KR20180106570A - 신규 스트렙토코커스 파라우베리스 균주의 방어 혈청형을 포함하는 강도다리 세균성 질병 예방용 불활성화 백신의 제조방법 및 투여방법 - Google Patents
신규 스트렙토코커스 파라우베리스 균주의 방어 혈청형을 포함하는 강도다리 세균성 질병 예방용 불활성화 백신의 제조방법 및 투여방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 연쇄구균증에 감염된 강도다리로부터 분리된 알파-용혈성스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC0045 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) (미생물 기탁번호 KCTC 18522P), HFTC0049 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) (미생물 기탁번호KCTC18523P), J101 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) (미생물 기탁번호KCTC18525P), 방어혈청형 균주를 포함하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화백신 및 이를 이용하여 어류를 면역시키는 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 신규 스트렙토코거스 균주들의 두 가지 혈청형을 포함하는 강도다리 전용백신으로써, 이를 이용한 강도다리의 세균성 질병예방용 혼합 불활성화 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 스트렙토코커스 균주 종래 알려진 균주의 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 불활성화 백신에 관한 것이다.
강도다리에 발생하는 연쇄상구균증은 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 및 락토코커스 갈비에(Lactococcus garvieae)가 주요 원인균으로 양식을 위한 사육환경이 열악하거나 관리가 부실할 때에 치어에서 성어에 이르기까지 광범위하게 발병하는 질병으로 6∼10월의 여름철 고수온기에 주로 발병한다. 연쇄상구균증에 걸린 강도다리의 주요 임상증상은 먹이 섭취가 불량, 식욕이 감퇴, 유영상태 불량, 복수, 신장 비대, 체색 흑화, 안구 돌출 및 백탁, 아가미 발적, 아가미와 체표의 점액 분비 등 매우 다양하며, 신장과 비장에서 균을 분리 배양하거나 도말표본을 만들어 검경하면 연쇄상구균증임을 보다 확실하게 파악할 수 있다. 질병이 발생되면 병어를 신속하게 분리·제거하거나 면역 증강제 등을 사료와 함께 공급하여 질병의 확산을 방지하는 것이 어장에서 주로 사용되고 있는 방법이나, 백신을 통해 질병을 발생을 예방하는 방법이 가장 바람직하다. 현재 국내 어류백신의 주요 허가사항을 살펴보면 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 에드워드 타르다 (Edward tarda)를 기반으로 한 세균성 질병 예방 백신이 주를 이루고 있으며, 대상 어종은 1개 제품을 제외하고 모두 넙치에 집중되어 있다. 나머지 1개 제품 또한 참돔, 방어, 돌돔을 대상으로 한 바이러스성 질병 예방 백신으로 현재 허가된 백신 제품상에 강도다리에 적용할 수 있는 백신은 전무하다. 넙치에게 허가된 제품을 경험적으로 사용할 수도 있겠으나, 아직은 이에 대한 아무런 검증 자료가 없고 추후 발생할 수 있는 여러 가지 문제점들을 감안했을 때, 기존 백신을 확대 적용하는 것보다는 강도다리에만 사용할 수 있는 전용 백신을 개발하는 것이 더 바람직하다고 판단된다.
강도다리 유래 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)에 대한 역학조사를 실시한 결과, 국내 강도다리 어장에서 발견되는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)는 혈청형 1형이었으며, 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 혈청형 1형은 1a과 1b/c형이 존재하며, 자체 역학조사 결과에 의하면 국내에는 1a형과 1b/c형이 고루 존재하며, 실험실내 실험을 통해 1a형의 경우 단일보다는 혼합인 경우, 1a형과 1b/c형의 경우 상호간에는 교차방어가 성립되지 않음을 확인하여, 최종적으로 1a형 2종과 1b/c형 1종 혼합백신이 높은 방어력을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 선행 연구결과를 바탕으로 강도다리 전용 연쇄상구균증 예방 백신을 개발하기 위해 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 1a형 2종과 1b/c형 1종씩을 각각 백신주로 최종 선별하여 방어혈청형을 모두 포함하는 시험 백신을 제조하였으며, 이에 대한 실험실 내 안전성 및 효력시험 결과 우수한 결과를 얻었다. 이를 이용하여 백신의 방어능 비교 실험을 실시한 결과, 1a형 1종만을 포함하는 것보다 항체응집능이 서로 다른 2개의 1a형 균주를 동시에 포함할 때 보다 효과적으로 방어가 되는 것을 확인하였기에 최종 백신의 조성으로 S.parauberis 1a형 2종, S.parauberis 1b/c형 1종을 포함시키기로 결정하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 세균성 질병에 감염된 강도다리로부터 분리된 균주를 사용하여, 교차방어가 성립되지 않는 다른 혈청형을 포함한 신규 연쇄상구균 예방용 불활성화 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 연쇄상구균 예방용 불활성화 백신에 대한 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045, 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0049, 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) J101 항원를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불활성화된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045, HFTC 0049, J101 항원을 포함하는 어류의 세균성 질병 예방용 불활성화 백신을 제공한다. 본 발명은 상기 세균을 포함하는 백신의 제조방법을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는 어류를 면역시키는 방법을 재공한다.
