ES2413159T3 - Proteínas quiméricas aisladas de lumazina sintetasa modificada - Google Patents

Abstract

Proteína quimérica aislada que consiste en un péptido, un polipéptido o un dominio proteicoligado covalentemente a una proteína lumazina sintetasa modificada de Brucella spp., en dondelos primeros 8 residuos de aminoácidos N-terminales han sido eliminados y el noveno Asn (N) hasido reemplazado por Leu (L).

Description

Proteínas quiméricas aisladas de lumazina sintetasa modificada

Proteínas quiméricas aisladas que incluyen hasta diez copias de péptidos, polipéptidos o dominios proteicos insertados en los extremos amino terminales de la enzima lumazina sintetasa de Brucella spp. Secuencias aisladas de nucleótidos que codifican las proteínas quiméricas. Vectores, plásmidos y células transformadas utilizados para expresar las proteínas. Anticuerpos monoclonales y policlonales inducidos por las proteínas quiméricas. Hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales. Vacunas y compuestos farmacéuticos que incluyen las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos y anticuerpos. Un metódo para inducir una respuesta inmune en organismos superiores que incluye la administración de cantidades efectivas de las vacunas y compuestos farmacéuticos. Biosensores que incluyen las proteínas quiméricas. Conjugados proteicos formados por las proteínas quiméricas y un ligando unidos mediante enlaces covalentes y no covalentes. Usos de las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos, vectores, plásmidos, células transformadas, anticuerpos, hibridomas, conjugados, biosensores, vacunas y composiciones farmacéuticas. La estructura cuaternaria de las proteínas quiméricas.

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas formadas por proteínas modificadas derivadas de la enzima lumazina sintetasa de Brucella spp., ligadas a péptidos, polipéptidos o dominios proteicos. Las proteínas quiméricas son útiles para la inducción de respuestas inmunes en animales superiores y para otros propósitos. La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que incluyen antígenos o anticuerpos, o segmentos de antígenos o anticuerpos, unidos a las proteínas modificadas.

La aplicación masiva de vacunas atenuadas vivas ofrece varios inconvenientes económicos y sanitarios. Por ejemplo, la atenuación de vacunas vivas a menudo disminuye la inmunogenicidad de las mismas. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19(7):300-302, (1998); Nieba, et al., Mod. Asp. Immunobiol., 1(2):36-39 (2000). Otro inconveniente es la posibilidad de que la atenuación se revierta y que el microorganismo recupere sus propiedades de inducción de la enfermedad. Ver Redfield, N., N. Eng. J. Med., 316:673-678 (1998). Es por ello que en los últimos años se ha tendido a formular vacunas acelulares, basadas en compuestos individuales aislados de bacterias o virus. En general, estos compuestos individuales, como proteínas características de un microorganismo, poseen baja inmunogenicidad. Esta limitación ha sido superada mediante el uso de sustancias adyuvantes. Sin embargo, existen proteínas que aún en presencia de sustancias adyuvantes continúan mostrando baja inmunogenicidad. Varias estrategias de ingeniería de proteínas han sido propuestas para superar estas dificultades. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19(7):300-302 (1998).

Las proteínas de cápside virales son capaces de formar partículas ordenadas tridimensionalmente, las llamadas “partículas tipo virus”. Estas partículas tienen el mismo tamaño y forma que los virus enteros. Sin embargo, se encuentran vacías en su interior y sin el material genético dejándolas incapaces de producir infección. Su gran tamaño y orden les otorga una marcada inmunogenicidad. Ver Bachmann, et al., Science, 262:1448-1451 (1993). La vacuna recombinante contra la hepatitis B, de amplia aceptación en el mercado, se fundamenta en este concepto. Las “partículas tipo virus” han sido utilizadas como un vehículo para la inserción de péptidos característicos de ciertos patógenos con el objeto de producir vacunas contra dichos microorganismos patogénicos. Ver WO0032227 (Renner, et al.); WO0185208 (Bachmann, et al.). Una estrategia favorita ha sido la inserción de copias múltiples de un péptido en un vehículo muy inmunogénico de por sí, a fin de proveer al péptido de carácter adyuvante del vehículo. Sin embargo, este acercamiento ha encontrado muchas dificultades: debido al gran tamaño de estas partículas, cualquier inserción de un péptido en su proteína componente obstruye su propio plegamiento, y en muchos casos disminuye su estabilidad. Además, son pocos los sitios de la proteína que son capaces de aceptar inserciones de péptidos sin cambiar su estructura general. Ver Nieba, et al. Mod. Asp. Immunobiol., 1(2):36-39 (2000).

Algunas proteínas bacterianas han sido postuladas como vehículos para el desarrollo de vacunas quiméricas. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19(7):300-302 (1998). La subunidad B de la toxina colérica es una proteína pentamérica estable que ha sido utilizada para obtener respuesta inmune de mucosas contra péptidos insertados. Esta estrategia ha sido exitosa debido a la capacidad de toxina para penetrar por la mucosa gástrica. Ver Arakawa, et al. Nature Biotech., 16:934-938 (1998). La enzima dihidrolipoil deshidrogenasa de Bacillus steearothermophilus también ha sido postulada como vehículo proteico debido a que forma una estructura polimérica compleja y muy estable. Ver Domingo, et al., J. Mol. Biol., 305:259-267 (2001); WO0142439 (Domingo, et al.).

La enzima lumazina sintetasa cataliza el anteúltimo paso en la vía biosintética de la riboflavina. Ver Goldbaum, et al.,

J. Med. Microbiol., 48:833-839 (1999). Su sitio activo se encuentra en la interfase entre monómeros, haciendo que esta proteína adquiera un ordenamiento polimérico muy estable. Ver Ritsert, et al. J. Mol. Biol., 253:151-167 (1995). Estos ordenamientos varían entre proteínas que forman partículas pentaméricas e icosahédricas. Ver Braden, et al.,

J. Mol. Biol., 297:1031-1036 (2000). La estructura icosahédrica de la lumazina sintetasa de B. subtilis ha sido propuesta como un vehículo para la inserción de péptidos y el desarrollo de vacunas. Ver WO0053229 (Bacher, et al.).

La lumazina sintetasa de Brucella spp. es una proteína altamente estable. Se ha demostrado que esta proteína de 18 kDa es un marcador útil para el diagnóstico serológico de brucelosis humana y animal. Ver Goldbaum, et al., J. Clin. Microbiol., 30:604-607 (1992); Goldbaum, et al., J. Clin. Microbiol., 31:2141-2145 (1993); Baldi, et al., Clin. Diag. Lab. Immunol., 3 (4):472-476 (1996). De acuerdo a estudios inmunoquímicos, de función enzimática y de estructura tridimensional por cristalografía de rayos X la proteína original sin modificar muestra el mismo plegamiento cuando es expresada en forma recombinante como la proteína salvaje. Ver Braden, et al. J. Mol. Biol., 297:1031-1036 (2000); Goldbaum, et al., J. Med. Microbiol., 48:833-839 (1999); Goldbaum, et al., J. Struct. Biol., 123:175-178 (1998). La estructura muestra que esta proteína de 18 kDa se comporta como un decámero de 180 kDa en solución, constituyéndose en un nuevo tipo de arreglo cuaternario de lumazina sintetasa. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem., 279(9):8093-8101 (2004).

Se ha postulado que la inmunogenicidad de la lumazina sintetasa de Brucella spp. se debe fundamentalmente a su característica polimérica. Ver Baldi, et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 33:741-747 (2000). La estructura también muestra que el extremo amino terminal de 10 aminoácidos no participa en el plegamiento general ni en los contactos entre monómeros. Ver Braden, et al. J. Mol. Biol., 297:1031-1036 (2000). La lumazina sintetasa de Brucella spp. es un inmunógeno potente, capaz de producir una alta respuesta inmune humoral y celular en el modelo murino. Esta capacidad ha sido verificada cuando la inmunización es inducida con la proteína recombinante no modificada, y con un plásmido que codifica para la proteína (terapia génica, vacunación con ADN). Ver Velikovsky, et al., J. Immunol. Meth., 244(1-2):1-7 (2000). Es posible modular la respuesta cambiando la vía de inmunización y el adyuvante utilizado. Ver Velikovsky, et al., Infec. Immun., 70(5):2507-11 (2002). En particular, es posible generar una fuerte respuesta de tipo TH1, que sería la respuesta de mayor capacidad protectora en brucelosis. Ver Velikovsky, et al. Infec. Immun., 70(5):2507-11 (2002).

Velikowsky, et al. Infection and Immunity, 71(10), Oct.2003, p. 5750-5755 describe eficacia immunogénica y protectiva de la lumazina sintetasa recombinante de Brucella ssp. en ratones.

Toledo et al. Infection and Immunity, 69(3), Mar.2001, p.1766-1773 describe antígenos recombinantes KETc1 y KETc12 compartidos por Taenia crassiceps y Taenia solium, mejorando la inmunoprotección en contra de la cisticercosis experimental por T. crassiceps.

Dichaine et al. (Molecular and Cellular Biology, American Society for microbiology, Washington US, vol.20 (15), Aug.2000, p.5592-5601 describe las proteínas Staufen-1 humanas y murinas y su caracterización estructural, estructura de dominio, incluyendo el dominio RBD3.

WO 00/53229 describe proteínas de fusión immunogénicas que comprenden la lumazina sintetasa de diversos microorganismos que incluyen entre otros Brucella abortus.

Zylberman et al., J.Biol.Chem., 2004, 279(9), p.8093-8101 describe la disposición cuaternaria decamérica de lumazina sintetasa de Brucella sp. Sin embargo, persiste todavía en el arte la necesidad de nuevos vehículos con estructuras estables más pequeñas que sean útiles para la presentación de péptidos, polipéptidos y proteínas, en general, y de antígenos o agentes inductores de respuesta inmune, en particular. El desarrollo y uso de la estructura decamérica de la lumazina sintetasa como un vector de este tipo no han sido descriptos en el arte.

Depósito de Microorganismos

El plásmido pBLS-OMP31 fue depositado el 1 de abril de 2004, bajo el número de acceso DSM 15546 en DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemania.

Diagramas

La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica y de aminoácidos del extremo 5' del gen de la BLS clonado en el vector de expresión pET11a (Novagen, USA) y el cassette generado. La sección en negrita muestra la región codificante. La sección en rojo muestra las bases mutadas en el cassette. La sección resaltada en amarillo muestra los nuevos sitios de restricción.

La Figura 2 muestra los oligonucleótidos utilizados para generar la quimera BLS-OMP31. El apareo de los mismos produce la aparición de sitios cohesivos correspondientes a las enzimas de restricción NsiI (extremo 5’) y AflII (extremo 3’), ubicándose entre ellos la secuencia de 27 aminoácidos insertada en la quimera (abajo, en negrita). Se muestra también el peso molecular teórico del monómero de proteína resultante (19.977,5 Daltons) y el punto isoeléctrico teórico (p1 = 6,00) del péptido insertado.

La Figura 3 muestra: a) el esquema del plásmido pET11a conteniendo la secuencia de la quimera BLS-OMP31, mostrando los sitios de restricción utilizados en el clonado, b) la secuencia nucleotídica completa del plásmido pET11a conteniendo la quimera BLS-OMP31 y c) el marco abierto de lectura de la quimera BLS-OMP31.

La Figura 4 describe la expresión de BLS-OMP31 analizada por SDS-PAGE al 17 % de acrilamida. PM: Marcadores de Peso Molecular en KiloDaltons, 1: BLS purificada. 2 y 3: Alícuotas de cultivo de expresión de dos clones de BLS-OMP31. Por tratarse de un gel desnaturalizante, la proteína migra como un monómero de 20 KDa.

La Figura 5 describe la expresión de BLS-OMP31 analizada por SDS-PAGE al 17 % de acrilamida. 1: Cultivo sin inducir. 2: Cultivo inducido con 1 mM IPTG. 3: Fracción citoplasmática. 4: Fracción de cuerpos de inclusión resuspendidos en urea 8M. La flecha señala las bandas correspondientes a BLS-OMP31. (LMWM = marcadores de peso molecular bajo; su peso se indica en kilodaltons).

La Figura 6 muestra el cromatograma correspondiente a la elución de BLS-OMP31 en columna Superdex 200 (Pharmacia, USA). Se numeran los picos analizados luego por gel. Ver Figura 7.

La Figura 7 muestra los datos de la purificación de BLS-OMP31 analizada por SDS-PAGE al 17 % de acrilamida. Los números 1 y 2 corresponden a los picos obtenidos por gradiente de elución de BLS-OMP31 a través de una columna de Q-Sepharose (Pharmacia, USA). Los números 4 y 5 corresponden con la numeración de los picos en la Figura 6. (LMWM = marcadores de peso molecular bajo; se indica su peso en kilodaltons).

La Figura 8 muestra los espectros de dicroísmo circular de BLS y la quimera BLS-OMP31. Se monitoreó la elipticidad molar de una solución de 1,0 !M de proteína entre 190 y 260 nm en un espectropolarímetro (Jasco, UK).

La Figura 9 describe un análisis comparativo de la estabilidad de la quimera BLS-OMP31 con respecto a la proteína salvaje. Las curvas muestran la sensibilidad al desplegamiento en presencia de concentraciones crecientes del agente químico desnaturalizante clorhidrato de guanidinio, evaluada por la elipticidad desarrollada por la proteína en un espectropolarímetro a 222 nm.

La Figura 10 muestra la antigenicidad de BLS-OMP32 por ELISA. Se utilizaron masas de 1 !g, 0,25 !g, 0,1 ug y 20 ng de BLS-OMP31 y BLS como antígenos. Mab Anti-BLS (1/1000) y Mab Anti-OMP31 (1/1000) se utilizaron como anticuerpos.

