CN102776220A - 布鲁氏菌病a19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定，本发明利用重组自杀质粒介导的同源重组技术敲除了布鲁氏菌病A19疫苗株中布鲁氏菌四型分泌系统中的一个毒力因子VirB12基因，得到A19-ΔVirB12的分子标记疫苗株。经动物实验结果表明，A19分子标记疫苗株毒力稍弱于亲本A19疫苗株，使菌株的安全性进一步提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果，而且该分子标记疫苗株具有稳定的遗传性。本发明以布鲁氏菌VirB12基因作为分子标记，应用PCR方法能鉴别布鲁氏菌疫苗菌株与野毒菌株，为建立区分疫苗免疫和自然感染的鉴别方法提供了分子标记，提升了原有的布鲁氏菌病A19疫苗功能，对控制牛布鲁氏菌病流行具有重要的实际意义，应用前景广阔。

Description

布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定

技术领域

本发明涉及布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定，属于微生物细菌基因工程技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的以感染家畜为主的人兽共患传染病。布鲁氏菌具有宿主广泛、传染性强以及感染后根治困难等特点，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。

疫苗免疫是预防和控制布鲁氏菌病的主要措施。目前，用于牛布鲁氏菌病免疫的A19苗有较好的免疫力，该疫苗在我国使用至今已有60余年，为有效地控制布病提供了重要保障，但同时也存在一定的缺陷。即现用的A19疫苗缺乏鉴别诊断标记，疫苗接种动物与自然患病动物无法甄别，造成布鲁氏菌无法在畜群中根除，严重地影响了布鲁氏菌病的诊断、检疫。

本发明借助于现代生物学和分子细菌学技术改造现有A19疫苗菌株，使其成为分子标记疫苗。该疫苗免疫动物在获得免疫保护作用的同时又能将感染患病动物进行区别，有利于临床患病动物的检疫淘汰，保护人们的健康和安全。另外，VirB12基因是布鲁氏菌四型分泌系统中的一个毒力因子，敲除VirB12基因的A19疫苗株的毒力有所减弱，提高了布鲁氏菌病疫苗的安全性，但其仍然保持原有疫苗的免疫学原性和生物学特性。A19疫苗株生产与应用都有较长的历史，因此，敲除VirB12基因的A19分子标记株提升了原有的布鲁氏菌病A19疫苗功能，作为一种新型疫苗投放市场周期短、风险小。敲除的VirB12基因为建立区分疫苗免疫和自然感染动物的鉴别方法提供了分子标记。为将来应用免疫学方法甄别免疫动物与自然感染动物抗体提供了检测基础，因此，A19分子标记株可以作为疫苗用于牛布鲁氏菌病的预防。

发明内容

本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定，用PCR方法区分分子标记疫苗株和野毒株。本发明所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，是应用同源重组技术敲除了布鲁氏菌病A19疫苗株中毒力因子VirB12基因，得到A19-ΔVirB12分子标记疫苗株。以小鼠实验测定的A19的分子标记疫苗株的毒力、安全性、免疫原性。建立了区分该分子标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株的PCR方法。

本发明所述的一种布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，其特征在于按下列步骤进行：

a、为敲除布鲁氏菌A19菌株的VirB12基因，从布鲁氏菌A19疫苗株基因组中分别扩增出VirB12基因上游同源臂片段和下游同源臂片段；

b、再将扩增出VirB12基因上游同源臂片段和下游同源臂片段经中间载体pGEM-T将其克隆至自杀性质粒pBK-CMV-S载体上，从而构建敲除VirB12基因的重组自杀质粒pBCSV12；

c、将重组自杀质粒pBCSV12电击到A19感受态细胞里，运用同源重组技术原理筛选同源重组双交换子，得到敲除VirB12基因的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建中，是将流产布鲁氏菌A19菌株中的四型分泌系统的一个毒力因子VirB12基因敲除得到的菌株，即A19-ΔVirB12株。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建中，毒力因子VirB12基因如序列表的序列1所示。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建中，毒力因子VirB12基因的编码序列如序列表的序列2所示。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株毒力和免疫原性的测定，通过构建的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株应用常规的PCR方法鉴别区分布鲁氏菌野毒株和分子标记疫苗株。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株毒力和免疫原性的测定中，通过构建的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株按常规方法进行毒力和免疫原性的测定，其中A19分子标记疫苗株毒力弱于亲本A19株，以BALB/C鼠为动物模型，A19分子标记疫苗株具有好的免疫原性。

