaktivt middel dispergeret i oliedråber, idet oliedråberne er dispergerede i en matrix omfattende en enterisk overtrækspolymer, hvor partiklerne hver især yderligere indbefatter en slimhindetilhæftende polymer.

I et andet aspekt tilvejebringer frembringelsen en anvendelse af en sammensætning som beskrevet ovenfor til postgastrisk fremføring af et bioaktivt middel til et dyr, omfattende oral indgift af en sammensætning som beskrevet ovenfor til dyret, hvor det bioaktive middel er et immunogen.

I et yderligere aspekt tilvejebringer frembringelsen en anvendelse af sammensætningen som beskrevet ovenfor til vaccination af vand- eller landlevende arter, indbefattende oral indgift til arterne af en sammensætning som beskrevet ovenfor, hvor sammensætningen er et fremføringsvehikel for en vaccine.

I endnu et yderligere aspekt tilvejebringer frembringelsen en anvendelse af et bioaktivt middel som beskrevet ovenfor til opnåelse af en sammensætning som beskrevet ovenfor, omfattende i rækkefølge: (a) at danne en vandig blanding omfattende et dispergeret eller opløst bioaktivt middel; (b) at homogenisere den vandige blanding fra foregang (a) i olie til dannelse afen emulsion af den vandige blanding i olien; (c) at danne en opslæmning af produktet fra foregang (b) i en vandig opløsning omfattende en enterisk overtrækspolymer; og enten (dl) at sprøjte, dryppe eller injicere opslæmningen fra foregang (c) i en vandig opløsning indeholdende et krydsbindingsmiddel til den enteriske overtrækspolymer til dannelse af partiklerne, hvor den vandige blanding fra foregang (a) yderligere indbefatter en slimhindetilhæftende polymer, eller (d2) at danne partikler fra opslæmningen fra foregang (c), hvor foregang (b) yderligere indbefatter at danne dråber af emulsionen i vandig slimhindetilhæftende polymer og at krydsbinde den slimhindetilhæftende polymer til dannelse af mellemstadiepartikler.

Med mindre de defineres anderledes i nærværende sammenhæng, skal videnskabelige og tekniske fagudtryk, der benyttes i denne tekst, gives de betydninger, som de normalt tillægges af en fagmand inden for området. Desuden har udtrykkene "mindst én" og "én eller flere" som benyttet heri og i kravene den samme betydning og indbefatter én, to, tre eller flere. Med mindre andet angives, er procentdele eller andele af bestanddele i sammensætninger på vægtbasis. Betegnelsen "dispergeret" betyder opslæmmet og/eller opløst.

"Oral vaccination" er defineret som oral indgift gennem kosten af immu-nogent materiale til stimulering af det systemiske immunsystem hos et dyr for at udvikle en specifik immunreaktion over for et patogen.

"Krydsbinding" og varianter deraf henviser til forbindelsen af to eller flere materialer og/eller stoffer, herunder et hvilket som helst af de heri beskrevne, via en eller flere kovalente og/eller ikke-kovalente bindinger, f.eks. ionbindinger. Krydsbinding kan være afstedkommet naturligt (f.eks. disulfidbindinger i cystin-rester) eller ad syntetiske eller halvsyntetiske veje. Krydsbinding af ladede polymerer kan være afstedkommet ved ionforbindelse med en polyvalent modion med modsat ladning. Stabile, faste strukturer, for eksempel hydrogeler, kan være fremstillet ved en sådan krydsbinding.

"Gastrisk beskyttelse" henviser til beskyttelsen af et bioaktivt middel mod nedbrydning og tab af aktivitet i maven.

Sammensætningerne ifølge frembringelsen indbefatter partikelformige materialer omfattende et bioaktivt middel og en slimhindetilhæftende polymer, hvor det bioaktive middel er dispergeret i en olie. Oliedråberne er for deres vedkommende indlejret i eller overtrukket med en ekstern matrix af en enterisk overtrækspolymer. Den eksterne matrix omgiver oliedråberne og beskytter indholdet mod at blive udsat for lave pH-værdier i dyrets mave, idet polymeren forbliver uopløselig ved lave pH-værdier og opretholdes intakt som et beskyttende overtræk eller lag. Partiklerne har typisk en gennemsnitlig geometrisk størrelse (også omtalt som diameter) i området 10 til 5000 pm og kan enten være dannet direkte i dette størrelsesområde eller være nedbragt i størrelse ved formaling, findeling eller andre midler. Almindeligvis har partiklerne en diameter på under 100 pm, fortrinsvis under 50 pm.

I nogle udførelsesformer er den slimhindetilhæftende polymer og det bioaktive middel sammenblandet og i gensidig kontakt, associerede i partikler, som på deres side er dispergerede i oliedråben. En eller flere af disse partikler er til stede i en enkelt oliedråbe, og en eller flere oliedråber er til stede i den eksterne matrix. Den slimhindetilhæftende polymer og/eller den enteriske overtrækspolymer kan være krydsbundet eller ikke.

I andre udførelsesformer er det bioaktive middel dispergeret som ovenfor i oliedråber, og disse er så indlejrede i den slimhindetilhæftende polymer. De fremkomne partikler er for deres vedkommende indlejrede i den eksterne matrix af den enteriske overtrækspolymer. Den slimhindetilhæftende polymer og/eller den enteriske overtrækspolymer kan være krydsbundet eller ikke.

I nogle udførelsesformer tilvejebringer frembringelsen en sammensætning til oral indgift af en vaccine til stimulering af en immunreaktion i vand- og landlevende arter mod specifikke sygdomme. Sammensætningen omfatter en virksom mængde af et antigen som det bioaktive middel. Nærværende sammensætninger er udformet til at præsentere det bioaktive materiale med henblik på kontakt med dyrets tarmslimhinde for at stimulere optagelsen og slimhindeimmuniteten. Sammensætninger ifølge denne frembringelse indgives oralt, typisk med foder eller et farmaceutisk acceptabelt bæreemne, herunder for eksempel vand (f.eks. drikkevand til dyr), tabletter, kapsler, bolusdoseringsformer, foderpiller eller som fødevaretilsætning for at bringe sammensætningen ind i tarmen hos den tilsigtede art.

Sammensætningerne ifølge frembringelsen frembyder flere fordele med hensyn til fremføring af et bioaktivt middel til et individ. For det første overflødiggør fremføringssystemets fremstillingsmåde brugen af organiske opløsningsmidler eller høj temperatur og pH-værdi, som ofte kræves til partikelfremstilling ved andre fremgangsmåder. Ved at opretholde et vandigt miljø under milde pH-forhold og lave temperaturer under hele fremstillingen af nærværende sammensætning kan følsomme bioaktive emner såsom levende svækkede bakterier eller vira fremføres oralt. For det andet beskytter det yderligere lag af enterisk overtrækspolymer det bioaktive middel mod nedbrydning i mave-tarm-systemet.

