MXPA06013984A - Proteinas quimericas aisladas de lumazina sintetasa modificada. - Google Patents

Abstract

Proteinas quimericas conteniendo diez copias de peptidos, polipeptidos o dominios proteicos insertados en los extremos amino terminales de la enzima lumazina sintetasa de Brucella spp. Las secuencias aisladas de nucleotidos que codifican las proteinas quimericas. Los vectores, plasmidos y celulas transformadas utilizados para expresar dichas proteinas quimericas. Los anticuerpos monoclonales y policlonales inducidos por las proteinas quimericas. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales. Las vacunas y composiciones farmaceuticas que contienen las proteinas quimericas, secuencias de nucleotidos y anticuerpos. Un metodo para inducir respuesta inmune en organismos superiores que incluye la administracion de cantidades efectivas de las vacunas y composiciones farmaceuticas. Biosensores que incluyen las proteinas quimericas. Conjugados proteicos conformados por las proteinas quimericas y un ligando unidos mediante enlaces covalentes y no covalentes. Los usos de las proteinas quimericas, secuencias de nucleotidos, vectores, plasmidos, celulas transformadas, anticuerpos, hibridomas, conjugados, biosensores, vacunas y composiciones farmaceuticas. La estructura cuaternaria de las proteinas quimericas.

Description

PROTEÍNAS QUIMÉRICAS AISLADAS DE LUMAZINA SINTETASA MODIFICADA Descripción Técnica de la Invención Proteínas quiméricas aisladas que incluyen hasta diez copias de péptidos, polipéptidos o dominios proteicos insertados en los extremos amino terminales de la enzima lumazina sintetasa de Brucella spp. Secuencias aisladas de nucleótidos que codifican para dichas proteínas quiméricas. Vectores, plásmidos y células transformadas utilizados para expresar las proteínas quiméricas. Anticuefos monoclonales y policlonales inducidos por las proteínas quiméricas. Hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales. Vacunas y composiciones farmacéuticas que incluyen las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos y anticuerpos. Un método para inducir una respuesta inmune en organismos superiores que incluye vía administración de cantidades efectivas de las vacunas y composiciones farmacéuticas. Biosensores que incluyen las proteínas quiméricas. Conjugados proteicos formados por las proteínas quiméricas y un ligando unidos mediante enlaces covalentes y no covalentes. Usos de las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos, vectores, plásmidos, células transformadas, anticuefos, hibridomas, conjugados, biosensores, vacunas y composiciones farmacéuticas. La estructura cuaternaria de las proteínas quiméricas. Campo Técnico de la Invención La presente invención se refiere a proteínas quiméricas formadas por proteínas modificadas derivadas de la enzima Lumazina sintetasa de Brucella spp., conectadas a péptidos, polipéptidos o dominios proteicos. Las proteínas quiméricas son útiles para la inducción de respuesta inmune en animales superiores y para otros propósitos. La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que incluyen antígenos o anticuerpos, o segmentos de antígenos o anticuerpos, unidos a la proteína modificada.

Antecedentes de la Invención La aplicación masiva de vacunas atenuadas vivas ofrece varios inconvenientes económicos y sanitarios. Por ejemplo, cabe mencionar que la atenuación disminuye la inmunogenicidad de las mismas. Ver Leclerc, et al, Immunol. Today, /P( :300-302, (1998); Nieba, et al, Mod. Asp. Immunobiol, 70:36-39 (2000). Otro inconveniente es la posibilidad de que la atenuación se revierta y que el microorganismo recupere sus propiedades de inducción de la enfermedad. Ver Redfield, N., N Eng. J. Med., 316:673-678 (1998). Es por ello que en los últimos años se ha tendido a formular vacunas acelulares, basadas en componentes individuales aislados de bacterias o virus. En general, estos componentes individuales, como proteínas características del microorganismo, poseen baja inmunogenicidad. Esta limitación puede superarse mediante el uso de sustancias adyuvantes. Sin embargo, existen proteínas que aún en presencia de sustancias adyuvantes continúan mostrando baja inmunogenicidad. Varias estrategias de ingeniería de proteínas han sido propuestas para superar estas dificultades. Ver Leclerc, et al, Immunol Today, 19(7) .300-302 (1998). Las proteínas de cápside virales tienen la propiedad de formar partículas ordenadas tridimensionalmente, las llamadas '''partículas tipo virus". Estas partículas tiene el mismo tamaño y forma que los virus enteros. Sin embargo, se encuentran vacías en su interior, sin el material genético, y por lo tanto, sin el riesgo de producir infección. Su gran tamaño y orden les otorga una marcada inmunogenicidad. Ver Bachmann, et al, Science, 262. 1448-1451 (1993). La vacuna recombinante contra la hepatitis B, de amplia aceptación en el mercado, se fundamenta en este concepto. Las "partículas tipo virus" han sido utilizadas como vehículo para la inserción de péptidos característicos de ciertos patógenos con el objeto de producir vacunas contra dichos microorganismos patogénicos. Ver WO0032227 (Renner, et al); WO0185208 (Bachmann, et al). Una estrategia favorita ha sido la inserción de copias múltiples de un péptido en un vehículo muy inmunogénico de por sí, a fin de proveer al péptido de carácter adyuvante. Sin embargo, este acercamiento ha encontrado muchas dificultades: el gran tamaño de estas partículas hace que cualquier inserción de un péptido en su proteína componente haga muy dificultoso el correcto plegamiento de la misma, y en muchos casos disminuya su estabilidad. Además, son pocos los sitios de la proteína que son capaces de aceptar inserciones de péptidos sin cambiar su estructura general. Ver Nieba, et al. Mod. Asp. Immunobiol, 1 :36-39 (2000). Algunas proteínas bacterianas han sido postuladas como vehículos para el desarrollo de vacunas quiméricas. Ver Leclerc, et al, Immunol Today, 790:300-302 (1998). La subunidad B de la toxina colérica es una proteína pentamérica estable. Esta proteína ha sido utilizada para obtener respuesta inmune de mucosas contra péptidos insertados debido a su capacidad para penetrar por la mucosa gástrica. Ver Arakawa, et al. Nature Biotech., 76:934-938 (1998). La enzima dihidrolipoil deshidrogenasa de Bacillus steearothermophilus forma una estructura polimérica compleja, muy estable, por lo que también ha sido postulada como vehículo proteico. Ver Domingo, et al, J. Mol. Biol., 305:259-267 (2001); WO0142439 (Domingo, et al). La enzima lumazina sintetasa cataliza el anteúltimo paso en la vía biosintética de la riboflavina. Ver Goldbaum, et al, J. Med. Microbiol., 48:%33-%39 (1999). Su sitio activo se encuentra en la interfase entre monómeros, haciendo que esta proteína adquiera ordenamientos poliméricos muy estables. Ver Ritsert, et al. J. Mol. Biol, 253:151-167 (1995). Estos ordenamientos varían entre proteínas que forman partículas pentaméricas e icosahédricas. Ver Braden, et al, J. Mol. Biol., 297: 1031-1036 (2000). La estructura icosahédrica de la lumazina sintetasa de B. subtilis ha sido propuesta como vehículo para la inserción de péptidos y el desarrollo de vacunas. Ver WO0053229 (Bacher, et al). La lumazina sintetasa de Brucella spp. es una proteína altamente estable. Se ha demostrado que esta proteína de 18 kDa es un marcador útil para el diagnóstico serológico de brucelosis humana y animal. Ver Goldbaum, et al, J. Clin. Microbiol., 50:604-607 (1992); Goldbaum, et al, J. Clin. Microbiol., 57:2141-2145 (1993); Baldi, et al, Clin. Diag. Lab. Immunol, 3 (4)?72- 76 (1996). La proteína expresada en forma recombinante muestra el mismo plegamiento que la proteína nativa, según estudios inmunoquímicos, de función enzimática y de estructura tridimensional por cristalografía de rayos X. Ver Braden, et al. J. Mol. Biol., 297: 1031-1036 (2000); Goldbaum, et al, J. Med. Microbiol., 45:833-839 (1999); Goldbaum, et al, J. Struct. Biol., 725:175-178 (1998). La estructura muestra que esta proteína de 18 kDa se comporta en solución como un decámero de 180 kDa. Ver Zylberman, et al, J. Biol. Chem., 2790:8093-8101 (2004), constituyéndose en un nuevo tipo de rearreglo cuaternario de lumazina sintetasa. Se ha postulado que la inmunogenicidad de la lumazina sintetasa de Brucella spp. se debe fundamentalmente a su característica polimérica. Ver Baldi, et al, Braz. J. Med. Biol. Res., 55:741-747 (2000). La estructura también muestra que el extremo amino terminal de 10 aminoácidos no participa en el plegamiento general ni en los contactos entre monómeros. Ver Braden, et al. J. Mol. Biol., 297:1031-1036 (2000). La lumazina sintetasa de Brucella spp. es un inmunógeno potente, capaz de producir una alta respuesta inmune humoral y celular en el modelo murino. Esta capacidad ha sido verificada cuando la inmunización es inducida con la proteína recombinante no modificada, y con un plásmido que codifica para la proteína (terapia génica, vacunación con ADN). Ver Velikovsky, et al, J. Immunol Meth., 244(10:1-7 (2000). Es posible modular la respuesta cambiando la vía de inmunización y el adyuvante utilizado. Ver Velikovsky, et al, Infec. Immun., 700:2507-11 (2002). En particular, es posible generar una fuerte respuesta de tipo THI , que sería la respuesta de mayor capacidad protectora en brucelosis. Ver Velikovsky, et al. Infec. Immun., 700:2507-11 (2002). Sin embargo, persiste todavía en el arte la necesidad de nuevos vehículos con estructuras estables más pequeñas que sean útiles para la presentación de péptidos, polipéptido y proteínas, en general, y de antígenos o agentes inductores de respuesta inmune, en particular. El desarrollo y uso de la estructura decamérica de la lumazina sintetasa como un vector de este tipo no han sido descritos en el arte.

Depósito de Microorganismos El plásmido pBLS-OMP31 fue depositado el 1 de abril de 2004, bajo el número de acceso DSM 15546 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg IB, D-38124 Braunschweig, República Federal Alemana.

Diagramas La Fig. 1 muestra la secuencia nucleotídica y de aminoácidos del extremo 5' del gen de la BLS clonado en el vector de expresión pETl la (Novagen, USA) y el cassette generado. La sección en negritas muestra la región codificante. La sección en rojo muestra las bases mutadas en el cassette. La sección resaltada en amarillo muestra los nuevos sitios de restricción. La Fig. 2 muestra los oligonucleótidos utilizados para generar la quimera BLS-OMP31. El apareo de los mismos produce la aparición de sitios cohesivos correspondientes a las enzimas de restricción Nsil (extremo 5') y AflII (extremo 3'), ubicándose entre ellos la secuencia de 27 aminoácidos insertada en la quimera (abajo, en negrita). Se muestra también el peso molecular teórico del monómero de proteína resultante (19.977,5 Daltons) y el punto isoeléctrico teórico (pl = 6,00) del péptido insertado. La Fig. 3 muestra: a) el esquema del plásmido pETl la conteniendo la secuencia de la quimera BLS-OMP31, mostrando los sitios de restricción utilizados en el clonado, b) la secuencia nucleotídica completa del plásmido pETl la conteniendo la quimera BLS-OMP31 y c) el marco abierto de lectura de la quimera BLS-OMP31. La Fig. 4 describe la expresión de BLS-OMP31 analizada por SDS-PAGE al 17% de acrilamida. PM. Marcadores de Peso Molecular en KiloDaltons, 1: BLS purificada. 2 y 3: Alícuotas de cultivo de expresión de dos clones de BLS-OMP31. Por tratarse de un gel desnaturalizante, la proteína migra como un monómero de 20 KDa. La Fig. 5 describe la expresión de BLS-OMP31 analizada por SDS-PAGE al 17% de acrilamida. 1: Cultivo sin inducir. 2: Cultivo inducido con 1 mM IPTG. 3: Fracción citoplasmática. 4: Fracción de cuefos de inclusión resuspendidos en urea 8M.