본 발명에 따른 백신은 강도다리 유래 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)의 혈청형(1a, 1b/c)을 포함하는 강도다리 전용 백신으로, 불활성화 백신 1회 투여로 연쇄상구균에 의한 질병을 효과적으로 그리고 경제적으로 예방할 수 있으므로, 강도다리의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.
[도 1], [도 2] = 1.5% NaCl이 첨가된 BHIA(Difco, USA) 배지 및 면양혈청배지(BAP)에서 자란 S. parauberis 의 상기균주의 순수분리 콜로니(colony)의 사진이다.
[도 3] = 상기균주 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)의 23S rRNA target primer 염기서열로써 718 bp의 size를 갖는 특이 primer 정보를 나타낸다.
[도 4] = 상기균주 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 각 혈청형별 1a는 213bp, 1b/c는 303bp의 사이즈(size)를 갖는 특이 프라이머(primer) 정보를 나타낸다.
[도 5] = Thermal cycler(열 사이클러)(Bio-rad, USA)를 사용해 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시 후 전기영동을 거친 Product(결과물)를 1.5% Agarose gel (아가로오스젤) + EtBr(에씨듐 브로마이드)에 전기영동을 수행하여 718bp의 최종 생성물을 확인, 밴드로 확인되는 결과물을 나타낸 사진이다.
[도 6] = thermal cycler (Bio-rad, USA)를 사용해 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시 후 전기영동을 거친 Product(결과물)를 1.5% Agarose gel (아가로오스젤) + EtBr(에씨듐 브로마이드)에 전기영동을 수행하여 213bp, 303bp의 최종 생성물을 확인, 밴드로 확인되는 결과물을 나타낸 사진이다.
[도 7], [도 8], [도 9] = 강도다리로부터 분리된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045, HFTC 0049 J101 균주를 공시어류 강도다리에, 공격접종 후 나온 폐사개체의 외부증상 및 부검소견을 나타낸다. 상기균주에 감염된 강도다리의 병변을 나타내는 사진으로써, 주로 안구돌출, 안구 주위 농양 및 출혈, 주둥이 주위 출혈, 복부팽만 등의 외부 증상과 간의 충혈 및 울혈 등의 내부 증상이 관찰되고 있다.
[도 10], [도 11], [도 12] = 16S rRNA의 universal primer 이용한 16S rRNA의 시퀀스(sequence)를 통한 염기서열 각 백신주 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045, HFTC 0049 J101 균주 분석결과로, 전문 시퀀싱 업체(Bionicsro, Macrogen. 한국)에 분석 의뢰하여 KCTC11537균주와 높은 상동성을 나타내는 것을 확인하였으며, 최종적으로 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)로 동정확인하였다.
[도 13], [도 14], [도 15] = 각 시험공시어 개체는 11~14cm (17g~40g)의 강도다리를 사용하였다. 백신 접종군의 신장, 간장, 비장 등 장기별 조직검경 사진으로써, 전반적으로 미토마이신 C(mitomycin, MMC)의 발생이 관찰되는 것으로 전반적인 형태로 분석하여도 타원면(Ellipsoid) 비후는 관찰되지 않는 것으로 관찰되며. 비장에서 Ellipsoid 가 경미하게 비후한 것을 제외하면 나머지 장기의 측면에서는 정상 범주의 조직병리학적 소견을 나타내었다. 이는 병원체의 전신적 감염의 수준이 낮거나, 염증반응을 유발할 역치값에 도달하지 못하는 것으로 사료되며, 백신 처리구의 모든 장기에서 정상적인 조직 소견이 관찰되었으므로, 접종백신의 독성이 없음을 확인 할 수 있었다.
[도 16], [도 17], [도 18], [도 19] = 각 시험공시어 개체는 11~14cm (17g~40g)의 강도다리를 사용하였다. 백신접종군과 반대로 백신의 면역없이, 공격접종만을 실시한 실험개체에서는 신장에서 정상개체보다 다소 미토마이신 C(mitomycin, MMC)가 증가한 것으로 관찰되며, 멜라닌(Melanin)이 대다수로 관찰되며, 일부 구역에서 활성화된 대식세포가 세포를 포식작용 하는 모습을 관찰할 수 있어 정상개체보다 대식세포의 비중이 높아진 것으로 관찰되어진다.
간에서는 지방간이 고도로 심화되어 나타나는 위축 소견도 이루고 있으며. 간세포 사이에 단핵백혈구(Monocyte)가 침윤 및 포식활동을 나타내는 것으로 관찰된다.