La Figura 11 muestra la inmunogenicidad de BLS-OMP31 analizada por ELISA. Se muestra la reactividad de diluciones 1/100 de sueros de ratones inmunizados con BLS-OMP31 con adyuvante ("AF") o sin adyuvante ("PBS") contra OMP31. Los sueros de cada grupo se ordenaron por reactividad decreciente. Se indica con línea de puntos la reactividad de un suero pre-inmune (control negativo). Un ratón del grupo AF murió antes de la extracción.

La Figura 12 muestra los resultados de una prueba ELISA de titulación de sueros de conejo anti BLS-OMP31. Se ensayó la reactividad de los tres sueros contra OMP31. Se utilizó como suero negativo una dilución 1/100 de un suero anti BLS salvaje de conejo. Se muestra en línea de puntos la reactividad de este suero.

La Figura 13 describe la reactividad del suero de conejo anti BLS-OMP31 (4ta dosis) contra bacteria entera

B. melitensis H38 lisa o rugosa. A los valores mostrados se restó la reactividad correspondiente a un suero de anti BLS salvaje de conejo, el cual se tituló en simultáneo contra ambos antígenos. Los errores corresponden a la suma de errores estándar de la media.

La Figura 14 muestra la cinética de anticuerpos IgG totales anti-OMP31 en lotes de ratones BALB/c (8 por grupo) inmunizados en 4 ocasiones por vía intramuscular e intradérmica con 100 !g de pCI-BLS-OMP31. Se analizaron los niveles de anticuerpos cada 15 días por ELISA. Los valores representan la media de los 8 animales ± D.E. Las flechas indican el momento de la inmunización. Los sueros de los ratones pCI (control) presentaron DO similares o inferiores al “cut-off”.

La Figura 15 describe: a) la secuencia de los oligonucleótidos utilizados para obtener la quimera BLS-KETc1, b) las secuencias nucleotídicas completas del plásmido pET11a conteniendo la quimera BLS-KETc1 y c) el marco abierto de lectura de la quimera BLS-KETc1 y su secuencia de aminoácidos.

La Figura 16 muestra el esquema de la estrategia general para producir quimeras mixtas.

La Figura 17 muestra los resultados de la purificación y análisis de las quimeras mixtas generadas entre las quimeras BLS-OMP31 y BLS-KETc1. A: análisis por cromatografía de intercambio aniónico en columna MonoQ de las quimeras BLS-OMP31 (pico 3) y BLS-KETc1 (pico 1) replegadas y de la mezcla estequeométrica de ambas (pico 2). B1: análisis mediante SDS-PAGE de los picos 1, 2 y 3 obtenidos en la cromatografía de intercambio aniónico. B2: análisis mediante PAGE nativo de las quimeras puras BLS-OMP31 y BLS-KETc1 y del pico 2 correspondiente a las quimeras mixtas.

La Figura 18 muestra la inmunogenicidad de la quimera mixta BLS-OMP31-KETc1 analizada por ELISA. La reactividad de diluciones 1/100 de sueros de ratones inmunizados con BLS-OMP31-KETc1 (barras vacías) contra BLS y contra los péptidos sintéticos OMP31 y KETc1. En barras grises se indica la reactividad de un suero pre-inmune (control negativo) contra los mismos antígenos.

La Figura 19 muestra la proliferación in vitro de esplenocitos inducida por inmunización con BLS-KETc1. Se indica el promedio más la desviación estándar de la incorporación de timidina titulada (en cpm) después de la estimulación in vitro de esplenocitos de ratones previamente inmunizados con el péptido KETc1 o BLS-KETc1 emulsificados en saponina. * Incremento significativo en cpm con respecto a esplenocitos incubados con medio de cultivo (P < 0,05).

La Figura 20 describe la secuencia nucleotídica y aminoacídica de la quimera BLS-RBD3. En rojo se encuentra representada la secuencia codificante del dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina. La secuencia codificada de BLS truncada en los primeros 8 residuos de su extremo amino Terminal se muestra en negrita.

La Figura 21 muestra la estructura de la quimera BLS-RBD3 (panel A: vista lateral, panel B: vista superior). La estructura fue modelada con el programa MacroModel fusionando el extremo C-terminal de la estructura teórica del dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina (en gama de azules) con el extremo N-terminal de la estructura cristalográfica de BLS (Protein DataBank file pdb: 1DIO) (en gama de rojos). La estructura teórica del dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina fue construida a través de un modelado por homología con la estructura del dominio RBD3 de la proteína Staufen de Drosophila melanogaster (pdb: 1EKZ). La figura fue construida con el programa CHIMERA.

La Figura 22 muestra: A: la separación de la quimera BLS-RBD3 por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida 15 % (P/V), en la calle de la derecha fueron corridos una serie de marcadores de diversos pesos moleculares. B: el espectro de dicroísmo circular en el UV lejano de la quimera BLS-RBD3. La figura muestra en forma comparativa el espectro de la quimera medido experimentalmente (línea continua) y su espectro teórico (línea punteada), calculado a partir de la combinación de los espectros correspondientes a la proteína BLS y el dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina en forma aislada. La medición fue realizada en un buffer Tris/HCl 50 mM, NaCl 1,2 M, pH 8, a 4°C. C: determinación del peso molecular de la quimera BLS-RBD3 mediante el uso de un detector de dispersión de luz conectado en serie a la salida de una columna de filtración molecular y un detector de índice de refracción (LR). BLS-RBD3 fue corrida en una columna Superdex-200 y eluida con un buffer 50 mM Tris/HCl, urea 3 M, NaCl 1 M, pH 8, a un flujo de 0,5 ml/min. El eluído fue monitoreado a través de la medición de su señal de dispersión de luz a 90 grados y refracción de luz (RL). El peso molecular de la muestra fue calculado comparando la relación de sus señales de dispersión y refracción de luz, con la de una muestra de seroalbumina bovina (BSA) utilizada como patrón de referencia (peso molecular de BSA: 66,5 kDa).

La Figura 23 muestra la densidad óptica obtenida a 492 nm de la dilución 1/100 de los sueros analizados para cada uno de los ratones de cada grupo experimental. Se muestra como ejemplo representativo el resultado obtenido a los 30 días después de la segunda inmunización. La línea horizontal representa la media de cada grupo.

La Figura 24 muestra los resultados de una prueba ELISA Mab anti-OMP31.

La Figura 25 muestra la detección del anticuerpo monoclonal anti-OMP31, AcMo 37F7, utilizando un biosensor formado por derivatización con la proteína quimérica BLS-OMP31.

La Figura 26 muestra la expresión de moléculas coestimulatorias en células dendríticas estimuladas con BLS. Se incubaron células dendríticas derivadas de médula ósea durante 18 hs con BLS (BLS 10 !M) o con medio solo (control). Se muestra la expresión de CD40 en células CD11c+ (A) y de I-Ad en CD11c+ (B). En cada gráfico se muestran a la izquierda los controles de isotipo.

La Figura 27 muestra la estrategia seguida para formar arreglos moleculares con péptidos heterodiméricos complementarios incorporados en la proteína BLS modificada y un antígeno diana teórico X. Ver Braden, et al., supra. Se utilizó un software de modelado Swisspdbviewer.

La Figura 28 muestra la secuencia de nucleótidos del gen del inserto BLS-RR12EE345L clonado en el vector de expresión pEt11a (Novagen, U.S.A). La sección en letras rojas muestra la región codificante del péptido inserto BLS-RR12EE345L. La sección en negrita muestra la región codificante para la proteína BLS modificada.

La Figura 29 describe las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína de fusión BLS-RR12EE345L. La sección en letras rojas muestra la región codificante del péptido RR12EE345L. La sección en negrita muestra la región codificante para la proteína modificada BLS. La sección en verde muestra la posición del residuo K49 sustituido con serina.

La Figura 30 muestra la separación de la proteína de fusión BLS-RR12EE345L mediante BLS-PAGE en un gel de poliacrilamida 17 %. 1: marcadores de peso molecular, 2: muestra irrelevante, 3: proteína de fusión BLS-RR12EE345L.

La Figura 31 muestra la evaluación del peso molecular de la quimera BLS-RR12EE345L mediante el uso de un detector de dispersión de luz conectado en serie a la salida de una columna de filtrado molecular y un detector de índice de refracción (LR).

Se corrió BLS-RR12EE345L en una columna Superdex-200 y se eluyó con un buffer de Tris/HCl 50 mM, urea 3 M, NaCl 0,1 M, pH 8, a un caudal de 0,5 ml/min. La elución se monitoreó midiendo su señal de dispersión de luz a 90º y refracción de luz (RL). El peso molecular de la muestra fue calculado comparando la relación de sus señales de dispersión de luz y de refracción con aquellas de una muestra de seroalbúmina bovina utilizada como patrón de referencia (peso molecular de BSA: 66,5 kDa).

La Figura 32 muestra la secuencia nucleotídica del gen del péptido inserto RR12EE345L clonado en el vector de expresión pGEX-4T1 (Novagen U.S.A.). La secuencia está insertada entre los sitios de restricción BamH1 y EcoR1 del vector. La sección en negrita muestra la región que codifica para la proteína GST. La sección en rojo muestra la región que codifica para el péptido RR12EE345L.

Descripción de la invención

La presente invención describe proteínas quiméricas útiles, en general, para la presentación de péptidos, polipéptidos y proteínas. Los péptidos, polipéptidos y proteínas mostrados en la presente pueden inducir respuesta inmune o servir para otros fines útiles.

De acuerdo con la reivindicación 1 las proteínas quiméricas aisladas son el objeto de la presente invención.

La presente invención describe además composiciones farmacéuticas y vacunas de alto valor y efectividad inmunogénicos. Estas composiciones y vacunas contienen las proteínas quiméricas de acuerdo con la reivindicación

1.

Las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud pueden presentar péptidos, polipéptidos, proteínas o moléculas de otros tipos característicos de numerosos patógenos y no patógenos.

Más específicamente, las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud pueden ser útiles para el tratamiento y prevención de enfermedades en seres humanos. Estas entidades pueden servir para la inoculación de antígenos, toxinas y dominios proteicos con baja o sin actividad inmunogénica. Ejemplos de estas indicaciones serían la vacunación en contra del sarampión común, sarampión alemán (rubéola), hepatitis, tétano, pertussis, poliomielitis, difteria, paperas, meningitis y rabia en infantes. Otros ejemplos de estas indicaciones son la vacunación en contra de las hepatitis A, B y C, influenza, encefalitis, rabia, fiebre tifoidea, fiebre amarilla, hérpes simple, varicela zóster, dengue, virus del papiloma humano, cólera, malaria, tuberculosis y paperas en adultos. Otros ejemplos de estas indicaciones son vacunas aplicables para contrarrestar bioterrorismo, para los siguientes patógenos: toxina Botulínica, Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Bacillus subtilus, Bacillus thuringiensis, virus de la conjuntivitis hemorrágica (Enterovirus 70) y rotavirus.

Estas entidades también pueden utilizarse para el tratamiento de condiciones crónicas, como el mal de Alzheimer, el mal de Parkinson y la artritis reumatoidea u otras condiciones, como alergias y tumores. Un ejemplo de esta última aplicación, podría consistir en una proteína quimérica conteniendo simultáneamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra marcadores tumorales, y elementos radiactivos para radioterapia. Las proteínas quiméricas desarrolladas de acuerdo con la presente invención y los anticuerpos derivados de las mismas, también pueden ser útiles para el diagnóstico de fertilidad y embarazo, o de enfermedades como el cáncer de colon, pulmonar, mamario y prostático. Estas entidades además podrían ser útiles para el monitoreo y control del abuso de drogas o del progreso de tratamientos terapéuticos. Las proteínas quiméricas descriptas en la presente invención también tienen múltiples usos en la crianza de animales domésticos, de granja y peces. Estas entidades pueden servir para preparar vacunas contra la Brucella spp., un agente bacteriano que produce grandes inconvenientes en ganado vacuno, o contra la Piscirickettsia salmonis, que afecta principalmente la crianza comercial del salmón. Además, estas entidades pueden ser útiles para administrar agentes antibacterianos, como penicilina, amoxicilina u otros derivados de la penicilina, en combinación o no con anticuerpos específicos a animales domésticos, como gatos y perros, o de granja, como ganado vacuno.

Otros posibles usos de las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud son la preparación de vacunas contra Mycoplasma hyopneumoniae, un agente neumónico que produce grandes pérdidas en el ganado porcino, y la administración de parasiticidas, como albendazole, fenbendazole e ivermectina contra Ostertagia ostertagi, a terneros y ganado vacuno en general. También sería posible utilizar estas nuevas entidades para administrar parasiticidas, como abamectina y praziquantel, al ganado equino y para la vacunación con epítopes de antígenos o dominios proteicos virales, como la influenza aviaria, a aves. En todos los casos la proteína quimérica puede contener simultáneamente, el agente parasiticida y los anticuerpos específicos contra el párasito involucrado. Un uso terapéutico adicional de las nuevas entidades sería la administración de agentes anti-inflamatorios, como carprofen a animales domésticos, como perros y gatos.

Las proteínas quiméricas de acuerdo con la presente invención podrían tener también indicaciones distintas al control de patógenos. Estas entidades podrían ser utilizadas para modificar la expresión de ciertas hormonas para acelerar la tasa de crecimiento e incrementar la producción de leche, en animales de granja o hacer su carne más magra. Un ejemplo de estas indicaciones no convencionales sería el uso de estas entidades para la inmunocastración de animales de granja como el ganado porcino.