La flecha señala las bandas correspondientes a BLS-OMP31. (LMW = marcadores de peso molecular; se indica su peso en kilodaltons). La Fig. 6 muestra el cromatograma correspondiente a la elución de BLS-OMP31 en columna Superdex 200 (Pharmacia, USA). Se numeran los picos analizados luego por gel. Ver Fig. 7. La Fig. 7 muestra los datos de la purificación de BLS-OMP31 analizada por SDS-PAGE al 17% de acrilamida. Los números 1 y 2 corresponden a los picos obtenidos por gradiente de elución de BLS-OMP31 de la columna de Q-Sepharose (Pharmacia, USA). Los números 4 y 5 corresponden con la numeración de los picos en las Fig. 6. (LMW = marcadores de peso molecular; se indica su peso en kilodaltons). La Fig. 8 muestra los espectros de dicroísmo circular de BLS y la quimera BLS-OMP31. Se monitoreó la elipticidad molar de una solución 1 ,0 µM de proteína entre 190 y 260 nm en un espectropolarímetro (Jasco, UK). La Fig. 9 describe un análisis comparativo de la estabilidad de la quimera BLS-OMP31 con respecto a la proteína nativa. Las curvas muestran la sensibilidad al desplegamiento en presencia de concentraciones crecientes del agente químico desnaturalizante clorhidrato de guanidinio, evaluada por la elipticidad desarrollada por la proteína en un espectropolarímetro a 222 nm. La Fig. 10 ilustra la antigenicidad de BLS-OMP31 por ELISA. Se utilizaron masas de 1 µg, 0,25 µg, 0,1 ug y 20 ng de BLS-OMP31 y BLS como antígenos y Mab Anti-BLS (1/1000) y Mab Anti-OMP31 (1/1000) como anticuefos. La Fig. 11 muestra la inmunogenicidad de BLS-OMP31 analizada por ELISA.

Se muestra la reactividad de diluciones 1/100 de sueros de ratones inmunizados con BLS-OMP31 con adyuvante ("AF") o sin adyuvante ("PBS") contra OMP31. Los sueros de cada grupo se ordenaron por reactividad decreciente. Se indica con línea de puntos la reactividad de un suero pre-inmune (control negativo). Un ratón del grupo AF murió antes de la extracción. La Fig. 12 muestra los resultados de una prueba ELISA de titulación de sueros de conejo anti BLS-OMP31. Se ensayó la reactividad de los tres sueros contra OMP31. Se utilizó como suero negativo una dilución 1/100 de un suero de conejo anti BLS-WT. Se ilustra en línea de puntos la reactividad de este suero. La Fig. 13 describe la reactividad del suero de conejo anti BLS-OMP31 (4ta dosis) contra bacteria entera B. melitensis H38 lisa o rugosa. A los valores mostrados se restó la reactividad correspondiente a un suero de conejo anti BLS-WT, el cual se tituló en simultáneo contra ambos antígenos. Los errores corresponden a la suma de errores estándar de la media.

La Fig. 14 ilustra la cinética de anticuefos IgG totales anti-OMP31 en lotes de ratones BALB/c (8 por grupo) inmunizados en 4 ocasiones por vía intramuscular e intradérmica con 100 µg de pCI-BLS-OMP31. Se analizaron los niveles de anticuefos cada 15 días por ELISA. Los valores representan la media de los 8 animales ± D.E. Las flechas indican el momento de la inmunización. Los sueros de los ratones pCI (control) presentaron DO similares o inferiores al "cut-off." La Fig. 15 describe: a) la secuencia de los oligonucleótidos utilizados para obtener la quimera BLS-KETcl, b) las secuencias nucleotídicas completas del plásmido pETl la conteniendo la quimera BLS-KETcl y c) el marco abierto de lectura de la quimera BLS-KETcl y su secuencia de aminoácidos. La Fig. 16 muestra el esquema de la estrategia general para producir quimeras mixtas. La Fig. 17 muestra los resultados de la purificación y análisis de las quimeras mixtas generadas entre las quimeras BLS-OMP31 y BLS-KETcl. A: análisis por cromatografía de intercambio aniónico en columna MonoQ de las quimeras BLS-OMP31 (pico 3) y BLS-KETcl (pico 1) replegadas y de la mezcla estequeométrica de ambas (pico 2). Bl: análisis mediante SDS-PAGE de los picos 1, 2 y 3 obtenidos en la cromatografía de intercambio aniónico. B2: análisis mediante PAGE nativo de las quimeras puras BLS-OMP31 y BLS-KETcl y del pico 2 correspondiente a las quimeras mixtas. La Fig. 18 muestra la inmunogenicidad de la quimera mixta BLS-OMP31- KETcl analizada por ELISA. La reactividad de diluciones 1/100 de sueros de ratones inmunizados con BLS-OMP31-KETcl (barras vacías) contra BLS y contra los péptidos sintéticos OMP31 y KETcl. En barras grises se indica la reactividad de un suero pre-inmune (control negativo) contra los mismos antígenos. La Fig. 19 muestra la proliferación in vitro de esplenocitos inducida por inmunización con BLS-KETcl. Se indica el promedio más 1 desvío estándar de la incoforación de timidina tritiada (en cpm) después de la estimulación in vitro de esplenocitos de ratones previamente inmunizados con el péptido KETcl o BLS-KETcl emulsificados en saponina. * Incremento significativo en cpm con respecto a esplenocitos incubados con medio de cultivo (P < 0,05). La Fig. 20 describe la secuencia nucleotídica y aminoacídica de la quimera BLS-RBD3. En rojo se encuentra representada la secuencia codificante del dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina. La secuencia codificada de BLS truncada en los primeros 8 residuos de su extremo amino Terminal se muestra en negrita. La Fig. 21 muestra la estructura de la quimera BLS-RBD3 (panel A: vista lateral, panel B: vista superior). La estructura fue modelada con el programa MacroModel fusionando el extremo C-terminal de la estructura teórica del dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina (en gama de azules) con el extremo N-terminal de la estructura cristalográfica de BLS (Protein DataBank file pdb: 1DIO) (en gama de rojos). La estructura teórica del dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina fue construida a través de un modelado por homología con la estructura del dominio RBD3 de la proteína Staufen de Drosophila melanogaster (pdb: 1EKZ). La figura fue construida con el programa CHIMERA. La Fig. 22 muestra: A: la separación de la quimera BLS-RBD3 por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida 15% (P/v), en la calle de la derecha fueron corridos una serie de marcadores de peso molecular (LMW). B: el espectro de dicroísmo circular en el UV lejano de la quimera BLS-RBD3. La figura muestra en forma comparativa el espectro de la quimera medido experimentalmente (línea continua) y su espectro teórico (línea punteada), calculado a partir de la combinación de los espectros correspondientes a la proteína BLS y el dominio RBD3 de la proteína Staufen- 1 murina en forma aislada. La medición fue realizada en un buffer Tris/HCl 50 mM, NaCl 1,2 M, pH 8, a 4°C. C: determinación del peso molecular de la quimera BLS-RBD3 mediante el uso de un detector de dispersión de luz conectado en serie a la salida de una columna de filtración molecular y un detector de índice de refracción (IR). BLS-RBD3 fue corrida en una columna Superdex-200 y eluida con un buffer 50 mM Tris/HCl, urea 3 M, NaCl 1 M, pH 8, a un flujo de 0,5 ml/min. El eluído fue monitoreado a través de la medición de su señal de dispersión de luz a 90 grados (light scattering) y refracción de luz (Rl). El peso molecular de la muestra fue calculado comparando la relación de sus señales de dispersión y refracción de luz, con la de una muestra de seroalbumina bovina (BSA) utilizada como patrón de referencia (peso molecular de BSA: 66,5 kDa). La Fig. 23 muestra la densidad óptica obtenida a 492 nm de la dilución 1/100 de los sueros analizados para cada uno de los ratones de cada grupo experimental. Se muestra como ejemplo representativo el resultado obtenido a los 30 días después de la segunda inmunización. La línea horizontal representa la media de cada grupo. La Fig. 24 muestra los resultados de una prueba ELISA Mab anti-OMP31. La Fig. 25 muestra la detección del anticuefo monoclonal anti-OMP31, AcMo 37F7, utilizando un biosensor formado por derivatización con la proteína quimérica BLS-OMP31. La Fig. 26 muestra la expresión de moléculas coestimulatorias en células dendríticas estimuladas con BLS. Se incubaron células dendríticas derivadas de médula ósea durante 18 hs con BLS (BLS 10 µM) o con medio solo (control). Se muestra la expresión de CD40 en células CD1 lc+ (A) y de I-Ad en CD1 lc+ (B). En cada gráfico se muestran a la izquierda los controles de isotipo. La Fig. 27 muestra la estrategia seguida para formar arreglos moleculares con péptidos heterodiméricos complementarios incoforados en la proteína BLS modificada y un antígeno diana teórico X. Ver Braden, et al., supra. Se utilizó un software de modelado Swisspdbviewer. La Fig. 28 muestra la secuencia de nucleótidos del gen del inserto BLS- RR12EE345L clonado en el vector de expresión pEtl la (Novagen, U.S.A). La sección en letras rojas muestra la región codificante del péptido inserto BLS-RR12EE345L. La sección en negrita muestra la región codificante para la proteína BLS modificada. La Fig. 29 describe las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína de fusión BLS-RR12EE345L. La sección en letras rojas muestra la región codificante del péptido RR12EE345L. La sección en negrita muestra la región codificante para la proteína modificada BLS. La sección en verde muestra la posición del residuo K49 sustituido con serina.

La Fig. 30 muestra la separación de la proteína de fusión BLS-RR12EE345L mediante BLS-PAGE en un gel de poliacrilamida 17%. 1: marcadores de peso molecular, 2: muestra irrelevante, 3: proteína de fusión B S-RR12EE345L. La Fig. 31 muestra la evaluación del peso molecular de la quimera BLS-RR12EE345L mediante el uso de un detector de dispersión de luz (light scattering detector) conectada en serie a la salida de una columna de filtrado molecular y un detector de índice de refracción (IR). Se corrió BLS-RR12EE345L en una columna Superdex-200 y se eluyó con un buffer de Tris/HCl 50 mM, urea 3 M, NaCl 0,1 M, pH 8, a un caudal de 0,5 ml/min. La elución se monitoreó midiendo su señal de dispersión de luz a 90° y refracción de luz (RL). El peso molecular de la muestra fue calculado comparando la relación de sus señales de dispersión de luz y de refracción con aquellas de una muestra de seroalbúmina bovina utilizada como patrón de referencia (peso molecular de BSA: 66,5% kDa). La Fig. 32 muestra la secuencia nucleotídica del gen del péptido inserto RR12EE345L clonado en el vector de expresión pGEX-4Tl (Novagen U.S.A.). La secuencia está insertada entre los sitios de restricción BamHl y EcoRl del vector. La sección en negrita muestra la región que codifica para la proteína GST. La sección en rojo muetra la región que codifica para el péptido RR12EE345L.

Descripción de la Invención La presente invención describe proteínas quiméricas útiles, en general, para la presentación de péptidos, polipéptidos y proteínas. Los péptidos, polipéptidos y proteínas mostrados en la presente pueden inducir respuesta inmune o servir para otros fines útiles. La presente invención describe además composiciones farmacéuticas y vacunas de alto valor y efectividad inmunogénicos. Estas composiciones y vacunas contienen proteínas quiméricas generadas mediante el uso de la enzima lumazina sintetasa de Brucella spp. como vehículo inmunogénico.