비장에서 대규모의 미토마이신 C(mitomycin, MMC) 가 발생하였으며 멜라닌(Melanin)성 과립보다 세로이드 (Ceroid) 및 Hemosiderin 성 색소의 비중이 높은 것으로 관찰되며 또한 타원면(Ellipsoid)에 있는 Macrophage가 활성화되어 있으며, 타원면(Ellipsoid)의 비후한 모습을 나타낸다. 비장의 경우 국소적으로 조혈활성이 나타나는 것으로 관찰되며, 일부 국소지역에서 macrophage가 활성화되어 타원면(Ellipsoid) 가 증대해진 것으로 관찰되며 이에 따라 미토마이신 C(mitomycin, MMC)또한 증가되는 것으로 관찰되어이러한 소견은 지속적으로 어체에 타격을 주는 병원체 또는 내부적 타격요소가 활발히 진행되고 있는 경향으로 관찰된다.
[도 3] = 상기균주 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)의 23S rRNA target primer 염기서열로써 718 bp의 size를 갖는 특이 primer 정보를 나타낸다.
[도 4] = 상기균주 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 각 혈청형별 1a는 213bp, 1b/c는 303bp의 사이즈(size)를 갖는 특이 프라이머(primer) 정보를 나타낸다.
[도 5] = Thermal cycler(열 사이클러)(Bio-rad, USA)를 사용해 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시 후 전기영동을 거친 Product(결과물)를 1.5% Agarose gel (아가로오스젤) + EtBr(에씨듐 브로마이드)에 전기영동을 수행하여 718bp의 최종 생성물을 확인, 밴드로 확인되는 결과물을 나타낸 사진이다.
[도 6] = thermal cycler (Bio-rad, USA)를 사용해 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시 후 전기영동을 거친 Product(결과물)를 1.5% Agarose gel (아가로오스젤) + EtBr(에씨듐 브로마이드)에 전기영동을 수행하여 213bp, 303bp의 최종 생성물을 확인, 밴드로 확인되는 결과물을 나타낸 사진이다.
[도 7], [도 8], [도 9] = 강도다리로부터 분리된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045, HFTC 0049 J101 균주를 공시어류 강도다리에, 공격접종 후 나온 폐사개체의 외부증상 및 부검소견을 나타낸다. 상기균주에 감염된 강도다리의 병변을 나타내는 사진으로써, 주로 안구돌출, 안구 주위 농양 및 출혈, 주둥이 주위 출혈, 복부팽만 등의 외부 증상과 간의 충혈 및 울혈 등의 내부 증상이 관찰되고 있다.
[도 10], [도 11], [도 12] = 16S rRNA의 universal primer 이용한 16S rRNA의 시퀀스(sequence)를 통한 염기서열 각 백신주 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045, HFTC 0049 J101 균주 분석결과로, 전문 시퀀싱 업체(Bionicsro, Macrogen. 한국)에 분석 의뢰하여 KCTC11537균주와 높은 상동성을 나타내는 것을 확인하였으며, 최종적으로 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)로 동정확인하였다.
[도 13], [도 14], [도 15] = 각 시험공시어 개체는 11~14cm (17g~40g)의 강도다리를 사용하였다. 백신 접종군의 신장, 간장, 비장 등 장기별 조직검경 사진으로써, 전반적으로 미토마이신 C(mitomycin, MMC)의 발생이 관찰되는 것으로 전반적인 형태로 분석하여도 타원면(Ellipsoid) 비후는 관찰되지 않는 것으로 관찰되며. 비장에서 Ellipsoid 가 경미하게 비후한 것을 제외하면 나머지 장기의 측면에서는 정상 범주의 조직병리학적 소견을 나타내었다. 이는 병원체의 전신적 감염의 수준이 낮거나, 염증반응을 유발할 역치값에 도달하지 못하는 것으로 사료되며, 백신 처리구의 모든 장기에서 정상적인 조직 소견이 관찰되었으므로, 접종백신의 독성이 없음을 확인 할 수 있었다.
[도 16], [도 17], [도 18], [도 19] = 각 시험공시어 개체는 11~14cm (17g~40g)의 강도다리를 사용하였다. 백신접종군과 반대로 백신의 면역없이, 공격접종만을 실시한 실험개체에서는 신장에서 정상개체보다 다소 미토마이신 C(mitomycin, MMC)가 증가한 것으로 관찰되며, 멜라닌(Melanin)이 대다수로 관찰되며, 일부 구역에서 활성화된 대식세포가 세포를 포식작용 하는 모습을 관찰할 수 있어 정상개체보다 대식세포의 비중이 높아진 것으로 관찰되어진다.
간에서는 지방간이 고도로 심화되어 나타나는 위축 소견도 이루고 있으며. 간세포 사이에 단핵백혈구(Monocyte)가 침윤 및 포식활동을 나타내는 것으로 관찰된다.
