CN107723269A - 重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，其包括步骤：以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建缺失asd、crp和rfbN基因的菌株；通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O‑抗原基因簇部分基因片段wzx‑wbaR‑wbaL‑wbaQ‑wzy‑wbaW‑wbaZ与含T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11‑1；将所得Asd+质粒pCZ11‑1转入上述所得菌株，即得。本发明构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌SLN06具有100％的免疫保护效率。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用。
背景技术
非伤寒沙门菌(Not-typhoidal Salmonella)能够引起人类、哺乳类、鸟类、爬行类等多种动物的食物源性人畜共患病，对公共卫生安全造成了重要威胁。据统计，全世界每年超过9000万人感染NTS而引发肠胃炎，并造成至少15万人的死亡。此外，NTS还能引起全球范围内的免疫缺陷病人或非洲地区人群的系统性感染，引发菌血症、败血症及脑膜炎等，死亡率较高。接触受污染的动物产品，如鸡蛋、肉制品等是人感染沙门菌的重要途径，因而控制沙门菌在动物与人类间的传播是沙门菌病防控的关键。
NTS血清型多达上千种，然而据研究，在人类和动物中流行的血清型主要是鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门菌和血清群C沙门菌(如纽波特沙门菌、猪霍乱沙门菌、婴儿沙门菌等)。疫苗是控制疾病最经济有效的手段，随着沙门菌耐药现象日益严重，人们意识到一种能够预防多种血清型的沙门菌多价疫苗是防控动物和人类非伤寒沙门菌病的迫切需求。然而，目前尚无应用于人类的非伤寒沙门菌疫苗，开发的商品化动物用疫苗均为单价疫苗，交叉免疫保护力不足。
因此，本领域亟需可解决上述问题的技术出现。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，该方法包括如下步骤：
(1)以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建同时缺失asd、crp和rfbN三个基因的菌株；
(2)通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ与含T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
(3)将步骤(2)所得Asd+质粒pCZ11-1转入步骤(1)所得菌株，即得所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株；
所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率；所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2x107CFU。
步骤(1)中，设计6对引物分别缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三个基因，突变顺序为asd、crp、rfbN；进行利用自杀质粒pRE112介导的同源重组操作时，利用所述6对引物分别对asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂进行扩增和融合，得到融合片段，再对融合片段和质粒pRE112进行酶切和连接处理；
所述6对引物的序列如下：
优选的，扩增所述上、下游同源臂时，反应体系为：模板DNA1μl，2×primeSTARMax25μl，上游引物1μl，上游引物1μl，ddH2O 22μl；扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec。30个循环后，72℃延伸8min。
进行所述融合处理时，将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例混合，取其中2μl作为模板，然后利用相应引物和高保真酶primeSTAR Max进行PCR扩增，得到融合片段。
进行所述酶切和连接处理时，方法为：分别用KpnI和XmaI酶酶切融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段；利用T4DNA连接酶将酶切后的融合片段与pRE112质粒连接，16℃，过夜，转化λ，过夜大肠杆菌感受态细胞SM10中，待其长出后进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒pRE112。
构建Asd+质粒pCZ11-1时，以纽波特沙门菌ATCC27869基因组为模板，利用引物C2-F/C2-R扩增获得7547bp的wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ序列片段；以pCZb1-1质粒为模板，利用引物C2-VEC-F/C2-VEC-R扩增获得5306bp的包括T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段；上述引物的序列为：
本发明的另外一个目的在于提供由上述构建方法构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株，该疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率，所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2×107CFU；；所述疫苗株的分类命名为肠沙门氏菌Salmonella enterica，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14477，保藏时间为2017年07月31日。