Las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud pueden presentar péptidos, polipéptidos, proteínas o moléculas de otros tipos característicos de numerosos patógenos y ho patógenos. Más específicamente, las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud pueden ser útiles para el tratamiento y prevención de enfermedades en seres humanos. Estas entidades pueden servir para la inoculación de antígenos, toxinas y dominios proteicos con baja o sin actividad inmunogénica. Ejemplos de estas indicaciones serían la vacunación en contra del sarampión común, sarampión alemán (rubéola), hepatitis, tétano, pertussis, poliomielitis, difteria, paperas, meningitis y rabia, en infantes. Otros ejemplos de estas indicaciones son la vacunación en contra de las hepatitis A, B y C, influenza, encefalitis, rabia, fiebre tifoidea, fiebre amarilla, hefes simplex, varicella zoster, dengue, virus papilloma humano, cólera, malaria, tuberculosis, paperas y gripe en adultos. Otros ejemplos de estas indicaciones son vacunas aplicables a bioterrorismo, para contrarrestar los siguientes patógenos: Botulinum toxin, Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Bacillus subtilus, Bacillus thuringiensis, virus de la conjuntivitis hemorrágica (Enterovirus 70) y rotavirus. Estas entidades también pueden utilizarse para el tratamiento de condiciones crónicas, como el mal de Alzheimer, el mal de Parkinson y la artritis reumatoidea u otras condiciones, como alergias y tumores. Un ejemplo de esta última aplicación, podría consistir en una proteína quimérica conteniendo simultáneamente anticuefos o fragmentos de anticuefos contra marcadores tumorales, y elementos radiactivos para radioterapia. Las proteínas quiméricas desarrolladas según la presente invención y los anticuefos derivados de las mismas, también pueden ser útiles para el diagnóstico de fertilidad y embarazo, o de enfermedades como el cáncer de colon, pulmonar, mamario y prostático y para el monitoreo y control del abuso de drogas o del progreso de tratamientos. Las proteínas quiméricas según la presente invención también pueden tener múltiples usos en el manejo y crianza de animales domésticos, de granja y peces. Estas entidades pueden servir para preparar vacunas contra la Brucella spp., un agente bacteriano que produce grandes inconvenientes en la crianza de ganado vacuno, o contra la Piscirickettsia salmonis, que afecta principalmente la crianza comercial del salmón. Además, estas entidades pueden ser útiles para administrar agentes antibacterianos, como penicilina, amoxicilina u otros derivados de la penicilina, en combinación o no con anticuefos específicos contra el agente bacteriano, a animales domésticos, como gatos y perros, y de granja, como ganado vacuno. Otros posibles usos de las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud son la preparación de vacunas contra Mycoplasma hyopneumoniae, un agente neumónico que produce grandes pérdidas en el ganado porcino, y la administración de parasiticidas, como albendazole, fenbendazole e ivermectina contra Ostertagia ostertagi, a terneros y ganado vacuno en general. También sería posible utilizar estas nuevas entidades para administrar parasiticidas, como abamectina y praziquantel, al ganado equino o para la vacunación con epítopes de antígenos o dominios proteicos virales, como la influenza aviaria, a aves. En todos los casos la proteína quimérica puede contener simultáneamente, el agente parasiticida y los anticuefos específicos contra el parásito involucrado. Un uso terapéutico adicional de las nuevas entidades lo sería la administración de agentes anti-inflamatorios, como cafrofen a animales domésticos, como perros y gatos. Las proteínas quiméricas según la presente invención pueden tener también indicaciones distintas al control de patógenos. Estas entidades pueden ser utilizadas para modificar la expresión de ciertas hormonas para acelerar la tasa de crecimiento e incrementar la producción de leche, en animales de granja o hacer su carne más magra. Un ejemplo de estas indicaciones no convencionales sería el uso de estas entidades para la inmunocastración de animales de granja como el ganado porcino. Las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud también pueden utilizarse para la producción a gran escala de vacunas y anticuerpos en plantas transgénicas (molecular farming). De acuerdo a esta posibilidad, la vacuna o anticuefo se expresaría primeramente en la planta para luego extraer y purificar el mismo y finalmente preparar una formulación farmacéutica con éste. Otra posibilidad sería alimentar animales con plantas así transformadas para inmunizarlos por esta vía (vacunas comestibles).

Una ventaja particular de la presente invención es que el vehículo utilizado es capaz de acomodar péptidos más largos que otros vehículos conocidos en el arte, como son las "partículas tipo virus", dado su menor tamaño y mayor estabilidad. Este sistema de presentación antigénica posee la ventaja adicional de presentar los péptidos, polipéptidos y proteínas insertadas en forma repetida y espacialmente ordenada, aumentando su estabilidad y vida media. La proteína portadora (BLS) tiene además un efecto adyuvante considerable sobre los péptidos, polipéptidos y proteínas insertadas potenciando de esta manera la efectividad de la respuesta inmune el inserto. Otra de las ventajas de la presente invención es que la proteína portadora BLS induce respuesta inmune por sí en ausencia de adyuvantes adicionales. Esto permite la inoculación con las vacunas preparadas según la presente descripción por diversas vías de administración (por ej. intravenosa, nasal, oral, a alta presión de aire) con o sin adyuvantes. Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en esta solicitud se distinguen por su alta estabilidad a temperatura ambiente. Esta característica haría posible conservar la composición o vacuna sin necesidad de mantener una cadena de frío estricta. La generación de quimeras mixtas con múltiples péptidos insertados en los distintos extremos de la proteína portadora BLS es útil también para el diseño de vacunas multivalentes o vacunas dirigidas a distintas vías de respuesta inmune. Al presente, la opinión prevaleciente en el arte es que la vacuna debe contener 10 ó menos agentes inductores de respuesta inmune. También se recomienda que la vacuna contenga 5 ó menos agentes inductores para obtener resultados óptimos. Las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud pueden servir para la producción de anticuefos. Estos anticuefos y sus entidades asociadas pueden utilizarse en métodos de diagnóstico de enfermedades. También es posible llevar a cabo el desarrollo de kits para el diagnóstico de enfermedades utilizando los anticuefos y las entidades asociadas antedichas Varias de las entidades desarrolladas según la presente invención pueden ser utilizadas además para la presentación de péptidos y la construcción de bibliotecas de proteínas, y sus aplicaciones asociadas (por ej. biología combinatoria aplicada a la identificación de moléculas para el desarrollo de drogas, o a la identificación de secuencias polipeptídicas que unen preferentemente compuestos inorgánicos, para aplicaciones nanobiológicas). Algunas de las nuevas entidades también pueden ser utilizadas para la producción y ensamblado de aparatos nanotecnológicos o para llevar a cabo procesos nanotecnológicos. Las proteínas quiméricas según la presente invención pueden ser utilizadas en la construcción y desarrollo de biosensores aplicados a la detección analítica de diversas sustancias y moléculas (por ej. detección de contaminantes o toxinas en aguas, suelos o aire, detección de residuos de drogas, herbicidas y pesticidas en alimentos). Otra de las ventajas de las entidades descritas en la presente solicitud es su facilidad y bajo costo de producción. Las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud se obtienen en altas cantidades de un modelo de cepas transformadas de E. coli, un microorganismo de conocido manejo y cultivo. Las proteínas de interés obtenidas según este método se purifican con facilidad del medio de cultivo. En una versión de la presente invención las proteínas quiméricas aisladas reivindicadas en la presente están formadas por un péptido, polipéptido o proteína conectado a una proteína mutada de lumazina sintetasa de Brucella spp. cuya secuencia de nucleótidos codificante para sus primeros 8 residuos N-terminales ha sido modificada para permitir su corte por enzimas de restricción que no cortan naturalmente a la secuencia de nucleótidos codificante para la proteína nativa lumazina sintetasa de Brucella spp. Preferentemente, se ha modificado la secuencia de nucleótidos codificante para los primeros 8 residuos de la proteína mutada de lumazina sintetasa de Brucella spp. con el objeto de permitir su corte por las enzimas de restricción Nsi I y Afl II. Más preferentemente, se utilizan las proteínas mutadas de lumazina sintetasa con las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO:la, SEQ ID NO:2a, SEQ ID NO:3a, SEQ ID NO:4a, SEQ ID NO:5a, SEQ ID NO:6a, SEQ ID NO:7a . El péptido, polipéptido o proteína conectado puede ser homólogo o heterólogo. En una versión de la presente invención el péptido conectado a la proteína mutada es un dominio de heterodimerización. Preferentemente este dominio de heterodimerización es un dominio de "cierre de leucinas". Las proteínas quiméricas obtenidas de este modo, incluyen pero no se limitan a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:8a, y son utilizadas preferentemente para el acople de dominios proteicos, proteínas completas y/u otras entidades no proteicas. En otra realización de esta invención se reivindican combinaciones de las proteínas quiméricas aisladas descritas en la presente solicitud. También se reivindica el uso de estas proteínas quiméricas aisladas y de combinaciones de proteínas quiméricas aisladas. En otra realización de la presente invención se reivindican las secuencias aisladas de nucleótidos codificantes para las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud. Estas secuencias pueden ser de ARN, de ADN genómico o ADN copia. En una variante de la presente invención la secuencia codificante para el péptido, polipéptido o proteína conectado está ubicada en la región 5' de la secuencia de nucleótidos codificante para la proteína mutada lumazina sintetasa de Brucella spp. En otra variante de la presente invención la secuencia codificante para el péptido, polipéptido o proteína conectado está enlazada operativamente a 5' de la secuencia de nucleótidos codificante para la proteína mutada lumazina sintetasa de Brucella spp. Preferentemente, se utilizan las secuencias de ADN: SEQ ID NO: Ib, SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b, SEQ ID NO:7b y SEQ ID NO:8b. Instancias específicas de las secuencias de la proteína mutada utilizadas en la presente invención, incluyen pero no están limitadas a, las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura: a) BLS-OMP31 b) BLS-KETcl y c) BLS-RBD3, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. En una variante de esta invención se reivindican las combinaciones de secuencias de nucleótidos aisladas descritas en la presente solicitud. También se reivindica el uso de estas secuencias de nucleótidos y de combinaciones de secuencias de nucleótidos aisladas. En otra realización de la presente invención se reivindican combinaciones de las proteínas quiméricas aisladas y las secuencias aisladas de nucleótidos descritas en la presente solicitud. En otra realización de la presente invención se reivindican los vectores que contienen las secuencias codificantes para las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud. Estos vectores pueden ser de origen bacteriano, viral u otro y son capaces de expresar o posibilitar la expresión de las proteínas quiméricas descritas en la presente solicitud. Instancias específicas de estos vectores son los plásmidos pBLS-OMP31, pBLS- KETcl y pBLS-RBD3, utilizados en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. Preferentemente, se utiliza el plásmido pBLS-OMP31, DSM 15546, como vector y como precursor para la generación de plásmidos que expresan las proteínas quiméricas descritas en la presente solicitud. También se reivindican el uso de estos vectores. En otra realización de la presente invención se reivindican las células o microorganismos transformados con los vectores descritos en la presente solicitud. Estos microorganismos pueden ser procariotas, eucariotas o de otro tipo. Instancias específicas de células que pueden transformarse con los vectores descritos en la presente solicitud, incluyen pero no están limitadas a, células de insectos, bacterias, como Escherichia coli, y células de mamífero, como CHO, COS, BHK, Namalwa y HeLa. Más preferentemente, se utilizan cepas competentes de Escherichia coli para dichas transformaciones. También se reivindica el uso de estas células. En una versión de la presente las proteínas quiméricas aisladas descriptas en la presente son capaces de inducir una respuesta inmune en un organismo eucariota. Estas proteínas quiméricas pueden inducir respuestas celulares o humorales en el organismo tratado. En estos casos, la respuesta puede ser en contra del mismo antígeno, toxina, dominio proteico o agente inductor o en contra de antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes inductores diferentes. Los antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes utilizados de acuerdo a la presente invención pueden ser de origen bacteriano, parasítico, viral u otro capaces de inducir una respuesta inmune. Instancias específicas de estos agentes inductores incluyen, pero no están limitadas a, las a las secuencias de aminoácidos de los: a) 27 aminoácidos de la proteína OMP31 de Brucella melitensis, b) 14 aminoácidos de la proteína KETcl de Tenia solium y c) 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. En general, los organismos eucariotas tratados son aves, peces o mamíferos. Preferentemente, estos organismos son de origen murino, conejuno o humano. Más preferentemente el organismo es de origen humano. También se reivindica el uso de estas proteínas quiméricas capaces de inducir respuesta inmune. En una versión de la presente se reivindican' secuencias de nucleótidos codificantes para las proteínas quiméricas aisladas descriptas en la presente son capaces de inducir una respuesta inmune en un organismo eucariota. Estas secuencias de nucleótidos pueden inducir respuestas celulares o humorales en el organismo tratado. En estos casos la respuesta puede ser en contra del mismo antígeno, toxina, dominio proteico o agente inductor o en contra de antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes inductores diferentes. Los antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes utilizados de acuerdo a la presente invención pueden ser de origen bacteriano, parasítico, viral u otro capaces de inducir una respuesta inmune. Instancias específicas de estos agentes inductores incluyen, pero no están limitadas a, las secuencias nucleótidos codificantes para los: a) 27 aminoácidos de la proteína OMP31 de Brucella melitensis, b) 14 aminoácidos de la proteína KETcl de Tenia solium y c) 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. En general, los organismos eucariotas tratados son aves, peces o mamíferos. Preferentemente, estos organismos son de origen murino, conejuno o humano. Más preferentemente el organismo es de origen humano. También se reivindica el uso de estas secuencias de nucleótidos capaces de inducir respuesta inmune. En una versión de la presente invención se reivindica una composición farmacéutica o vacuna que contiene: 1) al menos un tipo de las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud, 2) al menos un tipo de la secuencias de nucleótidos codificante para las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud ó 3) una combinación de 1 y 2). Las composiciones farmacéuticas o vacunas reivindicadas en la presente solicitud pueden estar en forma líquida o en otras formulaciones farmacéuticas conocidas en el arte, como lo son emulsiones inyectables. Las composiciones farmacéuticas o vacunas descritas en la presente invención también pueden estar en forma de cápsulas, soluciones líquidas, suspensiones o elíxires para administración oral o líquidos estériles como soluciones o suspensiones. Preferentemente, se utiliza un medio inerte, como medios salinos, buffers fosfato-salinos, y cualquier otro medio en el cual las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos, o partes de éstas, reivindicadas ' en la presente invención posean una solubilidad adecuada. Los agentes activos de las composiciones farmacéuticas o vacunas reivindicadas en la presente invención están presentes en dosis fisiológicas eficientes. Estos agentes activos pueden administrarse solos o en conjunción con excipientes farmacéuticos aceptables, como adyuvantes, que potencien la producción de anticuefos. Las composiciones farmacéuticas o vacunas según la presente invención incluyen, pero no están limitados a, varias formulaciones aceitosas como el adyuvante de Freund, estereato de tirosina, el dipéptido MDP, saponina, hidróxido de aluminio (alúm), citoquinas linfáticas, la proteína nativa de lumazina sintetasa de Brucella spp. y las proteínas mutadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. descritas en la presente solictud. Ver US 4.258.029 (Moloney, et al); US 5.057.540 (Kensil, et al). Preferentemente, se utiliza estereato de tirosina, hidróxido de aluminio, la proteína nativa de lumazina sintetasa de Brucella spp. y las proteínas mutadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. descritas en la presente solicitud en el caso de seres humanos. El adyuvante de Freund, aunque potente, no se utiliza usualmente en seres humanos. La composición farmacéutica o vacuna también pueden administrarse utilizando mecanismos de liberación lenta, como por ejemplo, liposomas. Ver US 4.235.877 (Fullerton, W.). La preparación de vacunas y composiciones farmacéuticas para su uso en organismos superiores es conocida en el arte. Ver Remington, et al, Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1980; Voller, et al, Eds., New Trends and Developments in Vaccines, University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. En una versión de la presente invención se reivindica un método para inducir una respuesta inmune en un organismo eucariota. El método comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica o vacuna a dicho organismo de: 1) al menos un tipo de las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud, 2) al menos un tipo de la secuencias de nucleótidos codificante para las proteínas quiméricas descritas en esta solicitud ó 3) una combinación de 1 y 2). En una variante de esta invención, se induce una respuesta humoral. En otra variante de esta invención, se induce una respuesta celular. En otra variante de esta invención, se inducen, de manera simultánea o secuencial, respuestas humorales o' celulares. En estos casos la respuesta puede ser en contra del mismo antígeno, toxina, dominio proteico o agente inductor o en contra de antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes inductores diferentes. Los antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes utilizados de acuerdo a la presente invención pueden ser de origen bacteriano, parasítico, viral u otro capaces de inducir una respuesta inmune. Instancias específicas de estos agentes inductores incluyen, pero no están limitadas a, las secuencias nucleótidos codificantes para, o a las secuencias de aminoácidos de los: a) 27 aminoácidos de la proteína OMP31 de Brucella melitensis, b) 14 aminoácidos de la proteína KETcl de Tenia solium y c) 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. Ejemplos de organismos que pueden tratarse con las vacunas y composiciones farmacéuticas descritas en esta solicitud son aves, peces o mamíferos. Preferentemente, estos organismos son de origen murino, conejuno o humano. Más preferentemente el organismo es de origen humano. La administración de las vacunas o composiciones farmacéuticas descritas en la presente invención puede ser en una o varias dosis. Preferentemente, la administración se realiza en una sola dosis. La administración puede además realizarse de forma subcutánea, intravenosa, intramuscular, oral, nasal o "sin agujas" (needle-free). Preferentemente, se realiza de manera subcutánea o intramuscular. En otra realización de la presente invención se reivindica los anticuefos monoclonales y policlonales asociados a la inmunización con las proteínas quiméricas y secuencias de nucleótidos descritas en esta solicitud. Además se reivindican los hibridomas desarrollados según la presente invención para la expresión y producción de los anticuefos monoclonales descritos en esta solicitud. También se reivindica el uso de estos anticuefos para fines preventivos, terapéuticos, de diagnóstico u otros. Se reivindica además las composiciones farmacéuticas que contienen los anticuefos descritos en la presente solicitud y sus usos. En otra realización de la presente invención se reivindican conjugados proteicos conformados entre las proteína quiméricas descritas en esta solicitud y un ligando. En una variante de esta invención, el enlace entre la proteína quimérica y el ligando es covalente. En estos casos, el enlace es preferentemente peptídico. En otra variante de esta invención, el enlace entre la proteína quimérica y el ligando es no-covalente. También se reivindican los usos de estos conjugados proteicos. En otra versión de la presente invención se reivindica la estructura cuaternaria típica de las proteínas quiméricas descritas en la presente. Tal como se utiliza en la presente descripción, "agente activo" se define como: 1) el ADN genómico, ADN copia, ARN mensajero, o partes de éstos, codificante para las proteínas quiméricas, o partes de éstas, reivindicadas en la presente solicitud y 2) las proteínas quiméricas, o partes de éstas, reivindicadas en la presente solicitud, 3) las combinaciones de 1) y 2) y 4) los conjugados proteicos formados entre las proteínas quiméricas reivindicadas en la presente solicitud, o partes de éstas, y otras entidades. Tal como se emplea en la presente descripción, el término "cantidad efectiva" se define como una cantidad suficiente para producir uno o más de los siguientes resultados: inducir una respuesta inmune adecuada, ya sea humoral o celular, incluyendo la producción de anticuefos en contra del agente inductor, inhibir el crecimiento, desarrollo, tamaño y motilidad de la célula o microorganismo asociado al agente inductor. Cuando el agente inductor es un tumor, la "cantidad efectiva" será la necesaria para reducir el tamaño, evitar el crecimiento, inhibir la metástasis o el crecimiento del tumor, o aliviar la molestia causada por dicho tumor o prolongar la vida de un individuo que padece dicho tumor. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término "mamífero" significa un animal vertebrado de sangre caliente cuya descendencia es alimentada con leche secretada por sus glándulas mamarias. El término "mamífero" incluye, pero no está limitado a, ratas, ratones, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, vacas, ovejas, cerdos, primates y seres humanos. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término "composición farmacéutica o vacuna" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el que se administra un agente activo. Incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, soluciones acuosas, gaseosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, retardadores o aceleradores de la absorción, o sustancias similares. El uso de dichos medios y agentes en la administración de sustancias activas farmacéuticas es conocido en el arte. Salvo en la medida en que algún medio o agente convencional sea incompatible con el agente inductor, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas. Los principios activos suplementarios también pueden ser incoforados a agentes activos de la invención. Las "composiciones farmacéuticas o vacunas" incluyen, pero no están limitadas a, diluyentes o rellenos sólidos inertes, soluciones acuosas estériles y varios solventes orgánicos no tóxicos. Las "composiciones farmacéuticas o vacunas" no deberán reaccionar con, ni de ninguna otra forma reducir la eficacia o estabilidad, del agente activo. Los transportes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, agua, etanol, polietilenglicol, aceite mineral, petrolatum, propilenglicol, lanolina y agentes similares. Las "composiciones farmacéuticas o vacunas" para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. En todos los casos, la formulación deberá ser estéril y deberá ser fluida en la medida en que posibilite una forma fácil de dispensar en jeringa. También debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deberá estar preservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias, virus y hongos. Tal como se emplea en la presente descripción, el término "uso preventivo" significa la inducción y generación de capacidad de respuesta inmune en contra de uno o más antígenos, toxinas, dominios proteicos u otros agentes inductores, o segmentos de los mismos. Tal como se utiliza en la presente descripción, "administración secuencial" significa que: 1) el mismo agente activo se administra en más de una ocasión durante periodos consecutivos de tiempo ó 2) dos o más agentes activos se administran alternadamente en más de una ocasión durante períodos consecutivos de tiempo. En los casos donde la administración es "secuencial", la diferencia de tiempo entre la administración de los agentes activos puede ser minutos, horas, días, semanas o meses dependiendo de sí el uso es preventivo o terapéutico y el organismo tratado. Tal como se utiliza en la presente descripción, "administración única o simultánea" significa que uno o más agentes activos son administrados en una sola vez.