비장에서 대규모의 미토마이신 C(mitomycin, MMC) 가 발생하였으며 멜라닌(Melanin)성 과립보다 세로이드 (Ceroid) 및 Hemosiderin 성 색소의 비중이 높은 것으로 관찰되며 또한 타원면(Ellipsoid)에 있는 Macrophage가 활성화되어 있으며, 타원면(Ellipsoid)의 비후한 모습을 나타낸다. 비장의 경우 국소적으로 조혈활성이 나타나는 것으로 관찰되며, 일부 국소지역에서 macrophage가 활성화되어 타원면(Ellipsoid) 가 증대해진 것으로 관찰되며 이에 따라 미토마이신 C(mitomycin, MMC)또한 증가되는 것으로 관찰되어이러한 소견은 지속적으로 어체에 타격을 주는 병원체 또는 내부적 타격요소가 활발히 진행되고 있는 경향으로 관찰된다.
본 발명은 강도다리로부터 분리된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 1a형 HFTC 0045, HFTC 0049 균주, 신규 베타-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 1b/c형 J101 항원을 제공한다. 상기 균주는 16S rRNA의 universal primer 이용한 16S rRNA의 sequence를 통한 염기서열 각 백신주를 분석하였으며, 공시 균주로부터 전문 시퀀싱 업체(Bionicsro, Macrogen. 한국)에 분석 의뢰하여 최종적으로 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC11537균주와 높은 상동성을 나타내며, 각 염기서열의 분석결과는 하기 도면과 표를 참고한다.
본 발명에 따른 상기 신규 균주는 경상북도어업기술센터의 사전 야외분리주 및 제주 준원지비아이의 사전 야외분리주 중 성장성시험 등을 거쳐 균주를 선별(포항유래)한 강도다리 유래 균주로써, HFTC 0045, HFTC 0049, J101균주라 명명하였으며, 균주의 유래 및 주요 정보는 아래 [표 1]과 같다.
본 발명은 상기 균주를 이용한 불활성화 백신을 제공한다. 항원형(serotype)별 구별을 통한세균성 질병 예방용 불활성화 백신으로, 구제척으로 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis) 항원을 포함하는 세균성 질병 예방용 불활성화 백신을 제공한다. 상기 불활성화 백신은 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 당해 기술분야에 알려진 불활성화제를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 불활성화 백신은 연쇄구균증을 억제함으로써 어류에서 가장 흔하게 발병되는 세균성 질병을 예방할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 50 ㎖/병, 100 ㎖/병, 250 ㎖/병, 500 ㎖/병 1000 ㎖/병 등에 분주한 다음, 밀봉하여 사용될 수 있다. 이러한 백신은 액상뿐만 아니라, 나누어 주입한 다음에 동결건조함으로써 건조제제로 사용될 수도 있다. 상기 건조제제는 사용직전에 첨가한 감균액으로 건조물질을 완전하게 재용해하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신은 감염의 위험성이 있는 임의의 연령의 어류에 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 백신에 대한 제조방법을 포함한다. 이하 본 발명은 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규 스트렙토코커스 균주의 분리 및 동정
강도다리 양식 산업에서 대량 폐사를 일으키는 연쇄상구균증의 병원체가 S. parauberis 임을 확인하였고, 연쇄상구균증을 예방하는 S. parauberis 백신의 필요성을 제기하였다. 또한, 울진, 포항, 제주 소재 강도다리 양식장으로부터 연쇄구균증에 감염된 병어 장기(간, 심장, 신장, 비장) 및 안구에서 균주를 분리하였다. 1.5% NaCl이 첨가된 BHIA(Difco, USA) 배지를 사용하여 병든어류의 간, 신장, 비장, 심장, 뇌 등의 내부장기 및 복수, 혈액을 무균적으로 적출하여 도말한 후 25℃, 24~28시간 배양하여 분리하였다. 배양상태에 따라 우점 콜로니(colony)를 선택하여 순수분리 배양하였으며, 분리된 야외 분리 균주(S. parauberis)들 가운데 백신 후보 균주 중 병원성 및 성장성이 높은 균주를 선정하였으며, 선정된 백신주를 HFTC 0045 및 HFTC 0049, J101로 명명하였다. 상기균주의 배지별 순수분리 콜로니(colony) 사진은 아래 [도 1], [도 2]와 같다.
S. parauberis 의 경우, 개발과정 중 혈청형간의 상호 교차방어능이 인정되지 않음을 확인하였으며, 이에 항원형(serotype) 1a균주 2종과 (HFTC 0045 및 HFTC 0049), 항원형(serotype) 1b/c 1종(J101)을 포함하는 3종의 S. parauberis 야외 분리 균주를 가지고 신규스트렙토코커스 균주를 백신주로 최종 선정하였다.