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101。
本发明的另外一个目的在于提供上述疫苗株在预防鼠伤寒沙门菌和/或纽波特沙门菌的感染方面的应用。
如何快速简单地构建多糖表达质粒且使其在沙门菌体内稳定地表达，如何选择突变使疫苗载体阻断同源O抗原的表达并提升异源O-抗原的表达，是研究多糖重组疫苗的关键。
本发明以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为载体，先构建鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028基因缺失株(Δasd Δcrp)并以其做为载体，以宿主-质粒平衡致死系统为技术基础，先通过缺失减毒株O-多糖基因簇rfbN基因以阻断同源O抗原多糖的表达；再利用Gibson组装试剂盒将包含T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA片段(来源于质粒pCZb1-1)与纽波特沙门菌O-抗原基因簇的部分基因wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ(下简称wzx-wbaZ)进行克隆连接，构建重组表达纽波特沙门菌O-抗原的Asd+重组质粒pCZ11-1；然后将重组质粒导入缺失rfbN基因和保留rfbN基因的减毒鼠伤寒沙门菌菌株中，构建新颖的沙门菌二价疫苗株，以之来同时预防纽波特沙门菌和鼠伤寒沙门菌在动物上的侵染。本发明为研制沙门菌或其他细菌多价疫苗提供了新策略。
本发明的有益效果：
本发明构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌SLN06具有100％的免疫保护效率。
附图说明
图1为沙门菌rfbN突变株PCR鉴定图；其中，泳道1：ATCC14028菌株；泳道2：rfbN突变株。M：DNA Marker；
图2为构建Asd+质粒pCZ11-1时片段的扩增结果图；其中，泳道1：利用引物C2-F/C2-R扩增wzx-wbaZ序列，泳道2：利用引物C2-VEC-F/C2-VEC-R扩增获得5309bp的DNA骨架片段(包括T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子)，M：DNA Marker；
图3为WesternBlot鉴定O-抗原表达情况结果图；其中，利用抗沙门菌O:4抗体(A)和抗沙门菌O:8抗体(B)检测SLT25(pCZb1-1)(泳道1)、SLT25(pCZ11-1)(泳道2)、SLT26(pCZb1-1)(泳道5)、SLT26(pCZ11-1)(泳道6)表达O-抗原的情况；表达O:8的ATCC27869(泳道3和7)和表达O:4的ATCC14028(泳道4)为阳性对照；
图4为ELISA检测免疫后第3周、第7周针对同源LPS(A)和异源LPS(B)的血清IgG抗体应答结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
下述内容中，所述SLT26(pCZ11-1)菌株即为CGMCC No.14477。下述所述纽波特沙门菌SLN06为实验室自己分离出的菌株，其对于BALB/C小鼠的LD50为2x107CFU。
一、重组鼠伤寒二价疫苗株的构建
1.鼠伤寒沙门菌疫苗载体的构建：以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法构建了两株鼠伤寒沙门菌弱毒株SLT25(14028ΔasdΔcrp)和SLT26(14028ΔasdΔcrpΔrfbN)。突变株构建所用引物如表1所示。具体方法如下：
1.1突变引物设计
根据Genbank公布的来源于鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028全基因组序列，设计表1中的6对引物分别缺失ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三个基因。突变顺序为asd、crp、rfbN。因缺失3个基因的实验步骤类似，下面以rfbN的缺失为例说明突变株构建过程。引物均由北京华大基因公司合成，序列如下：
表1.构建沙门菌突变株所需引物
1.2rfbN基因上、下游同源臂的扩增以及融合
1)挑取ATCC14028单菌落于5mL LB液体培养基中过夜培养(37℃，180rpm),用天根生化科技有限公司的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组抽提。
2)上、下游同源臂的扩增：以DrfbN1F/DrfbN1R、DrfbN2F/DrfbN2R分别扩增rfbN基因的上、下游同源臂，扩增片段大小分别为421bp和462bp。PCR扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA(细菌基因组)1μl，2×primeSTAR Max(宝生物有限公司)25μl，上游引物1μl，上游引物1μl，ddH2O 22μl。扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec。30个循环后，72℃延伸8min。扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小与预期大小相符。
3)上、下游同源臂的融合：将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例混合，取其中2μl作为模板，然后利用引物DrfbN-1F/DrfbN-2R和高保真酶primeSTARMax进行PCR扩增，得到融合片段。