本发明所述敲除牛布鲁氏菌病A19疫苗株的VirB12基因的构建，包括以下步骤：

以牛布鲁氏菌病A19疫苗株为起始材料，用PCR的方法从A19的染色体中扩增出VirB12基因上下同源臂片段，分别并把它克隆至中间载体pGEM-T上；自杀性质粒pBK-CMV载体上含有果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB基因)，即自杀性pBCS质粒，该质粒由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。通过分子克隆分别将VirB12基因上游同源臂片段和下同源臂片段与自杀性质粒pBCS连接，得到重组自杀性质粒pBCSV12；

用电转化法把重组自杀性质粒pBCSV12转入受体布鲁氏菌A19中，使其线性化并与VirB12基因发生置换；应用卡那抗性和含5％蔗糖的培养基筛选同源重组交换子，得到敲除VirB12基因的布鲁氏菌病A19分子标记株(A19-ΔVirB12株)。

本发明所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株，用PCR方法可区分该分子标记疫苗株和自然野毒株。该分子标记疫苗具有毒力弱、安全、免疫原性好的特点，而且分子标记疫苗株具有稳定的遗传性。作为一种新型疫苗投放市场周期短、风险小，为将来应用血清学方法甄别免疫动物与自然感染动物抗体提供了检测基础，提升了原有的牛布鲁氏菌病A19疫苗功能，为牛布病的防控、净化提供了有效的检测方法。

本发明所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定，其中所涉及的序列表：

序列1为布鲁氏菌VirB12基因DNA序列

ATGCGCACATTGGTTATGGTCGCATGCGCTGTCTCTCTGGCCGCTTGTTCCAGCCCGCCGAAGCCGCCCACAGTCAGCGGACGCCACCGCATTCCGATAAACAGCCCGGCGGCACAAGAGGAACTGCGCTTGCAGGTTTTCCCGCAAGAACCCACCGCGCAAGCAACCATGTGGCCAGCACGACCGCCCAAACAAACAGTCAACGTGTATTTTCCCCAGGATGTGACGGTATTCCGGCCAACATCCGCACAGATAAACCAACTCCACACACTGCTCTGGCCCGTGCCCAAGCATATCAACGTCAGGGGCCTGACGGACAACAACTGCCCTCCTCCCGGTGATACGCAAGTCGCGCGTGTCCGTGCGCTGGCTATCTATAATTGGCTGATCAATCAAGGCGTACCCGCCAGCAGGATCACCATAAGCTATGCCCCGGTAAAAGATTACGCATCAAATGCCCCCCTTTCACCGGGCCGCGTCCTGAACAGGCGCGTGGATATCGAAATTTTACGCAAGTAA

备注：以上序列中第17个碱基到477个碱基之间的序列为敲除的VirB12基因DNA序列。

序列2为布鲁氏菌VirB12基因编码氨基酸序列

MRTLVMVACAVSLAACSSPPKPPTVSGRHRIPINSPAAQEELRLQVFPQEPTAQATMWPARPPKQTVNVYFPQDVTVFRPTSAQINQLHTLLWPVPKHINVRGLTDNNCPPPGDTQVARVRALAIYNWLINQGVPASRITISYAPVKDYASNAPLSPGRVLNRRVDIEILRK

