CN109776660A - 一种制备高活性无毒破伤风类毒素的方法以及破伤风疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备高活性无毒破伤风类毒素的方法以及破伤风疫苗，涉及生物技术领域。该方法包括将用以表达毒破伤风类毒素的表达盒插入至破伤风杆菌基因组或大肠杆菌基因组；其中，所述毒破伤风类毒素的形式选自：TeNT(RY)、LN+TTC和2TTC中的至少一种。通过对破伤风杆菌基因组改造，在其中插入表达TeNT(RY)、LN+TTC或2TTC等形式的毒破伤风类毒素抗原的表达盒，使得所表达的抗原具有无毒性和活性高的特点，可用于制备破伤风疫苗，提高疫苗的安全性。

Description

一种制备高活性无毒破伤风类毒素的方法以及破伤风疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种制备高活性无毒破伤风类毒素的方法以及破伤风疫苗。

背景技术

破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)属于革兰氏阳性厌氧菌，中等大小细长杆菌，两端钝圆，无荚膜，有周身鞭毛，能运动。本菌可产生两种外毒素，一种是破伤风溶血素(tetanolysin)，只在培养初期产生以后逐渐减少并消失。另一种是破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)，是一种与破伤风梭菌的致病性有关的神经毒素，即通常所指的破伤风毒素或破伤风类毒素(tetanus neurotoxin,简写TeNT)，它是目前已知的毒性最强的蛋白质之一。它与中枢神经系统的抑制性突触前膜的神经节结合，阻断该突触释放抑制性介质，骨骼肌持续兴奋，发生痉挛，造成破伤风特有的牙关紧闭角弓反张等症状。

破伤风类毒素(图1)是一个由1315个氨基酸组成的分子量约为 150kDa多肽。该多肽在破伤风杆菌的蛋白水解酶作用后，在456和 467氨基酸残基之间裂解成为分量大约为50KD轻链(LC)和100KD 重链(LN)，在864和863之间有一个木瓜蛋白酶(papin)切位点可以将重链进一步降解为N端(HCN)和C端(HCC或TTC)。LC和LN 通过一对二硫键S439-S467连接。LC是锌依赖蛋白酶，在193-197 位有一个锌指结合蛋白的功能域HELIH，375位的酪氨酸是一个催化活性位点。HCN负责突触囊泡通过细胞质进入细胞质的膜，而TTC 负责毒素结合神经元细胞。当TTC结合神经元上神经节苷脂受体后，在HCN协助下，LC进入神经元后被运输到神经元胞质，在那里裂解可溶性NSF黏附蛋白(soluble NSF attachment protein(SNAP)receptor(SNARE)proteins)，通过水解突触囊泡蛋白Ⅱ而阻断神经抑制性介质的释放，阻断了神经元和运动神经元之间的信号传递，从而产生了破伤风特有的痉挛性瘫痪特征。最新的文献报道将372位的精氨酸突变为丙氨酸(R372A)和将375位的酪氨酸突变为苯丙氨酸(Y375F)，这种双突变(R372A/Y375F)后重组表达的破伤风抗原没有毒性但同时保持抗原性。

目前，破伤风类毒素的生产工艺有两种：(1)先脱毒后精制；(2) 先精制后脱毒。国外学者推荐采用第二种工艺，据认为前者在脱毒的过程中，甲醛极容易与毒素分子交联，后续的提纯较困难，但后者在精制过程中对操作人员存在潜在危险，所以目前国内大多采用后者精制类毒素。一般的纯化方法采取硫酸铵沉淀、铝制剂吸附，而灭活的方式主要采取甲醛灭活，一方面甲醛的脱毒作用比较复杂，脱毒后形成的多聚体在各厂家或批次不统一，导致效价差异大；另一方面类毒素中可能有游离甲醛的存在，很大程度上影响到毒素的稳定性，也给接种者带来潜在的危险。

近年来，对破伤风抗毒素的研究集中于两个方面：一是采取杂交瘤技术或噬菌体展示技术筛选出抗破伤风类毒素的抗体，人们期望采取一种或几种单抗或者单链抗体来代替抗血清，但是由于单抗或者单链抗体生产成本明显高于动物来源的抗血清，缺乏经济因素的驱动力；另一方面重组抗原不断报导，但是研究主要集中于TTC片段的研究，包括各种表达方式，比如优化密码子以适合大肠杆菌表达、融合Trx表达标签等。但是这些重组片段产生中和抗体保护功能的报导却是互相矛盾的，一个原因可能是大肠杆菌和破伤风杆菌表达破伤风类毒素的环境有差异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法。采用该方法可以制得活性高、无毒的破伤风类毒素或片段串联体。

本发明的目的在于提供一种破伤风疫苗。其含有无毒破伤风类毒素或片段串联体。

本发明是这样实现的：

一种制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其包括：将用以表达无毒破伤风类毒素的表达盒插入至破伤风杆菌基因组或大肠杆菌基因组；

其中，所述无毒破伤风类毒素或片段串联体的形式选自： TeNT(RY)、LN+TTC和2TTC中的至少一种。

需要说明的是：TeNT(RY)是指双突变(R372A/Y375F)全长1315 个氨基酸的无毒破伤风类毒素；LN+TTC是指采用接头将重链(LN) 和TTC片段串联起来的片段；2TTC是指采用接头将两个TTC片段串联起来的片段。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，LN+TTC和2TTC的接头序列各自独立地选自如下序列中的至少一种：

PAPAP、(GGGGS)n、(XP)n、(EAAK)n和(EAAKA)n；其中n为的1-10的任意一自然数。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，将含有所述表达盒的质粒转染所述破伤风杆菌以使所述表达盒插入至所述破伤风杆菌基因组中；