Las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud también pueden utilizarse para la producción a gran escala de vacunas y anticuerpos en plantas transgénicas. De acuerdo a este enfoque, la vacuna o anticuerpo se expresaría primeramente en una planta adecuada. La vacuna o anticuerpo luego se extraerá de la planta y se purificará para preparar una formulación farmacéutica. Otra posibilidad sería alimentar animales con plantas transformadas con las entidades descriptas en la presente para inmunizar mediante la ingesta de alimento (vacunas comestibles).

Una ventaja particular de la presente invención es que los vehículos descriptos en la presente invención son capaces de llevar péptidos más grandes que otros vehículos conocidos en el arte, tales como las “partículas tipo virus”. Esta ventaja se debe a su menor tamaño y mayor estabilidad. Este sistema de presentación antigénica de los vehículos descriptos en la presente posee la ventaja adicional de presentar los péptidos, polipéptidos y proteínas insertadas en forma repetida y espacialmente ordenada, aumentando su estabilidad y vida media. La proteína portadora (BLS) tiene además un efecto adyuvante considerable sobre los péptidos, polipéptidos y proteínas insertadas potenciando de esta manera la efectividad de la respuesta inmune.

Otra ventaja de la presente invención es que la proteína portadora BLS induce una respuesta inmune por sí en ausencia de adyuvantes adicionales. Esta característica facilita la administración de vacunas preparadas de acuerdo con la presente invención por diversas vías de administración (por ejemplo, intravenosa, nasal, oral, “sin aguja”) con

o sin adyuvantes.

Los compuestos farmacéuticos y vacunas descriptas en esta solicitud se distinguen por su alta estabilidad a temperatura ambiente. Esta característica haría posible conservar el compuesto o vacuna sin necesidad de mantener una cadena de frío estricta de almacenamiento.

La generación de quimeras mixtas con múltiples péptidos insertados en los distintos extremos de la proteína portadora BLS es útil también para el diseño de vacunas multivalentes o vacunas dirigidas a distintas vías de respuesta inmune. La opinión prevaleciente en el arte es que una vacuna no debería contener más de 10 agentes inductores de respuesta inmune. Otra opinión prevaleciente en el arte es que la vacuna debería contener 5 ó menos agentes inductores para obtener resultados óptimos.

Las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud pueden servir para la producción de anticuerpos. Estos anticuerpos y sus entidades asociadas podrían utilizarse en diagnóstico. También es posible desarrollar kits para el diagnóstico de enfermedades utilizando los anticuerpos y las entidades asociadas antedichas.

Varias de estas entidades desarrolladas de acuerdo con la presente invención podrían ser utilizadas además para la presentación de péptidos y la construcción de bibliotecas de proteínas, y sus aplicaciones asociadas (por ej. biología combinatoria aplicada a la identificación de moléculas para el desarrollo de drogas, o a la identificación de secuencias polipeptídicas que unen preferentemente compuestos inorgánicos, para aplicaciones nanobiológicas). Algunas de estas nuevas entidades también podrían ser utilizadas para la producción y ensamblado de aparatos nanotecnológicos o para llevar a cabo procesos nanotecnológicos.

Las proteínas quiméricas de acuerdo con la presente invención podrían ser utilizadas en la construcción y desarrollo de biosensores aplicados a la detección analítica de diversas sustancias y moléculas (por ej. detección de contaminantes o toxinas en agua, suelo o aire, detección de residuos de drogas, herbicidas y pesticidas en alimentos).

Otra ventaja de las entidades descriptas en la presente solicitud es su facilidad y bajo costo de producción. Las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud se obtienen en altas cantidades de un modelo de cepas transformadas de E. coli, un microorganismo de conocido manejo y cultivo. Las proteínas de interés obtenidas de acuerdo con este método se purifican con facilidad del medio de cultivo.

Las proteínas quiméricas aisladas reivindicadas en la presente están formadas por un péptido, polipéptido o proteína conectado a una proteína mutada de lumazina sintetasa de Brucella spp. cuya secuencia de nucleótidos codificante ha sido modificada en sus primeros 8 residuos N-terminales para permitir su corte por enzimas de restricción que no cortan naturalmente a la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína salvaje lumazina sintetasa de Brucella spp. La secuencia de nucleótidos codificante de la proteína mutada de lumazina sintetasa de Brucella spp. ha sido modificada en sus primeros 8 residuos N-terminales con el objeto de permitir su corte por las enzimas de restricción Nsi I y Afl II. Preferentemente las proteínas mutadas de lumazina sintetasa utilizadas de acuerdo con la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7a . El péptido, polipéptido o proteína conectado puede ser homólogo o heterólogo. En una versión de la presente invención, el péptido ligado a la proteína mutada es un dominio de heterodimerización. Preferentemente este dominio de heterodimerización es un dominio de “zipper de leucinas”. Las proteínas quiméricas obtenidas de este modo, incluyen pero no se limitan a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8a, y son utilizadas preferentemente para el acople de dominios proteicos, proteínas completas y/u otras entidades no proteicas. En otra realización de esta invención se reivindican también las combinaciones de proteínas quiméricas aisladas descriptas en la presente solicitud. También se reivindican los usos de estas proteínas quiméricas aisladas y de sus combinaciones.

En otra realización de la presente invención se reivindican las secuencias aisladas de nucleótidos codificantes para las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud. Estas secuencias pueden ser de ARN, de ADN genómico o ADN copia. En otra realización de la presente invención la secuencia codificante para el péptido, polipéptido o proteína conectado está ubicada en la región 5’ de la secuencia de nucleótidos codificante para la proteína mutada lumazina sintetasa de Brucella spp. En otra realización de la presente invención la secuencia codificante para el péptido, polipéptido o proteína ligado está ligada operativamente a la región 5’ de la secuencia de nucleótidos codificante para la proteína mutada lumazina sintetasa de Brucella spp. Preferentemente, se utilizan las siguientes secuencias de ADN: SEQ ID NO:1b, SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b, SEQ ID NO:7b. Ejemplos específicos de las secuencias de la proteína mutada utilizados en la presente invención, incluyen pero no están limitados a, las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura: a) BLS-OMP31 b) BLS-KETc1 y c) BLS-RBD3, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. En otra realización de esta invención se reivindican las combinaciones de secuencias de nucleótidos aisladas descriptas en la presente solicitud. También se reivindican los usos de estas secuencias de nucleótidos aisladas y sus combinaciones.

En otra realización de la presente invención se reivindican combinaciones de dichas proteínas quiméricas aisladas y las secuencias aisladas de nucleótidos descriptas en la presente solicitud.

En otra realización de la presente invención se reivindican los vectores que contienen las secuencias codificantes para las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud. Estos vectores pueden ser de origen bacteriano, viral u otro y son capaces de expresar o posibilitar la expresión de las proteínas quiméricas descriptas en la presente solicitud. Ejemplos específicos de estos vectores son los plásmidos pBLS-OMP31, pBLS- KETc1 y pBLS-RBD3, utilizados en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. Preferentemente, se utiliza el plásmido pBLS-OMP31, DSM 15546, como vector y como precursor para la generación de plásmidos que expresan las proteínas quiméricas descriptas en la presente solicitud. También se reivindican los usos de estos vectores.

En otra realización de la presente invención se reivindican las células o microorganismos transformados con los vectores descriptos en la presente solicitud. Estos microorganismos podrían ser procariotas, eucariotas o de otro tipo. Ejemplos específicos de células que pueden transformarse con los vectores descriptos en la presente solicitud, incluyen pero no están limitados a, células de insectos, bacterias, como Escherichia coli, y células de mamífero, como CHO, COS, BHK, Namalwa y HeLa. Más preferentemente, se utilizan cepas competentes de Escherichia coli para dichas transformaciones. También se reivindican los usos de estas células.

En una versión de la presente las proteínas quiméricas aisladas descriptas en la presente son capaces de inducir una respuesta inmune en un organismo eucariota. Estas proteínas quiméricas pueden inducir respuestas celulares o humorales en el organismo tratado. En estos casos, la respuesta puede ser en contra del mismo antígeno, toxina, dominio proteico o agente inductor o en contra de antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes inductores diferentes. Los antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes utilizados de acuerdo a la presente invención pueden ser de origen bacteriano, parasítico, viral u otro capaces de inducir una respuesta inmune. Ejemplos específicos de estos agentes inductores incluyen, pero no están limitados a: a) la secuencia de 27 aminoácidos de la proteína OMP31 de Brucella melitensis, b) la secuencia de 14 aminoácidos de la proteína KETc1 de Tenia solium y c) la secuencia de 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. En general, los organismos eucariotas tratados son aves, peces o mamíferos. Preferentemente, estos organismos son de origen murino, conejuno o humano. Más preferentemente el organismo es de origen humano. También se reivindica el uso de estas proteínas quiméricas capaces de inducir respuesta inmune.

En una versión de la presente las secuencias de nucleótidos codificantes para las proteínas quiméricas aisladas descriptas en la presente son capaces de inducir una respuesta inmune en un organismo eucariota. Estas secuencias de nucleótidos pueden inducir respuestas celulares o humorales en el organismo tratado. En estos casos la respuesta puede ser en contra del mismo antígeno, toxina, dominio proteico o agente inductor o en contra de antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes inductores diferentes. Los antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser de origen bacteriano, parasítico, viral u otro capaces de inducir una respuesta inmune. Ejemplos específicos de estos agentes inductores incluyen, pero no están limitadas a, las secuencias nucleótidas codificantes para los: a) 27 aminoácidos de la proteína OMP31 de Brucella melitensis, b) 14 aminoácidos de la proteína KETc1 de Tenia solium y c) 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. En general, los organismos eucariotas tratados son aves, peces o mamíferos. Preferentemente, estos organismos son de origen murino, conejuno o humano. Más preferentemente el organismo es de origen humano. También se reivindican los usos de estas secuencias de nucleótidos capaces de inducir una respuesta inmune.

En una versión de la presente invención se reivindican composiciones farmacéuticas o vacunas que contienen: 1) al menos un tipo de las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud, 2) al menos un tipo de la secuencias de nucleótidos codificantes para las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud o 3) una combinación de 1 y 2.

Las formulaciones farmacéuticas o vacunas reivindicadas en la presente solicitud pueden estar en forma líquida o en cualquier otra forma farmacéutica conocida en el arte, como lo son emulsiones inyectables. Las composiciones farmacéuticas o vacunas descriptas en la presente invención también pueden estar en forma de tabletas, soluciones líquidas, suspensiones o jarabes para administración oral o líquidos estériles como soluciones o suspensiones. Preferentemente, se utiliza un medio inerte, como medios salinos, buffers fosfato-salinos, y cualquier otro medio en el cual las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos, o partes de éstas, posean una solubilidad adecuada.

Los agentes activos de las composiciones farmacéuticas o vacunas reivindicadas en esta invención están presentes en dosis fisiológicas eficientes. Estos agentes activos pueden administrarse solos o en conjunción con excipientes farmacéuticos aceptables, como adyuvantes, para incrementar la producción de anticuerpos.

Las composiciones farmacéuticas o vacunas utilizadas de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, varias formulaciones oleosas como el adyuvante de Freund, estereato de tirosina, el dipéptido MDP, saponina, hidróxido de aluminio (alúmina), citoquinas linfáticas, la proteína salvaje de lumazina sintetasa de Brucella spp. y las proteínas mutadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. descriptas en la presente solictud. Ver US

4.258.029 (Moloney, et al.); US 5.057.540 (Kensil, et al.). Preferentemente, se utiliza estereato de tirosina, hidróxido de aluminio, la proteína salvaje de lumazina sintetasa de Brucella spp. y las proteínas mutadas descriptas en la presente en el caso de seres humanos. El adyuvante de Freund, aunque potente, no se utiliza usualmente en seres humanos. La composición farmacéutica o vacuna también pueden administrarse utilizando mecanismos de liberación lenta, tales como liposomas. Ver US 4.235.877 (Fullerton, W.). La preparación de vacunas y composiciones farmacéuticas para su uso en organismos superiores es conocida en el arte. Ver Remington, et al., Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1980; Voller, et al., Eds., New Trends and Developments in Vaccines, University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978.

La presente invención permite inducir una respuesta inmune en un organismo eucariota. El método relevante comprende la administración a dicho organismo de una cantidad efectiva de un compuesto farmacéutico o vacuna que incluye: 1) al menos un tipo de las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud, 2) al menos un tipo de las secuencias de nucleótidos codificantes para las proteínas quiméricas descriptas en esta solicitud ó 3) una combinación de 1 y 2). En una versión, se induce una respuesta humoral. En otra versión, se induce una respuesta celular. En otra versión, se inducen, de manera simultánea o secuencial, respuestas humorales o celulares. En estos casos las respuestas pueden ser en contra del mismo antígeno, toxina, dominio proteico o agente inductor o en contra de antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes inductores diferentes. Los antígenos, toxinas, dominios proteicos o agentes utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser de origen bacteriano, parasítico, viral u otro capaces de inducir una respuesta inmune. Ejemplos específicos de estos agentes inductores incluyen, pero no están limitados a, las secuencias nucleótidos codificantes para, o a las secuencias de aminoácidos de los: a) 27 aminoácidos de la proteína OMP31 de Brucella melitensis, b) 14 aminoácidos de la proteína KETc1 de Tenia solium y c) 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen, utilizadas en los Ejemplos 1, 5 y 8, respectivamente. Ejemplos de organismos que pueden tratarse con las vacunas y composiciones farmacéuticas descriptas en esta solicitud son aves, peces o mamíferos. Preferentemente, estos organismos son de origen murino, conejuno o humano. Más preferentemente el organismo es de origen humano. La administración de las vacunas o composiciones farmacéuticas descriptas en la presente invención puede ser en una o varias dosis. Preferentemente, la administración se realiza en una sola dosis. La administración puede además realizarse de forma subcutánea, intravenosa, intramuscular, oral, nasal o “sin agujas”. Preferentemente, se realiza de manera subcutánea o intramuscular. Los anticuerpos monoclonales y policlonales producidos en respuesta a la inmunización con dichas proteínas quiméricas y secuencias de nucleótidos descriptas en la presente. Además, se describen los hibridomas desarrollados para la expresión y producción de los anticuerpos descriptos en esta solicitud. Se describen los usos de estos anticuerpos para fines preventivos, terapéuticos, de diagnóstico y otros. Se describen también los compuestos farmacéuticos que contienen dichos anticuerpos y sus usos.