선정된 상기 균주를 동정하기 위하여, S. parauberis, 에 대한 Kinya, Mata (2015), Mata et al (2004), 등이 보고한 특이 프라이머 (Specific primer) 를 제작 (Bioneer)하고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 연쇄구균을 동정하였다. [도 3].[도 4]
중합효소 연쇄 반응(PCR)반응은 Accupower PCR premix (Bioneer, korea)를 사용하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응 조건은 predenaturation (94℃, 5분)한 후 변성(Denaturation) (95℃, 30초), 어닐링(Annealing) (55℃, 30초), 연장(Extension) (72℃, 30초)의 주기를 30cyclesfh 반복하고 final extension (72℃, 5분)을 하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 생성물은 0.5㎍/㎖ EtBr(에씨듐 브로마이드)이 첨가된 1.0% Agarose gel (아가로오스젤) 상에서 100V, 30분간 전기영동한 후 Gel-Doc (Bio-Rad)으로 718bp의 최종 생성물을 확인하였다. 상기 증폭된 중합효소 연쇄 반응(PCR) 산물을 AccuPrep PCR 정제키트(Bioneer) 및 AccuPrep PCR 플라스미드 익스텐션 키트(Bioneer)를 이용하여 염기서열의 분석을 실시하였다.
상기균주의 23S rRNA 염기서열 및 GenBank에 등록되어 있는 스트렙토코커스 속 세균의 유전정보를 Squman 프로그램을 사용하여 멀티플 얼라인먼트를 실시하고 각 균종간의 상동성을 비교하였다. 23S rRNA 유전자에 대한 염기서열을 분석한 결과, GenBank에 등록되어 있는 스트렙토코커스 파라우베리스 KCTC11537 균주와 99% 이상의 상동성을 나타내어, HFTC 0045 와 HFTC 0049, J101은 스트렙토코커스 파라우베리스로 최종동정 되었다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 후 전기영동을 거친 Gel-Doc (Bio-Rad)으로 718bp의 공통밴드, HFTC 0045 와 HFTC 0049는 항원형(serotype) 1a로 213bp, J101은 항원형(serotype) 1b/c로 303bp의 최종 생성물을 확인, 결과물은 [도 5], [도 6]와 같다.
실시예 2 : 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0045, HFTC 0049, J101의 특성분석
<2-1>미생물학적 생화학 검사
실시예 1에서 동정된 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0045 , HFTC 0049, J101 의 특성을 분석하기 위하여 미생물학적 생화학 동정을 시도하였다.[표 2]
미생물학적 생화학검사 결과, S. parauberis 의 미생물학적 생화학적 성상시험 결과 운동성이 없는 그람양성균으로, indol 생성능, Voges-Proskauer(VP) test, Oxidase, catalase, 성장염도 6.5% NaCl 시험 등에서 모두 음성반응을 보였으며, 면양혈액 5% 첨가배지(BAP)에서 용혈성을 보였고, lactose, mannitol 시험에서 균주별 차이가 나타났다.
<2-2>미생물학적 효소활성 검사
실시예 1에서 동정된 상기 백신주와 종래 알려진 스트렙토코커스 파라우베리스 표준균주(KCTC3651) 및 당사 넙치백신주와 효소활성도 및 당발효를 측정하였다.[표3]
API ZYM kit (BioMerieux, France)를 사용하여, alkaline phophatase외 18가지 효소의 활성검사를 실시하였으며, 실험결과 Acid phospatase, Alkaline phosphatase 등 에서는 양성을 나타내었으며, -mannosidase, -fucosidase 등에서는 음성반응을 나타내었고, 참조균주 KCTC3651과 비교하였을 때, -galactosidase, -glucosidase, N-acetyl--glucosaminidase 등의 효소 활성에서 균주별 차이가 있는 것으로 나타났다.
<2-3> 병원성실험
평균 17∼25g의 강도다리 10마리 씩 수조에 구분하고, HFTC 0045, HFTC 0049, J101 균주를 약 1x108CFU/㎖ 의 활성 높은 생균 상태로 복강에 0.1㎖ 접종, 유수방식으로 18℃의 수온을 유지하며, 14일간 임상 증상 및 폐사 유무를 관찰하였다. 임상증상으로 두부출혈, 복부 팽만, 점액과다, 안구 돌출 등의 증상을 보임. 폐사어의 부검 소견으로는 복수증가, 녹간증, 간출혈 등의 병변을 보임. 임상어의 병리조직 소견으로 신장의 백혈구 침윤, 간의 위축, 비장의 백혈구 증가 소견을 보였다.
높은 폐사율을 보인 상기 각 균주를 1.0 × 108 CFU/㎖ (1 × 107 CFU/0.1㎖)이 되도록 조정한 후 10-fold로 희석하여 최저농도가 1.0~1.5 × 102 CFU/㎖ (1 × 101 CFU/0.1㎖)이 되게 하였다. 희석한 농도의 균주로 LD60 확인 실험을 하여, 준비한 균액 0.1㎖을 각 시험구당 10마리의 시험어에 복강주사하고, 대조군은 동량의 생리식염수를 복강주사 하였으며, 인위감염 후 2주간 누적폐사율을 조사하였다. 자세한 폐사일지는 아래 [표 4]에 나타내었다.