备注：以上序列中第7个氨基酸到165个氨基酸之间的序列为敲除的VirB12基因编码的氨基酸序列。

附图说明

图1为本发明重组自杀性质粒pBCSV12构建图谱

图2为本发明VirB12基因上下游同源臂片段的PCR扩增图

图3为本发明VirB12基因上下游同源臂片段克隆质粒的酶切鉴定图

图4为本发明重组自杀性质粒pBCSV12双酶切鉴定图

图5为本发明A19-ΔVirB12株与A19株的PCR鉴定图

图6为本发明的PCR法区分A19-ΔVirB12疫苗株与野毒株鉴定图

图7为本发明A19-ΔVirB12株传代50代遗传稳定性的PCR鉴定图

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明，下述实施例中方法与材料，如无特殊说明，均为常规方法与常用试剂。

实施例1

重组自杀性质粒的构建

材料与方法

菌株、质粒、载体

布鲁氏菌A19株购自中国兽药监察所，自杀质粒pBK-CMV-sacB由新疆畜牧科学院兽医研究所布病室保存；克隆pGEM-T载体为商品化试剂，购自Promega公司。

试剂

限制性内切酶购自Fermentas公司；质粒DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自Promega公司；T4DNA连接酶、DNA Marker、DH5α为北京庄盟生物公司产品；序列测定由上海Invitrogen贸易有限公司完成。

根据GenBankAF141604序列设计引物，如表1：

表1引物序列

PCR扩增

virB12基因上游同源臂片段的扩增

根据virB12基因序列、pGEM-T Easy Vector和pBK-CMV质粒载体特点分别设计引物VS_9-11(F)和VS_9-11(R)，以布鲁氏菌A19疫苗株的基因组为模板扩增VirB12基因上游同源臂片段，PCR反应体系：2×PCR mix 25μl，上下游引物(10μM)各1.5μl，模板2.0μl，补水至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。VirB12基因上游同源臂片段大小为2300bp。

virB12基因下游同源臂片段的扩增：

根据virB12基因序列、pGEM-T Easy Vector和pBK-CMV质粒载体特点分别设计引物VX₁₃(F)和VX₁₃(R)，以布鲁氏菌A19疫苗株的基因组为模板扩增VirB12基因下游同源臂片段，PCR反应体系：2×PCR mix 25μl，上下游引物(10μM)1.5μl，模板2.0μl，补水至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min；VirB12基因下游同源臂片段大小为2030bp，见序列4。PCR扩增产物见图2，其中图2中，M为DNA Marker；1为VirB12基因上游同源臂；2为VirB12基因下游同源臂。

VirB12基因上游和下游同源臂片段的克隆及鉴定：

将VirB12基因上游同源臂和下游同源臂的PCR产物分别与pGEM-T载体4℃连接16h，转化DH5α，铺板并于37℃温箱培养16h，挑取阳性克隆并摇菌，提取质粒DNA并进行双酶切和测序鉴定。VirB12上游同源臂克隆质粒(pVirB12s)经BamH I和XhoI酶切，得到3000bp和2300bp目的条带，VirB12下游同源臂克隆质粒(p VirB12x)经XhoI和Xba I酶切，得到3000bp和2030bp目的条带；质粒酶切鉴定结果见图3，其中图3中M为DNA Marker，1为VirB12基因上游同源臂质粒酶切(BamH I和XhoI)，2为VirB12基因下游同源臂质粒酶切(XhoI和XbaI)。上海Invitrogen贸易有限公司对VirB12上游同源臂克隆质粒和VirB12下游同源臂克隆质粒测序，VirB12上游同源臂片段序列与目的片段一致，见序列3；VirB12下游同源臂片段测序结果与目的片段一致，见序列4；