En otra realización de la presente invención se reivindican conjugados proteicos conformados entre las proteínas quiméricas descriptas en la presente y al menos un ligando. En una versión de esta invención, el enlace entre la proteína quimérica y el ligando es covalente. En estos casos, el enlace es preferentemente peptídico. En otra realización de esta invención, el enlace entre la proteína quimérica y el ligando es no-covalente.

En otra realización de la presente invención se reivindica la estructura cuaternaria típica de las proteínas quiméricas descriptas en la presente.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión “agente activo” se define como: 1) el ADN genómico, ADN copia, ARN mensajero, o partes de éstos, codificante para las proteínas quiméricas, o partes de éstas, descriptas en la presente solicitud y 2) las proteínas quiméricas, o partes de éstas, descriptas en la presente solicitud, 3) las combinaciones de 1) y 2) y 4) los conjugados protéicos formados entre las proteínas quiméricas descriptas en la presente y otras entidades, partes de éstas.

Tal como se emplea en la presente, la expresión “cantidad efectiva” se define como una cantidad suficiente para producir uno o más de los siguientes resultados: 1) inducir una respuesta inmune adecuada, ya sea humoral o celular, incluyendo la producción de anticuerpos en contra del agente inductor; 2) inhibir el crecimiento, desarrollo, tamaño y motilidad de la célula o microorganismo asociado al agente inductor. Cuando el agente inductor es un tumor, la “cantidad efectiva” será la cantidad suficiente para reducir el tamaño, evitar el crecimiento, inhibir la metástasis o el crecimiento del tumor, o aliviar la molestia causada por dicho tumor o prolongar la vida de un individuo que padece dicho tumor.

Tal como se utiliza en la presente, el término “mamífero” significa un animal vertebrado de sangre caliente cuya descendencia es alimentada con leche secretada por sus glándulas mamarias. El término “mamífero” incluye, pero no está limitado a, ratas, ratones, conejos, perros, gatos, cabras, vacas, ovejas, cerdos, primates y seres humanos. Tal como se utiliza en la presente, la expresión “composición farmacéutica o vacuna” se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el que se administra conjuntamente un agente activo. Incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, soluciones acuosas y gaseosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, retardadores o catalizadores, o sustancias similares. El uso de tales medios y agentes en la administración de sustancias activas farmacéuticas es conocido en el arte. Se contempla el uso de tal medio convencional con el agente activo salvo que el agente activo se vuelva inefectivo por el medio. Los principios activos suplementarios también pueden ser incorporados a agentes activos descriptos en la presente invención. El término “composiciones farmacéuticas o vacunas” incluyen, pero no están limitadas a, solventes o excipientes inertes, soluciones acuosas estériles y varios solventes orgánicos no tóxicos. Las “composiciones farmacéuticas o vacunas” no deberán reaccionar con, ni de ninguna otra forma reducir la eficacia o estabilidad, del agente activo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, agua, etanol, polietilenglicol, aceite mineral, petrolatum, propilenglicol, lanolina y agentes similares. Las “composiciones farmacéuticas o vacunas” para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación de dispersiones o soluciones inyectables estériles. En todos los casos, la formulación deberá ser estéril y deberá ser fluida en la medida en que posibilite una forma de dispensar en jeringa. También debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deberá estar preservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias, virus y hongos.

Tal como se emplea en la presente, la expresión “uso preventivo” significa la capacidad de inducción y generación de una respuesta inmune en contra de uno o más antígenos, toxinas, dominios proteicos u otros agentes inductores,

o partes de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión “administración secuencial” significa que: 1) el mismo agente activo se administra en más de una ocasión durante periodos consecutivos de tiempo ó 2) dos o más agentes activos se administran alternadamente en más de una ocasión durante períodos consecutivos de tiempo. En los casos donde la administración es “secuencial”, la diferencia de tiempo entre las administraciones de los agentes activos puede ser minutos, horas, días, semanas o meses dependiendo de sí el uso es preventivo o terapéutico y de la naturaleza del organismo tratado.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión “administración única o simultánea” significa que uno o más agentes activos son administrados en la misma ocasión de una sola vez.

Tal como se emplea en la presente, la expresión “uso terapéutico” se refiere a todo proceso, aplicación, terapia o acción similar, en la que un organismo superior, incluyendo a un ser humano, esté sujeto a asistencia médica con el objeto de mejorar la condición o resistencia a enfermedades de dicho organismo, ya sea directa o indirectamente.

Ejemplo 1

Construcción del gen quimérico BLS-OMP31

El ejemplo describe la estrategia utilizada para introducir la secuencia correspondiente a los aminoácidos 48 a 74 de la secuencia polipeptídica de la proteína OMP31 de Brucella melitensis en los diez amino terminales del decámero que forma la lumazina sintetasa de Brucella spp.

1. Mutación y Clonado

El plásmido pBLS-OMP31, de SEQ ID NO:9c, se obtuvo mediante el siguiente protocolo:

a) Para el clonado del gen codificante para la lumazina sintetasa de Brucella spp (BLS), la secuencia de la BLS fue obtenida por amplificación por PCR con primers específicos a partir de ADN genómico de B. abortus y clonada en el vector pET11a (Novagen, USA). El plásmido pET11-BLS conteniendo el marco abierto de lectura de la lumazina sintetasa de Brucella spp. fue luego digerido con las enzimas de restricción Bam HI y XbaI, y el inserto obtenido fue subclonado en el vector pALter-Ex1 (Promega, USA).

b) Se realizó una mutagénesis dirigida sobre la secuencia que codifica para el marco de lectura abierto de la lumazina sintetasa de Brucella spp (BLS). Esta secuencia fue clonada en el vector pALter-Ex1 (Promega, USA) usando el kit ALTERED sitesII (Promega, USA). Para el desarrollo del cassette, se insertaron dos nuevos sitios de restricción en la región 5' del gen de la BLS: un sitio Nsi I en los dos primeros codones del extremo 5'; y un sitio AFL II en los dos codones que comprenden los residuos 8 y 9 de la secuencia nativa de aminoácidos de BLS. Se consideró que estos sitios de restricción no ocurren ni en el gen de la BLS ni en el vector pET11a. Ver Figura 1.

c) La mutación fue verificada luego por secuenciación. El cassette que contiene la secuencia de BLS mutada (SEQ ID NO:1b), fue subclonado en el vector pET11a (Novagen, USA) para obtener el plásmido denominado de aquí en adelante pBLSm.

d) Para insertar la secuencia correspondiente al plásmido OMP31, se diseñaron dos oligonucleótidos de manera que al aparearse formaran un ADN de doble cadena conteniendo la secuencia codificante para los aminóacidos 48-74 de la proteína OMP31 de Brucella melitensis flanqueada por los extremos cohesivos propios de las enzimas de restricción Nsi I y Afl II. La Figura 2 muestra los oligonucleótidos diseñados para la construcción de pBLS-OMP31 y el inserto sintético formado por éstos.

e) El plásmido pBLSm fue digerido con las enzimas de restricción Nsi I y Afl II. La secuencia codificante correspondiente a los 8 primeros residuos de la BLS fue removida. La secuencia original de BLS fue intercambiada por la secuencia de nucleótidos del péptido insertado OMP31 en este caso.

f) el inserto sintético del paso anterior d) fue ligado al cassette abierto del pBLSm obtenido en el paso en e), por incubación de una noche utilizando la enzima T4 ADN ligasa, a 16°C. La inserción fue confirmada por secuenciación. De esta manera, se generó un gen con la secuencia SEQ ID NO:9b. El análisis de secuenciación mostró que se cambiaron los primeros 8 aminoácidos de la lumazina sintetasa de Brucella spp. por los 27 aminoácidos provenientes de la secuencia 48-74 de la proteína OMP31 de Brucella melitensis. A este marco abierto de lectura se denominó como quimera BLS-OMP31, de SEQ ID NO:9b. Su plásmido correspondiente se denominó pBLS-OMP31, de SEQ ID NO:9c. Ver Figuras 3b y c.

Esta experiencia se repitió utilizando las secuencias de ADN de la BLS mutada SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b y SEQ ID NO:7b. Se obtuvieron resultados similares.

2. Transformación

Una cepa competente de bacteria E. coli BL21 (DE3) fue transformada mediante choque térmico con el plásmido pBLS-OMP31 obtenido de acuerdo con el protocolo anterior. Posteriormente, las bacterias fueron cultivadas en placas de agar conteniendo LB-agar/ampicilina para seleccionar aquellas transformadas con el plásmido. Para las pruebas de expresión en escala pequeña, 2 ml de medio LB/ampicilina se inocularon a una colonia extraída de la placa de agar. La colonia se incubó a 37°C con agitación. El cultivo saturado se indujo con 2 !l de IPTG 1M. Tres horas más tarde, 100 !l de cultivo se removieron y se centrifugaron. El pellet resultante se resuspendió en 25 !l de buffer muestra 1X para su análisis por SDS-PAGE 17 %. Ver Figura 4.

3. Expresión y Purificación de la Proteína Quimérica BLS-OMP31

Se cultivó un precultivo de 5 ml de las cepas transformadas según el paso anterior a saturación, con el cual se inocularon 500 ml de LB/ampicilina. El cultivo se incubó con agitación a 37°C. Se indujo con 0,5 ml de IPTG (1M) para alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 0,6-0,8. El cultivo se retiró a las tres horas y se centrifugó a 4000 g por 20 min. El pellet se suspendió en 15 ml de solución de suspensión (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Tritón X-100 1 % pH = 8,0).

La suspensión fue sonicada durante 5 min a intervalos de 1 minuto cada 1 minuto y se centrifugó durante 30 min a

20.000 g. El pellet se resuspendió en 15 ml de solución de suspensión sin Tritón X-100 y se repitió el sonicado. El proceso se repitió una tercera vez. Los tres sobrenadantes de sonicado contenían la quimera expresada en citoplasma, mientras que el pellet final contenía cuerpos de inclusión. Ver Figura 5.

Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en buffer PBS con urea 8 M y se dejaron durante la noche a temperatura ambiente. La resuspensión se dializó contra PBS por dos días con un cambio de buffer. La muestra se centrifugó y el sobrenadante se dializó contra buffer A (50mM Tris/HCl, pH 8,5). El primer paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de intercambio aniónico MonoQ o Q-Sepharose (Pharmacia, USA) en equipo de FPLC (Pharmacia, USA). La muestra se inyectó en la columna equilibrada en buffer A y se eluyó por gradiente lineal hasta 50 % de buffer B (buffer A + 1 M NaCl).

El segundo paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de exclusión molecular Superdex 200 (Amersham, UK). Ver Figuras 6 y 7. Para esto el pico de la quimera se concentró en tubo Centriprep (Millipore, USA) e inyectó en la columna para elución con PBS. La presencia de la proteína quimérica en los picos se evalúo por SDS-PAGE.

La construcción del gen quimérico BLS-OMP31 se llevó a cabo utilizando técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Ver Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, New York, 1989; Brown, Gene Cloning, Chapman & Hall, London, England, 1995; Watson, et al., Recombinant DNA, 2nd Ed., Scientific American Books, New York, New York, 1992 y Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., New York, New York, 1986, Alberts, et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland Science, New York, New York, 2002.

Ejemplo 2

Estabilidad de la quimera BLS-OMP31

La primera evidencia de que la proteína quimérica BLS-OMP31 adoptó un plegamiento decamérico se obtuvo a partir de la técnica de dispersión de luz. Este procedimiento se utilizó para calcular el tamaño molecular de proteínas en solución. Para realizar estos ensayos se acopló una columna de exclusión molecular al detector de dispersión de luz. De manera que a medida que eluía la proteína de la columna, se determinaba su peso molecular.

Según esta metodología el peso molecular de BLS calculado fue de 163 kDa mientras que el de la quimera BLS-OMP31 fue de 215 kDa. Los pesos moleculares teóricos de los decámeros de BLS salvaje y BLS-OMP31 fueron de 174,4 y 197,8 kDa, respectivamente. Considerando que la exactitud del método es de un 90 %, este resultado sugiere que la quimera BLS-OMP31 forma un decámero, de manera muy parecida que lo hace la proteína BLS salvaje.

Mediante dicroísmo circular se estudió el plegamiento de las proteínas quiméricas. Las mediciones de dicroísmo circular se realizaron en un espectropolarímetro J-810 (Jasco, UK), configurado a velocidad de lectura 100 nm/min, tiempo de respuesta 4 s y ancho de banda 1 nm. Se utilizaron cubetas de cuarzo de 1, 2 o 5 mm (Hellma). Las muestras se ensayaron en buffer fosfato 50 mM pH 7. La superposición de los espectros de dicroísmo circular de la quimera BLS-OMP31 y de la BLS salvaje mostró que el plegamiento general de ambas proteínas fue muy similar. Ver Figura 8. En consecuencia, se confirmó que las proteínas quiméricas se plegaron correctamente en forma de decámeros, con estructura secundaria comparable a aquella de la proteína salvaje.