Tal como se emplea en la presente descripción, el término "uso terapéutico" se refiere a todo proceso, acción, aplicación, terapia o similar, en la que un organismo superior, incluyendo a un ser humano, esté sujeto a asistencia médica con el objeto de mejorar la condición o resistencia a enfermedades de dicho organismo, ya sea directa o indirectamente.

Ejemplo 1 Construcción del gen quimérico BLS-OMP31 El ejemplo describe la estrategia utilizada para introducir la secuencia correspondiente a los aminoácidos 48 a 74 de la secuencia polipeptídica de la proteína OMP31 de Brucella melitensis en los diez extremos amino terminales del decámero que forma la lumazina sintetasa de Brucella spp. 1. Mutación y Clonado El plásmido pBLS-OMP31, de SEQ ID NO:9c, se obtuvo mediante el siguiente protocolo: a) Para el clonado del gen codificante para la lumazina sintetasa de Brucella spp (BLS), la secuencia de la BLS fue obtenida por amplificación por PCR con primers específicos a partir de ADN genómico de B. abortus y clonada en el vector pETl la (Novagen, USA). El plásmido pETl 1-BLS conteniendo el marco abierto de lectura del la lumazina sintetasa de Brucella spp. fue luego digerido con las enzimas de restricción Bam Hl y Xbal, y el inserto obtenido fue subclonado en el vector pALter-Exl (Promega, USA). b) Utilizando el kit ALTERED sitesll (Promega, USA), se realizó una mutagénesis dirigida sobre la secuencia que codifica para el marco de lectura abierto de la lumazina sintetasa de Brucella spp (BLS), clonada en el vector pALter-Exl (Promega, USA). Para el desarrollo del cassette, se insertaron dos nuevos sitios de restricción en la región 5' del gen de la BLS: un sitio Nsi I en los dos primeros codones del extremo 5'; y un sitio AFL II en los dos codones que comprenden los residuos 8 y 9 de la secuencia nativa de aminoácidos de BLS. Al elegir los sitios a insertar, se consideró que no existieran ya en el gen de la BLS ni en el vector pETl la. Ver Figura 1. c) Después de verificar las mutaciones por secuenciación, el cassette conteniendo la secuencia de BLS mutada (SEQ ID NO: Ib), fue subclonado en el vector pETl la (Novagen, USA), obteniendo el plásmido denominado a partir de ahora pBLSm. d) Para insertar la secuencia correspondientes al péptido OMP31, se diseñaron dos oligonucleótidos de manera que al aparearse formaran un ADN de doble cadena conteniendo la secuencia codificante para los aminoácidos 48-74 de la proteína OMP31 de Brucella melitensis flanqueada por los extremos cohesivos propios de las enzimas de restricción Nsi I y Afl II La Figura 2 muestra los oligonucleótidos diseñados para la construcción de pBLS- OMP31 y el inserto sintético formado por éstos. e) El plásmido pBLSm fue digerido con las enzimas de restricción Nsi I y Afl II, removiendo la secuencia codificante correspondiente a los 8 primeros residuos de la BLS. La secuencia original de BLS fue intercambiada por la secuencia de nucleótidos del péptido insertado OMP31 en este caso. f) Se ligó el inserto sintético del paso anterior d) al cassette abierto en e) del pBLSm, utilizando la enzima T4 ADN ligasa, por incubación O.N. a 16°C. La inserción fue confirmada por secuenciación del marco de lectura. De esta manera, se generó un gen con la secuencia SEQ ID NO:9b. Dicha secuencia muestra que se cambiaron los primeros 8 aminoácidos de la lumazina sintetasa de Brucella spp. por los 27 aminoácidos provenientes de la secuencia 48-74 de la proteína OMP31 de Brucella melitensis. A este marco abierto de lectura se le denominó quimera BLS-OMP31, de SEQ ID NO:9b, y al plásmido que la expresa, pBLS-OMP31, de SEQ ID NO:9c. Ver Figuras 3b y c. Está experiencia se repitió utilizando las secuencias de ADN de la BLS mutada SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b y SEQ ID NO:7b obteniéndose resultados similares. 2. Transformación Una cepa competente de E. coli BL21(DE3) fue transformada mediante choque térmico con el plásmido pBLS-OMP31 obtenido según el protocolo anterior. Posteriormente, las bacterias fueron cultivadas en placas de agar conteniendo LB-agar/ampicilina para seleccionar aquellas transformadas con el plásmido. Para las pruebas de expresión en escala pequeña, 2 ml de medio LB/ampicilina se inocularon con una colonia de la placa y se incubó a 37°C con agitación. El cultivo saturado se indujo con 2 µl de IPTG ÍM. Tres horas más tarde se tomaron 100 µl de cultivo, se centrifugaron y se resuspendió el pellet en 25 µl de buffer muestra IX para su análisis por SDS-PAGE 17% (18). Ver Figura 4.