Hvor der er tale om et immunogen, tillader dette stimulering af den samme immunreaktion med en mindre mængde antigen/vaccine. For det tredje omslutter oliedispersionen det bioaktive middel og forhindrer små bioaktive molekyler såsom proteiner, peptider og lægemidler i at lække til et vandigt miljø under fremstillingen såvel som under eksponering i maven. Desforuden giver den slimhinde-tilhæftende polymer selv en adjuvansvirkning. Endelig kan fremføringssystemet let formuleres med henblik på effektiv fremføring til både vand- og landlevende arter.

Typisk er alle bestanddele, der benyttes i fremstillingen af sammensætningerne ifølge frembringelsen af fødevarekvalitet, ikke-toksiske og bionedbrydelige, og de forekommer typisk naturligt. I det følgende skal gives en beskrivelse af materialer, der er nyttige til fremstilling af sammensætningerne.

Bioaktivt middel

Det bioaktive middel kan være et naturligt forekommende, syntetisk eller halvsyntetisk materiale (f.eks. forbindelser, fermentater, ekstrakter, cellestrukturer) med evne til direkte eller indirekte at fremkalde en eller flere fysiske, kemiske og/eller biologiske virkninger. Det bioaktive middel kan være i stand til at forebygge, lindre, behandle og/eller helbrede abnorme og/eller patologiske tilstande i et levende legeme, såsom ved at ødelægge en parasitorganisme eller ved at begrænse virkningen af en sygdom eller abnormalitet. Afhængigt af virkningen og/eller dets anvendelse kan det bioaktive middel være et farmaceutisk middel (såsom et profylaktisk middel eller et terapeutisk middel), et diagnostisk middel og/eller et kosmetisk middel og indbefatter, uden begrænsning, vacciner lægemidler, lægemiddelforstadier, affinitetsmolekyler, syntetiske organiske molekyler, hormoner, antistoffer, polymerer, enzymer, lavmolekylære proteinholdige forbindelser, peptider, vitaminer, steroider, steroidanaloger, lipider, nukleinsyrer, kulhydrater, forstadier dertil og derivater deraf. Det bioaktive middel kan også være et kosttilskud. Ikke-begrænsende kosttilskud indbefatter proteiner, kulhydrater, vandopløselige vitaminer (f.eks. vitamin C, B-kompleksvitaminer og lignende), fedtopløselige vitaminer (f.eks. vitamin A, D, E, K og lignende), mineraler og planteekstrakter. Det bioaktive middel kan være kommercielt tilgængeligt og/eller fremstillet ved kendte fremgangsmåder.

Bioaktive midler i nærværende frembringelse indbefatter, uden begrænsning, vacciner (vacciner kan også fremføres som del af immunstimulerende komplekser, konjugater og antigener med koleratoksin og dets B-underenhed, lectiner og adjuvanser), antibiotika, affinitetsmolekyler, syntetiske organiske mo lekyler, polymerer, lavmolekylære proteinholdige forbindelser, peptider, vitaminer, steroider, steroidanaloger, lipider, nukleinsyrer, kulhydrater, forstadier dertil og derivater deraf. Det bioaktive middel kan også være et pesticid, for eksempel et rodenticid.

Det bioaktive middel kan være et immunogen, dvs. et materiale, som er i stand til at rejse en specifik immunreaktion hos et dyr. Eksempler på immuno-gener indbefatter antigener og vacciner. For eksempel kan immunogener indbefatte immunogene peptider, proteiner eller rekombinante proteiner, herunder blandinger omfattende immunogene peptider og/eller proteiner og bakterier (f.eks. bacteriner); intakte inaktive, svækkede og smitsomme viruspartikler, intakte dræbte, svækkede og smitsomme prokaryoter; intakte dræbte, svækkede og smitsomme protozoer, herunder ethvert livscyklusstadium heraf, og intakte dræbte, svækkede og smitsomme flercellede patogener, rekombinante underenhedsvacciner og rekombinante vektorer til fremføring og ekspression af gener, der koder for immunogene proteiner (f.eks. DNA-vacciner).

Det ene eller de flere bioaktive midler udgør typisk mindst 0,1 % af partiklernes vægt, eksklusiv vand, eller mindst 1 % eller mindst 5 %. Typisk udgør de højst 40 % eller højst 20 % eller højst 10 %.

Slimhindetilhæftende polymer

Den slimhindetilhæftende polymer er en polymer, der specifikt binder sig til slimhindevæv og hjælper med at holde det bioaktive middel tæt på slimhinden, så indgiften forbedres. Egnede eksempler indbefatter syntetiske polymerer såsom poly(akrylsyre), hydroxypropylmethylcellulose og poly(methylacrylat), carboxylfunktionaliserede polymerer, sulfatfunktionaliserede polymerer, amin-funktionaliserede polymerer, og derivater eller modifikationer deraf, så vel som naturligt forekommende polymerer så som carrageenan, hyaluronsyre, chitosan, kationisk guar og alginat. Derivatiserede eller på anden vis modificerede versioner af naturligt forekommende polymerer kan også finde anvendelse, og mange sådanne polymerer kendes inden for fagområdet. Ikke-begrænsende eksempler indbefatter propylenglykolalginat og pektiner, carboxymethylchitosan, carboxy-methylkitin, methylglykolchitosan, trimethylchitosan og lignende.

En foretrukken slimhindetilhæftende polymer er chitosan og modificeret eller derivatiseret chitosan, som kan opnås vis deacetylering af kitin, hovedbe-standdelen af exoskelettet hos krebsdyr. Chitosan [a-(l~4)-2-amino-2-deoxy-3-D-glucan], et mucopolysaccharid nært beslægtet med cellulose, udviser kemiske egenskaber, som er bestemt af molekylvægten, deacetyleringsgraden og viskosi teten. Chitosan kan danne mikropartikler og nanopartikler, som kan binde store mængder antigener ved kemisk reaktion med krydsbindingsmidler så som phosphationer, glutaraldehyd eller sulfationer.

Selv om chitosan anvendes i nogle foretrukne udførelsesformer, kan andre polymerer også anvendes til at opnå en lignende slimhindetilhæftende funktion. Disse indbefatter men er ikke begrænsede til gelatine, alginat, dextran, hya-luronsyre, agar og resistent stivelse.

Den ene eller de flere slimhindetilhæftende polymerer udgør typisk mindst 1 % partiklernes vægt, eksklusiv vand, eller mindst 10 % eller mindst 15 %. Typisk udgør de højest 50 % eller højest 30 % eller højest 20 %.