1.3pRE112-ΔrfbN自杀质粒的构建
1)融合片段和自杀质粒pRE112酶切处理：分别用KpnI和XmaI酶酶切融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段。
2)连接：利用T4DNA连接酶将酶切后的融合片段与pRE112质粒连接，16℃，过夜，转化λpir大肠杆菌感受态细胞SM10中，待其长出后进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒pRE112-rfbN。将质粒抽提后送往上海英俊生物技术有限公司进行测序与鉴定。
1.4SLT25ΔrfbN突变株的构建与鉴定
1)构建过程：将构建好的重组自杀质粒pRE112-ΔrfbN电转化鼠伤寒沙门菌SLT25(ATCC14028ΔasdΔcrp)菌株，在氯霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落。接着将阳性菌落置于不含氯霉素抗性的LB液体培养基中增殖培养，然后涂于10％蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。
2)PCR鉴定：以待检菌落为模板，用引物DrfbN-1F/DrfbN-2R进行PCR扩增。菌株缺失rfbN后，引物DrfbN-1F/DrfbN-2R扩增产物大小为融合同源臂rfbN-UD大小，883bp。若未缺失成功则PCR产物条带大小为1745bp。如图1所示，缺失株PCR鉴定条带大小与理论相符，表明rfbN基因缺失株构建成功，命名为SLT26(14028ΔasdΔcrpΔrfbN)。
2.重组Asd+质粒pCZ11-1的构建：
通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌O-抗原基因簇部分基因wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ(简称wzx-wbaZ，其余地方与此同)与含T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11-1。所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQ ID No.1。具体方法如下：
2.1两个DNA片段的扩增
以纽波特沙门菌ATCC27869基因组为模板，利用引物C2-F/C2-R扩增获得7547bp的wzx-wbaZ序列；以pCZb1-1质粒为模板，利用引物C2-VEC-F/C2-VEC-R扩增获得5306bp的DNA骨架片段(包括T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子)。所用引物序列如下表所示。
表2.构建重组Asd+质粒pCZ11-1所需引物
所用DNA聚合酶为primeSTAR Max(宝生物有限公司)，PCR扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系为：模板DNA 1μL，2×primeSTARMax 25μL，上游引物1μL，上游引物1μL，ddH2O 22μL。扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃2min。30个循环后，72℃延伸8min。如图2所示，扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，两个片段大小与预期大小相符。
2.2两个DNA片段的融合与组装
Gibson组装：将两个片段按照摩尔数1:1的比例混合，准备10μL的混合液。利用Gibson组装预混液(NEB)进行组装，反应体系为：模板混合液10μL，Gibson组装预混液10μL，反应条件为：50℃、60min。然后将链接产物转化TOP.10大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行PCR鉴定，获得多糖表达质粒pCZ11-1。将质粒抽提后送往上海英俊生物技术有限公司进行测序，证实构建的多糖表达质粒是正确的。
2.3重组鼠伤寒二价疫苗株的构建与鉴定：将重组Asd+质粒pCZ11-1分别转入SLT25(14028ΔasdΔcrp)和SLT26(14028ΔasdΔcrpΔrfbN)，构建重组表达疫苗株SLT25(pCZ11-1)、SLT26(pCZ11-1)；同时将Asd+对照质粒pCZb1-1转入SLT25和SLT26，构建对照疫苗株SLT25(pCZb1-1)、SLT26(pCZb1-1)。pCZb1-1是仅含骨架DNA片段的质粒。然后，通过Western Blot鉴定上述菌株的O-抗原表达情况，所用鉴定抗体为商品化抗O4因子抗体(anti-O4 Ab)和抗O8因子抗体(anti-O8 Ab)。如图3所示，SLT25(pCZ11-1)同时表达同源O-抗原(鼠伤寒沙门菌O-抗原)和异源O抗原(纽波特沙门菌O-抗原)(泳道2)，SLT26(pCZ11-1)不表达同源O-抗原，只表达异源O抗原(泳道6)。对照菌株SLT25(pCZb1-1)仅表达同源O-抗原(泳道1)；SLT26(pCZb1-1)不表达O-抗原(泳道5)。这证实，我们成功构建了两株表达异源O-抗原的重组疫苗株SLT25(pCZ11-1)、SLT26(pCZ11-1)。
二、重组鼠伤寒二价疫苗株的免疫保护效应测定
2.1疫苗株的毒力(半数致死量，LD50)测定：为了确保所构建疫苗株的安全性，我们在BALB/c小鼠上测定了各菌株的LD50。我们将ATCC14028、SLT25(pCZb1-1)、SLT26(pCZb1-1)、SLT25(pCZ11-1)、SLT26(pCZ11-1)经口接种7周龄BALB/c小鼠，感染剂量为105-109CFU，如表3所示。攻毒后记录动物死亡情况，按照Reed/Muench法计算半数致死量，评价候选疫苗株的安全性。如表3所示，野生株ATCC14028的LD50为5×105CFU，其他疫苗株是没有毒性的，LD50均大于1×109CFU。因而，我们构建的各疫苗株是安全的，可用于免疫保护评价。