序列3为布鲁氏菌VirB12基因上游同源臂DNA序列

TGTTGCTCTTTCTCTTTGTCGTGGGCTTCATCGTCGTGCTGCTGTTGCTGCTCGTGTTTCACATGAGGGGCAATGCAGAGAATAATCACCATTCAGACAAGACGATGGTGCAGACCAGCACAGTTCCGATGCGAACTTTCAAGCTGCCACCCCCGCCACCACCAGCACCACCAGAACCACCAGCCCCGCCACCGGCCCCAGCCATGCCCATCGCGGAACCCGCAGCGGCGGCGCTGAGCCTGCCACCATTGCCGGATGATACGCCGGCAAAGGACGATGTACTGGACAAATCGGCCAGCGCGTTGATGGTCGTCACCAAGTCCAGCGGCGATACGAACGCTCAAACGGCCGGCGATACGGTCGTTCAAACGACCAATGCGCGCATTCAAGCCCTGCTCGACAGTCAAAAGAACACCAAGCAGGATGCTGGATCGCTGGGTACTCTCCTTCACGGCACACAAACGGATGCACGCATGGCGAGCCTTCTGCGCAACCGTGATTTCCTGCTCGCGAAGGGCAGCATCATCAATTGCGCGCTGCAAACCCGTCTGGATTCGACGGTGCCGGGCATGGCTGCCTGCGTGGTCACACGCAACATGTATAGCGATAACGGCAAGGTGTTGCTGATTGAGCGCGGTTCAACCATCTCGGGTGAATATGATGCCAACGTAAAGCAGGGCATGGCTCGCATTTATGTCCTGTGGACGCGCGTGAAGACGCCGAACGGTGTCGTGATCGATCTCGACTCTCCAGGCGCCGACCCCCTGGGCGGGGCAGGCTTGCCCGGCTACATCGACTCCCACTTCTGGAAGCGCTTTGGCGGCGCCTTGATGTTGAGCACGATCGAGACCCTCGGCCGCTATGCAACCCAGAAGGTCGGCGGCGGGGGTTCAAATCAGATCAACCTCAATACCGGCGGAGGTGAATCGACGAGCAACCTGGCTTCAACTGCCTTGAAGGATACGATCAACATTCCGCCGACACTGTACAAGAACCAGGGCGAAGAGATCGGCATCTATATCGCCCGCGACCTAGATTTTTCGAGTGTGTATGATGTCAAACCGAAGTGACTTTATTGTGCCTGACGAGGCGGCTGTCAAACGGGCGGCCTCGGTCAATTTCCATCTGGAACCGCTACGCCCTTGGTTGGACGATCCGCAGATCACCGAAGTTTGCGTGAACCGGCCGGGCGAAGTGTTCTGCGAGCGAGCAAGCGCGTGGGAATACTATGCGGTGCCAAACCTCGACTATGAACACCTGATTTCGCTGGGAACCGCCACCGCGCGGTTTGTGGATCAGGATATTTCGGACAGCCGACCGGTGCTGTCTGCGATCCTGCCGATGGGTGAGCGCATTCAGATTGTGCGCCCGCCCGCATGTGAGCACGGCACCATCTCGGTGACGATCCGCAAGCCGTCTTTCACCCGGCGCACACTGGAAGACTATGCGCAGCAGGGCTTTTTCAAACACGTCAGACCCATGAGTAAGAGCCTGACGCCGTTTGAACAGGAACTGCTCGCATTGAAGGAAGCTGGTGATTACATGAGCTTCCTGCGGCGGGCGGTACAGCTTGAAAGGGTGATCGTCGTCGCCGGCGAGACGGGATCAGGCAAGACCACACTGATGAAAGCGCTGATGCAGGAAATTCCGTTCGATCAGCGCCTGATCACCATCGAGGACGTACCGGAGTTGTTCTTGCCGGACCATCCGAACCACGTCCACCTGTTTTATCCGAGCGAAGCGAAGGAAGAAGAAAACGCACCAGTGACGGCCGCCACGCTACTGCGGAGCTGCCTGCGCATGAAACCGACGCGCATCCTGCTTGCCGAGCTGCGCGGCGGCGAGACTTACGATTTCATCAACGTGGCCGCGTCCGGCCATGGCGGCAGCATCACCAGTTGCCATGCCGGTTCGTGCGAACTGACTTTCGAGCGGCTGGCATTGATGGTGTTGCAGAACCGCCAGGGCCGCCAGTTGCCATACGAGATCATCCGCCGGCTGCTCTATCTGGTGGTGGATGTCGTCGTGCACGTCCACAATGGCGTGCACGACGGCACTGGCCGCCATATATCTGAAGTTTGGTACGACCCGAATACAAAACGGGCACTGTCACTGCAACACAGTGAGAAGACGCAATGAAGCTGCAACTTTCACCCCTGCACCAGAATGCGCGCAGGGCGTCAGCTTCTCGCCAACACAAGCTCTGTGCAGCCGCATATCACGCATATGCTGCACAAATTTATAATCCCGGTGCCCGCACTCACCCGAAAATGGAGTCTACACAATGCGCACATTGGTTA