Olie I typiske traditionelle produkter tabes en betydelig mængde bioaktivt middel til det vandige miljø ved udsivning fra partiklen under dens fremstilling og under passagen gennem maven, og dette gælder navnlig lavmolekylære bioaktive midler så som vira, proteiner, lægemidler, antibiotika, pesticider og lignende. I nærværende frembringelse er udsivning af bioaktivt middel fra partiklen i vidt omfang bragt til ophør ved at særskilte partikler, domæner eller faser, der indeholder midlet, er dispergeret i eller overtrukket med en olie. En hvilken som helst type olie, herunder vegetabilske, animalske eller syntetiske olier og fedtstoffer på enten flydende eller fast form, eller vokstyper, kan anvendes til overtrækning af det bioaktive middel. Olier af vegetabilsk oprindelse, som finder anvendelse i nærværende frembringelse indbefatter uden begrænsning amerikansk olie, ko-kosnøddeolie, kakaosmør, majsolie, bomuldsfrøolie, olivenolie, olivensqualan, palmeolie, jordnøddeolie, rapsolie, saflorolie, sesamolie, sojabønneolie, solsikkeolie, stearat, carnaubavoks og blandinger deraf. Olier af animalsk oprindelse, som finder anvendelse i nærværende frembringelse omfatter uden begrænsning fiskeolie, hajsqualan, smørfedt, bivoks, lanolin, svinefedt og lignende. I visse tilfælde er dispergeringsolien en blanding af oliven- eller hajsqualaner med en hvilken som helst anden type olie, fedt eller voks. Typisk er massen af olien større end den samlede masse af bioaktivt middel og slimhindetilhæftende polymer.

Ved en typisk procedure homogeniseres en vandig opløsning indeholdende det bioaktive middel og den slimhindetilhæftende polymer med olie i et forhold på én del opløsning til 1,1-5 dele olie efter vægt, indtil en ensartet emulsion dannes. Til at hjælpe med dannelsen af en ensartet og stabil emulsion kan en non-ionisk surfaktant tilsættes. Egnede non-ioniske surfaktanter indbefatter uden begrænsning ethoxyleret alifatisk alkohol, polyoxyethylensurfaktanter og carboxylsyreestre osv. Når en stabil emulsion er dannet, stivnes de vandige dråber, som er dispergeret i olien, ved en kemisk eller fysisk reaktion af den slim-hindetilhæftende polymer. For eksempel stivnes gelatine- og agarpolymerer ved at sænke temperaturen eller ændre pH-værdien i emulsionen, medens chitosan stivnes ved et hæve pH-værdien i emulsionen til over 6,5 og/eller ved at tilsætte modioner så som natriumtripolyphosphat (TPP).

De ene eller de flere olier udgør typisk mindst 1,5 % af partiklernes vægt, eksklusiv vand, eller mindst 10 % eller mindst 20 %. Typisk udgør de højest 40 % eller højest 30 % eller højest 25 %.

Enterisk overtrækspolvmer

Dråber af oliedispersionen, enten indeholdende eller overtrukket med den slimhindetilhæftende polymer, dispergeres i en matrix af enterisk overtrækspolymer, som giver beskyttelse mod mavesyre og frigivelse eller fremføring af det bioaktive middel i intakt form efter mavepassage, dvs. frigivelse i tarmen.

Eksempler på enteriske overtrækspolymerer indbefatter polymerer, der er opløselige i vand ved tilstrækkelig høj pH-værdi, men uopløselige ved lav pH-værdi. Typisk er de opløselige ved en pH-værdi større end 5,0 og uopløselige ved en pH-værdi under 4,0. Egnede polymerer er i det væsentlige opløselige eller fordøjelige under de relative skånsomme pH-forhold i tarmen på et dyr, hvor det bioaktive materiale skal frigives, men uopløselige og ufordøjelige i maven, hvor den ydre matrix af enterisk overtrækspolymer beskytter det følsomme bioaktive middel mod nedbrydning. I nogle tilfælde er den enteriske overtrækspolymer krydsbundet, for eksempel med divalente kationer, for at forhindre opløsning eller fordøjelse i maven.

Egnede enteriske overtrækspolymerer kan være udvalgt blandt en lang række hydrofile polymerer ind befattende, for eksempel, polyacrylsyre, po-ly(meth)acrylater, carboxymethylcellulose, methylcellulose, celluloseacetatphtha-lat og vandopløselige, naturlige eller syntetiske polysaccharidgummier. Et eksempel på en syntetisk enterisk overtrækspolymer er EUDRAGIT® FS30D (Evonik Industries). Natriumalginat og pektiner er foretrukne vandopløselige gummier på grund af deres milde krydsbindingsbetingelser.

Alginater udgør en foretrukken hydrofil bærematrix til mavefølsomme bioaktive midler, navnlig på grund af letheden, hvormed de danner faste gelsammensætninger. Alginatopløsninger danner faste geler, når de kombineres eller blandes med divalente kationer. Ikke desto mindre er alginaten i visse udførelsesformer ikke krydsbundet, men forbliver ufordøjelig og uopløselig i et ma- vemiljø og beskytter dermed partikelindholdet under de lave pH-værdier i maven på et dyr.

Alginater omfatter vekslende andele af 1,4-bundet β-D-mannuronsyre (M), α-L-guluronsyre (G) og vekslende (MG) blokke. Viskositeten af algina-topløsninger bestemmes hovedsageligt af det molekylære forhold i M/G-blokkene. Lavviskøse alginater indeholder typisk mindst 50 % mannuronatenhe-der, og deres viskositet er i området 20-200 mPa. Middel- og højviskøse alginater indeholder mindst 50 % guluronsyreenheder, og deres viskositet er typisk over >200 mPa.

I nogle udførelsesformer er den matrixdannende polymer alginat, pektin eller en blanding deraf. Lavviskøse alginater og lavmethoxypektiner foretrækkes. Typiske lavmethoxypektiner har en methyleringsgrad under 50 %, og de er typisk krydsbundne med en divalent kation såsom Ba, Ca, Mg, Sr eller Zn.

Den ene eller de flere enteriske overtrækspolymerer udgør typisk mindst 10 % af partiklernes vægt, eksklusiv vand, eller mindst 20 % eller mindst 30 %. Typisk udgør de højst 70 % eller højst 50 % eller højst 40 %.

Valgfrie ingredienser I nogle udførelsesformer indbefatter sammensætningen eventuelt næringsstoffer, kosttilskud, appetitfremmere og/eller smagsmaskeringssammensætninger ud over det primære bioaktive middel. Gennemtrængningsforstærkere eller hjælpestoffer kan også være indbefattede for at fremkalde en kraftig immunreaktion og forbedre antigenet, der optages af slimhindelymfocytter. Et eksempel på en adjuvans er betaglucan.

Opnåelse af sammensætninger

En første almen foregang til opnåelse af partiklerne er som følger. En vandig blanding omfattende et dispergeret bioaktivt middel og slimhindetilhæf-tende polymer homogeniseres med olie til opnåelse af en emulsion af den vandige blanding i olien. Typisk anvendes et forhold på 1 del vandig blanding til 1,1-5 dele olie efter vægt til opnåelse af emulsionen. Emulsionen opslæmmes derefter i en vandig opløsning omfattende en enterisk overtrækspolymer, og opslæmningen sprøjtes, dryppes eller injiceres i en vandig opløsning indeholdende en krydsbinder til den enteriske overtrækspolymer til dannelse af partiklerne.