表3.各疫苗株半数致死量的测定
2.2重组鼠伤寒二价疫苗株的免疫原性与免疫保护评价
1)免疫与攻毒：购买6周龄BALB/c小鼠，饲养一周适应环境后对其免疫接种。将20μl含109CFU的各菌株，包括对照疫苗株SLT25(pCZb1-1)和SLT26(pCZb1-1)、重组疫苗株SLT25(pCZ11-1)和SLT26(pCZ11-1)口服接种小鼠，28天后同剂量同途径加强免疫。同时设立PBS对照组。每一免疫组含12只小鼠。第二次免疫后1个月，分别用100×LD50的鼠伤寒沙门菌强毒株ATCC14028和纽波特沙门菌强毒株SLN06对各免疫组小鼠进行口服挑战接种，然后记录攻毒后各组小鼠的死亡情况。具体分组、免疫与攻毒情况如表4、5所示。
2)抗体水平检测：分别在一免后3周、7周采集每组6只小鼠的血清，通过定量ELISA方法检测针对同源LPS(鼠伤寒沙门菌LPS)和异源LPS(纽波特沙门菌LPS)的血清IgG应答。如图4A所示，一免后3周，与PBS对照组相比，SLT25(pCZb1-1)、SLT26(pCZ11-1)和SLT26(pCZ11-1)引起了微弱但差异显著的针对同源LPS的抗体应答；一免后7周，与PBS对照组相比，四个疫苗免疫组均产生了显著的针对同源LPS的抗体应答，但SLT26(pCZb1-1)组激发的抗体水平显著低于其余三个免疫组(p<0.001)。如图4B所示，一免后3周，仅SLT26(pCZ11-1)组产生了显著的针对异源LPS的抗体应答；一免后7周，与PBS对照组相比，SLT25(pCZb1-1)、SLT25(pCZ11-1)、SLT26(pCZ11-1)组抗体水平升高，均产生了差异显著的针对异源LPS的抗体应答，且SLT26(pCZ11-1)产生的抗体水平显著高于其余两组。相比之下，SLT26(pCZb1-1)没有产生针对异源LPS的抗体应答。SLT25(pCZb1-1)只表达同源O-抗原，SLT26(pCZ11-1)只表达异源O-抗原，但两者免疫后同时产生了显著的针对两种LPS的抗体应答，表明鼠伤寒沙门菌LPS和纽波特沙门菌LPS之间存在共同抗原表位。
综上，我们构建的重组疫苗组SLT25(pCZ11-1)、SLT26(pCZ11-1)均产生了高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，且SLT26(pCZ11-1)产生的针对异源LPS的血清IgG水平较高。
2)免疫保护效力：如表4所示，在同源菌株—鼠伤寒沙门菌强毒株ATCC14028攻毒后，PBS组小鼠全部死亡，其余四个免疫组的小鼠全部存活。如表5所示，在异源菌株—纽波特沙门菌强毒株SLN06攻毒后，PBS、SLT26(pCZb1-1)组小鼠全部死亡，SLT25(pCZb1-1)、SLT25(pCZ11-1)组小鼠一半存活，即50％的存活率，相比之下，SLT26(pCZ11-1)免疫组无死亡情况。因此，重组疫苗株SLT25(pCZ11-1)能够提供100％的同源保护率和50％的异源保护率，而SLT26(pCZ11-1)能够同时提供完全的同源保护率和异源保护率。这表明我们构建的重组鼠伤寒沙门菌二价SLT26(pCZ11-1)可以用以预防鼠伤寒沙门菌和纽波特沙门菌的感染。
表4.各候选疫苗株针对同源菌株的免疫保护效力
表5.各候选疫苗株针对异源菌株的免疫保护效力
综上，我们利用Gibson组装的方法构建了一个携带纽波特沙门菌部分O-抗原基因簇基因的重组Asd+质粒pCZ11-1，然后将其转入减毒的鼠伤寒沙门菌asd突变株SLT25(14028ΔasdΔcrp)和SLT26(14028ΔasdΔcrpΔrfbN)，成功构建二株重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株SLT25(pCZ11-1)、SLT26(pCZ11-1)。基于BALB/c小鼠的免疫保护实验证实，SLT25(pCZ11-1)能够提供100％的同源保护率和50％的异源保护率，SLT26(pCZ11-1)能够同时提供完全的同源保护率和异源保护率。这表明我们构建的重组鼠伤寒沙门菌二价SLT26(pCZ11-1)可以用以预防鼠伤寒沙门菌和纽波特沙门菌的感染，同时证实异源表达O-抗原是构建沙门菌二价疫苗株的理想策略，也为沙门菌多价疫苗的构建奠定了理论基础。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用
<130> 2017
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7449
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atgaatcgta ttattagaat gttaggtgta gataaagcaa ttcgttatgt tatttttggt 60
aagataatat ctgtattaac gggtttactg ttaataatgt taatatcaca ccatttatct 120
aaagacgcac agggctatta ttatacattt aattcagtag tggcactaca gataatattt 180
gaattggggc tatcaacggt aatcattcaa ttcgctagcc atgaaatgtc agcgttaaaa 240
tatgattatt ctgaacgaga tattataggt gaaagtaaaa ataagcaacg ttacctatcg 300
ttatttcggt tggcaataaa atggtatgca gtaatagctt tgctaataat attaatagtc 360
ggtcccatcg ggtatgtttt ttttacgcaa aaagaaggct taggtgtacc ttggcaaggg 420
gcatggttat tattaacaat agttacagct tttaatattt ttcttgtttc tgtactttct 480