序列4为布鲁氏菌VirB12基因下游同源臂DNA序列

TGGATATCGAAATTTTACGCAAGTAACCTGCGAGGCCTATCGCAAAGACACGCATTTTCTCAAAAATGCCATCCATGTTCTCCGGATCATGAAGACCTATAGAGCGGTTCCGACGGCTTTGTAAAAATAGGAACCGCTCTATTTTTCTGTTTTTACGCATTACGCATCGAAGCGGGATCAGAATTCAGTTCTGTGGGCCGATTTCCCCGTATAGGGGCTTCACAGTTTTGCTGGAAATGCTCTAGGCTGCCATAAATTACCAGCAAGGCGGGACGGATGCGTGAAGCTCTGACAAGCGGAAAATTTCTGAAACTGGCCGGCATGATGCTGGCCGCTGCGGCACTTCTGCTCACAAGCCTTGCCGCCGCAACGGCACAGGAGCGCCCGCGCACCCTTTTCGATCTCCTTTTCGGCTCAAGACAAGCCCAACCCCAGCGCCAGTATGAGCGCCCCGCACCCCAGCGCGTGAAACCGAAGCCCAAGCGCCCCAGGGCATCTTCACCTGCCGCGCACGCCGCCGCCCCATCAGCCGCCGCTCCCGCCGTCGAAATCGCCACTAAAAAACCGGATGCGAAGAAGATACTGGTGGTCGGCGATTTTATCGGCAATGGCCTTGCCGAAGGGCTGGATGCAGCCTTCGCCACCGATCCCGACCTGACGGTCGCAACCCGTGTAAACGGTTCTTCCGGCTTCGTGCGCGACGATTATTTCAACTGGCCGGACAATATCGGCAAGATACTGGACGAGGAAAAACCCGCTGCCGTTGTCGTTATGATCGGCGCAAACGACCGGCAGGCAATCACCGCAAACGGGAACAGCCTCCAGCCGCGCTCGCCGGAATGGAATGCGGAATATCAAAAACGCGTTGCCGCCTTCACCAAGGTCATCAGCGACAGGCATTATCCGCTCGTCTGGGTTGGCCAGCCACCTTTCCGCCCCAAGGGCATGTCGCAGGATATGCTGGCACTCAATGAAATCTATCGCAATGCCGCCGAAAAGGCGGGCGGCAAATTTGCCGATGTGTGGGATGGTTTCGTGGATGAAGAAGGCAATTTTACCCAGACCGGCTTCGATATTAACGGCCAGACGGCACGGCTGCGCGCCAATGACGGAATCAACATAACGTCAACAGGCAAACGCAAACTCGCCTTCTATGCGGAAAAACCGCTGCACGCCTATCTGGGCGTCAGCAGGGAAGAAGGCAACTCTCTGCCCGCAACCCACAGCCTGGACCCTTCCAAACCTGTCGATCGCGTCGCGCCTGTCAGCCTGCGCGATATCAACAAGGACGACAGTGGCATATTGCTGGGTGGGACGCCCGCCATGCAAGCAAAGCCATTGAAAACCGAGCAGAAAAAAGCCAACCCCTCGCCCGGACGCGCTGATGATTTTTCCTGGCCGCGCAATGGAAAAGCCCCCAGAAAATAGCCAAGTAATAGTTTGTTTAATTATTAATAACGCCCCAGCATAGCTGGGTTTCTCTAACACATATATATCTGATTGCTACTTTAGAGACTATTCAAACAAGTAATTTCATGCTCTACCAGAAAGCGTCGTGTGCCTGAAACGACATATAGGAGAGGGTGCAGCTACGCGCATTCGCGCGCAGTGTGATTATGCGTTTACCAACATAAGAGGCGCTTGCATGAATACTATATCAAAGCCTTCCGTTGATTTGCACCGGGAGGAGGAACCTCATCTTGCACGTAATCTATCCAATCGACACCTCCAGCTGATCGCCATCGGCGGCACGATCGGCACCGGCCTTTTCATGGGGTCGGGCAAAGCCGTTTCGCTGGCGGGGCCTTCGATCCTGCTCATCTATGCGATCACCGGCTTCATGCTGTTTTTCGTCATGCGCGCGCTGGGCGAAATTCTGCTTTCCAACCTGCAATATCGCTCCTTCGCGGACTTCGCGGGTGACTATCTGGGGCCATGCGCACAATTTTTCACCGGCTGGACCTACTGGCTATGCTGGATCGTGACGGCCGTGGCGTTCCCGGCTATGTCTCATTCTGGTTTCCTCATCT