Ifølge en anden almen foregang homogeniseres en vandig blanding omfattende et dispergeret bioaktivt middel med olie til opnåelse af en emulsion af den vandige blanding i olien. Typisk anvendes et forhold på 1 del vandig blanding til 1,1-5 dele olie efter vægt til opnåelse af emulsionen. Dråber af emulsionen dispergeres derefter i vandig slimhindetilhæftende polymer, som krydsbindes til dannelse af mellemstadiepartikler, som eventuelt kan separeres fra krydsbindingsopløsningen. De isolerede eller ikke-isolerede mellemstadiepartikler op-slæmmes derefter i en vandig opløsning omfattende en enterisk overtrækspolymer. Partiklerne dannes ved sprøjtetørring eller ved frysetørring og formaling. Der tilvejebringes således anvendelser af et bioaktivt middel til opnåelse af sammensætningerne ifølge frembringelsen.

Ifølge en specifik anvendelse af bioaktivt middel til opnåelse af sammensætningerne opslæmmes en olie indeholdende dispergerede partikler af bioaktivt middel forbundet med den slimhindetilhæftende polymer i en 5-15 % opløsning af lavviskøs natriumalginat, eventuelt indbefattende 1-3 % lavmetho-xypektiner, og opslæmningen injiceres, dryppes eller sprøjteforstøves i en vandig opløsning af divalente kationer såsom calciumchlorid. Størrelsen af de fremkomne matrixpartikler kan justeres ved hjælp af hastigheden og måden, hvorpå algi-natdispersionen fremføres til calciumchloridopløsningen. I en anden udførelsesform tørres opslæmningen uden krydsbinding af alginaten under anvendelse af en hvilken som helst kendt måde at opnå tørring på, der kendes inden for fagområdet, for eksempel sprøjtetørring eller vakuumtørring. Typisk er størrelsen på de resulterende partikler i området fra cirka 20 pm til cirka 8 millimeter, mere typisk fra cirka 50 pm til cirka 1000 pm.

Ifølge en alternativ specifik anvendelse tilsættes 0,5-2 % af en uopløselig kilde til divalente kationer såsom CaC03 til opslæmningen af natriumalgina-topløsning af oliedråber indeholdende bioaktivt middel, efterfulgt af tilsætning af 0,5 -1 % af en svag organisk syre såsom glucon-delta-lacton (GDL) som syredanner for langsomt at frigive kationer såsom calciumioner. Kationerne krydsbinder alginaten til dannelse af en fast gelkage, som kan hakkes eller knuses til små stykker eller partikler. Typisk er størrelsen af de resulterende stykker eller partikler i området fra cirka 50 pm til cirka 10 millimeter, mere typisk fra cirka 100 til cirka 5000 pm. Fagmanden vil indse, at andre naturlige eller syntetiske polymerer, fortrinsvis anioniske polymerer, kan benyttes under anvendelse af ioninterak-tionsbaseret affinitet, der danner basis for de nærværende sammensætninger.

Anvendelse af sammensætningerne

Sammensætningerne ifølge frembringelsen kan opbevares i vandig opslæmning eller tørres ved en hvilken som helst fremgangsmåde, der kendes inden for fagområdet, og opbevares i dehydreret tilstand i lange tidsrum uden betydende aktivitetstab.

Sammensætninger ifølge frembringelsen kan indgives oralt som en bestanddel af drikkevand, som fødevaretilsætning eller som del afen vaccineformulering indeholdende en farmaceutisk acceptabel bærer og eventuelle hjælpestoffer. Alternativt, kan de nærværende sammensætninger indgå i andre standardmæssige orale doseringsformer. Fagmanden vil indse, at der inden for fagområdet er en lang række anerkendte fødevarer, foderstoffer, kosttilskud eller farmaceutiske doseringsformer og acceptable bærere, der er egnede til fremføring af sammensætningen til det tilsigtede dyr.

Indgift af sammensætningerne ifølge frembringelsen kan ske ved doseringsprogrammer med en enkelt eller flere doser. I en udførelsesform indgives immunogene sammensætninger i flerdosisprogrammer over en periode på cirka 3 dage til cirka 10 dage eller længere og kan gentages periodisk i takt med at den tilsigtede art viser tegn på immunitetstab.

Med hensyn til anvendelser i drikkevand til brug hos svin, fjerkræ, kvæg eller vandlevende dyr, kan yderligere olie eller inerte polypropylen- eller polyesterpartikler inkorporeres i sammensætningen til forøgelse af opdriften (dvs. sænkning af densiteten), således at vandingsanordninger til indbringning i fiskeopdrætstanke ville kunne bruges til fremføring af nærværende sammensætninger. Således kan sammensætningerne indgives til dyrene enten som en bestanddel af deres daglige foder eller som en bestanddel af deres drikkevand.

EKSEMPLER Eksempel la

Opnåelse af sammensætningen ifølge frembringelsen

En sammensætning ifølge frembringelsen opnåedes som følger. Tre gram slimhindetilhæftende polymer (Chitosan, FMC Biopolymers Inc.) opløstes i 100 ml 0,5 N isafkølet eddikesyreopløsning ved 50 °C. Opløsningens pH-værdi indstilledes til 5,8 med natriumhydroxid, og opløsningen tillodes at afkøle til stuetemperatur. Tween 80 (0,2 %, Sigma, St. Louis, MO) og Antifoam (0,5 %, Sigma, St. Louis, MO) tilsattes, og chitosanopløsningen blev holdt ved 4 °C indtil brug. En 30 ml opløsning indeholdende 300 mg ovalbumin ("OVA", en modelvaccine) tilsattes til chitosanopløsningen til dannelse af en blanding. Den resulterende opløsning tilsattes til 195 g olivenolie indeholdende 5 % Span-80 (Sigma) og homogeniseredes ved 10000 opm i 30 min i et isbad til dannelse af en vand-i-olie-emulsion. 20 ml vandig natriumtripolyphosphat (5 %) og 0,5 N NaOH tilsattes langsomt under blanding til emulsionen af bioaktivt middel indeholdende ovalbumin og krydsbundet chitosanmikropartikler i en kontinuert oliefase. Partiklerne fik lov at hærde i mindst 2 timer, men blev ikke fjernet fra oliefasen.

Dispersionen af partikler i olie blev omrørt i 330 ml af en 9 % vandig opløsning af lavviskøs natriumalginat (FMC Biopolymers Inc.), som også indeholdt 66 g oligosaccharider (lyninulin, Cargill, Minneapolis, MN), 10 g lecithin og 3 g Tween-80. Den fremkomne vandige dispersion injiceredes i en krydsbindende opløsning indeholdende 5 % CaCI2 til dannelse af alginatmatrixperler, hver især indeholdende flere oliedråber, som på deres side hver især indeholdt mikropar-tikler af ovalbumin og krydsbundet chitosan. Perlerne blev frysetørret og formalet til partikler med en størrelse under 150 pm til opnåelse af en tør sammensætning ifølge nærværende frembringelse.