gtcgctgaag ggagtgggtt aattactgat gtgaataaaa tgagaatgta tcagtcgctg 540
ttagctggta tattggcagt aagcttactt attagtggct ttggactata tgctacgtct 600
gcaatagcta tttcagggac tatcatattc tccatatttt catataagta ttttaaaaaa 660
attttcctgc aatctttaaa gcataaaaat aaatatactg aaggtggtat ttcatgggtt 720
aatgaaatat ttcctatgca atggcgaatt gctctaagtt ggatgtcagg gtattttatt 780
tattttgtta tgacccccat tgcattcaaa tatttcgggg ctatatatgc agggcagtta 840
gggatgtctt taacattatg caatatggta atggctacgg gcctggcttg gatatccact 900
aaatatccaa aatggggagt aatggtttcc aacaaacagc ttgcggaact gagtaaatcg 960
ttcaaaagtg cagtaatgca atcatccttt tttgtcttga caggattaac tggtgtatac 1020
atttcattat ggttattgaa attatctggt tcaaacattg gcgagcggtt tttgggattg 1080
caggattttt tctttttatc tttagcaatt attggtaatc acattgtagc ttgctttgca 1140
acctatataa gagcgcataa aactgaaaaa atgacattgg catcatgtat aatggctctc 1200
ttgactataa ctacaatgtt gtttgttgca tatttagagt actcgaggtt ctacatgtta 1260
atgtatgcag cactaacgtg gttatatttt gttcctcaaa cttatataat ctttaaaaga 1320
ttcaagagtt cttatgagta aaaaacctct tcttactatt gctattccga catataaccg 1380
ctcttcatgt ttggctcgtt tacttgatag tataattcaa caggagaact attgtcatga 1440
tgaactcgag gttattgttt gtgataatgc ttcaacagat gaaacagcaa gaatagccaa 1500
gagtggctta gataaaataa gaaatagtac ttatcatcta aatgaagaaa acttaggaat 1560
ggatggtaac ttccagaaat gttttgagtt atcaaatgga aaatatcttt ggatgattgg 1620
cgatgatgat ctaatagtca aaaatggtat ttcgaaggtt ttttcgatat taaagtcccg 1680
gcctgcatta gatatggtgt atgtaaattc agcagcaaag actgagttaa actataatgc 1740
tgatgtgagg acgtcattct acacaaatga tgtagatttt atttcagacg tgaaagttat 1800
gttcacgttt atttctggaa tgatatgtaa gaaaactgat gcaattgtca aagccgttgg 1860
tattttcagt ccgcaaacta ctggaaaata tcttatgcat ttaacatggc aattgccatt 1920
acttaaacag ggtggagagt tcgcagttat ccataataat ataattgagg ctgagccaga 1980
taattcaggt ggatatcatt tatataaggt tttttctaat aatcttgcga caatctttga 2040
tgttttttat cccagagagc accgtgtaag taaaagagtt cgcgcatcag catgtttatt 2100
cttacttaac ttcataggcg atgaagataa aaccaaaaat tttgctacaa ataattattt 2160
aagagattgc gatagtgcat ttatagattt aattatatat aaatatgggc ttaggttttt 2220
ctatctatac cctaaaactg tgcctttatt tagaaaaata aaatatatta taaagacggt 2280
tttaatgcgt aaataaaaat tattcaagat ggtttgctga aaacgactta taggactatc 2340
taatgtttgt ctatagttta agattaaaat taaatcttat catatcatta ttgagtaaag 2400
ttaggcggaa atcaaaagca aagtttcttg ttctgcttag cggatatgat tttaaaatgg 2460
ttgggaagaa ttttaaattg aatgtcaaac cttactctgc aaaaaataac acctcttcca 2520
aatggggtag tatgcgggtt ggtgataact gctggattga agctgtatat aattatggtg 2580
atgaaaaatt tgaaccttat ttgtacatag gtgatcgtat atgtttaagt gataatgttc 2640
atatttcttg cgtatcatgt ttaattttag aaaacgatat attaattggt agcaaagttt 2700