重组自杀性质粒的构建：

将本室保存的自杀质粒pBCS和VirB12上游同源臂克隆质粒(pVirB12s)分别经BamH I和XhoI双酶切，回收VirB12基因上游同源臂片段与自杀性质粒pBCS酶切片段，将这两个酶切片段连接，转化得到中间自杀性质粒pBCS1，分别将中间自杀性质粒pBCS1和VirB12下游同源臂克隆质粒(pVirB12x)经XhoI和XbaI双酶切，将酶切得到的VirB12基因下游同源臂片段与中间自杀性质粒pBCS1连接，转化，抗性筛选得到重组自杀性质粒pBCSV12(图4)，其中图4中：M1和M2为DNA Marker，1为重组自杀性质粒pBCSV12的Xba I和XhoI双酶切；2为重组自杀性质粒pBCSV12的BamH I和Xba I双酶切；3为重组自杀性质粒pBCSV12的BamH I和SalI双酶切；4为重组自杀性质粒pBCSV12XbaI和SalI双酶切。

制备布鲁氏菌A19的电转化感受态细菌：

将布鲁氏菌A19单菌落接种于200mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中培养至OD₆₀₀＝0.3左右，放入冰水混合物中冰浴30min，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，分别用50mL、25mL、10mL、5mL、2mL灭菌超纯水洗涤1遍后，用2ml含有10％甘油的超纯水重悬，每管分装200μL，此即为待用的感受态细菌。

电击转化：

将构建的重组自杀性质粒pBCSV12与布鲁氏菌A19感受态细菌混匀，冰浴30min，混匀后转移到电击杯中，电击电压为1250V，电击5毫秒，电击完成后加入1ml SOC培养基，置温度37℃摇振培养4h，将转化液涂于含有kana(50μg/mL)抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基(TSA)上，温度37℃培养3d。

筛选敲除VirB12基因的A19标记株：

从含有kana抗生素的TSA平板上挑单菌落，置于不含kana的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基温度37℃培养4h，再通过5％蔗糖的TSA平板筛选同源重组的重组菌(丢失sacB基因和抗性等载体序列)，根据VirB12两端相邻基因序列设计引物VirB12-F(5’GTCAGCTTCTCGCCAACACAAG-3’和VirB12-R(5’CGTCGGAACCGCT CTATAGG TC-3’)对重组菌进行PCR鉴定；PCR反应体系：2×PCR mix 25μl，上下游引物(10μM)1.5μl，模板2.0μl，补水至50μl；PCR反应条件：温度95℃预变性5min；温度94℃变性1min；温度55℃退火1min；温度72℃延伸1min，30个循环；温度72℃延伸10min。PCR鉴定结果表明，敲除virB12基因的A19标记株扩增片段为236bp，命名为A19-ΔVirB12株。A19株PCR扩增片段为713bp。PCR扩增片段序列见序列5和图5，其中图5中，M为DNA Marker；1为A19-ΔVirB12分子标记株；2为A19株；