Eksempel lb

En alternativ måde at danne sammensætningerne ifølge frembringelsen gør brug af en emulsion af en vandig bioaktiv opløsning i en olie. Ti ml af en vandig opløsning indeholdende 100 mg ovalbumin blev kombineret med 15 g canola-rapsolie indeholdende 5 % Span-80 og homogeniseredes til dannelse af en fin vand-i-olie-emulsion. Emulsionen blev blandet med 100 ml 3 % vandig chitosa-nopløsning, og dispersionen injiceredes i en krydsbindingsopløsning indeholdende 5 % tripolyphosphatopløsning (5 % TPP). Partiklerne fik lov at hærde i mindst 2 timer. De resulterende faste krydsbundne chitosanpartikler indeholdt indlejrede oliedråber, og hver af disse oliedråber indeholdt på deres side dispergerede dråber af den vandige ovalbumin mindre end 10 pm. De fast partikler blev isoleret ved filtrering og blev fint dispergeret i 400 ml af en vandig opløsning af 9 % lavviskøs alginat. Den fremkomne vandige dispersion injiceredes i en krydsbindingsopløsning indeholdende 5 % CaCI2 til dannelse af alginatmatrixperler. Perlerne blev frysetørret og formalet til partikler af en størrelse under 150 pm til opnåelse af en tør sammensætning ifølge nærværende frembringelse.

Eksempel 2

Fremstilling afen immunogen sammensætning

Chitosan (3 g, FMC Biopolymer) blev opløst i 100 ml opløsning 0,5 N isafkølet eddikesyre ved 50 °C. Opløsningens pH-værdi indstilledes til 5,8 med natriumhydroxid, og opløsningen fik lov at afkøles til stuetemperatur. 10 ml opløsning indeholdende 100 mg ovalbumin (OVA) som en modelvaccine blev blandet med 50 mg immunstimulerende middel (betaglucan, AHD International, Atlanta, GA) og tilsat til chitosanopløsningen. Den resulterende blanding emulgeredes i 150 g hajsqualanolie (Jedwards International) indeholdende 5 % efter vægt

Span-80 ved 10000 opm i 30 minutter til dannelse af en emulsion af vandige dråber af OVA, chitosan og betaglucan i en kontinuert oliefase. Emulsionen tilsattes under omrøring til 400 ml af en vandig opløsning af 9 % lavviskøs natriumal-ginat i 0,5 N NaOH, som også indeholdt oligosaccharider (40 g, lyninulin). Den fremkomne emulsion injicerede i en 5 % CaCI2-opløsning til krydsbinding af algi-naten, hvilket resulterede i en immunogen sammensætning ifølge den aktuelle frembringelse. Sammensætningen blev frysetørret og formalet til partikler med en størrelse på under 250 pm.

Eksempel 3

Fremstilling af en sammensætning til behandlinq/forebvaaelse af parasitinfektion hos fisk

En sammensætning indeholdende et proteinantigen eller en parasiticid forbindelse til behandling af parasitinfektion fremstilles. Ti mg af det bioaktive middel opløses i 10 ml 3 % vandig chitosanopløsning som beskrevet i Eksempel 2 ovenfor og emulgeres i 15 g olieblanding indeholdende 75 % olivenolie, 20 % squalanolie og 5 % Span-80.

Én ml vandig 5 % natriumtripolyphosphat, 0,5 N NaOH-opløsning emulgeres i ét g olivenolie og blandes i emulsionen med bioaktivt middel, hvilket resulterer i en dispersion i olie af partikler indeholdende det bioaktive middel og det krydsbundne chitosan. Dispersionen får lov at henstå i 2 timer til hærdning af den krydsbundne chitosan. Den fremkomne dispersion af partikler i olie tilsættes under omrøring til 20 ml opløsning indeholdende 9 % lavviskøs natriumalginat, 1 % lavmethoxypektin, 30 % efter vægt lyninulin og 1 % Tween-80. Den fremkomne blanding injiceres i en krydsbindingsopløsning indeholdende 3 % CaCI2 til dannelse af perler af en alginat-pektin-matrix indeholdende indlejrede disperge-rede oliedråber, der hver især på deres side indeholder mikropartikler af bioaktiv og krydsbundet chitosan. Perlerne frysetørres og formales til under 150 pm til opnåelse af en tør sammensætning ifølge nærværende frembringelse.

Eksempel 4

Fremstilling af en sammensætning indeholdende et farmaceutisk lægemiddel

En sammensætning indeholdende et farmaceutisk lægemiddel (et glucocorticoid såsom dexamethason eller methylprednisolon) til behandling af tyktarmssygdomme fremstilles. Lægemidlet tilsættes til chitosanopløsning som beskrevet i Eksempel 1 eller 2 ovenfor og emulgeres i en blanding af 95 % squalanolie og 5 % Span-80. En alkaliemulsion indeholdende 5 % natriumtripolyphosphat i 0,5 N NaOH i squalanolie fremstilles og blandes langsomt (20 % ef ter vægt) i den bioaktive emulsion til krydsbinding af chitosanen, og blandingen får lov at henstå i mindst 2 timer til hærdning af de krydsbundne partikler. Oliedispersionen af chitosanmikropartikler blandes i en væske indeholdende den en-teriske overtrækspolymer (30 % efter vægt EUDRAGIT ® FS30D, Evonik Industries) i et forhold mellem emulsion og Eudragit-væske på 1:3 og sprøjtetørres til dannelse af en tør partikelformig sammensætning ifølge nærværende frembringelse.

Eksempel 5

Effektivitet af indkapslingen af et bioaktivt middel i sammensætningen ifølge nærværende frembringelse

Virkningen af den yderligere oliedispersion og enteriske overtrækspoly-mermatrix i sammensætningen ifølge nærværende frembringelse vurderes under anvendelse af ovalbumin (OVA) for at simulere et typisk proteinlægemiddel eller vaccine. Tre OVA(Sigma)-holdige sammensætninger fremstilledes. Sammensætning 1 bestod af OVA-bundne chitosanmikropartikler fremstillet ved opløsning af 100 mg OVA i 10 ml 3 % chitosanopløsning og indsprøjtning af opløsningen i 10 % vandig TPP til dannelse af krydsbunde perler, efterfulgt af 2 timers pause for at hærde perlerne med efterfølgende frysetørring og formaling. Sammensætning 2 dannedes ved at emulgere 10 ml vandig opløsning indeholdende 100 mg OVA i 15 g squalanolie indeholdende 3 % Spann-80 og blande den fremkomne emulsion i 20 ml 3 % chitosanopløsning. Den fremkomne opslæmning indsprøjtedes derefter i en 10 % TPP-opløsning til dannelse af perler, efterfulgt af hærdning, frysetørring og formaling som ovenfor. Sammensætning 3 bestod af OVA-bundne chitosanmikropartikler ifølge frembringelsen, fremstillet som i Eksempel 2.