Expresión y Purificación de la Proteína Quimérica BLS-OMP31 Se cultivó un precultivo de 5 ml de las cepas transformadas según el paso anterior a saturación, con el cual se inocularon 500 ml de LB/ampicilina. El cultivo se incubó con agitación a 37°C y se indujo con 0,5 ml de IPTG (ÍM) al alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 0,6-0,8. El cultivo se retiró a las tres horas y se centrifugó a 4000 g por 20 min. El pellet se suspendió en 15 ml de solución de suspensión (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Tritón X-100 1% pH = 8,0). La suspensión fue sonicada durante 5 min a intervalos de 1 minuto cada 1 minuto y se centrifugó durante 30 min a 20.000 g. El pellet se resuspendió en 15 ml de solución de suspensión sin Tritón X-100 y se repitió el sonicado. El proceso se repitió una tercera vez. Los tres sobrenadantes de sonicado contenían la fracción de la quimera expresada en citoplasma, mientras que el pellet final contenía la fracción de cuefos de inclusión. Ver Figura 5. Los cuefos de inclusión se resuspendieron en buffer PBS con urea 8 M y se dejaron durante la noche a temperatura ambiente. La resuspensión se dializó contra PBS por dos días con un cambio de buffer. La muestra se centrifugó y el sobrenadante se dializó contra buffer A (50mM Tris/HCl, pH 8,5). El primer paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de intercambio aniónico MonoQ o Q-Sepharose (Pharmacia, USA) en equipo de FPLC (Pharmacia, USA). La muestra se inyectó en la columna equilibrada en buffer A y se eluyó por gradiente lineal hasta 50% de buffer B (buffer A + 1 M NaCl). El segundo paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de exclusión molecular Superdex 200 (Amersham, UK). Ver Figuras 6 y 7. Para esto el pico de la quimera se concentró en tubo Centriprep (Millipore, USA) e inyectó en la columna de la cual se eluyó con PBS. La presencia de la proteína quimérica en los picos se evalúo por SDS-PAGE. La construcción del gen quimérico BLS-OMP31 se llevó a cabo utilizando técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Ver Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, New York, 1989; Brown, Gene Cloning, Chapman & Hall, London, England, 1995; Watson, et al, Recombinant DNA, 2nd Ed., Scientific American Books, New York, New York, 1992 y Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., New York, New York, 1986, Alberts, et al, Molecular Biology ofthe Cell, 4? Ed., Garland Science, New York, New York, 2002.

Ejemplo 2 Análisis de la estabilidad de la quimera BLS-OMP31 La primera evidencia de que la proteína quimérica BLS-OMP31 adoptó un plegamiento decamérico se obtuvo a partir de la técnica de dispersión de luz (light scattering), la cual se utilizó para calcular el tamaño molecular de proteínas en solución.

Para realizar estos ensayos se acopló una columna de exclusión molecular al detector de dispersión de luz. De manera que a medida que eluía la proteína de la columna, se determinaba su peso molecular. Según esta metodología el peso molecular de BLS calculado fue de 163 kDa mientras que el de la quimera BLS-OMP31 fue de 215 kDa. Los pesos moleculares teóricos de los decámeros de BLS salvaje y BLS-OMP31 fueron de 174,4 y 197,8 kDa, respectivamente. Considerando que la exactitud del método es de un 90%, este resultado demostró que la quimera BLS-OMP31 forma un decámero, de manera muy parecida que lo hace la proteína BLS salvaje. Mediante dicroísmo circular se estudió el plegamiento de las proteínas quiméricas. Las mediciones de dicroísmo circular se realizaron en un espectropolarímetro J-810 (Jasco, UK), configurado a velocidad de lectura 100 nm min, tiempo de respuesta 4 s y ancho de banda 1 nm. Se utilizaron cubetas de cuarzo de 1, 2 o 5 mm de camino óptico (Hellma). Las muestras se ensayaron en buffer fosfato 50 mM pH 7. La supefosición de los espectros de dicroísmo circular de la quimera BLS-OMP31 y de la BLS salvaje mostró que el plegamiento general de ambas proteínas fue muy similar. Ver Figura 8. En consecuencia, se confirmó que las proteínas quiméricas se plegaron correctamente en forma de decámeros, con estructura secundaria comparable a aquella de la proteína nativa. A continuación se estudió si las sustituciones del extremo N-terminal comprometían de alguna manera a la estabilidad de las proteínas. Para esto se estudió la desnaturalización de las quimeras por hidrocloruro de guanidinio (Gdm-HCl) y por temperatura mediante dicroísmo circular. A partir de las curvas de desnaturalización-equilibrio fue posible obtener ciertos parámetros termodinámicos, como por ejemplo, el cambio de energía libre asociado al desplegamiento. Con este parámetro se evalúo la estabilidad conformacional propia de una proteína. Ver Pace, et al, Methods Enzymol., 131: 266-80 (1986). Para determinar el cambio de energía libre asociado al desplegamiento de cada proteína, los datos experimentales se ajustaron a una curva teórica descriptiva. Este diagrama describe la correlación de la constante de equilibrio entre el estado plegado y el desplegado de la proteína quimérica y la concentración variable del agente desnaturalizante. Para realizar estos experimentos, se incubó una misma cantidad de proteína (0,1 µM de decámero) con concentraciones crecientes del agente desnaturalizante. Las soluciones para cada punto de la curva se prepararon a partir de una solución madre de guanidinio-HCl 6 M (ICN, ultra puro), fosfato 50 mM, pH 7. Las muestras se incubaron tres horas a temperatura ambiente y se centrifugaron antes de la medición. Las mediciones de dicroísmo circular se realizaron en cubeta de 5 mm, a 25°C, en el equipo de dicroísmo circular mencionado anteriormente. Se comprobó que la desnaturalización por guanidinio es reversible en las condiciones utilizadas, tanto para BLS como para BLS-OMP31. Las curvas de desnaturalización-equilibrio se ajustaron a un modelo de disociación en dos etapas. Según este modelo el decámero se disoció en primer lugar generando dos pentámeros iguales. En una segunda etapa de la desnaturalización, cada uno de estos pentámeros se disoció adicionalmente en cinco monómeros desplegados. Las fórmulas que describen esta transición se dedujeron a partir de las ya propuestas para proteínas monoméricas. Ver Zylberman, et al, J. Biol. Chem., 2790:8093-8101 (2004). Los valores termodinámicos obtenidos para la BLS salvaje y BLS-OMP31 muestran que el reemplazo del extremo N-terminal de la BLS no afectó la estabilidad del decámero. Ver Figura 9. Por lo tanto queda confirmado que las quimeras de BLS forman dímeros correctamente plegados y éstos son igualmente estables que BLS salvaje.

Ejemplo 3 Antigenicidad e inmunogenicidad de la quimera BLS-OMP31 Se estudió la antigencicidad de BLS-OMP31, midiendo su capacidad de unirse a un anticuefo monoclonal específico contra el péptido insertado (anticuefo monoclonal A59/10F09/G10) y a un anticuefo monoclonal específico contra la proteína BLS salvaje (anticuefo monoclonal BI24). Ver Vizcaíno, et al, Infecí. Immun., (59(77/ 7020- 28, (2001); Goldbaum, et al, J. Clin. Microbiol., 57:2141-2145 (1993). Esto permitió ensayar tanto la antigenicidad del péptido como del núcleo de la proteína. La antigénicidad se ensayó por ELISA. Ver Figura 10. Se observó que BLS-OMP31 fue reconocida tanto por el anticuerpo monoclonal que reconoce BLS salvaje como por el que reconoce el péptido insertado, mientras que BLS salvaje sólo fue reconocida por el primer anticuefo, como se esperaba. Esto indica que el péptido conservó sus propiedades antigénicas al ser presentado por la quimera. A su vez, se mostró que el plegamiento de la quimera no presentó cambios importantes que impidieran su reconocimiento por el anticuefo anti-BLS. Ambos anticuerpos detectaron hasta 20 ng de quimera por pocilio. Se evaluó la capacidad de BLS-OMP31 de generar respuesta inmune humoral específica contra el péptido insertado. Esta capacidad se analizó en ratones con y sin la asistencia de adyuvaentes. Se trabajó con dos grupos de cinco ratones cada uno. El grupo "AF" recibió tres dosis, por vía intraperitoneal, de 25 µg de proteína en emulsión al medio con adyuvante de Freund a intervalos de 0, 20 y 40 días. La primera dosis se aplicó en adyuvante completo y las restantes en incompleto. El grupo "PBS" recibió el mismo tratamiento pero con la proteína inyectada sin adyuvante. Se extrajo sangre a los 7 días de la tercera inmunización y se ensayó la reactividad de los sueros contra la proteína de membrana OMP31 por ELISA. Ver Figura 11. Se obtuvo una fuerte respuesta contra OMP31 en ratones inmunizados con la quimera y el adyuvante. También fue importante la respuesta serológica obtenida en ratones inmunizados con la proteína en PBS sin adyuvante. Esto demuestra que ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31 con y sin adyuvante desarrollan una respuesta inmune específica contra el péptido insertado. Un conejo se inyectó con BLS-OMP31 con adyuvante según el siguiente protocolo: lera dosis, día 0: 200 µg de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + lml de adyuvante de Freund completo, inyección intramuscular. 2da dosis, día 22: 200 µg de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + lml de adyuvante de Freund incompleto (AFI), inyección subcutánea. 3ra dosis, día 45: 200 µg de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + lml de AFI, inyección intramuscular. 4ta dosis, día 155: 200 µg de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + lml de AFI, inyección subcutánea. Se extrajeron muestras de sangre a los días 31, 52 y 180. Se centrifugaron las muestras y el suero se conservó congelado. Los antisueros colectados luego de la 2da, 3ra y 4ta dosis de antígeno se titularon por ELISA contra la proteína de membrana OMP31. Ver Figura 12. El título de los antisueros ensayados, definido como la máxima dilución en reconocer el antígeno por sobre el suero negativo, fue de 3.200, 12.800 y 25.600 para los sueros correspondientes a la 2da, 3ra y 4ta, dosis respectivamente. La línea de base se definió como la máxima dilución capaz de identificar el antígeno frente al suero negativo. El conejo inmunizado desarrolló una fuerte respuesta inmune específica contra OMP31. Dado que el suero contra BLS salvaje no reconoció a OMP31, esta alta reactividad se debió a una respuesta de anticuefos específicos contra el péptido insertado en la quimera. Ver Figura 13, control negativo. La proteína OMP31 utilizada en los ensayos de ELISA mostrados se produjo en forma recombinante en E. coli. Por tratarse de una proteína de membrana, la misma no puede mantenerse en solución acuosa, por lo que se obtuvo en condiciones desnaturalizantes. En los ensayos mostrados, entonces, no se demostró que los antisueros fueran capaces de reconocer a OMP31 en su conformación salvaje en el contexto de la membrana extema bacteriana. Esta propiedad sería importante para la potencial efectividad de la quimera como inmunógeno capaz de conferir inmunidad humoral contra Brucella. Para evaluar esta propiedad se realizaron ensayos de ELISA utilizando como antígeno dos cepas de B. melitensis H38, una lisa y otra rugosa. Ver Figura 13. La reactividad de un suero contra bacterias enteras resulta por lo general difícil de evaluar debido a la complejidad del antígeno utilizado. El ensayo demostró, sin embargo, que el suero anti BLS-OMP31 reconoció específicamente a OMP31 insertada en la membrana de la cepa rugosa. La reactividad de este suero contra la cepa lisa no se diferenció de la propia del suero anti BLS. Este resultado es totalmente coherente con el publicado para el anticuerpo monoclonal A59/10F09/G10. Ver Vizcaíno, et al, supra. Este anticuefo específico para el inserto incluido en la quimera BLS-OMP31 tiene una fuerte reactividad con cepa rugosa de B. melitensis H38 y no así con la cepa lisa.