A continuación se estudió si las sustituciones del extremo N-terminal de las proteínas quiméricas comprometían su estabilidad. Para esto se estudió la desnaturalización inducida de las quimeras por hidrocloruro de guanidinio (Gdm-HCl) y por temperatura mediante dicroísmo circular.

A partir de las curvas de desnaturalización-equilibrio fue posible obtener diversos parámetros termodinámicos, tales como el cambio de energía libre asociado al desplegamiento. Con este parámetro, se evalúo la estabilidad conformacional típica de una proteína. Ver Pace, et al, Methods Enzymol., 131: 266-80 (1986). Para evaluar el cambio de energía libre asociado al desplegamiento de cada proteína, los datos experimentales se ajustaron a una curva teórica descriptiva. Este diagrama describe la correlación de la constante de equilibrio entre el estado plegado y el desplegado de la proteína quimérica y concentracies variables del agente desnaturalizante.

Para realizar estos experimentos, se incubó una misma cantidad de proteína (0,1 !M de decámero) con concentraciones crecientes del agente desnaturalizante. Las soluciones para cada punto de la curva se prepararon a partir de una solución madre de guanidinio-HCl 6 M (ICN, ultra puro), fosfato 50 mM, pH 7. Las muestras se incubaron tres horas a temperatura ambiente y se centrifugaron antes de la medición. Las mediciones de dicroísmo circular se realizaron en cubeta de 5 mm, a 25°C. Se comprobó que la desnaturalización por guanidinio es reversible en las condiciones utilizadas, tanto para la proteína salvaje BLS como para la proteína quimérica BLS-OMP31.

Las curvas de desnaturalización-equilibrio se ajustaron a un modelo de disociación en dos etapas. Según este modelo, el decámero se disoció en primer lugar generando dos pentámeros iguales. En una segunda etapa de la desnaturalización, cada uno de estos pentámeros se disoció adicionalmente en cinco monómeros desplegados. Las fórmulas que describen estas transiciones se dedujeron a partir de aquellas ya propuestas para proteínas monoméricas. Ver Zylberman, et al, J. Biol. Chem., 279(9):8093-8101 (2004).

Los valores termodinámicos obtenidos para la BLS salvaje y BLS-OMP31 muestran que el reemplazo del extremo Nterminal de la BLS no afectó la estabilidad del decámero. Ver Figura 9. Por lo tanto queda confirmado que las quimeras de BLS forman dímeros correctamente plegados y que su estabilidad es similar a aquella de la BLS salvaje.

Ejemplo 3

Antigenicidad e inmunogenicidad de la quimera BLS-OMP31

Se estudió la antigenicidad de BLS-OMP31, midiendo su capacidad de unirse a un anticuerpo monoclonal específico contra el péptido insertado (anticuerpo monoclonal A59/10F09/G10) y a un anticuerpo monoclonal específico contra la proteína BLS salvaje (anticuerpo monoclonal BI24). Ver Vizcaíno, et al., Infect. Immun., 69(11):7020-28, (2001); Goldbaum, et al., J. Clin. Microbiol., 31:2141-2145 (1993). Este procedimiento permite ensayar tanto la antigenicidad del péptido como del núcleo de la proteína. La antigenicidad se ensayó por ELISA. Ver Figura 10.

Se observó que BLS-OMP31 fue reconocida tanto por el anticuerpo monoclonal que reconoce BLS salvaje como por el anticuerpo monoclonal que reconoce el péptido insertado. La BLS salvaje fue solamente identificada por el primer anticuerpo, como esperado. Este resultado indica que el péptido insertado conservó sus propiedades antigénicas al ser presentado por la quimera. Se mostró que el plegamiento de la quimera no afectó la afinidad del anticuerpo anti-BLS por el núcleo de la proteína. Ambos anticuerpos detectaron hasta 20 ng de quimera por pocillo.

Luego, se evaluó la capacidad de BLS-OMP31 de generar respuesta inmune humoral específica contra el péptido insertado. Esta capacidad se analizó en ratones con y sin la asistencia de adyuvantes. Se trabajó con dos grupos de cinco ratones cada uno. El grupo "AF" recibió tres dosis, por vía intraperitoneal, de 25 μg de proteína en emulsión con un adyuvante de Freund a intervalos de 0,20 y 40 días. La primera dosis se aplicó con un adyuvante de Freund completo. Las dosis restantes fueron aplicadas con un adyuvante de Freund incompleto. El grupo "PBS" recibió el mismo tratamiento pero con la proteína quimérica inyectada sin adyuvante. Se extrajo sangre a los 7 días de la tercera inmunización y se ensayó la reactividad de los sueros contra la proteína de membrana OMP31 mediante ELISA. Ver Figura 11.

Se obtuvo una fuerte respuesta contra OMP31 en ratones inmunizados con la quimera y el adyuvante. También fue importante la respuesta serológica obtenida en ratones inmunizados con la proteína quimérica con y sin el adyuvante. Estos resultados demuestran que ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31 con y sin adyuvante desarrollan una respuesta inmune específica contra el péptido insertado.

Un conejo se inyectó con quimera BLS-OMP31 con adyuvante según el siguiente protocolo:

1era dosis, día 0: 200 !g de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + 1ml de adyuvante de Freund completo, inyección intramuscular.

2da dosis, día 22: 200 !g de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + 1ml de adyuvante de Freund incompleto (AFI), inyección subcutánea.

3ra dosis, día 45: 200 !g de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + 1ml de AFI, inyección intramuscular.

4ta dosis, día 155: 200 !g de BLS-OMP31 en 1 ml de PBS + 1ml de AFI, inyección subcutánea.

Se extrajeron muestras de sangre a los días 31, 52 y 180. Se centrifugaron las muestras y el suero se conservó congelado.

Los antisueros colectados luego de la 2da, 3ra y 4ta dosis de antígeno se titularon por ELISA contra la proteína de membrana OMP31. Ver Figura 12. El título de los antisueros ensayados fue de 3.200, 12.800 y 25.600 para los sueros correspondientes a la 2da, 3ra y 4ta dosis, respectivamente. La línea de base se definió como la máxima dilución capaz de identificar el antígeno frente al suero negativo. El conejo inmunizado desarrolló una fuerte respuesta inmune específica contra OMP31. Dado que el suero contra BLS salvaje no reconoció a OMP31, esta alta reactividad se debió a una respuesta de anticuerpos específicos contra el péptido insertado en la quimera. Ver Figura 13, control negativo.

La proteína OMP31 utilizada en los ensayos de ELISA mostrados se produjo en forma recombinante en E. coli. Por tratarse de una proteína de membrana, la misma no puede mantenerse en solución acuosa, por lo que se obtuvo en condiciones desnaturalizantes. En los ensayos realizados, entonces, no se demostró que los antisueros fueran capaces de reconocer a OMP31 en su conformación salvaje como una proteína de membrana bacteriana. Esta propiedad sería importante para evular la efectividad potencial de la quimera como inmunógeno capaz de conferir inmunidad humoral contra Brucella. Para evaluar esta propiedad se realizaron ensayos de ELISA utilizando como antígeno dos cepas de B. melitensis H38, una lisa y otra rugosa. Ver Figura 13. La reactividad de un suero contra bacterias enteras resulta por lo general difícil de evaluar debido a la complejidad del antígeno utilizado. El ensayo demostró, sin embargo, que el suero anti BLS-OMP31 reconoció específicamente a OMP31 insertada en la membrana de la cepa rugosa. La reactividad de este suero contra la cepa lisa no se diferenció de la propia del suero anti BLS. Este resultado es totalmente coherente con el publicado para el anticuerpo monoclonal A59/10F09/G10. Ver Vizcaíno, et al., supra. Este anticuerpo específico para el inserto incluido en la quimera BLS-OMP31 tiene una fuerte reactividad con cepa rugosa de B. melitensis H38 y no así con la cepa lisa.

Ejemplo 4

Vacuna de ADN de BLS-OMP31

La secuencia codificante para BLS-OMP31 fue subclonada en el vector pCI-neo (Promega Madison, USA), incluyendo sitios de restricción en los extremos 5’ de los cebadores (en marco) y la secuencia consenso Kozak (subrayado). Para ello se construyeron los siguientes oligonucleótidos:

BLS-OMP31 “sentido”:

5’TAAGAA GAATCC ACCACCATG CAT ACC GCC GGT TA 3’.

BLS-OMP31 “antisentido”:

5’TGT CCA CCA GTC AT GCTAGCT CAG ACA AGC GCG ATG C 3´.

Se amplificó dicha secuencia mediante PCR utilizando como plantilla el plásmido pET-BLS-OMP31. El producto de PCR y el vector se digirieron con las enzimas de restricción correspondientes y luego se realizó la reacción de ligación. La construcción obtenida fue verificada mediante secuenciación. El plásmido pCI-BLS-OMP31 así construido fue amplificado en células E. coli JM109 y posteriormente purificado por columnas “mega prep” (Quiagen, UK). Se determinó la pureza y concentración del ADN por espectrofotometría a 260/280 nm. La preparación plasmídica contiene menos de 0,05 unidades de endotoxina por 100 Dg de ADN, determinado por un kit de análisis de lisado de Limulus Amebocyte (Sigma, USA).

Grupos de ratones Balb/c fueron inoculados con 100 !g de plásmido pCI-BLSOMP31 y el plásmido control sin inserto (pCI) en solución fisiológica por vía intramuscular (im) e intradérmica (id) a las 0,2, 4 y 6 semanas. Los animales fueron sangrados por vía retroorbital a los días 0, 15, 30, 45, 60, 75 posteriores a la primera inmunización y los sueros fueron mantenidos a –20°C para la detección de anticuerpos específicos.

La respuesta humoral anti-OMP31 inducida por la inmunización con la quimera BLS-OMP31 como vacuna a ADN (pCI-BLSOMP31) se analizó por ELISA indirecto utilizando como antígeno la proteína OMP31 recombinante. Luego de la inmunización todos los animales desarrollaron una elevada respuesta inmune humoral. Se observó un elevado nivel del isotipo IgG producido específicamente contra la proteína Omp31. Ver Figura 14.

La preparación, amplificación, purificación y uso como vacuna de ADN del plásmido pCI-BLS-OMP31 se llevó a cabo por técnicas de biología molecular y de preparación y administración de composiciones farmacéuticas conocidas en el arte. Ver Schleef, M., Ed., Plasmids for Therapy and Vaccination, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Alemania, 2001.

Ejemplo 5

Quimeras mixtas de BLS

El hallazgo de que la lumazina sintetasa de Brucella spp. se disocia en forma reversible cuando es tratada con altas concentraciones de cloruro de guanidinio fue utilizado para construir quimeras mixtas. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem. 279(9):8093-8101 (2004). Se tomaron dos quimeras distintas, con marcadas diferencias en el tamaño del péptido y en su punto isoeléctrico, a fin de demostrar la factibilidad de esta estrategia, dada la facilidad de poder identificar a los decámeros mixtos.

Para ello, además del péptido OMP31 ya descrito, se utilizó el péptido KETc1 mostrado en la Figura 15.El péptido KETc1, proveniente de una proteína de Tenia solium, ha sido descripto como altamente protectivo contra neurocisticercosis murina y porcina. Ver Huerta, et al., Vaccine 20:62-266 (2001); Toledo, et al., Infect. Immun., 69:1766-1773 (2001).

La proteína quimérica BLS-KETc1 se obtuvo según el siguiente protocolo:

1 . Clonado

a) El plásmido pBLS-OMP31 fue digerido con las enzimas de restricción Nsi I y Afl II, para remover la secuencia codificante correspondiente a los 27 aminoácidos provenientes de la secuencia 48-74 de la proteína OMP31. Se extrajo la secuencia codificante de la proteína OMP31.

b) Se ligó la secuencia codificante para los 14 aminoácidos del péptido KETc1 antedicho al cassette abierto en a) mediante incubación durante la noche de cassette abierto del plásmido pBLS-OMP31-OMP31 con la enzima T4 ADN ligasa a 16 °C. De esta manera se obtuvo el marco de lectura de BLS-KETc1. La inserción fue confirmada por secuenciación del marco de lectura. A este marco abierto de lectura se lo denominó quimera BLS-KETc1, de SEQ ID NO:10b, y el plásmido de expresión, pBLS-KETc1.

Este procedimiento también puede realizarse siguiendo el protocolo indicado en el paso 1) del Ejemplo 1 mediante el corte con las enzimas de restricción Nsi I y Afl I sobre el cassette BLSm (SEQ ID NO:1b) y su posterior ligación con el inserto KETc1. De esta manera se obtiene el marco de lectura BLS-KETc1 y el plásmido BLS-KETc1.

Esta experiencia se repitió utilizando las secuencias de ADN de la BLS mutada SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b y SEQ ID NO:7b obteniéndose resultados similares.

2. Transformación

Se transformó una cepa competente de bacterias E. coli BL21(DE3) mediante choque térmico con el plásmido BLS-KETc1 obtenido según el protocolo anterior. Posteriormente, las bacterias fueron cultivadas en placas de agar conteniendo LB-agar/ampicilina para seleccionar aquéllas transformadas con el plásmido.