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caaataagcc attaggtgat attgctccta ttaaaatagg taattgctgc tggattggag 2820
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taataaaggt attttaaaat gaatgttttt atcagtattt gtataccgtc ttataataga 3000
gctgagtttt tagagccact actggatagc atatataatc aagattattg tttaaagaat 3060
aatgattttg aggtcattgt ttgtgaagat aaatctccac agagagatga gataaactct 3120
attatcgaaa actataaagc aaaaaataat aaacaaaatc tttatgttaa tttcaatgaa 3180
gataatttag gctatgataa gaatttaaaa aaatgcatta gtttgacgac aggtaaatat 3240
tgcatgatca tgggcaacga tgatctatta gcagatggag cgttatcaaa aatagtgaaa 3300
gttttgaagg ctaatcctga aattgtattg gctacgcgag cgtatggttg gtttaaggaa 3360
aatccgaatg agttatgtga tactgttcgt catttaacag acgatacttt atttcagccg 3420
ggggttgatg ccattaaatt tttcttccgt agagttggag ttatttcagg ctttattgtc 3480
aatgctgaaa aagcaaaaaa actatcgagt gatttatttg atgggcgttt atattatcaa 3540
atgtaccttg ctggtatgct aatggctgaa ggtcagggat actattttag cgacgtgatg 3600
acattgtcga gggatacaga ggctcctgac tttggtaacg ctggaactga aaaaggagtt 3660
ttcaccccgg gggggtataa accagagggc cgtatacata tggttgaagg cttgttgcta 3720
attgcaaaat atatagaaga tacaacaaaa attgatggcg tttatgctgg aattagaaaa 3780
gacttagcga actattttta tccttatatt cgagatcaac tcgacttgcc tctttatact 3840
tatattaaaa tgataaataa atttcggaaa atgggatttt caaatgaaaa gcttttctat 3900
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attcgtagca aaaaaggcgg tactccgcgt cttggtattt aacctccact ttcaaaaaat 4020
gttatgaata tacttcttgc tgcgatatta ggcgttaact tattttctcc atatattagt 4080
tcgtggatgg tgggtatgct gccatttcca ccaggagcaa tcctaaggga tgtactcaat 4140
gtattttttg tggcgttagt gctagttcga tttgtcattg ataggaaaaa aacttatttc 4200
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atattctcac cggataaaat tcaagcaatt atgggggggc ggagttatat tttattcccg 4320
gcagttttca tagcattagt gattttaaaa gtatcatacc cgcaatcctt aaatattgaa 4380
aaaatagttt gctacataat ttttctaatg tttatggttg cgacaatatc tattattgat 4440
gtactaatga atggagagtt cattaaattg ctcggatatg atgagcatta tgcaggagaa 4500
caattaaact taattaatag ctatgatggg atggtccggg ctacaggcgg ttttagtgat 4560
gctctcaatt ttggatatat gctcacatta ggtgttttgt tatgtatgga gtgtttttcc 4620
caaggatata aaagattatt gatgctcatt attagttttg tgctatttat agcgatctgc 4680
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gcaatttcta ctaatatttt tgacaactat acagaaattt tgatcggcag gtttacagat 4860
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aacttcctgt cagaacatcc atcaggtata ggtctgggta ctcaaggttc aggaaacatg 4980
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actggtatta ttggcttaat cataaatatt atttatctgg caagtcaatt ttattcttca 5100