其中，所述质粒还具有如下元件中的至少一种：

I-SceI酶表达盒、I-SceI酶识别位点、目标插入位点的上游同源序列和目标插入位点的下游同源序列。

利用I-SceI酶在体内表达，使质粒断链，质粒和破伤风杆菌的基因组发生同源重组，从而达到在目的基因组上敲出或者插入外源 DNA片段的效果。

借助基因组编辑技术，采用I-SceI在基因组上无抗生素的基因编辑，同时可以反复操作进行多位点整合表达盒，明显提高目的蛋白的表达量。可以为生产简化生产流程，降低生产成本，极大地提高破伤风疫苗的生产水平。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述目标插入位点位于所述破伤风杆菌的假基因区域。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述假基因位于所述破伤风杆菌基因组如下区域：第3886至4870位点之间的序列区域或第 12173至12872位点之间的序列区域。

在Harvard E88破伤风杆菌的基因组上，有两个假基因，第一个假基因位于3886至4870位点之间，由于移码导致突变(简称位点 3886)。第二个假基因位于12173至12872位点之间，由于插入突变导致蛋白不完整(简称位点12173)。

需要说明的是，目标插入位点也可以选择基因组上其他由于移码、插入等造成的假基因位置，也可以是两个编码基因之间的大片段区域。以达到增加表达盒数量的目的。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，I-SceI酶表达盒中的驱动I-SceI酶表达的启动子为持续性驱动表达启动子或诱导性驱动表达启动子；

优选的，所述持续性驱动表达启动子为ptb启动子 (phosphotransbutyrylase)或Thi启动子(thiolase)；

优选的，所述诱导性驱动表达启动子选自：木糖(xylose)诱导型启动子、乳糖(lactose)诱导型启动子、发光(radiation)诱导型启动子、昆布二糖(laminaribiose)诱导型启动子和树胶醛糖 (arabinose)诱导型启动子中的至少一种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述破伤风杆菌选自如下菌株中的一种：Harvard E88、Harvard C2、Harvard strain A2、 Harvard CN655、ATCC19406、ATCC9441、ATCC453、ATC454和 CMCC64008。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述无毒破伤风类毒素的形式或片段串联体为TeNT(RY)，插入至所述破伤风杆菌基因组上的所述表达盒的数量为2个。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述无毒破伤风类毒素或片段串联体的形式为LN+TTC，插入至所述破伤风杆菌基因组上的所述表达盒的数量为2个。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述无毒破伤风类毒素或片段串联体的形式为2TTC，插入至所述破伤风杆菌基因组上的所述表达盒的数量为3个。

另一方面，本发明提供了一种破伤风疫苗，其含有无毒破伤风类毒素或片段串联体，所述无毒破伤风类毒素或片段串联体为 TeNT(RY)、LN+TTC或2TTC。

本发明具有以下有益效果：

本发明的制备高活性无毒破伤风类毒素的方法，通过对破伤风杆菌基因组改造，在其中插入表达TeNT(RY)、LN+TTC或2TTC等形式的无毒破伤风类毒素或片段串联体的抗原的表达盒，所表达的抗原无毒性，小鼠可以耐受40μg的抗原在5日内不致死，远高于WHO 确定的2.5ng/kg致死剂量，消除了目前生产上甲醛灭活工艺和毒性逆转的可能性；

此外，该方法采用的是破伤风杆菌自身的系统来表达无毒破伤风类毒素抗原或片段串联体，表达产物具有高于用其他表达体系的表达产物活性，免疫性较高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为破伤风类毒素蛋白的结构简式。

图2为pET32a表达TeNT(RY)所构建的质粒示意图，以插入的 TeNT(RY)抗原形式为例，TeNT(RY)可以换为表1中的其他序列形式。

图3为pKO-TeNT质粒结构示意图，图中Thi是代表Thiolase promotor(硫解酶启动子)；S代表I-SceI识别位点；upstream和 downstream是指TeNT的上下游。

图4是以TeNT(RY)为例，将TeNT(RY)整合到破伤风杆菌基因组上的质粒示意图。

图5为大肠杆菌重组表达的九种破伤风类毒素抗原形式的凝胶电泳图。图中：1蛋白marker，从上到下的分子量大小250kD、150KD、 100KD、75KD、50KD、37KD、25KD；2TeNT(RY)；3LC(RY)；4LN； 5HCN；6TTC；7LC(RY)+TCC；8 2TTC；9 3TTC；10LN+TTC。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

所使用的宿主菌株E88购自ATCC，构建所使用的载体 CDFDuet-1质粒由捷瑞生物提供。

质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品。

基因序列的合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成、引物合成以及基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

在Harvard E88菌株的基因组中搜寻I-SceI酶切位点。

用I-SceI酶特征识别位点18bp (5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’)，搜寻Harvard E88菌株的基因组 (Genebank：AE015927.1和AF528097.1)，发现该基因组未有该特征序列。

实施例2

(1)合成基因和构建表达载体，并在大肠杆菌中表达、纯化。

基因合成和载体构建：将破伤风类毒素突变体TeNT(RY)翻译成适合大肠杆菌体系表达的核苷酸序列(核苷酸序列见表1)。

LC(RY)+TCC中LC(RY)通过接头即1个GGGGS单元与TCC相连，类似地，2TTC、3TTC和LN+TTC也是通过该接头序列即1个 GGGGS(其编码序列见SEQ ID NO.5)单元相连。一共有9种表达形式(表1)。将这些合成或构建的片段，使用Msc I和Xho I装入PET32a 载体(质粒结构示意图见图2)中并转入BL21(DE)3菌株中，进行诱导表达。表达产物在N段融合了Trx标签蛋白，在C段表达了6His标签蛋白。

表1无毒破伤风类毒素或片段串联体的结构特征

表达方法如下：

①接种单克隆于10mL含有卡拉霉素抗生素的培养基中。次日转接入1000ml含卡拉霉素的培养基体积中。②菌株在37℃250r/min 条件下培养至OD600nm达到0.6～0.8。③加入100mmol/L IPTG至每个培养体系(1mmol/L的终浓度)，28℃、190r/min诱导4h。④采用5000rpm离心5分钟收集表达细菌。