Indkapslingseffektiviteten af OVA i de tre typer sammensætning bestemtes som følger. Femhundrede mg af hver sammensætning dispergeredes i 10 ml RIPA-buffer og inkuberedes ved stuetemperatur i 30 minutter. Opslæmningerne hvirvelomrørtes i 5 minutter og centrifugeredes derefter ved 3000 opm i 15 minutter. Overstanden undersøgtes for OVA-indhold under anvendelse af Western Blot-analyse som følger.

Western Blot: sammensætningerne lyseredes med RIPA-buffer som beskrevet ovenfor, og en beregnet mængde ækvivalent med 12 pg protein per prøve sattes på en 10 % SDS-polyakrylamidgradientgel (SDS-PAGE, Bio-Rad, Hercules, CA). Proteinerne overførtes til en PVDF-membran (Bio-Rad) og blokeredes i 1 time med 5 % fedtfri mælk i PBS indeholdende 0,5 % Tween-20 (PBS-T). Blottene inkuberedes med en passende mængde primært antistof i fortyndinger på 1:5000 i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS-T (3 x 10 ml, 5 minutter hver) inkuberedes membranerne med et egnet HRP-konjugeret sekundært antistof (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) i en fortynding på 1:5000 i 1 time. Efter vask med PBS-T (3 x 10 ml, 5 minutter hver) fremkaldtes chemi-luminescente film med et ECL-substrat (Amersham Biosciences). Indkapslingseffektiviteten af OVA (% tilbageholdelse af den oprindelige mængde OVA) vises i Tabel 1.

Tabel 1.

Resultaterne viser den beskyttende virkning af oliedispersionen i sammensætningerne 2 og 3 med hensyn til forhindring af udsivning (tab) af det bioaktive middel til et simpelt vandigt miljø. Der fandtes imidlertid signifikante forskelle mellem sammenligningssammensætningen 2 og frembringelsessammensætningen 3, når de afprøvedes under mavebetingelser som beskrevet nedenfor i Eksempel 7.

Eksempel 6

Forringelse af ubeskyttet proteinantiaenaktivitet i simuleret mavesvre

For at vurdere aktivitetstabet af et proteinantigen efter en typisk mave-eksponering, inkuberedes ikke-indkapslet OVA (10 mg) i 10 ml simuleret mave-syre indeholdende 0,08 % pepsin ved en pH-værdi på 2 i 37 °C på en ryster. Medium blev trukket ud ved 15 min, 30 min, 60 og 120 min inkubationstid, og mængden af rest-OVA analyseredes ved Western Blot-analyse som beskrevet ovenfor. Tabel 2 viser nedbrydningen af OVA i løbet af 2 timers eksponering i mavesyre, angivet som % tilbageværende aktivitet i forhold til aktiviteten før eksponering.

Tabel 2

Disse resultater viser, at aktiviteten af ubeskyttet proteinbaseret antigen eller bioaktivt middel vil nedbrydes fuldstændigt i et dyrs fordøjelsessystem.

Eksempel 7

Gastrisk beskyttelse af et bioaktivt middel i sammensætningen ifølge nærværende frembringelse

For at vurdere den tilbageværende aktivitet af et proteinantigen efter ma-veeksponering, fremstilledes tre sammensætninger som beskrevet i Eksempel 5. Femhundrede mg af hver af de tre sammensætninger inkuberedes i 10 ml simuleret mavesyre indeholdende 0,08 % pepsin ved en pH-værdi på 2 i 2 timer ved 37 °C på en ryster. Ved afslutningen af 2 timers eksponering blev mavesyreop-løsningerne trukket ud, og den tilbageværende aktivitet af OVA i sammensætningerne måltes som beskrevet i Eksempel 5. Tabel 3 viser den tilbageværende aktivitet af OVA i hver af sammensætningerne efter 2 timers eksponering for simuleret mavesyre.

Tabel 3

Disse resultater viser tydeligt den overlegne beskyttende virkning mod mavesyre hos sammensætning 3 ifølge frembringelsen i forhold til den kendte tekniks sammensætninger 1 og 2.

Eksempel 8

Effekten af viskositetsa raden af alainat i sammensætningen på gastrisk beskyttelse

Tre sammensætninger indeholdende 9 % lavviskøs alginat (50cP), 6 % middelviskøs alginat (300cP) og 1 % højviskøs alginat (800 cP) fremstilledes ifølge Eksempel 2 ovenfor. De tre sammensætninger udsattes for simuleret mavesyre som beskrevet i Eksempel 7, og den tilbageværende aktivitet af OVA i sammensætningerne måltes som beskrevet i Eksempel 5. Tabel 4 viser den tilbageværende aktivitet af OVA i hver af sammensætningerne efter 2 timers eksponering for simuleret mavesyre.

Tabel 4

Disse resultater viser, at sammensætning indeholdende alginat af lavere viskositet giver bedre beskyttelse af et proteinbaseret antigen eller bioaktivt middel det simulerede dyrefordøjelsessystem.

Eksempel 9

Optimal partikelstørrelse af sammensætning ifølge frembringelsen I dette eksempel opgjordes den beskyttende virkning af partikelstørrelsen af en tørret og formalet sammensætning ifølge frembringelsen i et simuleret ma-vemiljø. En OVA-sammensætning fremstilledes som beskrevet i Eksempel 5, efterfulgt af separation af det tørre pulver i 2 partikelstørrelser: små partikler, som passerede en 50 pm sigte, og store partikler, som blev fanget på en 50 pm sigte, men passerede gennem en 100 pm sigte. Tabel 5 viser den tilbageværende aktivitet af OVA i hver partikelstørrelse af sammensætningen efter 2 timers eksponering i simuleret mavesyre.

Tabel 5

Disse resultater viser, at optimal gastrisk beskyttelse opnås, når den tørre sammensætning formales til en partikelstørrelse over 50 pm.

Eksempel 10

Oral indgift af OVA-sammensætning til mus

Ovalbumin indgives oralt til mus for at afprøve effektiviteten af sammensætningerne ifølge frembringelsen med hensyn til fremkaldelse afen immunreaktion.

Dyr: Ti-tolv uger gamle BALB/c-hunmus anvendes. Musene fodres ad libitum. Hver forsøgsgruppe huses i et særskilt bur.

Ovalbuminsammensætning: Ovalbumin (1 mg/g ovalbumin, Sigma, St. Louis, Mo.) indarbejdes i sammensætningen ifølge frembringelsen som beskrevet i Eksempel 5. Tre grupper på 4 mus podes som følger: 1) ovalbumin (OVA) i sammensætningen, indgivet oralt, 2) OVA-opløsning, indgivet subkutant (SC), 3) antigenfri sammensætning indgivet oralt. Musene podes ved uge 0 og 3.