Ejemplo 4 Vacuna de ADN de BLS-OMP31 La secuencia codificante para BLS-OMP31 fue subclonada en el vector pCI-neo (Promega Madison, USA), incluyendo sitios de restricción en los extremos 5' de los cebadores (primers) (enmarcado) y la secuencia consenso Kozak (subrayado). Para ello se construyeron los siguientes oligonucleótidos: BLS-OMP31 "sentido": 5'TAAGAA GAATCC ACCACCATG CAT ACC GCC GGT TA 3' BLS-OMP31 "antisentido": 5'TGTCCACCA GTC AT[GCTAGCT]CAGACAAGC GCGATG C 3' Se amplificó dicha secuencia mediante PCR utilizando como plantilla el plásmido pET-BLS-OMP31. El producto de PCR y el vector se digirieron con las enzimas de restricción correspondientes y luego se realizó la reacción de ligación. La construcción obtenida fue verificada mediante secuenciación. El plásmido pCI-BLS-OMP31 así construido fue amplificado en células E. coli JMl 09 y posteriormente purificado por columnas "mega prep" (Quiagen, UK). Se determinó la pureza y concentración del ADN por espectrofotometría a 260/280 nm. La preparación plasmídica contiene menos de 0,05 unidades de endotoxina por 100 µig de ADN, determinado por Limulus Amebocyte Lysate Análisis kit (Sigma, USA). Grupos de ratones Balb/c fueron inoculados con 100 µg de plásmido pCI-BLSOMP31 o plásmido control sin inserto (pCI) en solución fisiológica por vía intramuscular (im) e intradérmica (id) a las 0, 2, 4 y 6 semanas. Los animales fueron sangrados por vía retroorbital a los días 0, 15, 30, 45, 60, 75 posteriores a la primera inmunización y los sueros guardados a -20°C para la detección de anticuefos específicos. La respuesta humoral anti-OMP31 inducida por la inmunización con la quimera BLS-OMP31 como vacuna a ADN (pCI-BLSOMP31) se analizó por ELISA indirecto utilizando como antígeno la proteína OMP31 recombinante. Luego de la inmunización todos los animales desarrollaron una elevada respuesta inmune humoral específica de isotipo IgG contra Omp31. Ver Figura 14. La preparación, amplificación, purificación y uso como vacuna de ADN del plásmido pCI-BLS-OMP31 se llevó a cabo por técnicas de biología molecular y de preparación y admimstración de composiciones farmacéuticas conocidas en el arte. Ver Schleef, M., Ed., Plasmids for Therapy and Vaccination, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany, 2001.

Ejemplo 5 Quimeras mixtas de BLS El hallazgo de que la lumazina sintetasa de Brucella spp. se disocia en forma reversible cuando es tratada con altas concentraciones de cloruro de guanidinio fue utilizado para construir quimeras mixtas. Ver Zylberman, et al, J. Biol. Chem. 2790:8093-8101 (2004). Se tomaron dos quimeras distintas, con marcadas diferencias en el tamaño del péptido y en su punto isoeléctrico, a fin de demostrar la factibilidad de esta estrategia, dada la facilidad de poder identificar a los decámeros mixtos. Para ello, además del péptido OMP31 ya descrito, se utilizó el péptido KETcl, de 14 aminoácidos con la secuencia mostrada en la Figura 15. Dicho péptido, proveniente de una proteína de Tenia solium, ha sido descrito como altamente protectivo contra neurocisticercosis murina y porcina. Ver Huerta, et al, Vaccine 20:62-266 (2001); Toledo, et al, Infecí. Immun., 69:1766-1773 (2001). La proteína quimérica BLS-KETcl se obtuvo según el siguiente protocolo: 7 . Clonado a) El plásmido pBLS-OMP31 fue digerido con las enzimas de restricción Nsi I y Afl II, para remover la secuencia codificante correspondiente a los 27 aminoácidos provenientes de la secuencia 48-74 de la proteína OMP31. Se extrajo la secuencia codificante de la proteína OMP31. b) Se ligó la secuencia codificante para los 14 aminoácidos del péptido KETcl antedicho al cassette abierto en a) cassette abierto del plásmido pBLS-OMP3 rOMP31 utilizando la enzima T4 ADN ligasa, por incubación O.N. a 16 °C. De esta manera se obtuvo el marco de lectura de BLS- KETcl . La inserción fue confirmada por secuenciación del marco de lectura. A este marco abierto de lectura se le denominó quimera BLS- KETcl, de SEQ ID NO:10b, y al plásmido que la expresa, pBLS-KETcl . Este procedimiento también puede realizarse de una manera similar al paso 1) del Ejemplo 1 mediante el corte con las enzimas de restricción Nsi I y Afl I sobre el cassette BLSm (SEQ ID NO: Ib) y su posterior ligación con el inserto KETcl . De esta manera se obtiene el marco de lectura BLS-KETcl y el plásmido BLS-KETcl . Esta experiencia se repitió utilizando las secuencias de ADN de la BLS mutada SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b y SEQ ID NO :7b obteniéndose resultados similares. 2. Transformación Se transformó una cepa competente de bacterias E. coli BL21(DE3) mediante choque térmico con el plásmido BLS-KETcl obtenido según el protocolo anterior Posteriormente, las bacterias fueron cultivadas en placas de agar conteniendo LB-agar/ampicilina para seleccionar aquéllas transformadas con el plásmido. 5. Expresión y Purificación de la Proteína Quimérica BLS-KETcl Para las pruebas de expresión en escala pequeña, se inoculó una colonia transformada según el paso anterior con 2 ml de medio LB/ampicilina y se incubó a 37°C con agitación. El cultivo saturado se indujo con 2 µl de IPTG ÍM. Tres horas más tarde se tomaron 100 µl de cultivo, se centrifugaron y se resuspendió el pellet en 25 µl de buffer muestra IX para su análisis por SDS-PAGE 17% (18). Se creció un precultivo de 5 ml de las cepas transformadas según el paso anterior a saturación, con el cual se inocularon 500 ml de LB/ampicilina. El cultivo se incubó con agitación a 37°C y se indujo con 0,5 ml de IPTG (ÍM) al alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 0,6-0,8. El cultivo se retiró a las tres horas y se centrifugó a 4000 g por 20 min. El pellet se suspendió en 15 ml de solución de suspensión (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Tritón X-100 1% pH = 8,0). La suspensión se sometió a 5 min de sonicado neto con intervalos de lmin cada lmin de sonicado y se centrifugó durante 30 min a 20.000 g. El pellet se resuspendió en 15 ml de solución de suspensión sin Tritón X-100 y se repitió el sonicado. El proceso se repitió una tercera vez. Los tres sobrenadantes de sonicado contenían la fracción de la quimera expresada en citoplasma, mientras que el pellet final contenía la fracción de cuefos de inclusión. Los cuefos de inclusión se resuspendieron en buffer PBS con 8 M urea y se dejaron de una noche para otra a temperatura ambiente. La resuspensión se dializó contra PBS dos días con un cambio de buffer. La muestra se centrifugó y el sobrenadante se dializó contra buffer A (50mM Tris/HCl, pH 8,5). El primer paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de intercambio aniónico MonoQ o Q-Sepharose (Pharmacia, USA) en equipo de FPLC (Pharmacia, USA). La muestra se inyectó en la columna equilibrada en buffer A y se eluyó por gradiente lineal hasta 50% de buffer B (buffer A + 1 M NaCl). El segundo paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de exclusión molecular Superdex 200 (Amersham, UK). Para esto el pico de la quimera se concentró en tubo Centriprep (Millipore, USA) e inyectó en la columna de la cual se eluye con PBS. La presencia de la proteína quimérica en los picos se evalúo por SDS-PAGE.

La construcción del gen quimérico BLS-KETcl se llevó a cabo utilizando técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Ver Sambrook, et al, supra; Brown, supra; Watson, et al, supra; Davis et al, supra, Alberts, et al, supra. Las quimeras BLS-OMP31 y BLS-KETcl fueron desplegadas en cloruro de guanidinio 2 M, mezcladas en concentraciones equimolares, y reasociadas mediante diálisis. Con el agregado de guanidinio 2M, los decámeros se disociaron generando pentámeros que conservaron su estructura secundaria. Cuando se removió el guanidinio mediante diálisis, se reasociaron los pentámeros formando nuevamente decámeros. Ver Zylberman, et al, J. Biol. Chem., 2790:8093-8101 (2004). De esa forma se generó una quimera mixta, tal como se indica en forma esquemática en la Figura 16. El producto de la reasociación fue sometido a cromatografía en una columna de intercambio aniónico MonoQ, (Amersham, UK) y se comparó con el perfil de elución de cada quimera por separado (muestra sin disociar): la quimera BLS-KETcl (la más básica según predicción del punto isoeléctrico teórico del péptido insertado) eluyó a 16.8% de Buffer B y BLS-OMP31 a 35,8% del mismo buffer. La muestra reasociada se separó en tres picos diferentes, el primero correspondiendo a la quimera pura BLS-KETcl; el segundo pico mayoritario que eluyó con una movilidad intermedia, correspondiente a la quimera mixta y un último pico correspondiente a la quimera pura BLS-OMP31. Ver Figura 17 A. La muestra correspondiente al segundo pico fue analizada mediante SDS-PAGE y PAGE nativo. Los resultados demostraron que la muestra correspondía a una quimera mixta formada por el péptido KETcl demostrado en los cinco extremos amino terminales de un pentámero y mediante el péptido OMP31 demostrado en los cinco extremos amino terminales del otro pentámero. Ver Figuras 17 Bl y B2. Este resultado demostró que la estrategia propuesta de disociación, mezcla y reasociación de las proteínas modificadas fue efectiva para proveer quimera mixta, donde cinco copias de dos péptidos diferentes fueron mostradas por la estructura decamérica BLS. Ver Figura 16.

En estas mezclas de quimeras, cada uno de los péptidos puede darle a la proteína una característica determinada (por ejemplo diferente tráfico celular) y el otro péptido puede ser aquel contra el cual se intenta desarrollar respuesta inmune.

Ejemplo 6 Inmunización con quimeras de BLS mixtas Se evaluó la capacidad de la quimera mixta BLS-OMP31 -KETcl de generar respuesta inmune humoral específica contra ambos péptidos insertados al ser inyectada con adyuvante en ratones. Se trabajó con un grupo de cinco ratones. El grupo recibió tres dosis, por vía intraperitoneal, de 25 µg de proteína en emulsión al medio con adyuvante de Freund a los 0, 20 y 40 días. La primer dosis se aplicó en adyuvante completo y las restantes en incompleto. Se extrajo sangre a los 7 días de la tercera inmunización y se ensayó la reactividad de los sueros contra los péptidos sintéticos OMP31 y KETcl por ELISA. er Figura 18. Se obtuvo una fuerte respuesta contra ambos péptidos en ratones inmunizados con la quimera mixta en adyuvante. Esto demostró que ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31 -KETcl desarrollaron una respuesta inmune específica contra ambos péptidos insertados en forma simultánea.