(3)纯化

纯化方案：参考GE镍柱纯化指南。将上述的菌体在冰水混合物上用超声波破碎仪进行破碎。对破碎后混合物采取12000rpm离心20 分钟，取上清进行如下步骤纯化：①柱子准备：以3倍体积超纯水清洗柱子，去除乙醇；然后用0.1M NiSO4(约2～3倍柱体积)过柱，直到柱体变绿为止；最后再以约3倍体积超纯水清洗柱子，去除多余 Ni离子；②用20mMsodium phosphate,0.5M NaCl,pH 7.4平衡柱子，直到流穿液pH、电导与之一致；③上样，收集流穿液；连接紫外检测仪检测OD280，用20mM sodium phosphate,0.5M NaCl,pH 7.4缓冲液洗柱至OD280小于0.05；④洗脱：用20mM sodium phosphate,0.5 M NaCl,0.1Mimidazole,pH 7.4缓冲液洗脱并收集洗脱液；⑤柱清洗及保存：用0.05M EDTA洗柱直到柱变白(去除Ni离子)。再用2 倍体积的超纯水洗柱；最后加入20％乙醇保存。⑥电泳检测纯化样品结果见图5。结果显示各条带大小符合预期。

(4)检测各种形式的破伤风类毒素抗原的活性(类毒素絮状单位测定法)参考中国药典(2015版第三部通则3506)，采取类毒素絮状单位测定法测定大肠杆菌所表达的各种抗原的效价。

测定步骤如下：精密量取每lml含100Lf的抗毒素絮状反应标准品溶液0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml，分别加入絮状反应管，精密量取供试品溶液lml(上文步骤⑤的洗脱液样品)，快速准确加上述各絮状反应管内，摇匀，置45～50℃水浴中，连续观察，并记录絮状出现次序和时间。再取5支絮状反应管，重复上述试验，将最先出现絮状之管放中间，前后各加两管不同量抗毒素絮状反应标准品溶液，每管间隔0.05ml,再向各管中加入供试品lml，观察絮状出现情况。

根据结果，再重复试验1次，将最先出现絮状之管放中间，前后各加两管不同量抗毒素絮状反应标准品溶液，每管间隔0.02ml，同上法观察并记录结果，以2～3次相同值为最终测定值。

按下式计算：

供试品絮状单位(Lf/mi)＝100*V*n

式中V为最先出现絮状时使用的每lml含100IJ的抗毒素絮状反应标准品溶液的体积，ml；n为供试品稀释倍数。

结果显示，活性最好的三种抗原形式是：LN+TTC、2TTC和 TeNT(RY)，且它们的活性依次是20Lf/ml、15Lf/ml和12Lf/ml；3TTC 的为：10Lf/ml；LC(RY)+TCC的为：9Lf/ml；TTC的为：8Lf/ml； HCN的为：5Lf/ml；LN的为：8Lf/ml；LC(RY)的为：4Lf/ml。

(5)BCA试剂盒蛋白含量测定

依据BCA试剂盒(C503021，上海生工)操作说明书，测定其含量。

A试剂准备

1.按照以下公式计算所需的BCA工作液总体积。

BCA工作液总体积＝(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的BCA工作液体积。

2.根据所需的BCA工作液总体积，定量取溶液A：溶液B＝50：1，混匀，制成BCA工作液。

3.取一定量的BSA标准溶液，用1XPBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,8mMNa2HPO4.7H2O,1.5mM KH2PO4,pH 7.4)溶液稀释为500 μg/mL。

4.取16支1.5mL离心管，设置为8个重复管号，按照下表平行操作。

5.将样品用1×PBS做适当倍数的稀释备用。

B.分光光度法

1.取20支1.5mL离心管，分为标准组和样品组。其中16支1.5 mL离心管，每个标准品设置1个重复，各管分别加入100μL

相应浓度的标准蛋白质溶液；剩余4支1.5mL离心管，分为2 个重复组，重复组离心管编号相同。其中编号不同的两管加入浓度不同的100μL样品稀释液。

2.各管加入1mL BCA工作液，迅速混匀。

3.在37℃水浴中保温30min。

4.冷却至室温后，在分光光度计上测各管的A562值。

5.以标准组各管A562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。

6.根据两个相同样品稀释液A562值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。

实施例2

构建突变工程菌株

(1)用于基因编辑的质粒构建

构建的质粒分为两类:一类是将青霉素抗性基因转入破伤风菌株的基因组，使其达到敲出TeNT基因，或者在基因组上插入青霉素基因的目的。

比如构建用于敲出TeNT基因的质粒pKO-TeNT(图3)，以 CDFDuet-1质粒为骨架，加入以下元件：Thiolase promotor(GenBank: U08465.1)取300--492一段，I-SceI基因(GenBank:AF406953.1)取776--1477一段，青霉素抗性基因(GenBank:X52325.1)的1800--2958， TeNT的上游(GenBank:NC_004565.1)的67000--68639；TeNT的下游 (GenBank:NC_004565.1)的72818-74082；

用于在位点12173或3886的插入时，则将图2中的TeNT的上下游换成相应的位点12173或3886的上下游即可。

另一类是载体的功能是，将整合在基因组上的氨苄青霉素基因置换出来，达到转入TeNT(RY)、LN+TTC、2TTC基因，这类质粒只需将图4中氨苄青霉素基因(Amp)换成相应目标基因即可。图4中的 I-Sec酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