Ved hver dosis indgives samlet 100 mg tør sammensætning blandet med majsolie i et forhold på 1:2 efter vægt af sammensætning hhv. olie, overtrukket på foderpiller. Ved uge 4 aflives hver mus, og serum og miltceller indhøstes.

Immunologiske analyser: Serum analyseres for IgG og IgA ved ELISA. ELISA udføres under anvendelse af OVA absorberet på polystyrenplader. Prøverne placeres i brønde in triplo i en fortynding på 1:25 for serum. Gede-anti-museantistof konjugeret med peberrodperoxidase anvendes, efterfulgt af et orthophenylendiaminsubstrat (Sigma, St. Louis, Mo., USA). Optisk densitet af hver brønd bestemmes ved at anbringe pladen i et mikrotiterpladespektrofotome-ter og aflæse pladen ved 490 nm. Miltceller testes for antistofudskillende celler (ASC), som er specifikke for OVA, under anvendelse af tidligere beskrevne teknikker.

De OVA-specifikke IgG- og IgA-antistoffer kvantificeres ved at bestemme forøgelsen i optisk densitet over tid. OVA-specifikt serum og IgA, IgG og ASC-udskillende celler for hver mus podet med OVA forventes at være tilsvarende forøget hos de mus, der injiceres med OVA, og som oralt fodres med sammensætningen ifølge nærværende frembringelse. Ingen OVA-specifikke IgG- eller IgA-antistoffer forventes at blive påvist i mus fodret med antigenfri sammensætning. Således forventes sammensætningen at være virksom i fremkaldelse af en immunreaktion efter oral indgift.

Eksempel 11

Oral indgift af en sammensætning indeholdende antigener til kyllinger

Salmonella enteritidis er en vigtig årsag til sygdom hos liggehøner. Infektion sænker produktionen og forøger dødeligheden i flokke. Desuden kan S. enteritidis overføres via ægget til småkyllinger og efterfølgende inficere generationer af mennesker, som spiser inficerede æg. Eftersom infektionen begynder ved, at denne bakterie hæfter sig til og invaderer tarmslimhinden, og da længerevarende infektion omfatter infektion af tarmlymfoidvæv, er stimulering af slimhindeimmunitet afgørende for at bekæmpe denne sygdom.

For at vurdere effektiviteten af at vaccinere kyllinger med vaccinesammensætningerne ifølge nærværende frembringelse, inkorporeres flagellin fra Salmonella enteritidis, et vigtigt immunogen, i sammensætningen ifølge Eksempel 2, bortset fra, at vaccineemulsionen blandes i den basiske natriumalginatfase i et forhold på 1:2 efter vægt, og opslæmningen sprøjtetørres. Den tørre sammensætning topovertrækkes på foder og indgives oralt til kyllinger. Ti uger gamle kyllinger modtager 3 orale doser med 2-uges intervaller af sammensætningen tilsat enten 300 pg flagellinantigen fra S. enteritidis eller bovin serumalbumin. En uge efter sidste orale antigendosis, indsamles serum og tarmvæske og analyseres for flagellinspecifikke antistoffer med ELISA. Resultaterne ventes at vise at oralt vaccinerede fugle har signifikant forøget mængde flagellinspecifikke antistoffer i serum.

Eksempel 12

Oral indgift af en sammensætning indeholdende antigener til kalve

Effektiviteten af oralt indgivet ovalbuminholdig sammensætning fremstillet i overensstemmelse med nærværende frembringelse med henblik på stimulering afen immunreaktion i lungerne hos kalve demonstreres.

Ovalbumin inkorporeres i sammensætningen som beskrevet i Eksempel la. Til oral indgift til kalve indgives en sammensætning indeholdende en dosis på 40 pg ovalbumin per mg i foderet. Fire kalve anvendes per forsøgsgruppe, og hver kalv modtager 5 mg ovalbumin per dosis i 5 på hinanden følgende dage.

To grupper af kalve anvendes til at vurdere effektiviteten af oralt indgivet ovalbumin til at fremkalde en specifik immunreaktion. Gruppe 1 gives 2 doser ovalbumin i en ufuldstændig Freunds adjuvans ved subkutan (SC) injektion med 3 ugers mellemrum. Denne gruppe tjener til parenteral kontrolgruppe, svarende til den vaccinationsmetode, der rutinemæssigt benyttes til enhver vaccine. Gruppe 2 modtager 2 orale behandlingsprogrammer af en sammensætning indeholdende ovalbumin med 3 ugers mellemrum. Serummer undersøges for isotypisk antistofreaktion mod ovalbumin. Resultaterne ventes at vise, at en signifikant mængde OVA-specifik IgG og IgA dannes i kalvene, der fodres oralt med OVA-holdig sammensætning. Det forventede meget høje niveau af serum-IgA vidner om høj effektivitet med hensyn til stimulering afen systemisk immunreaktion hos kvæg.

Eksempel 13

Oral indgift af en sammensætning indeholdende Vibrio-antiqener til fisk

Vibrio aiginoiyticus er en alvorlig bakterieinfektion i akvakultur, særligt alvorlig hos regnbueørred. Den er nu endemisk i alle ørredproducerende lande, hvor den kan volde alvorlige økonomiske tab. Den er også ved at blive et mere betydende patogen i lakseopdræt, primært i ferskvandsvækstfasen, men det er blevet rapporteret, at den også forårsager tab i havet. Vaccination kan forhindre V. aiginoiyticus i at få betydende påvirkning i ethvert stadium af laksefiskopdrætscyklussen. Et typisk vaccinationsprogram omfatter en primær vaccination af fiskeyngel på 2-5 gram og en oral boostervaccination 4-5 måneder efter den pri mære vaccination. Imidlertid vil et ideelt vaccinationsprogram involvere kun en type vaccination givet periodisk til fisken for at opretholde en effektiv antistoftiter i fiskeserummet i hele opdrætsperioden.

Forsøgsudformning: Effektiviteten af oralt indgivet ERM-vaccine indeholdende sammensætning opnået i overensstemmelse med nærværende frembringelse til stimulering af en immunreaktion i ørredserum demonstreres.

Svækket V. alginolyticus inkorporeres i en sammensætning som beskrevet i Eksempel lb. Til oral indgift til fisk indgives en sammensætning indeholdende en dosis på 2 pg V. alginolyticus-vaccine per mg i foderet. Tyve fisk med en gennemsnitsstørrelse på 5 g anvendes som forsøgsgruppe, og hver fisk modtager 1 dosis af V. alginolyticus-v accine i foderrationen i 5 dage i træk.