Ejemplo 7 Obtención de respuesta inmune celular contra quimeras de BLS Para evaluar la respuesta inmune celular específica inducida por la quimera BLS- KETcl contra el péptido insertado, grupos de cinco ratones BALB/c fueron inmunizados dos veces con un intervalo de 10 días por vía subcutánea con 50 µg/ratón de la quimera BLS-KETcl emulsionada en saponina o del péptido sintético KETcl (10 µg/ratón) emulsionado en saponina. Tres días después de la última inmunización, el bazo de ratones de ambos grupos fue removido asépticamente y las células resuspendidas en medio de cultivo RPMI 1640 Gibco (InVitrogen Cof., USA), suplementado con L-glutamina (0,2 mM), 2-mercaptoetanol (0,05 mM), aminoácidos no-esenciales (0,01 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/ml) y 10 % suero fetal bovino (FBS). A diferentes cultivos de células se les agregó medio, péptido KETcl o quimera BLS-KETcl (10 µg/ml). Las células se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% CO , en microplacas de cultivo de fondo plano, a una concentración de 2 x 105 células por 200 µl de volumen final. Después de 72 hs, se agregó 1 µCi por cultivo de [metil- H] timidina (Amersham Biosciences, UK). Las células fueron cosechadas, y se midió el nivel de incoforación de timidina tritiada en un 1205 betaplate™ liquid scintillation counter (Wallac Oy, Fl). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Este ensayo mostró que las células de bazo de ratones inmunizados con la quimera BLS-KETcl proliferaron frente a la presencia en los cultivos tanto del péptido como de la quimera, indicando claramente que la quimera BLS-KETcl fue capaz de inducir respuesta inmune celular específica contra el péptido KETcl insertado en BLS. Ver Figura 19.

Ejemplo 8 Multipresentaci?n de Dominios Proteicos mediante Quimeras de BLS La BLS puede ser modificada para presentar en sus diez extremos amino terminales no sólo por péptidos, sino también dominios proteicos enteros. Para probarlo, se construyó la quimera BLS-RBD3, constituida por la secuencia codificante de BLS más la secuencia codificante del dominio RBD3 de la proteína Staufen- 1 murina. Ver Figuras 20 y 21. La proteína quimérica BLS- RBD3 se obtuvo según el siguiente protocolo: 7 . Clonado a) El plásmido pBLS-OMP31 fue digerido con las enzimas de restricción Nsi I y Afl II, para remover la secuencia codificante correspondiente a los 27 aminoácidos provenientes de la secuencia 48-74 de la proteína OMP31. Se extrajo la secuencia codificante de la proteína OMP31. b) Se ligó la secuencia codificante para los 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen al cassette abierto en a) cassette abierto del plásmido pBLS-OMP31"OMP31 utilizando la enzima T4 ADN ligasa, por incubación O.N. a 16 °C. De esta manera se obtuvo el marco de lectura de BLS-RBD3. La inserción fue confirmada por secuenciación del marco de lectura. A este marco abierto de lectura se le denominó quimera BLS-RBD3, de SEQ ID NO: l lb, y al plásmido que la expresa, pBLS-RBD3. Este procedimiento también puede realizarse de una manera similar al paso 1) del Ejemplo 1 mediante el corte con las enzimas de restricción Nsi I y Afl I sobre el cassette BLSm (SEQ ID NO: Ib) y su posterior ligación con el inserto RBD3. De esta manera se obtiene el marco de lectura BLS-RBD3y el plásmido pBLS-RBD3. Esta experiencia se repitió utilizando las secuencias de ADN de la BLS mutada SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b y SEQ ID NO :7b obteniéndose resultados similares. 2. Transformación El plásmido pBLS-RBD3 obtenido según el protocolo anterior se introdujo a bacterias E. coli BL21(DE3) por transformación por shock térmico. Posteriormente, la bacteria fue crecida a 37 °C en medio LB en presencia de ampicilina y el gen fue inducido con IPTG 1 mM por 4 horas a 28 °C. 5. Expresión y Purificación de la Proteína Quimérica BLS-RBD3 La proteína fue expresada en cuefos de inclusión, lavada con soluciones de urea 4 y 6 M, y solubilizada en un buffer Tris/HCl 50 mM, urea 8 M, EDTA 5mM, ß-ME 5 mM, PMSF 1 mM, pH 8, bajo agitación magnética durante 16 horas a 4 °C. La proteína solubilizada fue purificada en condiciones desnaturalizantes en una columna de intercambio aniónico Q-Sepharose aplicando un gradiente lineal entre 0 y 1 M NaCl en un buffer Tris/HCl 50 mM, urea 8 M, pH 8,5. La proteína eluida fue replegada por diálisis contra buffer PBS y purificada en una columna de Heparina Hyper D eluyendo la misma en un buffer Tris/HCl 50 mM, NaCl 1 ,2 M, pH 8 . La Figura 22 muestra el análisis por SDS-PAGE, dicroísmo circular y dispersión de luz (light scattering) de la quimera BLS-RBD3 obtenida según el método descrito anteriormente. El análisis por SDS-PAGE muestra que la quimera BLS-RBD3 fue obtenida con un alto grado de pureza. La pequeña anomalía observada en su movilidad electroforética estaría debida a la alta densidad de cargas positivas del dominio RBD3. La similitud del espectro de discroísmo circular de BLS-RBD3 con su espectro teórico, calculado a través de la combinación de los espectros de BLS y el dominio RBD3 de la proteína Staufen- 1 murina en forma aislada, indicaron que la quimera se encontraba bien plegada. El peso molecular de la quimera (257 kDa), calculado a partir de su corrida en una columna de filtración molecular conectada en serie a un detector de dispersión de luz y un detector de índice de refracción, indicaron que la misma presentaba una estructura decamérica. La construcción del gen quimérico BLS-RBD3 se llevó a cabo utilizando técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Ver Sambrook, et al, supra; Brown, supra; Watson, et al, supra; Davis et al, supra, Alberts, et al, supra.

Ejemplo 9 Obtención de anticuerpos de amplio espectro para inmunización con quimeras de BLS La quimera BLS-Staufen fue utilizada como inmunógeno para obtener anticuefos contra el dominio RBD3 de Staufen. Para ello se inocularon 5 ratones de la cepa Balb/c 2 veces con un intervalo de 14 días con 80 µg de la quimera BLS-RBD3 en 200 µl de buffer HCl 50mM, NaCl 1 ,2M, 50mM fosfato, pH 8 por vía intraperitoneal en ausencia de adyuvante. Como control se inmunizaron 5 ratones de la misma cepa con una mezcla de las proteínas BLS y el dominio RBD3 de Staufen, en la misma masa que contenía la quimera. Quince días después de la última inmunización, se sangraron los ratones mediante punción retroorbital y se obtuvo el suero mediante centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos. Se ensayó la reactividad de los sueros contra RBD3 por ELISA sensibilizando placas de 96 pocilios con la proteína de fusión glutation s-transferasa-RBD3 (GST-RBD3). Como anticuefo secundario se utilizó anti-inmunoglobulina de ratón conjugado a peroxidasa caprino (DakoCytomation, USA). La reacción se reveló con ortofenildiamina (OPD) y se detuvo con ácido sulfúrico 4 N. La densidad óptica se determinó por un lector de ELISA a 492 nm. La Figura 23 muestra un ejemplo representativo de la respuesta inmune humoral desarrollada en ambos grupos. Como se observa, la inmunización con la quimera BLS-RBD3 produjo una fuerte respuesta de anticuefos anti-RBD3. En los ratones inoculados con la mezcla de BLS y RBD3 no se observó reactividad contra el péptido.

Ejemplo 10 Obtención de anticuerpos monoclonales por inmunización con la quimeras de BLS Se evaluó la capacidad de generar anticuefos monoclonales específicos contra el péptido OMP31 a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31. Se trabajó con un grupo de cinco ratones. El grupo recibió tres dosis, por vía intraperitoneal, de 25 µg de proteína en emulsión al medio con adyuvante de Freund a los 0, 20 y 40 días. En el día 60 se inoculó 25 µg de BLS-OMP31 disuelta en PBS, por vía peritoneal, en el ratón que demostró la mayor respuesta contra el péptido OMP31. Se extrajo el bazo de dicho ratón, y se fusionaron los esplenocitos con células de mieloma NSO. Los hibridomas resultantes fueron seleccionado en medio HAT, y sus sobrenadantes de cultivo fueron ensayados para medir reactividad contra el péptido OMP31 por ELISA. El hibridoma que mostró la mayor reactividad fue clonado por dilución límite. En la Figura 24 se muestra la reactividad del AcMo 37F7 contra el péptido OMP31 y contra la proteína entera OMP31. Se obtuvo una fuerte respuesta contra ambas. Esto demostró que ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31 desarrollaron una respuesta inmune específica contra el péptido insertado, lo cual permitió obtener anticuefos monoclonales específicos contra el péptido insertado.

Ejemplo 11 Uso de quimeras de BLS como biosensores Los biosensores permiten detectar interacción específica entre macromoléculas, la cual es visualizada por el aumento de una señal que es proporcional a la acumulación de masa sobre una superficie reactiva. Para estudiar la utilidad de BLS como portador de péptidos y proteínas en el desarrollo de biosensores, se utilizó a la quimera BLS-OMP31 y su reacción con el AcMo 37F7 descrita en el ejemplo anterior. La quimera BLS-OMP31 fue utilizada para derivatizar una cubeta de carboximetil dextrano (IAsys AfBnity Sensors, Thermo, USA). Para tal fin, una solución conteniendo 80 ug/ml de BLS-OMP31, en buffer acetato de sodio 10 mM pH 5,5, fue incubada en una cubeta previamente derivatizada por el reactivo EDC/NHS. Luego de inmovilizar una señal correspondiente a 800 are sec (equivalentes a 5 ng de antígeno) se bloqueó la superficie reactiva con dietilamina. Luego de la derivatización, se estudió la reactividad del AcMo anti-OMP31 37F7, para lo cual se incubó 50 µl de sobrenandante de cultivo en la cubeta previamente activada. Como se observa en la Figura 25, el AcMo 37F7 reaccionó fuertemente, dando una señal de aproximadamente 300 are sec. En la fase de disociación se lavó y agregó buffer PBS + Tween, observándose una caída de la señal correspondiente a la disociación del AcMo de la fase sólida. Este ejemplo demostró claramente que la quimera es capaz de detectar anticuefos dirigidos contra el péptido en un biosensor.

Ejemplo 12 Activación de células dendríticas por BLS Se analizó la capacidad de BLS de activar células dendríticas. Para ello, se estudiaron los niveles de diferentes marcadores de activación en estas células luego de 18 hs de incubación con BLS. Se cultivaron células de médula ósea de ratones de la cepa Balb/c en placas de Petri con medio RPMI con 2mM L-glutamina, lOOU/ml penicilina, lOOµg/ml estreptomicina, 50µM 2-mercaptoetanol y 10% suero fetal bovino (medio RIO), suplementado con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos de ratón (mGM-CSF) en estufa gaseada a 37°C, 5% CO2. A los días 3, 6 y 8 se renovó el medio de cultivo. Al día 9 se levantaron las células no adheridas, se centrifugaron 8 min a 300xg y se incubaron en una concentración de 2x106 células/ml en un volumen final de 1 ml con BLS 1, 5 o lOµM o sin BLS en medio RIO durante 18 hs (n = 4). Luego se centrifugaron y se incubaron 4x105 células por 200 µl de volumen final con los siguientes anticuefos monoclonales (Pharmingen) conjugados a isotiocianato de fluoresceína (FITC): anti-CD40, anti-CD80, anti I-Ad o anti-CD86 y con el anticuefo monoclonal anti-CDl lc conjugado a ficoeritrina (PE). Se realizaron 3 lavados y se adquirieron las células en un citómetro FACScan (Becton Dickinson, USA). Los datos se analizaron mediante el software CellQuest (Becton Dickinson, USA). En las células incubadas con BLS, dentro de la subpoblación CD1 lc+ (75-80%) se observaron aumentos significativos en los porcentajes y en la fluorescencia media de células que expresan CD40, CD80, I-Ad y CD86. El experimento fue realizado 3 veces, obteniéndose resultados similares. La Figura 26 muestra histogramas representativos de la expresión de CD40 (A) y de I-Ad (B) en células CD1 lc+ tratadas o no con BLS. Similar activación por BLS se observó en células dendríticas de ratones de la cepa C3H/HeJ (no respondedores a LPS) o al preincubar la proteína BLS con polimixina B, a fin de eliminar LPS de E. coli.

Estos resultados demostraron que BLS es capaz de activar células dendríticas.