序列5为PCR法鉴定布鲁氏菌A19株与A19-ΔVirB12株的DNA序列GTCAGCTTCTCGCCAACACAAGCTCTGTGCAGCCGCATATCACGCATATGCTGCACAAATTTATAATCCCGGTGCCCGCACTCACCCGAAAATGGAGTCTACACAATGCGCACATTGGTTATGGTCGCATGCGCTGTCTCTCTGGCCGCTTGTTCCAGCCCGCCGAAGCCGCCCACAGTCAGCGGACGCCACCGCATTCCGATAAACAGCCCGGCGGCACAAGAGGAACTGCGCTTGCAGGTTTTCCCGCAAGAACCCACCGCGCAAGCAACCATGTGGCCAGCACGACCGCCCAAACAAACAGTCAACGTGTATTTTCCCCAGGATGTGACGGTATTCCGGCCAACATCCGCACAGATAAACCAACTCCACACACTGCTCTGGCCCGTGCCCAAGCATATCAACGTCAGGGGCCTGACGGACAACAACTGCCCTCCTCCCGGTGATACGCAAGTCGCGCGTGTCCGTGCGCTGGCTATCTATAATTGGCTGATCAATCAAGGCGTACCCGCCAGCAGGATCACCATAAGCTATGCCCCGGTAAAAGATTACGCATCAAATGCCCCCCTTTCACCGGGCCGCGTCCTGAACAGGCGCGTGGATATCGAAATTTTACGCAAGTAACCTGCGAGGCCTATCGCAAAGACACGCATTTTCTCAAAAATGCCATCCATGTTCTCCGGATCATGAAGACCTATAGAGCGGTTCCGACG

备注：序列5中第122个碱基至598个碱基的DNA序列为A19-ΔVirB12株缺失的序列。

PCR法鉴别A19-ΔVirB12疫苗株与野毒株

以VirB12-F和VirB12-R为引物，分别以布鲁氏菌A19-ΔVirB12疫苗株、A19和野毒株菌液为模板，以上述PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，结果A19-ΔVirB12疫苗株扩增出236bp大小的特异性片段，A19菌株和分离的野毒株均扩增出713bp大小的特异性片段，PCR扩增结果见序列5和图6，其中图6中，M为DNA Marker；1为阴性对照；2为A19菌株；4，5，6为分离的布鲁氏菌野毒株；7为A19-ΔVirB12分子标记株。

实施例2

所述为布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的毒力和免疫原性的测定。

A19分子标记株的特性：

实验动物为4-6周龄BALB/C雌小鼠购自新疆实验动物研究中心，许可证号：SCXK(新)2003-0002。

安全性检验：将A19-ΔVirB12活菌用生理盐水稀释成每1ml含活菌10亿，皮下注射体重18-20g的BABL/C小鼠5只，每只0.25ml，10日内全部健活。

遗传稳定性：

传代稳定性：将冻存的A19-ΔVirB12分子标记株在胰蛋白胨大豆肉汤培养基平板上划线培养，温度37℃含5％CO₂培养箱中培养72h，长出的菌落为一级种子，将一级种子在培养基上连续传50代，每隔5代对传代菌挑菌落进行PCR检测，结果表明A19-ΔVirB12分子标记株传代至50代，缺失的virB12基因能稳定遗传，没有发生重组获得缺失基因，结果见图7，其中图7中M为DNA Marker；1-10为A19-ΔVirB12株5-50代；11-12为A19疫苗株原代。

毒力遗传稳定性：

用生理盐水将胰蛋白胨大豆肉汤培养基上培养72h的A19-ΔVirB12的培养物洗下，稀释成每毫升含1×10⁵CFU菌的悬液，腹腔注射体重18-20g的BABL/C小鼠3只，每只0.1mL，经15日后剖杀，取脾脏混合后捣碎，制成乳剂，接种胰蛋白胨大豆肉汤培养基平板，温度37℃含5％CO₂培养箱中培养，根据其生长菌落数计算BABL/C小鼠每克脾脏的含菌量，将小鼠分离培养的A19-ΔVirB12菌重复上述步骤；结果表明A19-ΔVirB12分子标记株经BABL/C小鼠传3代，A19-ΔVirB12菌株的毒力未出现返强现象，没有发生重组获得缺失的VirB12基因。