3. Expresión y Purificación de la Proteína Quimérica BLS-KETc1

Para las pruebas de expresión en escala pequeña, se inoculó una colonia transformada según el paso anterior con 2 ml de medio LB/ampicilina. La colonia fue agitada e incubada a 37°C. El cultivo saturado se indujo con 2 !l de IPTG 1M. Tres horas más tarde se tomaron 100 !l de cultivo, y se centrifugó. El pellet resultante fue resuspendido en 25 !l de buffer muestra 1X para su análisis por SDS-PAGE 17%.

5 ml de precultivo de las cepas transformadas fue cultivado hasta saturación de acuerdo a la etapa anterior con 500 ml de LB/ampicilina. El cultivo se incubó y se agitó a 37°C. Fue inducido con 0,5 ml de IPTG (1M) al alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 0,6-0,8. El cultivo se retiró a las tres horas y se centrifugó a 4000 g por 20 min. El pellet se suspendió en 15 ml de solución de suspensión (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Tritón X-100 1% pH = 8,0).

La suspensión se sometió a 5 min de sonicado neto con intervalos de 1min cada 1min de sonicado y se centrifugó durante 30 min a 20,000 g. El pellet se resuspendió en 15 ml de solución de suspensión sin Tritón X-100 y se repitió el sonicado. El proceso se repitió una tercera vez. Los tres sobrenadantes de sonicado contenían la fracción de la quimera expresada en citoplasma, mientras que el pellet final contenía la fracción de cuerpos de inclusión.

Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en buffer PBS con 8 M urea y se dejaron de una noche para otra a temperatura ambiente. La resuspensión se dializó contra PBS dos días con un cambio de buffer. La muestra se centrifugó y el sobrenadante se dializó contra buffer A (50mM Tris/HCl, pH 8,5). El primer paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de intercambio aniónico MonoQ o Q-Sepharose (Pharmacia, USA) en equipo de FPLC (Pharmacia, USA). La muestra se inyectó en la columna equilibrada en buffer A y se eluyó por gradiente lineal hasta 50% de buffer B (buffer A + 1 M NaCl).

El segundo paso de purificación se realizó por cromatografía en columna de exclusión molecular Superdex 200 (Amersham, UK). Para esto el pico de la quimera se concentró en tubo Centriprep (Millipore, USA) e inyectó en la columna de la cual se eluye con PBS. La presencia de la proteína quimérica en los picos se evalúo por SDS-PAGE.

La construcción del gen quimérico BLS-KETc1 se llevó a cabo utilizando técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Ver Sambrook, et al., supra; Brown, supra; Watson, et al., supra; Davis et al., supra, Alberts, et al., supra.

Las quimeras BLS-OMP31 y BLS-KETc1 fueron desplegadas en cloruro de guanidinio 2 M, mezcladas en concentraciones equimolares, y reasociadas mediante diálisis. Con el agregado de guanidinio 2M, los decámeros se disociaron generando pentámeros que conservaron su estructura secundaria. Cuando se removió el guanidinio mediante diálisis, se reasociaron los pentámeros formando nuevamente decámeros. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem., 279(9):8093-8101 (2004). De esa forma se generó una mezcla de quimeras BLS. Ver Figura 16.

El producto de la reasociación fue purificado mediante cromatografía de intercambio en una columna de intercambio aniónico MonoQ (Amersham, UK). Los resultados fueron comparados con el perfil de elución de cada quimera separada (una muestra sin disociación) de acuerdo al siguiente protocolo: la quimera BLS-KETc1 (esta partícula fue estimada la más básica según predicción del punto isoeléctrico teórico del péptido insertado) fue eluida a 16.8% de Buffer B y la quimera BLS-OMP31 fue eluida a 35,8% del mismo buffer. La muestra reasociada se separó en tres picos diferentes, el primero correspondiendo a la quimera pura BLS-KETc1; el segundo pico mayoritario que eluyó con una movilidad intermedia, correspondiente a la quimera mixta y un último pico correspondiente a la quimera pura BLS-OMP31. Ver Figura 17 A.

La muestra correspondiente al segundo pico fue analizada mediante SDS-PAGE y PAGE nativo. Los resultados demostraron que la muestra correspondía a una quimera mixta formada por el péptido KETc1 mostrado en los cinco extremos amino terminales de un pentámero y mediante el péptido OMP31 mostrado en los cinco extremos amino terminales del otro pentámero. Ver Figuras 17 B1 y B2.

Este resultado demostró que la estrategia propuesta de disociación, mezcla y reasociación de las proteínas modificadas fue efectiva para proveer una quimera mixta, donde cinco copias de dos péptidos diferentes fueron mostradas por la estructura decamérica BLS. Ver Figura 16. Las mezclas pueden tener diferentes características dependiendo de la naturaleza de los insertos (Por ejemplo, un inserto podría estar dirigido a un tráfico celular específico mientras que el otro podría inducir una respuesta inmune particular).

Ejemplo 6

Inmunización con quimeras de BLS mixtas

Las mezclas de quimeras BLS-OMP31-KETc1 fue administrada con adyuvantes a ratones para evaluar su capacidad de inducir una respuesta inmune humoral específica. El experimento fue realizado con un grupo de cinco ratones. El grupo recibió tres dosis, por vía intraperitoneal, de 25 μg de proteína en emulsión al medio con adyuvante de Freund a los 0, 20 y 40 días. La primer dosis se aplicó con un adyuvante completo y la segunda y tercera dosis fueron aplicadas con un adyuvante incompleto. Se extrajo sangre a los 7 días de la tercera inmunización y se ensayó la reactividad de los sueros contra los péptidos sintéticos OMP31 y KETc1 por ELISA. Ver Figura 18.

Se obtuvo una fuerte respuesta contra ambos péptidos en ratones inmunizados con la quimera mixta en adyuvante. Esto demostró que ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31-KETc1 desarrollaron una respuesta inmune específica contra ambos péptidos insertados en forma simultánea.

Ejemplo 7

Respuesta inmune celular contra quimeras de BLS

Se inmunizaron grupos de cinco ratones BALB/c con 50!g/ratón de la quimera BLS-KETc1 emulsionada en saponina y con 10 !g/ratón del péptido sintético KETc1 emulsionada en saponina para evaluar la respuesta inmune celular específica inducida por la quimera BLS-KETc1 contra el péptido insertado. Los ratones fueron inmunizados dos veces dentro de un intervalo de diez días por vía subcutánea.

Tres días después de la última inmunización, el bazo de ratones de ambos grupos fue removido asépticamente.Las células de bazo fueron resuspendidas en medio de cultivo RPMI 1640 Gibco (InVitrogen Corp., USA), suplementado con L-glutamina (0,2 mM), 2-mercaptoetanol (0,05 mM), aminoácidos no-esenciales (0,01 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 !g/ml) y 10 % de suero fetal bovino (FBS). A diferentes cultivos de células se les agregó medio de cultivo, péptido KETc1 o quimera BLS-KETc1 (10 !g/ml). Las células fueron resuspendidas en microplacas de cultivo de fondo plano, a una concentración de 2 x 105 células por 200 !l de volumen final. Ellas se mantuvieron a 37°C en una ambiente humidificado de 5% CO2.

Después de 72 hs, se agregó 1 !Ci por cultivo de [metil-3H] timidina (Amersham Biosciences, UK). Las células fueron sembradas, y se midió el nivel de incorporación de timidina titulada en un contador de escintilación en líquido 1205 betaplateTM (Wallac Oy, FI). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.

Este ensayo mostró que las células de bazo de ratones inmunizados con la quimera BLS-KETc1 proliferaron frente a la presencia en los cultivos tanto del péptido como de la quimera. Este resultado indicó claramente que la quimera BLS-KETc1 fue capaz de inducir respuesta inmune celular específica contra el péptido KETc1 insertado en BLS. Ver Figura 19.

Ejemplo 8

Multipresentación de Dominios Proteicos mediante Quimeras de BLS

La BLS puede ser modificada para presentar en sus diez extremos amino terminales no sólo péptidos, sino también dominios proteicos enteros. A fin de demostrara este uso alternativo, se construyó una quimera BLS-RBD3, mediante unión de la secuencia codificante de BLS modificada y la secuencia codificante del dominio proteico RBD3 de la proteína Staufen-1 murina. Ver Figuras 20 y 21.

[0101] La proteína quimérica BLS-KETc1 se obtuvo según el siguiente protocolo:

1 . Clonado

a) El plásmido pBLS-OMP31 fue digerido con las enzimas de restricción Nsi I y Afl II, para remover la

secuencia codificante correspondiente a los 27 aminoácidos provenientes de la secuencia 48-74 de la

proteína OMP31. Se extrajo la secuencia codificante de la proteína OMP31.

b) Se ligó la secuencia codificante para los 75 aminoácidos del dominio RBD3 de la proteína murina Staufen al cassette abierto en a) por incubación durante la noche del cassette abierto del plásmido pBLS-OMP31-OMP31 con la enzima T4 ADN ligasa a 16 °C. De esta manera se obtuvo el marco de lectura de BLS-RBD3. La inserción fue confirmada por secuenciación del marco de lectura. A este marco abierto de lectura se lo denominó quimera BLS-RBD3, de SEQ ID NO:11b, y al plásmido que la expresa, pBLS-RBD3.

Este procedimiento también puede realizarse siguiendo el protocolo de indicado en el paso 1) del Ejemplo 1 mediante el corte con las enzimas de restricción Nsi I y Afl I sobre el cassette BLSm (SEQ ID NO:1b) y su posterior ligación con el inserto RBD3. De esta manera se obtuvieron el marco de lectura BLS-RBD3y el plásmido pBLS-RBD3.

Esta experiencia se repitió utilizando las secuencias de ADN de la BLS mutada SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b y SEQ ID NO:7b obteniéndose resultados similares.

2.

Transformación

El plásmido pBLS-RBD3 obtenido según el protocolo anterior fue insertadoena bacterias E. coli BL21(DE3) por transformación por shock térmico. Posteriormente, las bacterias fueron sembradas en medio LB en presencia de ampicilina. La expresión del gen fue inducida con IPTG 1 mM por 4 horas a 28 °C.

3.

Expresión y Purificación de la Proteína Quimérica BLS-RBD3

La proteína fue expresada en cuerpos de inclusión, lavada con soluciones de urea 4 y 6 M, y solubilizada en un buffer Tris/HCl 50 mM, urea 8 M, EDTA 5mM, f-ME 5 mM, PMSF 1 mM, pH 8, bajo agitación magnética durante 16 horas a 4 ºC. La proteína solubilizada fue purificada en condiciones desnaturalizantes en una columna de intercambio iónico Q-Sepharose aplicando un gradiente lineal entre 0 y 1 M NaCl en un buffer Tris/HCl 50 mM, urea 8 M, pH 8,5. La proteína eluida fue replegada por diálisis contra buffer PBS y purificada en una columna de Heparina Hyper D eluyendo la misma en un buffer Tris/HCl 50 mM, NaCl 1,2 M, pH 8.

La Figura 22 muestra el análisis por SDS-PAGE, dicroísmo circular y dispersión de luz de la quimera BLS-RBD3 obtenida según el método descrito anteriormente.

El análisis por SDS-PAGE muestra que la quimera BLS-RBD3 fue obtenida con un alto grado de pureza. La pequeña anomalía observada en su movilidad electroforética estaría debida a la alta densidad de cargas positivas del dominio RBD3. La similitud del espectro de dicroísmo circular de BLS-RBD3 con su espectro teórico, calculado a través de la combinación de los espectros de BLS y el dominio RBD3 de la proteína Staufen-1 murina en forma aislada, indicaron que la quimera se encontraba bien plegada. El peso molecular de la quimera (257 kDa), calculado a partir de su corrida en una columna de filtración molecular conectada en serie a un detector de dispersión de luz y un detector de índice de refracción, indicaron que la misma presentaba una estructura decamérica.

La construcción del gen quimérico BLS-RBD3 se llevó a cabo utilizando técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Ver Sambrook, et al., supra; Brown, supra; Watson, et al., supra; Davis et al., supra, Alberts, et al., supra.

Ejemplo 9

Obtención de anticuerpos de amplio espectro para inmunización con quimeras de BLS

La quimera BLS-Staufen fue utilizada como inmunógeno para obtener anticuerpos contra el dominio RBD3 de Staufen. Para ello se inocularon 5 ratones de la cepa Balb/c 2 veces con un intervalo de 14 días con 80 !g de la quimera BLS-RBD3 en 200 !l de buffer HCl 50mM, NaCl 1,2M, 50mM fosfato, pH 8 por vía intraperitoneal en ausencia de adyuvante. Como control se inmunizaron 5 ratones de la misma cepa con una mezcla de las proteínas BLS y el dominio RBD3 de Staufen, en la misma masa que contenía la quimera. Quince días después de la última inmunización, se sangraron los ratones mediante punción retroorbital. Se preparó un suero mediante centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos. Se ensayó la reactividad de los sueros contra RBD3 por ELISA sensibilizando placas de 96 pocillos con la proteína de fusión glutation S-transferasa-RBD3 (GST-RBD3). Como anticuerpo secundario se utilizó anti-inmunoglobulina de ratón conjugado a peroxidasa caprino (DakoCytomation, USA). La reacción se reveló con ortofenildiamina (OPD) y se detuvo con ácido sulfúrico 4 N. La densidad óptica se determinó por un lector de ELISA a 492 nm.

La Figura 23 muestra un ejemplo representativo de la respuesta inmune humoral desarrollada en ambos grupos. Como se observa, la inmunización con la quimera BLS-RBD3 produjo una fuerte respuesta de anticuerpos anti-RBD3. En los ratones inoculados con la mezcla de BLS y RBD3 no se observó reactividad contra el péptido.