조사결과 각 백신주 S. parauberis 3종의 강도다리 병원성은 102.0 cfu/㎖ 에서 공격접종 12일 만에 누적폐사율 60%이상의 폐사를 기록하였다. 공격접종 후 폐사개체의 해부학적 증상 및 외부소견은 하기 [도 7, 8, 9]와 같다.
실시예 3: 백신 제조용 균주의 준비
백신 제조를 위해 하기 2종의 균주를 준비하였다. 실시예 1에서 동정된
알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0045,
알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0049,
알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 J101
실시예 4: 백신 제조용 균주의 병원성
상기 실시예 3의 백신용 균주의 LD값을 당해 기술분야에 널리 공지된 방법 (Hall, J.A. and Golding, L.A: Standard methods for whole effluent toxicity testing: development and application. Report No. MFE 80205. NIWA report for the ministry for environment, Wellington, New Zeland. 1988)을 이용하여 측정한 결과 하기 표 5와 같았다.
실시예 5: 혼합 불활성화 백신의 제조 및 접종
<5-1> 백신의 제조
야외분리주로써 강도다리 어체로부터 분리하여, 실시예 1과 내용과 같이, 최종 동정 확인된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 불활성화균체항원 (HFTC 0045 ,HFTC 0049, J101), 주를 사용하였다. 분리 동정 시험을 통해 확인된 원종균주를 혈액배지 (Blood agar) 혹은 1.5% NaCl이 첨가된 THBA(Todd Hewitt Broth에 agar첨가 plate)에 도말하고 25℃, 18 24 시간 overnight 배양 후 단독집락을 선정하여 1.5% NaCl이 첨가된 THB (Todd-Hewitt Broth)에 이식하여 25℃, 15 - 18시간 배양한 것을 동결건조하여 -20℃이하 냉암소에 보존하면서 사용한다. 동결 건조하여 -20℃이하 냉암소에 보관중인 원종균주를 멸균식염수로 용해하여 혈액배지(Blood Agar) 혹은 1.5% NaCl이 첨가된 THBA에 도말하고, 25℃, 24-48시간 배양하고, 단독집락을 선택하여 1.5% NaCl이 첨가된 THB에 이식하여 25℃, 15-18시간 진탕 배양한 것을 1차 종균으로 한다. 본배양 배지의 1/100의 1.5% NaCl이 첨가된 THB의 2차 종균배지에, 1차 종균배양액을 1% 접종하여 10~15시간 진탕배양한 것을 전 배양용액으로 사용한다.
1.5% NaCl이 첨가된 THB 배지를 퍼멘터(Fermenter)에 완전히 용해 후 121℃에서 20분간 고압증기멸균하고 멸균이 끝나면 냉각수를 이용하여 냉각을 하고 25℃를 유지하면서 미리 준비한 최종 종균배양액을 접종하고 25℃에서 15 - 18시간 배양하면서 UV-spectrophotometer (SHIMADZU Co.)를 이용하여 적절한 간격으로 600㎚에서 O.D치를 측정하여 필요한 농도까지 배양 한다. 최종 배양액의 OD600이 1.1 이상(약 1x109cfu/ml)에 도달하면 잡균 혼입여부를 조사하기 위한 샘플을 채취하고 배양액의 0.3%의 포르말린을 첨가하여 18~24시간 불활화한다. 불활화가 완료되면 연속원심분리기 (Tomoe-sharples centrifuges)를 사용하여 균체만을 수집하여 멸균된 phosphate buffered saline (PBS)에 재부유하여 농축한다.
원심분리하여 재부유한 벌크(Bulk)에 포르말린(formalin)을 0.5% 농도가 되게 첨가하여 37℃ 항온실에서 72시간 진탕하며 불활화시킨 후 5℃에 보관한 뒤, 균체의 불활성화 확인시험을 실시한다.(불활성화시킨 각 균체의 벌크(Bulk)는 각 균주에 해당하는 배지로 25℃에서 3일간 배양하여 어떠한 세균의 발육도 없어야 한다.)
불활성화가 완료된 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045, HFTC 0049, J101 항원을 1:1:1의 비율로 혼합하여, 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신을 제조한다.
<5-2> 백신의 접종
시험어로 강도다리를 사용하였다. 강도다리에 대한 백신 접종은 복강주사법으로 각각의 시험백신을 동량으로 혼합하여, 어체당 0.1㎖씩 복강 주사하였으며, 대조군은 멸균 생리 식염수를 동량씩 복강 주사하였다.
실시예 6: 불활성화 백신의 면역원성 시험
<6-1> : 방어력 조사
시험 백신이 방어력에 미치는 효과를 조사하기 위하여 백신접종 후 3주면역 후 동일균주인 S. parauberis HFTC 0045,HFTC 0049를 병원성시험 후 설정한 LD60값으로 0.1㎖씩 복강주사법 인위감염 후 2 주간 누적폐사율을 조사하였다.