actttactaa atagaatata tggcagtcat tgtagcaata tgcactatag attatatttt 5160
ctctttggaa gtatatattt tataagtgca gcgttaagtt cagcaccttc gtcatcaact 5220
ttttctatat attattggac agttttagct ttgattccat ttttaaaatt aacaaataga 5280
cggtgcacgc gataatgaat aataaaaagg ttttgatgga tattagttgg tctaataaag 5340
gggggattgg acgttttact gatgaaattt ctaaactact atgtgatata tctaaggagg 5400
aactatatag aaaatgtgct tctccgctgg ccccattagg tttagcagtc aatatttttc 5460
tgcgaaagaa aactgatgtg gtttttcttc ctggctatat tccaccactt ttttgttcga 5520
aaaagttcat aataacaata catgatctaa atcatctgga tttaaatgat aattcctctc 5580
tttttaagag gttattttat aattttataa taaagcgcgg ttgtagaaaa gcatataaaa 5640
tatttacagt ttcgaatttt tcaaaagaaa gaatagtagc atggtcaggt gtaaacccta 5700
ataaaatagt cacggtatat aatggggtat ctagtctatt taatgccgat gtaaaaccat 5760
tgaatttagg ctataaatat ttgctatgtg taggaaacag aaaaactcat aagaatgaga 5820
agtgtgttat atctgccttt gccaaagcag atattgatcc atcaataaaa ctcgttttta 5880
ctggtaatcc ttgtaatgat ttagaaaaac taataataca acatggttta agtgaacgtg 5940
taaagttctt tgggttcgtg tctgaaaaag atttaccatc gttatataag ggctcgttag 6000
gattagtttt cccttcttta tatgaaggtt ttggattacc tgtagtggag ggcatggcct 6060
gtggtattcc tgtattaact tctctaactt catcattgcc agaggtggct ggagatgcag 6120
cgattcttgt cgaccctctt tcggaagatg ctattactaa aggaatttcg aggttaatta 6180
atgattctga acttcgtaag catttaatcc aaaaggggct tttgcgggca aagaggttca 6240
attggcaaaa cgtggttagt gagattgaaa tggtactgac agaggcatgt gatggaaata 6300
aatgaaataa aaatatctct cgttcatgag tggttattaa gttatgcagg ctccgaacag 6360
gtatcatctg ccatcctgca tgtttttcct gaagcgaagt tatattcggt ggttgatttt 6420
ctaacggatg aacaaagaag acattttctg gggaaatatg cgactaccac atttattcaa 6480
aatttaccta aagctaaaaa attttaccag aaatatttac cactaatgcc actggctatt 6540
gaacaacttg atttatcaga tgctaatatc atcattagta gcgcccattc cgttgcaaaa 6600
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gtcgaagcct ttagtaaaat gccggaaaag aaattagtag ttattggtga tggaccggag 7020
atgaaaaaaa taaagagcaa ggctacagac aatataaaat tgctcggtta tcaatctttt 7080
cctgttttaa aagagtatat gcagagcgcc agggcgtttg tttttgcagc ggaagaggac 7140
tttggaataa tacctgtcga agctcaagct tgcggtaccc ctgttattgc ctttgggaag 7200
ggtggggcct tagaaaccgt tcgcccacta ggtgtagagg aaccgactgg cattttcttc 7260
aaggaacaga atattgcttc tttgcatgaa gctgttagtg aatttgaaaa aaatgcatca 7320
ttttttacat ctcaggcttg tagaaaaaat gcagaaaaat tttctcgatc aagatttgaa 7380
caagaattta agaactttgt taatgaaaag tggaatcttt tcaaaacaga acagattatt 7440
aaacgttaa 7449
Claims (10)
1.一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建同时缺失asd、crp和rfbN三个基因的菌株；
(2)通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ与含T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