Ejemplo 10

Producción de anticuerpos monoclonales por inmunización con la quimeras de BLS

Se evaluó la capacidad de generar anticuerpos monoclonales específicos contra el péptido OMP31 a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31. El experimento fue realizado con un grupo de cinco ratones. El grupo recibió tres dosis, por vía intraperitoneal, de 25 μg de proteína en emulsión al medio con adyuvante de Freund a los 0, 20 y 40 días. En el día 60 se inoculó 25 pg de BLS-OMP31 disuelta en PBS, por vía peritoneal, en el ratón que demostró la mayor respuesta contra el péptido OMP31. Se extrajo el bazo de dicho ratón, y se fusionaron los esplenocitos con células de mieloma NSO. Los hibridomas resultantes fueron seleccionados en medio HAT, y sus sobrenadantes de cultivo fueron ensayados para medir reactividad contra el péptido OMP31 por ELISA. El hibridoma que mostró la mayor reactividad fue clonado por dilución límite. En la Figura 24 se muestra la reactividad del AcMo 37F7 contra el péptido OMP31 y contra la proteína entera OMP31. Se obtuvo una fuerte respuesta contra ambas. Esto demostró que ratones inmunizados con la quimera BLS-OMP31 desarrollaron una respuesta inmune específica contra el péptido insertado. Esta experiencia también muestra que anticuerpos monoclonales específicos pueden ser producidos utilizando quimeras de BLS.

Ejemplo 11

Uso de quimeras de BLS como biosensores

Los biosensores permiten detectar interacción específica entre macromoléculas, la cual es visualizada por el aumento de una señal que es proporcional a la acumulación de masa sobre una superficie reactiva. Para estudiar la utilidad de las quimeras de BLS como portador de péptido y dominio proteico en el desarrollo de biosensores, se utilizó a la prote+ina modificada BLS-OMP31. Con esta finalidad, se analizó adicionalmente la reacción entre la BLS-OMP31 y AcMo 37F7 descriptas en el ejemplo anterior.

La quimera BLS-OMP31 fue utilizada para derivatizar una cubeta de carboximetil dextrano (IAsys Affinity Sensors, Thermo, USA). Para tal fin, una solución conteniendo 80 ug/ml de BLS-OMP31, en buffer acetato de sodio 10 mM pH 5,5, fue incubada en una placa previamente derivatizada por el reactivo EDC/NHS. Luego de inmovilizar una señal correspondiente a 800 arc sec (equivalentes a 5 ng de antígeno) se bloqueó la superficie reactiva con dietilamina. Luego de la derivatización, se estudió la reactividad del anti-OMP31 AcMo 37F7, para lo cual se incubó 50 μl de sobrenandante de cultivo en la placa previamente activada.

Como se observa en la Figura 25, el AcMo 37F7 reaccionó fuertemente, dando una señal de aproximadamente 300 arc sec. En la fase de disociación se lavó y agregó buffer PBS + Tween, observándose una caída de la señal correspondiente a la disociación del AcMo de la fase sólida. Este ejemplo demostró claramente que la quimera es capaz de detectar anticuerpos dirigidos contra el péptido en un biosensor.

Ejemplo 12

Activación de células dendríticas mediante BLS

Se analizó la capacidad de BLS de activar células dendríticas. Para ello, se estudiaron los niveles de activación de diferentes marcadores en estas células luego de 18 hs de incubación con BLS. Se cultivaron células de médula ósea de ratones de la cepa Balb/c en placas de Petri con medio RPMI con 2mM L-glutamina, 100U/ml penicilina, 100!g/ml estreptomicina, 50!M 2-mercaptoetanol y 10% del suero fetal bovino (medio R10), suplementado con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos de ratón (mGM-CSF) en un incubador con atmósfera de 5% CO2 a 37°C. A los días 3, 6 y 8 se renovó el medio de cultivo. Al día 9 se levantaron las células no adheridas, se centrifugaron 8 min a 300 x g y se incubaron en una concentración de 2x106 células/ml en un volumen final de 1 ml con BLS 1, 5 o 10!M o sin BLS en medio R10 durante 18 hs (n = 4). Luego se centrifugaron y se incubaron 4x105 células por 200 !l de volumen final con los siguientes anticuerpos monoclonales (Pharmingen) conjugados a isotiocianato de fluoresceína (FITC): anti-CD40, anti-CD80, anti I-Ad o anti-CD86 y con el anticuerpo monoclonal anti-CD11c conjugado a ficoeritrina (PE). Se realizaron 3 lavados y se extrajeron las células con un citómetro FACScan (Becton Dickinson, USA). Los datos se analizaron mediante el software CellQuest (Becton Dickinson, USA).

En las células incubadas con BLS, dentro de la subpoblación de CD11c+ (75-80%) se observaron aumentos significativos en los porcentajes y en la fluorescencia media de células que expresan CD40, CD80, I-Ad y CD86. El experimento fue realizado 3 veces, obteniéndose resultados similares. La Figura 26 muestra histogramas representativos de la expresión de CD40 (A) y de I-Ad (B) en células CD11c+ tratadas o no con BLS.

Similar activación por BLS se observó en células dendríticas de ratones de la cepa C3H/HeJ (no respondedores a LPS) o al preincubar la proteína BLS con polimixina B, a fin de eliminar LPS de E. coli.

Estos resultados demostraron que BLS es capaz de activar células dendríticas.

Ejemplo 13

Producción de ensambles moleculares con dominios proteicos mediante péptidos adaptadores conectados a quimeras de BLS

La proteína BLS pudo ser modificada en sus amino terminales para presentar dominios proteicos enteros. Esto pudo ser llevado a cabo mediante la formación de ensambles moleculares. En estos grupos se incorporaron péptidos heterodiméricos complementarios en la proteína BLS modificada en la diana. A continuación, la alta afinidad entre los heterodímeros enlaza la molécula diana y la proteína BLS modificada. El uso de heterodímeros de alta afinidad es útil para evitar que se afecte el plegado apropiado de la proteína portadora. Para demostrar esta aplicación de las quimeras de BLS se utilizaron dos péptidos de heterodimerización conocidos en el arte RR12EE345L y EE12RR345L. Ver Moll, et al., M. Protein Sci., 10:649-655 (2001). Ver Figura 27. Esta estrategia permite construir ensambles moleculares conteniendo diez copias del dominio en cuestión combinados con la BLS. El ensamblado se realiza in vitro, lo cual permite controlar la estequeometría del proceso. Este sistema permite además expresar el antígeno de interés en un sistema recombinante diferente al de la BLS. Ver Figura 28.

1. Construcción de la Proteína de Fusión BLS-RR12EE345L

El péptido RR12EE345L fue clonado en el extremo N terminal de la BLS. Ver Figuras 28 y 29. El residuo K49 situado en la región de unión BLS y RR12EE345L fue sustituido por serina. El gen quimérico para BLS-RR12EE345L fue clonado en un vector pET11a. Una cepa competente de bacterias E. Coli BL21 (DE3) fue transformada con el vector resultante. A continuación, las bacterias fueron cultivadas en un medio de cultivo LB-agar/ampicilina. La expresión del gen fue inducida con IPTG 1M durante 16 horas a 37ºC. La proteína fue expresada en los cuerpos de inclusión.

Los cuerpos de inclusión fueron lavados con un buffer 50 mM Tris/HCl, 5 mM EDTA, 5 mM j-ME, 1 mM PMSF, pH 8. La proteína disuelta fue tratada con un buffer 50 mM Tris/HCl, 8 M urea, 5 mM EDTA, 5 mM j-ME, 1 mM PMSF, pH 8 y agitado magnéticamente durante 16 horas a 4ºC. La quimera BLS-RR12EE345L resultante fue purificada bajo condiciones desnaturalizantes mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna Q-Sepharose (Pharmacia, USA). La muestra fue eluida utilizando un buffer 50 mM Tris/HCl, 8 M urea, pH 8,5 bajo un gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl. La proteína de fusión fue ensayada mediante análisis SDS-PAGE y de dispersión de luz. Ver Figuras 30 y 31.

El análisis SDS-PAGE mostró que la proteína de fusión BLS-RR12EE345L tenía un elevado nivel de pureza. El peso molecular de la proteína, según se determinó mediante la técnica de dispersión de luz, era de 224 kDa. Además, la proteína mostró una señal CD de elevada calidad en el espectro UV remoto. Estos resultados sugieren que la proteína de fusión está bien plegada y observa una estructura decamérica similar a la proteína BLS salvaje en presencia de urea 8 M. La estructura de BLS está distorsionada a temperatura ambiente cuando disminuye la concentración de urea. Esto se debe probablemente a la unión del RR12EE345L consigo mismo.

2. Construcción del Péptido RR12EE345L

El péptido RR12EE345L fue clonado en el extremo C-teminal de la proteína glutation S-transferasa (GST). Este péptido es complementario del péptido R12EE345L mostrado mediante la proteína de fusión BLS. Ver Figura 32.

El gen del péptido RR12EE345L fue clonado en el vector pGEX-4T1. Una cepa competente de bacterias E. Coli BL21 (DE3) fue transformada con el vector resultante. A continuación, las bacterias fueron cultivadas en un medio de cultivo LB-agar/ampicilina a 37ºC. La expresión del gen fue inducida con IPTG 1 mM durante 16 horas a 37ºC. Las bacterias fueron luego sonicadas.

El péptido RR12EE345L resultante fue purificado como una proteína de fusión GST utilizando una matriz de glutation/agarosa. El complejo acoplado fue colocado en una columna y fue lavado con un buffer 50 mM Tris, pH 8 hasta que el péptido carecía de eluyente. A continuación, la matriz fue incubada con trombina durante 16 horas a temperatura ambiente para clivar el RR12EE345L de la proteína de fusión GST. El péptido fue entonces eluido con un buffer 50 mM Tris, pH 8 para purificarlo adicionalmente. El péptido RR12EE345L resultante tenía un elevado nivel de pureza.

3. Formación del Ensamble Molecular entre la Proteína de Fusión BLS-RR12EE345L y el Péptido RR12EE345L

Una parte de la proteína de fusión BLS-RR12EE345L fue pre-incubada con urea 8 M, 50 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 8 durante 15 minutos a 30ºC. Cuatro partes del péptido RR12EE345L fueron pre-incubadas en un buffer 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, pH 8 durante 15 minutos a 30ºC. La proteína de fusión y el péptido fueron mezclados e incubados durante 15 minutos a 30ºC. La mezcla permaneció soluble después de la incubación.

El ensamble molecular resultante fue ensayado mediante análisis de dispersión de luz y se calculó su peso molecular teórico (PM: 222,1 kDa). Ver Figura 34. Este análisis mostró que aproximadamente 10 péptidos RR12EE345L (PM: 5,6 kDa) se acoplaron al decámero BLS-RR12EE345L (PM: 222,1 kDa). Ver Figura 35.

Además, el ensamble mostró una señal CD de alta calidad en el espectro UV remoto. Estos resultados sugieren que los ensambles moleculares formados con proteínas BLS modificadas que utilizan esta técnica son viables.

La presente invención ha sido descrita y ejemplificada en detalle para facilitar su comprensión y reproducción.

Referencias

Arakawa, T., Yu, J., Chong, D., Hough, J., Engen, P. C. y Langridge, W. H. R. “A plant-based cholera toxin B subunit-insulin fusion protein protects against the development of autoimmune diabetes” Nature Biotech., 16:934-938, 1998.

Bacher A. y Fischer M. “Protein conjugates, methods, vectors, proteins and DNA for producing them, their use, and medicaments and vaccines containing a certain quantity of said protein conjugates” WO0053229.

Bachmann, M. F., Rohrer, U. H., Kundig, T. M., Burki, K., Hengartner, H. y Zinkernagel, R. M. “The influence of antigen organization on B cell responsiveness” Science, 262:1448-1451, 1993.

Baldi, P.C., Velikovsky, C., Braden, B.C., Giambartolomei, G.H., Fossati, C.A. y Goldbaum, F.A. “Structural, functional and immunological studies on a polymeric bacterial protein” Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33:741-747, 2000.

Baldi, P.C., Giambartolomei, G.H., Goldbaum, F.A., Abdón, L.F., Velikovsky, C.A. Kittelberger, R. y Fossati,

C.A. “Humoral immune response against LPS and cytoplasmic proteins of Brucella in cattle vaccinated with Brucella abortus S19 or experimentally infected with Yersinia enterocolitica 0:9” Clinical Diagnostic and Laboratory Immunology, 3 (4):472-476, 1996.

Braden, B.C., Velikovsky, C.A., Cauerhff, A., Polikarpov, I. y Goldbaum, F. A. “Divergence in macromolecular assembly: X-ray crystallographic structure analysis of lumazine synthase from Brucella abortus” Journal of Molecular Biology, 297:1031-1036, 2000.

Domingo, G.J., Orru, S. y Perham, R.N. “Multiple display of peptides and proteins on a macromolecular scaffold derived from a multienzyme complex” Journal of Molecular Biology, 305:259-267, 2001.

Domingo, G.J., Orru, S. y Perham, R.N. “Molecular display on multimeric protein scaffolds derived from the E2 component of the alphaketoacid dehydrogenase” WO0185208.

Goldbaum, F.A., Rubbi, C.P., Wallach, J.C., Miguel, S.E., Baldi, P.C. y Fossati, C.A “Differentiation between active and inactive human brucellosis by measuring antiprotein humoral immune responses” Journal of Clinical Microbiology, 30:604-607, 1992.

Goldbaum, F.A., Leoni, J., Wallach, J.C. y Fossati, C.A. “Characterization of an 18 kDa brucella cytoplasmic protein which appears to be a serological marker of active infection of both human and bovine brucellosis” Journal of Clinical Microbiology, 31:2141-2145, 1993.