(2)敲出破伤风杆菌基因组上的TeNT基因

质粒大量制备：将合成的质粒pKO-TeNT转化DH5a菌株，然后使用北京康为世纪(CW2581)提取大量无毒质粒。

电转：参考伯乐电转手册和参考文献【Ning Zhang,Lijun Shao,Yu Jiang,YangGu,Qi Li,Jinle Liu,Weihong Jiang,Sheng Yang I-SceI-mediated scarless genemodification via allelic exchange in Clostridium Journal of MicrobiologicalMethods 108(2015)49–60】， 2μg以上的质粒DNA在1500V/lmm的电压强度下电转200ul破伤风杆菌感受态细胞，电转后的破伤风杆菌涂布于含有10μg/ml链霉素和100μg/ml氨苄青霉素的抗性平板上进行1天的第一轮抗性筛选，然后将菌落转移至含有100μg/ml氨苄青霉素的培养平板上进行3天的第二轮筛选，将筛选出来的阳性克隆用PCR方法扩增出相应的片段，然后进行测序验证。

(3)将突变后的TeNT(RY)编码区替换上一步整合到基因组的青霉素抗性基因的位置上。

质粒制备和电转的方法基本上同前述方法，在第二轮筛选的时候略有不同，将第一轮筛选出的阳性克隆同时在无抗生素、100μg/ml 氨苄青霉素和10μg/ml链霉素的平板上划板，只有在无抗生素平板上生长而在100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml链霉素的平板上不能生长的克隆才进行下一步的PCR并测序验证。

根据上述方法，对破伤风杆菌编码TeNT基因组进行改造，插入不同形式的抗原表达盒，可以得到表达各种形式抗原的突变菌株，但是表达量上有差异。如下：

菌株I:突变天然破伤风杆菌的基因组，使其表达TeNT(RY)，达到生产无毒破伤风抗原，后续不需要甲醛灭活工艺；

菌株II:在菌株I中的基因组的位点3886位置再插入一份 TeNT(RY)表达盒。该株有两个TeNT(RY)表达盒。

菌株III：在菌株I中的基因组上位点3886和位点12173分别插入一份TeNT(RY)表达盒。该株有三个TeNT(RY)表达盒。

菌株IV：将LN+TTC的DNA片段替换破伤风类毒素的编码区，该株有一个LN+TTC表达盒。

菌株V：在菌株IV的基因组上位点3886再插入一份LN+TTC 表达盒。该株有两个LN+TTC表达盒。

菌株VI:在菌株IV的基因组上位点3886和位点12173分别插入一份LN+TTC表达盒。该株有三个LN+TTC表达盒。

菌株VII:将2TTC的DNA片段替换破伤风类毒素的编码区，该株有一个2TTC表达盒。

菌株VIII：在菌株VII中破伤风的基因组的位点3886，插入一个2TTC表达盒。该株有两个2TTC表达盒。

菌株VX：在菌株VII中破伤风的基因组的位点3886和位点 12173，分别插入一个2TTC表达盒。该株有三个2TTC表达盒。

通过对这些菌株诱导表达，菌株I-III的表达量高低顺序为： II>III>I，II的表达量比I高50％，可达3mg/L；菌株IV-VI的表达量V>VI>IV，菌株V的表达量比IV高30％，可达2.5mg/L；菌株VII-VX 的表达量高低顺序为：VX>VII>VIII，菌株VX的表达量比VIII高120％，可达5mg/L.采取类毒素絮状法测定活性，II、VX和V的表达产物的活性依次45Lf/ml、60Lf/ml和80Lf/ml。将这些产物经过纯化后，采用免疫小鼠的方法确定小鼠可以耐受40ug/只，持续时间长达3周不死。2TTC和LN+2TTC所产生的中和抗体效价比外购破伤风类毒素分别高15％和40％。

总之，本发明的优势在于：①通过对破伤风杆菌的基因组改造，在破伤风杆菌体内表达突变的破伤风类毒素TeNT(RY)或一部分的串联体(LN+TTC和2TTC)，所表达的抗原无毒，小鼠可以耐受40ug 的抗原在5日内不致死，远低于WHO确定的2.5ng/kg致死剂量，消除了目前生产上甲醛灭活工艺和毒性逆转的可能性。②对破伤风杆菌进行基因组改造，抗原仍采用破伤风杆菌自身的系统来表达，因此表达产物具有高于用其他表达体系的表达产物活性免疫性高。③借助基因组编辑技术，采用I-SceI在基因组上无抗生素的基因编辑，同时可以反复操作进行多位点整合表达盒，明显提高目的蛋白的表达量。可见，这些优点可以为生产简化生产流程，降低生产成本，极大地提高破伤风疫苗的生产水平。

实施例3

突变菌株的诱导表达

(1)突变的破伤风菌株的培养和发酵

将实施例2得到的突变菌株接种至种子培养基，调整pH值到7.0，在培养箱中37℃静置密闭培养1d。次日，按照10％的接种比例将其转接至5L发酵罐中，调整pH到7.0，恒温35℃，转速100r/min 进行培养，培养5d。

其中，种子培养基配方为蛋白胨40g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖 10g/L，NaAC 5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NaH₂PO₄ 1g/L，胱氨酸0.13g/L， ZnSO₄ 16.5mg/L，MgSO₄ 0.13g/L。将上述各组分用纯化水充分溶解后调整pH到7.5～7.6，经116℃，20min高压蒸汽灭菌，降温至37℃后进行无菌接种。

(2)采取疏水柱结合阴离子柱纯化

第一步疏水柱纯化(HIC):Phenyl Bestarose 6Fast Flow(上海博格隆)凝胶被用于简易装柱，用0.5M(NH4)2SO4，3M NaCl，0.02 M磷酸盐缓冲液(pH 7.6)平衡柱子。样品用0.5M(NH4)2SO4，3M NaCl，0.02M磷酸盐缓冲液(pH 7.6)稀释；按每毫升填料载量10 mg/mL上样，上样后用0.5M(NH4)2SO4 3M NaCl，0.02M磷酸盐缓冲液(pH 7.6)洗涤柱子，最后用0.02M Na磷酸盐缓冲液(pH 7.6) 缓冲液洗脱样品。