공격접종 후 4주 간 실험 강도다리의 생존 유무를 확인하고, 아래 계산식에 따라 상대 생존율을 구한다. 상대생존율은 하기 표 6과 같이 계산하였다.
항원량 결정시험을 위한 백신을 주사 후, 공격접종을 거친 효능시험 결과, 90% 이상의 RPS값을 확인, 높은 상대생존율을 바탕으로 백신항원량을 결정하였다.
실시예 7: 혼합 불활성화 백신 투여에 따른 안전성 조사 및 공격접종 대조군 비교
<7-1> 본 발명에 따른 백신 처리의 안전성 조사
실시예 6의 혼합백신 복강 주사군 및 대조군에 대한 병리조직학적 검사를 실시하였다. 백신처리 1일, 1주일 및 4주일째 시험구의 간, 신장, 비장조직을 10% 중성 포르말린에 고정후 상법에 따라, H&E염색을 실시 후 검경하였다. 그 결과, 백신 처리구의 모든 장기에서 정상적인 조직 소견이 관찰되었으며, [도 13, 14, 15]을 통해 백신의 독성이없음을 확인 하였다. 백신을 접종하지않은 공격접종군의 폐사개체의 조직검경상 결과는 하기 [도 16, 17, 18]과 같다.
[표 1] = 상기균주 중 백신주의 유래 및 주요 정보를 나타낸다.
[표 2] = 상기균주의 미생물학적 생화학 검사결과 정보를 나타낸다.
[표 3] = 상기균주의 효소활성검사(API ZYM) 결과 정보를 나타낸다.
[표 4] = 상기균주의 공격 접종 2주 관찰일지로, 10진 희석한 뒤 강도다리 10마리씩에 0.1 ㎖를 강도다리 복강에 접종하고 14일 동안 관찰한 뒤, 누적 폐사율이 60%이상인 최대 희석 배수의 접종균수를 공격 접종량으로 하였으며, 최종 백신용 균주의 LD60값을 확인 한 내용을 공시한 표이다.
[표 5] = 최종 백신용 균주의 LD60값을 확인한 내용을 공시한 표이다.
[표 6] = 상대생존율 구하는 방법을 나타낸다.
[표 2] = 상기균주의 미생물학적 생화학 검사결과 정보를 나타낸다.
[표 3] = 상기균주의 효소활성검사(API ZYM) 결과 정보를 나타낸다.
[표 4] = 상기균주의 공격 접종 2주 관찰일지로, 10진 희석한 뒤 강도다리 10마리씩에 0.1 ㎖를 강도다리 복강에 접종하고 14일 동안 관찰한 뒤, 누적 폐사율이 60%이상인 최대 희석 배수의 접종균수를 공격 접종량으로 하였으며, 최종 백신용 균주의 LD60값을 확인 한 내용을 공시한 표이다.
[표 5] = 최종 백신용 균주의 LD60값을 확인한 내용을 공시한 표이다.
[표 6] = 상대생존율 구하는 방법을 나타낸다.
Claims (8)
- 연쇄구균증에 감염된 강도다리로부터 분리된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0045 균주.
(경상북도 어업기술센터 강도다리 야외분리균주 중 택1 분양균주.) - 연쇄구균증에 감염된 강도다리로부터 분리된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) HFTC 0049 균주.
(경상북도 어업기술센터 강도다리 야외분리균주 중 택1 분양균주.) - 연쇄구균증에 감염된 강도다리로부터 분리된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) J101 균주.
(제주 준원지비아이 강도다리 야외분리균주 중 택1 분양균주.) - 연쇄구균증에 감염된 강도다리로부터 분리하여 불활성화된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0045 균주, 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0049 균주 및 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 J101균주를 포함하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신.
- 제4항에 있어서, 불활성화된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0045균주, 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0049균주 및 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 J101 균주가 1:1:1의 중량비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신.
- 연쇄구균증에 감염된 강도다리로부터 분리하여 불활성화된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0045 균주, 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0049균주 및 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 J101 균주를 혼합시키는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신의 제조방법.
- 제 6항에 있어, 불활성화된 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0045 균주, 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 HFTC 0049 균주 및 신규 알파-용혈성 스트렙토코커스 파라우베리스 J101 균주를 1:1:1의 중량비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신의 제조방법.
- 제 4항 또는 제 5항의 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는 어류를 면역시키는 방법.