(3)将步骤(2)所得Asd+质粒pCZ11-1转入步骤(1)所得菌株，即得所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株；
所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率；所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2×107CFU。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，设计6对引物分别缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三个基因，突变顺序为asd、crp、rfbN；进行利用自杀质粒pRE112介导的同源重组操作时，利用所述6对引物分别对asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂进行扩增和融合，得到融合片段，再对融合片段和质粒pRE112进行酶切和连接处理；
所述6对引物的序列如下：
DrfbN 1F CGGGGTACCGTATGTGGTCGTACTGAC
DrfbN 1R TTTGACGAAGTTATTTTGATTCCGCCAACC
DrfbN 2F ATCAAAATAACTTCGTCAAAAGAGATAAAATA
AATG
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，扩增所述上、下游同源臂时，反应体系为：模板DNA1μl，2×primeSTAR Max25μl，上游引物1μl，上游引物1μl，ddH2O 22μl；扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec。30个循环后，72℃延伸8min。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，进行所述融合处理时，将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例混合，取其中2μl作为模板，然后利用相应引物和高保真酶primeSTAR Max进行PCR扩增，得到融合片段。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，进行所述酶切和连接处理时，方法为：分别用KpnI和XmaI酶酶切融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段；利用T4DNA连接酶将酶切后的融合片段与pRE112质粒连接，16℃，过夜，转化λpir大肠杆菌感受态细胞SM10中，待其长出后进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，构建Asd+质粒pCZ11-1时，以纽波特沙门菌ATCC27869基因组为模板，利用引物C2-F/C2-R扩增获得7547bp的wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ序列片段；以pCZb1-1质粒为模板，利用引物C2-VEC-F/C2-VEC-R扩增获得5306bp的包括T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段；上述引物的序列为：
C2-F CACACAGGAAACAGAATGAATCGTATTATTAGAATGT TAGGTGTAG
C2-R TCCGCCAAAACAGCCCTGTTTCGGATGCTCTTCACG
C2-VEC-F GAGCATCCGAAACAGGGCTGTTTTGGCGGATG
C2-VEC-R AATAATACGATTCATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG TTATC。
7.根据权利要求1或6所述的构建方法，其特征在于，进行Gibson组装时，采用的方法为：将两个片段按照摩尔数1:1的比例混合，准备10μL的混合液；利用Gibson组装预混液进行组装，反应体系为：模板混合液10μL，Gibson组装预混液10μL，反应条件为：50℃、60min。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在构建Asd+质粒pCZ11-1中，进行所述扩增时，所用DNA聚合酶为primeSTAR Max，PCR扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系为：模板DNA 1μL，2×primeSTARMax 25μL，上游引物1μL，上游引物1μL，ddH2O 22μL；扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃2min。30个循环后，72℃延伸8min。
9.由权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株，其特征在于，所述疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率，所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2×107CFU；所述疫苗株的分类命名为肠沙门氏菌Salmonella enterica，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14477，保藏时间为2017年07月31日。
10.由权利要求1～8任一项所述制备方法制备得到的疫苗株或权利要求9所述的疫苗株在预防鼠伤寒沙门菌和/或纽波特沙门菌的感染方面的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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