第二步阴离子(DEAE)柱纯化Bestarose Diamond DEAE(上海博格隆)凝胶被用于简易装柱，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5) 平衡装填好的DEAE柱，按每毫升填料载量10mg/mL上样，在280 nm波长检测蛋白吸收。以含80mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液 (pH7.5)进行洗脱，收集洗脱峰。

将纯化好的蛋白，用BCA试剂盒(上海生工)测定其含量，结果显示：菌株I-III的表达量高低顺序为：II>III>I，II的表达量比I 高50％，可达3mg/L；菌株IV-VI的表达量高低顺序为：V>VI>IV，菌株V的表达量比IV高30％，可达2.5mg/L；菌株VII-VX的表达量高低顺序为：VX>VII>VIII，菌株VX的表达量比VIII高120％，可达5mg/L。

(3)吸附破伤风疫苗效价测定和抗原毒性确定

(i)抗原毒性测定

依据参考文献[Mehdi Yousefi,Vahid Younesi,Ali Ahmad Bayat, FarhadJadidi-Niaragh,Ebrahim Abbasi,Alireza Razavi,Roya Khosravi-Eghbal,HosseinAsgarin-Omran,and Fazel Shokri Comparative human and mouse antibody responsesagainst tetanus toxin at clonal level J Immunotoxicol 2015,13(2):1]，将在大肠杆菌和破伤风杆菌内所表达的TeNT、2TTC和LN+TTC蛋白，按照每只小鼠给与5μg、10μg、20μg和40μg的剂量，腹腔注射10只，同时以脱毒的TeNT作为对照，观察5天并记录小鼠的死亡状况。实验结果表明， 5日内无小鼠死亡，进一步低，每10天注射40ug/只，持续注射3次，均无小鼠死亡。

(ii)吸附破伤风疫苗效价测定

参考中国药典2015版第三部通则3504，将在大肠杆菌和破伤风杆菌内所表达的TeNT、2TTC和LN+TTC蛋白作为供试品，用每一稀释度的破伤风类毒素标准品和供试品溶液分别免疫体重14～16g 同性别或雌雄各半NIH小鼠14只，每只小鼠皮下注射0.5ml。另外 10只未注射的小鼠作为对照。攻击用破伤风毒素使用0.2％明胶磷酸盐缓冲液稀释。免疫4周后，每只免疫小鼠皮下注射50LD5。破伤风毒素0.5ml。对照组每只小鼠皮下注射1LD5。破伤风毒素0.5ml。攻击后观察5天，每日记录结果。根据第5天存活率的剂量反应曲线，用平行线法计算结果。效价见表2。

表2表达的TeNT(RY)、2TTC和LN+TTC的中和效价测定结果

综上，上述实施例的结果显示菌株II、V和VX的表达量明显提高，采取类毒素絮状法测定活性，活性依次45Lf/ml、60Lf/ml和80 Lf/ml。将这些产物经过纯化后，采用免疫小鼠的方法确定小鼠可以耐受40μg/只，且能产生保护作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

<120> 一种制备高活性无毒破伤风类毒素的方法以及破伤风疫苗

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3948

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgccaataa ccataaataa ttttagatat agtgatcctg ttaataatga tacaattatt 60