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|---|---|
| KR (1) | KR101953460B1 (ko) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102047911B1 (ko) * | 2019-04-26 | 2019-11-28 | 대한민국 | 어류의 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법 |
| KR102106168B1 (ko) * | 2019-10-21 | 2020-04-29 | 대한민국 | 어류의 연쇄구균병 예방용 다가백신 |
| KR20200072834A (ko) | 2018-12-13 | 2020-06-23 | 주식회사 준원지비아이 | 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트 |
| KR20200077783A (ko) | 2018-12-21 | 2020-07-01 | 주식회사 준원지비아이 | 어류의 면역화 확인용 인테그린 베타 1 프라이머 세트 |
| KR20200078740A (ko) | 2018-12-21 | 2020-07-02 | 주식회사 준원지비아이 | Ldh를 함유하는 어류 또는 갑각류용 속효성 경구형 백신 제제 |
| KR102130010B1 (ko) | 2019-01-30 | 2020-07-03 | 주식회사 준원지비아이 | 어류의 면역화 확인용 tgf 베타 프라이머 세트 |
| KR20200115829A (ko) | 2019-03-27 | 2020-10-08 | 주식회사 준원지비아이 | 산처리 저분자 알긴산을 함유하는 어류 또는 갑각류용 경구형 백신 제제 |
| JP2020182455A (ja) * | 2019-04-26 | 2020-11-12 | 大韓民国（国立水産科学院）ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ） | 魚類の連鎖球菌病予防用新規血清型ワクチン |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0166928B1 (ko) | 1996-05-30 | 1999-01-15 | 구자홍 | 음식물 쓰레기 처리기의 탈취장치 |
| JP2004110146A (ja) | 2002-09-13 | 2004-04-08 | Ricoh Co Ltd | データ保存媒体回収装置 |
| JP2011111154A (ja) | 2009-11-25 | 2011-06-09 | Hyundai Motor Co Ltd | 車両のクラッシュパッド接続装置 |
| KR20130091301A (ko) * | 2013-07-25 | 2013-08-16 | 대한민국(관리부서:국립수산과학원) | 신규 스트렙토코커스 균주 및 상기 신규 스트렙토코커스 균주와 몬타나이드 보조제를 이용한 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신 |
-
2017
- 2017-03-21 KR KR1020170035103A patent/KR101953460B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0166928B1 (ko) | 1996-05-30 | 1999-01-15 | 구자홍 | 음식물 쓰레기 처리기의 탈취장치 |
| JP2004110146A (ja) | 2002-09-13 | 2004-04-08 | Ricoh Co Ltd | データ保存媒体回収装置 |
| JP2011111154A (ja) | 2009-11-25 | 2011-06-09 | Hyundai Motor Co Ltd | 車両のクラッシュパッド接続装置 |
| KR20130091301A (ko) * | 2013-07-25 | 2013-08-16 | 대한민국(관리부서:국립수산과학원) | 신규 스트렙토코커스 균주 및 상기 신규 스트렙토코커스 균주와 몬타나이드 보조제를 이용한 어류의 세균성 질병 예방용 혼합 불활성화 백신 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Fish & Shellfish Immunology. 2013, vol. 35, pp. 413-420. * |
| 한국어병학회지. 2008, 제21권, 제3호, pp. 209-217. * |
| 한국어병학회지. 2011, 제24권, 제3호, pp. 189-195. * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200072834A (ko) | 2018-12-13 | 2020-06-23 | 주식회사 준원지비아이 | 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트 |
| KR20200077783A (ko) | 2018-12-21 | 2020-07-01 | 주식회사 준원지비아이 | 어류의 면역화 확인용 인테그린 베타 1 프라이머 세트 |
| KR20200078740A (ko) | 2018-12-21 | 2020-07-02 | 주식회사 준원지비아이 | Ldh를 함유하는 어류 또는 갑각류용 속효성 경구형 백신 제제 |
| KR102130010B1 (ko) | 2019-01-30 | 2020-07-03 | 주식회사 준원지비아이 | 어류의 면역화 확인용 tgf 베타 프라이머 세트 |
| KR20200115829A (ko) | 2019-03-27 | 2020-10-08 | 주식회사 준원지비아이 | 산처리 저분자 알긴산을 함유하는 어류 또는 갑각류용 경구형 백신 제제 |
| KR102047911B1 (ko) * | 2019-04-26 | 2019-11-28 | 대한민국 | 어류의 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법 |
| JP2020182455A (ja) * | 2019-04-26 | 2020-11-12 | 大韓民国（国立水産科学院）ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ） | 魚類の連鎖球菌病予防用新規血清型ワクチン |
| KR102106168B1 (ko) * | 2019-10-21 | 2020-04-29 | 대한민국 | 어류의 연쇄구균병 예방용 다가백신 |
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| PX0901 | Re-examination |
Patent event code: PX09011S01I Patent event date: 20181126 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PX09012R01I Patent event date: 20180713 Comment text: Amendment to Specification, etc. |
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| PX0701 | Decision of registration after re-examination |
Patent event date: 20190128 Comment text: Decision to Grant Registration Patent event code: PX07013S01D Patent event date: 20181226 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I Patent event date: 20181126 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PX07011S01I Patent event date: 20180713 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I |
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| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
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Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20190222 Patent event code: PR07011E01D |
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| PR1001 | Payment of annual fee |
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| PR1001 | Payment of annual fee |
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