毒力检验：用生理盐水分别将胰蛋白胨大豆肉汤固体培养基上培养72h的A19-ΔVirB12和A19的培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU菌的悬液，每组腹股沟注射体重18-20g的BABL/C小鼠5只，每只0.2mL，经15日后剖杀，取脾脏，称重，制成乳剂，分别接种胰蛋白胨大豆肉汤培养基平板，根据其生长菌落数计算BABL/C小鼠每克脾脏的含菌量，结果BABL/C小鼠脾脏的克脾菌数含量不超过20万CFU。结果见表2：

表2A19-ΔVirB12标记株和A19株的毒力检验

从表2表明A19-ΔVirB12标记株为弱毒株，A19-ΔVirB12组BABL/C小鼠的克脾菌数为1.1×10⁵CFU，A19组BABL/C小鼠的克脾菌数为1.6×10⁵CFU，结果表明A19-ΔVirB12标记株毒力稍弱于A19株。

免疫原性：将4-6周龄，体重在18-22g左右的BABL/C雌鼠分为2组：A19-ΔVirB12组、空白组，每组10只，分别取A19-ΔVirB12的培养物，经PBS洗下并稀释成1×10⁹CFU/mL，A19-ΔVirB12分别腹腔注射菌悬液0.2mL，空白组注射0.01MpH7.2的PBS液0.2mL，免疫35天后攻毒所有小鼠，以3个最小感染量的牛布鲁氏菌2308菌株(约100CFU)接种攻毒，30日后断颈处死小鼠，无菌取脾脏并分离培养布鲁氏菌，80％以上的BABL/C鼠应无强毒出现，以VirB12-F和VirB12-R为引物，对从脾脏分离的菌落进行PCR鉴定，PCR结果表明A19-ΔVirB12组和对照组的鼠分离菌均扩增出713bp的片段，表明脾脏分离菌均为2308菌株。统计脾脏分菌的BALB/C鼠的数量及分离菌PCR鉴定结果，实验数据表明，A19-ΔVirB12组80％的BABL/C鼠未分到攻毒菌2308菌株，空白对照组100％的BABL/C鼠均分离到攻毒菌2308菌株。

Claims (6)

1.一种布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，其特征在于按下列步骤进行：

a、为敲除布鲁氏菌A19菌株的VirB12基因，从布鲁氏菌A19疫苗株基因组中分别扩增出VirB12基因上游同源臂片段和下游同源臂片段；

b、再将扩增出VirB12基因上游同源臂片段和下游同源臂片段经中间载体pGEM-T将其克隆至自杀性质粒pBK-CMV-S载体上，从而构建敲除VirB12基因的重组自杀质粒pBCSV12；

c、将重组自杀质粒pBCSV12电击到A19感受态细胞里，运用同源重组技术原理筛选同源重组双交换子，得到敲除VirB12基因的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株。

2.如权利要求1所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，其特征在于将流产布鲁氏菌A19菌株中的四型分泌系统的一个毒力因子VirB12基因敲除得到的菌株，即A19-ΔVirB12株。

3.如权利要求2所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，其特征在于毒力因子VirB12基因如序列表的序列1所示。

4.如权利要求3所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，其特征在于毒力因子VirB12基因的编码序列如序列表的序列2所示。

5.如权利要求1所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株毒力和免疫原性的测定，其特征在于通过构建的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株应用常规的PCR方法，区分布鲁氏菌野毒株和分子标记疫苗株。

6.如权利要求5所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株毒力和免疫原性的测定，其特征在于通过构建的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株按常规方法进行毒力和疫原性的测定，其中A19分子标记疫苗株毒力弱于亲本A19株，以BALB/C鼠为动物模型，A19分子标记疫苗株具有好的免疫原性。

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