Tre grupper af fisk benyttes for at vurdere effektiviteten af oralt indgivet V. alginolyticus-v accine til fremkaldelse afen immunreaktion i forhold til en standardvaccination ved injektion. Gruppe 1 vaccineres under anvendelsen af vaccination med injektionsprogram. Denne gruppe tjenersom parenteral kontrolgruppe, idet den anvendte vaccinationsmetode er den, der rutinemæssigt benyttes for enhver vaccine. Gruppe 2 modtager et oralt indgiftsprogram af en sammensætning indeholdende V. alginolyticus-v accine. Gruppe 3 modtager et oralt indgiftsprogram af vaccinefri sammensætning. Sera vurderes for isotypisk antistofreaktion mod V. alginolyticus 6 uger efter vaccination. Resultaterne ventes at vise, at en signifikant mængde V. alginolyticus-specifik IgA dannes i fisken, der fodres oralt med V. alginolyticus-holdig sammensætning. Immunreaktionerne i serum hos oralt vaccinerede og injektionsvaccinerede fisk forventes at være sammenlignelige. Det forventede meget høje niveau af serum-IgA forudsiger høj effektivitet med hensyn til stimulering afen systemisk immunreaktion hos fisk.

Eksempel 14

Sammensætning indeholdende et rodenticid

Warfarin er det mest almindelige rodenticid, der benyttes til at bekæmpe rotte- og museplager. Gnavere, der indtager lokkemad indeholdende warfarin udviser åbenlyse forgiftningssymptomer i løbet af 15-30 minutter og bliver bevidstløse i løbet af 1-2 timer. På grund af den hurtigt optrædende virkning indtager gnaveren imidlertid typisk en subletal mængde warfarin, og der sker restitution inden for 8 timer. Indkapsling af warfarinen kan forsinke symptomernes indtræden og muliggøre indtag afen fuld dødelig dosis.

Forsøgsmetoder: Ti-tolv uger gamle BALB/C-hunmus anvendes. Musene fodres ad libitum. Hvor forsøgsgruppe huses i et særskilt bur.

Warfarinsammensætning ifølge frembringelsen: Warfarin (400 mg/g sammensætning, Sigma, St. Louis, Mo.) inkorporeres i en sammensætning som beskrevet generelt i Eksempel 3. Tre grupper på 4 mus fodres hver ad libitum som følger: 1) Warfarinsammensætning ifølge frembringelsen, blandet i lokkemad ved 4 % warfarinaktivitet, 2) ikke-indkapslet warfarin, blandet i lokkemad ved 4 % aktivitet, 3) lokkemad indeholdende en sammensætning som i Eksempel 3, indeholdende ingen warfarin eller andre bioaktive midler. Foderindtaget og drabsvirkningen på musene måles.

Resultaterne viser, at foderindtaget hos grupperne 1 og 3 ligner hinanden, mens foderintaget hos gruppe 2 (ikke-indkapslet warfarin) er mere end 25 % mindre. Det forventes, at alle mus i gruppe 1 er døde efter 8 timer efter fodring, mens alle gruppe 2-mus er i live efter 8 timer efter fodring.

Claims (21)

1. Sammensætning til oral indgift af et bioaktivt middel til vand- eller landlevende arter, hvilken sammensætning omfatter partikler, der hver især omfatter et bioaktivt middel, der er dispergeret i oliedråber, idet oliedråberne er indlejrede i eller overtrukne med en matrix omfattende en enterisk overtrækspolymer, hvor partiklerne hver især yderligere omfatter en slimhindetilhæftende polymer.

2. Sammensætning ifølge krav 1, hvor den enteriske overtrækspolymer er krydsbundet.

3. Sammensætning ifølge krav 2, hvor krydsbindingsmidlet til den enteriske overtrækspolymer omfatter divalente metalkationer.

4. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den slimhindetilhæftende polymer er krydsbundet.

5. Sammensætning ifølge krav 4, hvor krydsbindingerne i den slimhindetilhæftende polymer er dannet ved association med tripolyphosphat.

6. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den slimhindetilhæftende polymer er dispergeret i oliedråberne.

7. Sammensætning ifølge krav 6, hvor den slimhindetilhæftende polymer og det bioaktive middel er forbundne.

8. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor partiklerne er større end 50 pm i diameter.

9. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor det bioaktive middel er et immunogen.

10. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den slimhindetilhæftende polymer er en eller flere polymerer udvalgt fra gruppen bestående af carrageenan, chitosan, hyaluronsyre, alginat, derivater eller modifikationer af en hvilken som helst af disse, carboxylfunktionaliserede polymerer, sulfatfunktionaliserede polymerer og aminfunktionaliserede polymerer.

11. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den enteriske overtrækspolymer er en eller flere polymerer udvalgt fra gruppen bestående af poly(meth)acrylater, alginat, pektiner, carboxymethylcellu-lose, methylcellulose og celluloseacetatphthalat.

12. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den enteriske overtrækspolymermatrix omfatter alginat med lav viskositet, lavmethoxypektin eller en kombination deraf.

13. Sammensætning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor olien er en eller flere olier udvalgt fra gruppen bestående af fedtstoffer, olier og vokstyper.

14. Sammensætning ifølge krav 13, hvor olien er en vegetabilsk eller animalsk olie.

15. Anvendelse af et bioaktivt middel ifølge krav 1 til opnåelse af sammensætningen ifølge krav 1, omfattende i rækkefølge: (a) at danne en vandig blanding omfattende et dispergeret eller opløst bioaktivt middel; (b) at homogenisere den vandige blanding fra foregang (a) i olie til dannelse af en emulsion af den vandige blanding i olien; (c) at danne en opslæmning af produktet fra foregang (b) i en vandig opløsning omfattende en enterisk overtrækspolymer; og enten (dl) at sprøjte, dryppe eller injicere opslæmningen fra foregang (c) i en vandig opløsning indeholdende en krydsbinder til den enteriske overtrækspolymer til dannelse af partiklerne, hvor den vandige blanding fra foregang (a) yderligere omfatter en slimhindetilhæftende polymer, eller (d2) at danne partikler fra opslæmningen fra foregang (c), hvor foregang (b) yderligere indbefatter at danne dråber af emulsionen i vandig slimhindetilhæftende polymer og at krydsbinde den slimhindetilhæftende polymer til dannelse af mellemstadiepartikler.

15. Anvendelse ifølge krav 15, hvor foregang (dl) finder sted.

17. Anvendelse ifølge krav 15, hvor foregang (d2) finder sted.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor foregangen at danne partiklerne omfatter at frysetørre og formale produktet fra foregang (c).

19. Anvendelse ifølge krav 17, hvor foregangen at danne partiklerne omfatter at sprøjtetørre produktet fra foregang (c).

20. Anvendelse af sammensætningen ifølge krav 9 til postgastrisk fremføring af det bioaktive middel til et dyr, omfattende oral indgift af sammensætningen til dyret.

21. Anvendelse af sammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-14 til vaccination afvand- eller landlevende arter, omfattende oral indgift til nævnte arter af sammensætningen, hvor sammensætningen er et fremføringsvehikel for en vaccine.