atgatggagc caccatactg taagggtcta gatatctatt ataaggcttt caaaataaca 120

gatcgtattt ggatagtgcc ggaaaggtat gaatttggga caaaacctga agattttaac 180

ccaccatctt cattaataga aggtgcatct gagtattacg atccaaatta tttaaggact 240

gattctgata aagatagatt tttacaaacc atggtaaaac tgtttaacag aattaaaaac 300

aatgtagcag gtgaagcctt attagataag ataataaatg ccatacctta ccttggaaat 360

tcatattcct tactagacaa gtttgataca aactctaatt cagtatcttt taatttatta 420

gaacaagacc ccagtggagc aactacaaaa tcagcaatgc tgacaaattt aataatattt 480

ggacctgggc ctgttttaaa taaaaatgag gttagaggta ttgtattgag ggtagataat 540

aaaaattact tcccatgtag agatggtttt ggctcaataa tgcaaatggc attttgccca 600

gaatatgtac ctacctttga taatgtaata gaaaatatta cgtcactcac tattggcaaa 660

agcaaatatt ttcaagatcc agcattacta ttaatgcacg aacttataca tgtactacat 720

ggtttatacg gaatgcaggt atcaagccat gaaattattc catccaaaca agaaatttat 780

atgcagcata catatccaat aagtgctgaa gaactattca cttttggcgg acaggatgct 840

aatcttataa gtattgatat aaaaaacgat ttatatgaaa aaactttaaa tgattataaa 900

gctatagcta acaaacttag tcaagtcact agctgcaatg atcccaacat tgatattgat 960

agctacaaac aaatatatca acaaaaatat caattcgata aagatagcaa tggacaatat 1020

attgtaaatg aggataaatt tcagatacta tataatagca taatgtatgg ttttacagag 1080

attgaattgg gaaaaaaatt taatataaaa actagacttt cttattttag tatgaatcat 1140

gaccctgtaa aaattccaaa tttattagat gatacaattt acaatgatac agaaggattt 1200

aatatagaaa gcaaagatct gaaatctgaa tataaaggac aaaatatgag ggtaaataca 1260

aatgctttta gaaatgttga tggatcaggc ctagtttcaa aacttattgg cttatgtaaa 1320

aaaattatac caccaacaaa tataagagaa aatttatata atagaactgc atcattaaca 1380

gatttaggag gagaattatg tataaaaatt aaaaatgaag atttaacttt tatagctgaa 1440

aaaaatagct tttcagaaga accatttcaa gatgaaatag ttagttataa tacaaaaaat 1500

aaaccattaa attttaatta ttcgctagat aaaattattg tagattataa tctacaaagt 1560

aaaattacat tacctaatga taggacaacc ccagttacaa aaggaattcc atatgctcca 1620

gaatataaaa gtaatgctgc aagtacaata gaaatacata atattgatga caatacaata 1680

tatcaatatt tgtatgctca aaaatctcct acaactctac aaagaataac tatgactaat 1740

tctgttgatg acgcattaat aaattccacc aaaatatatt catattttcc atctgtaatc 1800

agtaaagtta accaaggtgc acaaggaatt ttattcttac agtgggtgag agatataatt 1860

gatgatttta ccaatgaatc ttcacaaaaa actactattg ataaaatttc agatgtatcc 1920

actattgttc cttatatagg acccgcatta aacattgtaa aacaaggcta tgagggaaac 1980

tttataggcg ctttagaaac taccggagtg gttttattat tagaatatat tccagaaatt 2040

actttaccag taattgcagc tttatctata gcagaaagta gcacacaaaa agaaaagata 2100

ataaaaacaa tagataactt tttagaaaaa agatatgaaa aatggattga agtatataaa 2160

ctagtaaaag caaaatggtt aggcacagtt aatacgcaat tccaaaaaag aagttatcaa 2220

atgtatagat ctttagaata tcaagtagat gcaataaaaa aaataataga ctatgaatat 2280

aaaatatatt caggacctga taaggaacaa attgccgacg aaattaataa tctgaaaaac 2340

aaacttgaag aaaaggctaa taaagcaatg ataaacataa atatatttat gagggaaagt 2400

tctagatcat ttttagttaa tcaaatgatt aacgaagcta aaaagcagtt attagagttt 2460

gatactcaaa gcaaaaatat tttaatgcag tatataaaag caaattctaa atttataggt 2520

ataactgaac taaaaaaatt agaatcaaaa ataaacaaag ttttttcaac accaattcca 2580

ttttcttatt ctaaaaatct ggattgttgg gttgataatg aagaagatat agatgttata 2640

ttaaaaaaga gtacaatttt aaatttagat attaataatg atattatatc agatatatct 2700

gggtttaatt catctgtaat aacatatcca gatgctcaat tggtgcccgg aataaatggc 2760

aaagcaatac atttagtaaa caatgaatct tctgaagtta tagtgcataa agctatggat 2820

attgaatata atgatatgtt taataatttt accgttagct tttggttgag ggttcctaaa 2880

gtatctgcta gtcatttaga acaatatggc acaaatgagt attcaataat tagctctatg 2940

aaaaaacata gtctatcaat aggatctggt tggagtgtat cacttaaagg taataactta 3000

atatggactt taaaagattc cgcgggagaa gttagacaaa taacttttag ggatttacct 3060

gataaattta atgcttattt agcaaataaa tgggttttta taactattac taatgataga 3120

ttatcttctg ctaatttgta tataaatgga gtacttatgg gaagtgcaga aattactggt 3180

ttaggagcta ttagagagga taataatata acattaaaac tagatagatg taataataat 3240

aatcaatacg tttctattga taaatttagg atattttgca aagcattaaa tccaaaagag 3300

attgaaaaat tatacacaag ttatttatct ataacctttt taagagactt ctggggaaac 3360

cctttacgat atgatacaga atattattta ataccagtag cttctagttc taaagatgtt 3420

caattgaaaa atataacaga ttatatgtat ttgacaaatg cgccatcgta tactaacgga 3480

aaattgaata tatattatag aaggttatat aatggactaa aatttattat aaaaagatat 3540

acacctaata atgaaataga ttcttttgtt aaatcaggtg attttattaa attatatgta 3600

tcatataaca ataatgagca cattgtaggt tatccgaaag atggaaatgc ctttaataat 3660

cttgatagaa ttctaagagt aggttataat gccccaggta tccctcttta taaaaaaatg 3720

gaagcagtaa aattgcgtga tttaaaaacc tattctgtac aacttaaatt atatgatgat 3780

aaaaatgcat ctttaggact agtaggtacc cataatggtc aaataggcaa cgatccaaat 3840

agggatatat taattgcaag caactggtac tttaatcatt taaaagataa aattttagga 3900

tgtgattggt actttgtacc tacagatgaa ggatggacaa atgattaa 3948

<210> 2

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgccaataa ccataaataa ttttagatat agtgatcctg ttaataatga tacaattatt 60

atgatggagc caccatactg taagggtcta gatatctatt ataaggcttt caaaataaca 120

gatcgtattt ggatagtgcc ggaaaggtat gaatttggga caaaacctga agattttaac 180

ccaccatctt cattaataga aggtgcatct gagtattacg atccaaatta tttaaggact 240

gattctgata aagatagatt tttacaaacc atggtaaaac tgtttaacag aattaaaaac 300

aatgtagcag gtgaagcctt attagataag ataataaatg ccatacctta ccttggaaat 360

tcatattcct tactagacaa gtttgataca aactctaatt cagtatcttt taatttatta 420

gaacaagacc ccagtggagc aactacaaaa tcagcaatgc tgacaaattt aataatattt 480

ggacctgggc ctgttttaaa taaaaatgag gttagaggta ttgtattgag ggtagataat 540

aaaaattact tcccatgtag agatggtttt ggctcaataa tgcaaatggc attttgccca 600

gaatatgtac ctacctttga taatgtaata gaaaatatta cgtcactcac tattggcaaa 660

agcaaatatt ttcaagatcc agcattacta ttaatgcacg aacttataca tgtactacat 720

ggtttatacg gaatgcaggt atcaagccat gaaattattc catccaaaca agaaatttat 780

atgcagcata catatccaat aagtgctgaa gaactattca cttttggcgg acaggatgct 840

aatcttataa gtattgatat aaaaaacgat ttatatgaaa aaactttaaa tgattataaa 900

gctatagcta acaaacttag tcaagtcact agctgcaatg atcccaacat tgatattgat 960

agctacaaac aaatatatca acaaaaatat caattcgata aagatagcaa tggacaatat 1020

attgtaaatg aggataaatt tcagatacta tataatagca taatgtatgg ttttacagag 1080

attgaattgg gaaaaaaatt taatataaaa actagacttt cttattttag tatgaatcat 1140

gaccctgtaa aaattccaaa tttattagat gatacaattt acaatgatac agaaggattt 1200

aatatagaaa gcaaagatct gaaatctgaa tataaaggac aaaatatgag ggtaaataca 1260

aatgctttta gaaatgttga tggatcaggc ctagtttcaa aacttattgg cttatgtaaa 1320

aaaattatac caccaacaaa tataagagaa aatttatata ataga 1365

<210> 3

<211> 2582

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcatcatt aacagattta ggaggagaat tatgtataaa aattaaaaat gaagatttaa 60