. . Ejemplo 13 . . Producción de ensambles moleculares con dominios proteicos mediante péptidos adaptadores conectados a quimeras de BLS La proteína BLS pudo ser modificada en sus amino terminales para presentar dominios proteicos enteros. Esto pudo ser llevado a cabo mediante la formación de ensambles moleculares. En estos grupos se incoforaron péptidos heterodiméricos complementarios en la proteína BLS modificada en la diana. A continuación, la alta afinidad entre los heterodímeros enlaza la molécula diana y la proteína BLS modificada. El uso de heterodímeros de alta afinidad es útil para evitar que se afecte el plegado apropiado de la proteína portadora. Para demostrar esta aplicación de las quimeras de BLS se utilizaran dos péptidos de heterodimerización conocidos en el arte RR12EE345L y EE,2RR345L. Ver Molí, et al, M. Protein Sci., 70:649-655 (2001). Ver Figura 27. Esta estrategia permite construir ensambles moleculares conteniendo diez copias del dominio en cuestión combinados con la BLS. El ensamblado se realiza in vitro, lo cual permite controlar la estequeometría del proceso. Este sistema permite además expresar el antígeno de interés en un sistema recombinante diferente al de la BLS. Ver Figura 28. 7. Construcción de la Proteína de Fusión BLS-RR12EE345L El péptido RRi2EE3 5L fue clonado en el extremo N terminal de la BLS. Ver Figuras 28 y 29. El residuo K49 situado en la región de unión BLS y RR|2EE3 5L fue sustituido para serina. El gen quimérico para BLS-RRi2EE345L fue clonado en un vector pETl la. Una cepa competente de bacterias E. Coli BL21 (DE3) fue transformada con el vector resultante. A continuación, las bacterias fueron cultivadas en un medio de cultivo LB-agar/ampicilina. La expresión del gen fue inducida con IPTG ÍM durante 16 horas a 37°C. La proteína fue expresada en los cuefos de inclusión. Los cuefos de inclusión fueron lavados con un buffer 50 mM Tris/HCl, 5 mM EDTA, 5 mM ß-ME, 1 mM PMSF, pH 8. La proteína disuelta fue tratada con un buffer 50 mM Tris/HCl, 8 M urea, 5 mM EDTA, 5 mM ß-ME, 1 mM PMSF, pH 8 y agitado magnéticamente durante 16 horas a 4°C. La quimera BLS-RRi2EE345L fue purificada bajo condiciones desnaturalizantes mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna Q-Sepharose (Pharmacia, USA). La muestra fue eluida utilizando un buffer 50 mM Tris/HCl, 8 M urea, pH 8,5 bajo un gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl. La proteína de fusión fue ensayada mediante análisis SDS-PAGE y de dispersión de luz. Ver Figuras 30 y 31. El análisis SDS-PAGE mostró que la proteína de fusión BLS-RRi2EE345L tenía un elevado nivel de pureza. El peso molecular de la proteína, según se determinó mediante la técnica de dispersión de luz, era de 224 kDa. Además, la proteína mostró una señal CD de elevada calidad en el espectro UV remoto. Estos resultados sugieren que la proteína de fusión está bien plegada y observa una estructura decamérica similar a la proteína BLS salvaje en presencia de urea 8 M. La estructura de BLS está distorsionada a temperatura ambiente cuando disminuye la concentración de urea. Esto se debe probablemente a la unión del RRi2EE345L consigo mismo. 2. Construcción del Péptido RR12EE345L El péptido RR12EE345L fue clonado en el extremo C-teminal de la proteína glutation S-transferasa (GST). Este péptido es complementario del péptido R12EE345L representado mediante la pro teína de fusión BLS. Ver Figura 32. El gen del péptido RRi2EE345L fue clonado en el vector pGEX-4Tl . Una cepa competente de bacterias E. Coli BL21 (DE3) fue transformada con el vector resultante. A continuación, las bacterias fueron cultivadas en un medio de cultivo LB-agar/ampicilina a 37°C. La expresión del gen fue inducida con IPTG 1 mM durante 16 horas a 37°C. Las bacterias fueron luego sonicadas. El péptido RRi2EE3 5L resultante fue purificado como una proteína de fusión GST utilizando una matriz de glutationa/agarosa. El complejo acoplado fue colocado en una columna y fue lavado con un buffer 50 mM Tris, pH 8 hasta que el péptido carecía de eluyente. A continuación, la matriz fue incubada con trombina durante 16 horas a temperatura ambiente para clivar el RR|2EE345L de la proteína de fusión GST. El péptido fue entonces eluído con un buffer 50 mM Tris, pH 8 para purificarlo adicionalmente. El péptido RRi2EE3 5L resultante tenía un elevado nivel de pureza. 5. Formación del Ensamble Molecular entre la Proteína de Fusión BLS- RR12EE345L y el Péptido RR12EE345L Una parte de la proteína de fusión BLS-RR?2EE345L fue pre-incubada con urea 8 M, 50 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 8 durante 15 minutos a 30°C. Cuatro partes del péptido RR12EE345L fueron pre-incubadas en un buffer 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, pH 8 durante 15 minutos a 30°C. La proteína de fiísión y el péptido fueron mezclados e incubados durante 15 minutos a 30°C. La mezcla permaneció soluble después de la incubación. El ensamble molecular resultante fue ensayado mediante análisis de dispersión de luz y se calculó su peso molecular teórico (PM: 222,1 kDa). Ver Figura 34. Este análisis mostró que aproximadamente 10 péptidos BLS-RR?2EE34sL (PM: 5,6 kDa) se acoplaron al decámero BLS-RR^EE^sL (PM: 222,1 kDa). Ver Figura 35. Además, el ensamble mostró una señal CD de alta calidad en el espectro UV remoto. Estos resultados sugieren que los ensambles moleculares formados con proteínas BLS modificadas que utilizan esta técnica son viables.

La presente invención ha sido descrita en detalle para facilitar su comprensión y reproducción. Ciertos cambios en la manera de llevar a cabo la misma pueden ser realizados por técnicos versados en la materia sin exceder el objeto y alcance de las reivindicaciones de la presente invención.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Proteínas quiméricas aisladas que comprenden un péptido, un polipéptido o un dominio proteico conectado a una proteína lumazina sintetasa mutada, en donde las secuencias de nucleótidos que codifican para los primeros 8 residuos N-terminales de la proteína mutada han sido adaptados para permitir su clivaje por enzimas de restricción que no clivan la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína lumazina sintetasa natural. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las secuencias de nucleótidos que codifican para los primeros 8 residuos N-terminales de la proteína mutada comprenden los sitios de restricción para enzimas Nsi I y Afl II. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína mutada está derivada de la lumazina sintetasa de Brucella spp. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína mutada comprende las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: la, SEQ ID NO:2a, SEQ ID NO:3a, SEQ ID NO:4a, SEQ ID NO:5a, SEQ ID NO:6a, SEQ ID N0:7a, SEQ ID N0:8a, SEQ ID N0:9a, SEQ ID NO: 1 Oa y SEQ ID NO: 1 la. Secuencias de nucleótidos aisladas que comprenden las secuencias codificantes para las proteínas quiméricas y mutadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. Las secuencias de ADN aisladas de acuerdo con la reivindicación 5, que comprenden las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: Ib, SEQ ID NO :2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b, SEQ ID NO:7b, SEQ ID NO:8b SEQ ID NO:9b, SEQ ID NO: 10b y SEQ ID NO: l lb. Vectores utilizados como vehículo para las secuencias de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6. Los vectores de acuerdo con la reivindicación 7, en donde los vectores son virales o plasmídicos. El plásmido de SEQ ID N0:9c. El plásmido pBLS-OMP31 , número de depósito DSM 15546. Células transformadas con los vectores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10. Células transformadas de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las células son células Eucariotas o Procariotas. Células de Escherichia coli transformadas de acuerdo con la reivindicación 12. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido, polipéptido o dominio proteico, conectado, es homólogo o heterólogo. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido, polipéptido o dominio proteico, conectado, es un antígeno, toxina, agente, o segmento de los mismos, capaz de inducir una respuesta inmune en un organismo Eucariota. 16. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el péptido, polipéptido o dominio proteico, conectado, es un antígeno, toxina, agente, o segmento de los mismos, de origen bacteriano, viral o parasítico. 17. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el antígeno es BLS-OMP31 o segmentos del mismo. 18. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el antígeno es BLS-KETcl o segmentos del mismo. 19. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el antígeno es BLS-RD3 o segmentos del mismo. 20. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la respuesta inmune es humoral o celular. 21. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el organismo eucariota comprende un espécimen de ave, pez o mamífero. 22. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el organismo eucariota es un espécimen mamífero tal como un espécimen murino, conejo o humano. 23. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el espécimen mamífero es humano. 24. Las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el péptido, polipéptido o dominio proteico, conectado, es un antígeno, toxina, agente, o segmento de los mismos, que induce una respuesta inmune in vitro o in vivo. 25. La combinación de dos o más proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los péptidos, polipéptidos o dominios proteicos, conectados a cada proteína mutada son diferentes. 26. La combinación de dos o más proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los péptidos, polipéptidos o dominios proteicos, conectados a cada proteína mutada son idénticos. 27. La combinación de dos o más secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las secuencias de nucleótidos que codifican para los péptidos, polipéptidos o dominios proteicos conectados a las proteínas mutadas son diferentes. 8. La combinación de dos o más secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las secuencias de nucleótidos que codifican para los péptidos, polipéptidos o dominios proteicos, conectados, a las proteínas mutadas son idénticas. 9. La combinación de una o más proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, y una o más secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con la reivindicación 5. 0. Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 1. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 2. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el excipiente farmacéuticamente aceptable es un adyuvante. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el adyuvante comprende un adyuvante de Freund, un dipéptido MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de aluminio, citoquinas linfáticas, la proteína nativa de la lumazina sintetasa de Brucella spp o las proteínas mutadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 34, que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el excipiente farmacéuticamente aceptable es un adyuvante. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el adyuvante comprende un adyuvante de Freund, un dipéptido MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de aluminio, citoquinas linfáticas, la proteína nativa de la lumazina sintetasa de Brucella spp o las proteínas mutadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos una de las secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 38, que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 40. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el excipiente farmacéuticamente aceptable es un adyuvante. 41. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el adyuvante comprende un adyuvante de Freund, un dipéptido MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de aluminio, citoquinas linfáticas, la proteína nativa de la lumazina sintetasa de Brucella spp o las proteínas mutadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. 42. Un método para inducir una respuesta inmune en un organismo eucariota que comprende la administración al organismo de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica preparada de acuerdo con las reivindicaciones 30, 34 o 38. 43. Un método de acuerdo con la reivindicación 42, en donde la respuesta inmune es humoral o celular. 44. Un método de acuerdo con la reivindicación 42, en donde la composición farmacéutica es administrada en forma simultánea o secuencial. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 42, en donde el organismo eucariota comprende un espécimen de ave, pez o mamífero. 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el organismo eucariota es un espécimen mamífero tal como un espécimen murino, conejo o humano. 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el espécimen mamífero es humano. 48. Un método de acuerdo con la reivindicación 42, en donde la composición farmacéutica es administrada por una ruta subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, oral o nasal, o a través de un sistema de inyección sin agujas. 49. Anticuefos monoclonales y policlonales en donde los anticuefos reaccionan con los péptidos, polipéptidos y dominios proteicos o segmentos de los mismos, codificados por las secuencias de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6. 50. Anticuefos monoclonales y policlonales en donde los anticuefos reaccionan con los péptidos, polipéptidos y dominios proteicos o segmentos de los mismos, que comprenden las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 1 o segmentos de los mismos. 51. Composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuefos monoclonales y policlonales de acuerdo con las reivindicaciones 49 o 50. 52. Hibridomas que expresan los anticuefos monoclonales de acuerdo con las reivindicaciones 49 o 50. 3. Un biosensor que comprende: (a) un soporte donde se fija al menos una proteína quimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 1 y (b) dicho soporte está conectado a un medio de medición que permite determinar si un ligando se ha unido a, o reaccionado con, la proteína quimérica aislada. 4. Un biosensor de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el ligando es un anticuefo. 55. Conjugados de proteína que comprenden un ligando enlazado al péptido, polipéptido o dominio proteico, conectado a las proteínas mutadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. de acuerdo con la reivindicación 1. 56. Conjugados de proteína de acuerdo con la reivindicación 55, en donde el enlace es un enlace covalente, tal como un enlace peptídico. 57. Conjugados de proteína de acuerdo con la reivindicación 55, en donde el enlace es un enlace no covalente. 58. Conjugados de proteína de acuerdo con la reivindicación 55, en donde el ligando y la proteína quimérica están enlazados por medio de secuencias conectoras de dominio de heterodimerización, tal como secuencias que codifican para un cierre de leucina. 59. Proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde su estructura cuaternaria es un decámero.