cttttatagc tgaaaaaaat agcttttcag aagaaccatt tcaagatgaa atagttagtt 120

ataatacaaa aaataaacca ttaaatttta attattcgct agataaaatt attgtagatt 180

ataatctaca aagtaaaatt acattaccta atgataggac aaccccagtt acaaaaggaa 240

ttccatatgc tccagaatat aaaagtaatg ctgcaagtac aatagaaata cataatattg 300

atgacaatac aatatatcaa tatttgtatg ctcaaaaatc tcctacaact ctacaaagaa 360

taactatgac taattctgtt gatgacgcat taataaattc caccaaaata tattcatatt 420

ttccatctgt aatcagtaaa gttaaccaag gtgcacaagg aattttattc ttacagtggg 480

tgagagatat aattgatgat tttaccaatg aatcttcaca aaaaactact attgataaaa 540

tttcagatgt atccactatt gttccttata taggacccgc attaaacatt gtaaaacaag 600

gctatgaggg aaactttata ggcgctttag aaactaccgg agtggtttta ttattagaat 660

atattccaga aattacttta ccagtaattg cagctttatc tatagcagaa agtagcacac 720

aaaaagaaaa gataataaaa acaatagata actttttaga aaaaagatat gaaaaatgga 780

ttgaagtata taaactagta aaagcaaaat ggttaggcac agttaatacg caattccaaa 840

aaagaagtta tcaaatgtat agatctttag aatatcaagt agatgcaata aaaaaaataa 900

tagactatga atataaaata tattcaggac ctgataagga acaaattgcc gacgaaatta 960

ataatctgaa aaacaaactt gaagaaaagg ctaataaagc aatgataaac ataaatatat 1020

ttatgaggga aagttctaga tcatttttag ttaatcaaat gattaacgaa gctaaaaagc 1080

agttattaga gtttgatact caaagcaaaa atattttaat gcagtatata aaagcaaatt 1140

ctaaatttat aggtataact gaactaaaaa aattagaatc aaaaataaac aaagtttttt 1200

caacaccaat tccattttct tattctaaaa atctggattg ttgggttgat aatgaagaag 1260

atatagatgt tatattaaaa aagagtacaa ttttaaattt agatattaat aatgatatta 1320

tatcagatat atctgggttt aattcatctg taataacata tccagatgct caattggtgc 1380

ccggaataaa tggcaaagca atacatttag taaacaatga atcttctgaa gttatagtgc 1440

ataaagctat ggatattgaa tataatgata tgtttaataa ttttaccgtt agcttttggt 1500

tgagggttcc taaagtatct gctagtcatt tagaacaata tggcacaaat gagtattcaa 1560

taattagctc tatgaaaaaa catagtctat caataggatc tggttggagt gtatcactta 1620

aaggtaataa cttaatatgg actttaaaag attccgcggg agaagttaga caaataactt 1680

ttagggattt acctgataaa tttaatgctt atttagcaaa taaatgggtt tttataacta 1740

ttactaatga tagattatct tctgctaatt tgtatataaa tggagtactt atgggaagtg 1800

cagaaattac tggtttagga gctattagag aggataataa tataacatta aaactagata 1860

gatgtaataa taataatcaa tacgtttcta ttgataaatt taggatattt tgcaaagcat 1920

taaatccaaa agagattgaa aaattataca caagttattt atctataacc tttttaagag 1980

acttctgggg aaacccttta cgatatgata cagaatatta tttaatacca gtagcttcta 2040

gttctaaaga tgttcaattg aaaaatataa cagattatat gtatttgaca aatgcgccat 2100

cgtatactaa cggaaaattg aatatatatt atagaaggtt atataatgga ctaaaattta 2160

ttataaaaag atatacacct aataatgaaa tagattcttt tgttaaatca ggtgatttta 2220

ttaaattata tgtatcatat aacaataatg agcacattgt aggttatccg aaagatggaa 2280

atgcctttaa taatcttgat agaattctaa gagtaggtta taatgcccca ggtatccctc 2340

tttataaaaa aatggaagca gtaaaattgc gtgatttaaa aacctattct gtacaactta 2400

aattatatga tgataaaaat gcatctttag gactagtagg tacccataat ggtcaaatag 2460

gcaacgatcc aaatagggat atattaattg caagcaactg gtactttaat catttaaaag 2520

ataaaatttt aggatgtgat tggtactttg tacctacaga tgaaggatgg acaaatgatt 2580

aa 2582

<210> 4

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatctggatt gttgggttga taatgaagaa gatatagatg ttatattaaa aaagagtaca 60

attttaaatt tagatattaa taatgatatt atatcagata tatctgggtt taattcatct 120

gtaataacat atccagatgc tcaattggtg cccggaataa atggcaaagc aatacattta 180

gtaaacaatg aatcttctga agttatagtg cataaagcta tggatattga atataatgat 240

atgtttaata attttaccgt tagcttttgg ttgagggttc ctaaagtatc tgctagtcat 300

ttagaacaat atggcacaaa tgagtattca ataattagct ctatgaaaaa acatagtcta 360

tcaataggat ctggttggag tgtatcactt aaaggtaata acttaatatg gactttaaaa 420

gattccgcgg gagaagttag acaaataact tttagggatt tacctgataa atttaatgct 480

tatttagcaa ataaatgggt ttttataact attactaatg atagattatc ttctgctaat 540

ttgtatataa atggagtact tatgggaagt gcagaaatta ctggtttagg agctattaga 600

gaggataata atataacatt aaaactagat agatgtaata ataataatca atacgtttct 660

attgataaat ttaggatatt ttgcaaagca ttaaatccaa aagagattga aaaattatac 720

acaagttatt tatctataac ctttttaaga gacttctggg gaaacccttt acgatatgat 780

acagaatatt atttaatacc agtagcttct agttctaaag atgttcaatt gaaaaatata 840

acagattata tgtatttgac aaatgcgcca tcgtatacta acggaaaatt gaatatatat 900

tatagaaggt tatataatgg actaaaattt attataaaaa gatatacacc taataatgaa 960

atagattctt ttgttaaatc aggtgatttt attaaattat atgtatcata taacaataat 1020

gagcacattg taggttatcc gaaagatgga aatgccttta ataatcttga tagaattcta 1080

agagtaggtt ataatgcccc aggtatccct ctttataaaa aaatggaagc agtaaaattg 1140

cgtgatttaa aaacctattc tgtacaactt aaattatatg atgataaaaa tgcatcttta 1200

ggactagtag gtacccataa tggtcaaata ggcaacgatc caaataggga tatattaatt 1260

gcaagcaact ggtactttaa tcatttaaaa gataaaattt taggatgtga ttggtacttt 1320

gtacctacag atgaaggatg gacaaatgat taa 1353

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgggggcg gttcc 15

<210> 6

<211> 703

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcatcaaa aaaaccaggt aatgaacctg ggtccgaact ctaaactgct gaaagaatac 60

aaatcccagc tgatcgaact gaacatcgaa cagttcgaag caggtatcgg tctgatcctg 120

ggtgatgctt acatccgttc tcgtgatgaa ggtaaaacct actgtatgca gttcgagtgg 180

aaaaacaaag catacatgga ccacgtatgt ctgctgtacg atcagtgggt actgtccccg 240

ccgcacaaaa aagaacgtgt taaccacctg ggtaacctgg taatcacctg gggcgcccag 300

actttcaaac accaagcttt caacaaactg gctaacctgt tcatcgttaa caacaaaaaa 360

accatcccga acaacctggt tgaaaactac ctgaccccga tgtctctggc atactggttc 420

atggatgatg gtggtaaatg ggattacaac aaaaactcta ccaacaaatc gatcgtactg 480

aacacccagt ctttcacttt cgaagaagta gaatacctgg ttaagggtct gcgtaacaaa 540

ttccaactga actgttacgt aaaaatcaac aaaaacaaac cgatcatcta catcgattct 600

atgtcttacc tgatcttcta caacctgatc aaaccgtacc tgatcccgca gatgatgtac 660

aaactgccga acactatctc ctccgaaact ttcctgaaat aat 703

Claims (10)

1.一种制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，其包括：将用以表达无毒破伤风类毒素或片段串联体的表达盒插入至破伤风杆菌基因组或大肠杆菌基因组；

其中，所述无毒破伤风类毒素或片段串联体的形式选自TeNT(RY)、LN+TTC和2TTC中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，LN+TTC和2TTC的接头序列各自独立地选自如下序列中的至少一种：

PAPAP、(GGGGS)n、(XP)n、(EAAK)n和(EAAKA)n；其中n为的1-10的任意一自然数。

3.根据权利要求1所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，将含有所述表达盒的质粒转染所述破伤风杆菌以使所述表达盒插入至所述破伤风杆菌基因组中；

其中，所述质粒还具有如下元件中的至少一种：

I-SceI酶表达盒、I-SceI酶识别位点、目标插入位点的上游同源序列和目标插入位点的下游同源序列。

4.根据权利要求3所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，所述目标插入位点位于所述破伤风杆菌的假基因区域。

5.根据权利要求4所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，所述假基因位于所述破伤风杆菌基因组如下区域：第3886至4870之间的序列区域或第12173至12872之间的序列区域。

6.根据权利要求3所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，I-SceI酶表达盒中的驱动I-SceI酶表达的启动子为持续性驱动表达启动子或诱导性驱动表达启动子；

优选的，所述持续性驱动表达启动子为ptb启动子或Thi启动子；

优选的，所述诱导性驱动表达启动子选自木糖诱导型启动子、乳糖诱导型启动子、radiation诱导型启动子、昆布二糖诱导型启动子和树胶醛糖诱导型启动子中的至少一种。

7.根据权利要求1-6任一项所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，所述破伤风杆菌选自如下菌株中的一种：Harvard E88、Harvard C2、Harvard strain A2、Harvard CN655、ATCC19406、ATCC9441、ATCC453、ATC454和CMCC64008。

8.根据权利要求1-6任一项所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，所述毒破伤风类毒素的形式为TeNT(RY)，插入至所述破伤风杆菌基因组上的所述表达盒的数量为2个。

9.根据权利要求1-6任一项所述的制备高活性无毒破伤风类毒素或片段串联体的方法，其特征在于，所述无毒破伤风类毒素或片段串联体的形式为LN+TTC，插入至所述破伤风杆菌基因组上的所述表达盒的数量为2个；

或者，所述毒破伤风类毒或片段串联体素的形式为2TTC，插入至所述破伤风杆菌基因组上的所述表达盒的数量为3个。

10.一种破伤风疫苗，其特征在于，其含有无毒破伤风类毒素或片段串联体，所述无毒破伤风类毒素或片段串联体的形式为TeNT(RY)、LN+TTC或2TTC。