Goldbaum, F.A., Polikarpov, I., Cauerhff, A., Velikovsky, C.A., Braden B.C. y

Poljak, R.J. “Crystallization and preliminary X-ray analysis of the lumazine synthase from Brucella spp.” Journal of Structural Biology, 123:175-178, 1998.

Goldbaum, F.A., Velikovsky, C.A., Baldi, P.C., Mörtl, S., Bacher, A. y Fossati, C.A. “The 18 kDa cytoplasmic protein of Brucella spp. is as enzyme with lumazine synthase activity” Journal of Medical Microbiology, 48:833-839, 1999.

Huerta, M., et al. “Synthetic peptide vaccine against Taenia solium pig cysticercosis: successful vaccination in a controlled field trial in rural Mexico” Vaccine, 20:262-266, 2001.

Laemmli, U.K. “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.” Nature, 227(259): 680-5, 1970.

Leclerc, C. y Ronco, J. “New approaches in vaccine development” Immunol. Today, 19(7):300-302, 1998.

Li, Y., Mui, S., Brown, J.H., Strand, J., Reshetnikova, L., Tobacman, L.S. y Cohen, C. 2002. The Crystal Structure of the C-Terminal Fragment of Striated-Muscle Alpha-Tropomyosin Reveals a Key Troponin T Recognition site. Proceeedings National Academy of Sciences USA, 99:7378.

Moll, J., Ruvinov, S., Pastan, I. y Vinson, C. “Designed heterodimerizing leucine zippers with a ranger of pIs and stabilities up to 10-15 M” Protein Sci., 10:649-655, 2001.

Nieba, L. y Bachmann, M. F. “A new generation of vaccines” Moderns Aspects of Immunobiology, 1(2):36-39, 2000.

Pace, C.N. “Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves” Methods Enzymol., 131: 266-80, 1986.

Redfield, N. New England Journal of Medicine, 316:673-678, 1998.

Renner, W.A., Bachmann, M., Hennecke, F., y Nieba, L. “Ordered molecular presentation of antigens, method of preparation and use” WO0032227.

Bachmann, M., Dunant N., Sebbel, P., Tissot, A., y Lechener, F. “Molecular antigen array” WO0185208.

Ritsert, K., Huber, R., Turk, D., Ladenstein, R., Schmidt-Base, K. y Bacher, A. “Studies on the lumazine synthase/riboflavin synthase complex of Bacillus subtilis: crystal structure analysis of reconstituted, icosahedral j-subunit capsids with bound substrate analogue inhibitor at 2.4 Å resolution” Journal of Molecular Biology, 253: 151-167, 1995.

Toledo, A., et al. “Two epitopes shared by Taenia crassiceps and Taenia solium confer protection against murine T. crassiceps cysticercosis along with a prominent T1 response” Infect Immun 69:1766-1773, 2001.

Velikovsky, C. A., Cassataro, J., Sanchez, M., Fossati, C. A., Fainboim, L. y Spitz, M. “Single-shot plasmid DNA intrasplenic immunization for the production of monoclonal antibodies” Persistent Expression of DNA, J.

Immunol. Meth., 244(1-2):1-7, 2000b.

Secuencias

SEQ ID NO:1a:

MHSNQSCPLK TSFKIAFIQA RWHADIVDEA RKSFVAELAA KTGGSVEVEI FDVPGAYEIP

60

LHAKTLARTG RYAAIVGAAF VIDGGIYDHD FVATAVINGM MQVQLETEVP VLSVVLTPHH

120

FHESKEHHDF FHAHFKVKGV EAAHAALQIV SERSRIALV

159

SEQ ID NO:2a:

MHSNQSCLKT SFKIAFIQAR WHADIVDEAR KSFVAELAAK TGGSVEVEIF DVPGAYEIPL

60

HAKTLARTGR YAAIVGAAFV IDGGIYDHDF VATAVINGMM QVQLETEVPV LSVVLTPHHF

120

HESKEHHDFF HAHFKVKGVE AAHAALQIVS ERSRIALV

158

SEQ ID NO:3a:

MHSNQSLKTS FKIAFIQARW HADIVDEARK SFVAELAAKT GGSVEVEIFD VPGAYEIPLH

60

AKTLARTGRY AAIVGAAFVI DGGIYDHDFV ATAVINGMMQ VQLETEVPVL SVVLTPHHFH

120

ESKEHHDFFH AHFKVKGVEA AHAALQIVSE RSRIALV

157

SEQ ID NO:4a:

MHSNQLKTSF KIAFIQARWH ADIVDEARKS FVAELAAKTG GSVEVEIFDV PGAYEIPLHA

60

KTLARTGRYA AIVGAAFVID GGIYDHDFVA TAVINGMMQV QLETEVPVLS VVLTPHHFHE

120

SKEHHDFFHA HFKVKGVEAA HAALQIVSER SRIALV

156

SEQ ID NO:5a:

MHSNLKTSFK IAFIQARWHA DIVDEARKSF VAELAAKTGG SVEVEIFDVP GAYEIPLHAK

60

21

TLARTGRYAA IVGAAFVIDG GIYDHDFVAT AVINGMMQVQ LETEVPVLSV VLTPHHFHES 120 KEHHDFFHAH FKVKGVEAAH AALQIVSERS RIALV 155 SEQ ID NO:6a: MHSLKTSFKI AFIQARWHAD IVDEARKSFV AELAAKTGGS VEVEIFDVPG AYEIPLHAKT 60 LARTGRYAAI VGAAFVIDGG IYDHDFVATA VINGMMQVQL ETEVPVLSVV LTPHHFHESK 120 EHHDFFHAHF KVKGVEAAHA ALQIVSERSR IALV 154 SEQ ID NO:7a: MHLKTSFKIA FIQARWHADI VDEARKSFVA ELAAKTGGSV EVEIFDVPGA YEIPLHAKTL 60 ARTGRYAAIV GAAFVIDGGI YDHDFVATAV INGMMQVQLE TEVPVLSVVL TPHHFHESKE 120 HHDFFHAHFK VKGVEAAHAA LQIVSERSRI ALV 153 SEQ ID NO:8a: MHLEIRAAFL RQRNTALRTE VAELEQEVQR LENEVSQYET RYGPLGGGKL KTSFKIAFIQ 60 ARWHADIVDE ARKSFVAELA AKTGGSVEVE IFDVPGAYEI PLHAKTLART GRYAAIVGAA 120 FVIDGGIYDH DFVATAVING MMQVQLETEV PVLSVVLTPH HFHESKEHHD FFHAHFKVKG 180 VEAAHAALQI VSERSRIAL V 200 SEQ ID NO:9a: MHNAGYAGGK FKHPFSSFDK EDNEQVSGSL KTSFKIAFIQ ARWHADIVDE ARKSFVAELA 60 AKTGGSVEVE IFDVPGAYEI PLHAKTLART GRYAAIVGAA FVIDGGIYDH DFVATAVING 120 MMQVQLETEV PVLSVVLTPH HFHESKEHHD FFHAHFKVKG VEAAHAALQI VSERSRIALV 180 SEQ ID NO:10a: MHAPMSTPSA TSVRGSLKTS FKIAFIQARW HADIVDEARK SFVAELAAKT GGSVEVEIFD 60 VPGAYEIPLH AKTLARTGRY AAIVGAAFVI DGGIYDHDFV ATAVINGMMQ VQLETEVPVL 120 SVVLTPHHFH ESKEHHDFFH AHFKVKGVEA AHAALQIVSE RSRIALV 167 SEQ ID NO:11a: MHENLNKSEI SQVFEIALKR NLPVNFEVAR ESGPPHMKNF VTRVSVGEFV GEGEGKSKKI 60 SKKNAARAVL EQLRRLPLKT SFKIAFIQAR WHADIVDEAR KSFVAELAAK TGGSVEVEIF 120 DVPGAYEIPL HAKTLARTGR YAAIVGAAFV IDGGIYDHDF VATAVINGMM QVQLETEVPV 180 LSVVLTPHHF HESKEHHDFF HAHFKVKGVE AAHAALQIVS ERSRIALV 228 SEQ ID NO:1b: atgcatagca accaaagctg tccgcttaag acatccttta aaatcgcatt cattcaggcc 60 cgctggcacg ccgacatcgt tgacgaagcg cgcaaaagct ttgtcgccga actggccgca 120 aagacgggtg gcagcgtcga ggtagagata ttcgacgtgc cgggtgcata tgaaattccc 180 cttcacgcca agacattggc cagaaccggg cgctatgcag ccatcgtcgg tgcggccttc 240 gtgatcgacg gcggcatcta tcgtcatgat ttcgtggcga cggccgttat caacggcatg 300 atgcaggtgc agcttgaaac ggaagtgccg gtgctgagcg tcgtgctgac gccgcaccat 360 ttccatgaaa gcaaggagca tcacgacttc ttccatgctc atttcaaggt gaagggcgtg 420 gaagcggccc atgccgcctt gcagatcgtg agcgagcgca gccgcatcgc gcttgtctga 480 SEQ ID NO:2b: atgcatagca accaaagctg tcttaagaca tcctttaaaa tcgcattcat tcaggcccgc 60 tggcacgccg acatcgttga cgaagcgcgc aaaagctttg tcgccgaact ggccgcaaag 120 acgggtggca gcgtcgaggt agagatattc gacgtgccgg gtgcatatga aattcccctt 180 cacgccaaga cattggccag aaccgggcgc tatgcagcca tcgtcggtgc ggccttcgtg 240 atcgacggcg gcatctatcg tcatgatttc gtggcgacgg ccgttatcaa cggcatgatg 300 caggtgcagc ttgaaacgga agtgccggtg ctgagcgtcg tgctgacgcc gcaccatttc 360 catgaaagca aggagcatca cgacttcttc catgctcatt tcaaggtgaa gggcgtggaa 420 gcggcccatg ccgccttgca gatcgtgagc gagcgcagcc gcatcgcgct tgtctga 477 SEQ ID NO:3b: atgcatagca accaaagcct taagacatcc tttaaaatcg cattcattca ggcccgctgg 60 cacgccgaca tcgttgacga agcgcgcaaa agctttgtcg ccgaactggc cgcaaagacg 120 ggtggcagcg tcgaggtaga gatattcgac gtgccgggtg catatgaaat tccccttcac 180 gccaagacat tggccagaac cgggcgctat gcagccatcg tcggtgcggc cttcgtgatc 240 gacggcggca tctatcgtca tgatttcgtg gcgacggccg ttatcaacgg catgatgcag 300 gtgcagcttg aaacggaagt gccggtgctg agcgtcgtgc tgacgccgca ccatttccat 360 gaaagcaagg agcatcacga cttcttccat gctcatttca aggtgaaggg cgtggaagcg 420 gcccatgccg ccttgcagat cgtgagcgag cgcagccgca tcgcgcttgt ctga 474 SEQ ID NO:4b: atgcatagca accaacttaa gacatccttt aaaatcgcat tcattcaggc ccgctggcac 60 gccgacatcg ttgacgaagc gcgcaaaagc tttgtcgccg aactggccgc aaagacgggt 120 ggcagcgtcg aggtagagat attcgacgtg ccgggtgcat atgaaattcc ccttcacgcc 180 aagacattgg ccagaaccgg gcgctatgca gccatcgtcg gtgcggcctt cgtgatcgac 240 ggcggcatct atcgtcatga tttcgtggcg acggccgtta tcaacggcat gatgcaggtg 300 cagcttgaaa cggaagtgcc ggtgctgagc gtcgtgctga cgccgcacca tttccatgaa 360 agcaaggagc atcacgactt cttccatgct catttcaagg tgaagggcgt ggaagcggcc 420 catgccgcct tgcagatcgt gagcgagcgc agccgcatcg cgcttgtctg a 471 SEQ ID NO:5b: atgcatagca accttaagac atcctttaaa atcgcattca ttcaggcccg ctggcacgcc 60 gacatcgttg acgaagcgcg caaaagcttt gtcgccgaac tggccgcaaa gacgggtggc 120 agcgtcgagg tagagatatt cgacgtgccg ggtgcatatg aaattcccct tcacgccaag 180 acattggcca gaaccgggcg ctatgcagcc atcgtcggtg cggccttcgt gatcgacggc 240 ggcatctatc gtcatgattt cgtggcgacg gccgttatca acggcatgat gcaggtgcag 300 cttgaaacgg aagtgccggt gctgagcgtc gtgctgacgc cgcaccattt ccatgaaagc 360 aaggagcatc acgacttctt ccatgctcat ttcaaggtga agggcgtgga agcggcccat 420 gccgccttgc agatcgtgag cgagcgcagc cgcatcgcgc ttgtctga 468 SEQ ID NO:6b: atgcatagcc ttaagacatc ctttaaaatc gcattcattc aggcccgctg gcacgccgac 60 atcgttgacg aagcgcgcaa aagctttgtc gccgaactgg ccgcaaagac gggtggcagc 120 gtcgaggtag agatattcga cgtgccgggt gcatatgaaa ttccccttca cgccaagaca 180 ttggccagaa ccgggcgcta tgcagccatc gtcggtgcgg ccttcgtgat cgacggcggc 240 atctatcgtc atgatttcgt ggcgacggcc gttatcaacg gcatgatgca ggtgcagctt 300 gaaacggaag tgccggtgct gagcgtcgtg ctgacgccgc accatttcca tgaaagcaag 360 gagcatcacg acttcttcca tgctcatttc aaggtgaagg gcgtggaagc ggcccatgcc 420 gccttgcaga tcgtgagcga gcgcagccgc atcgcgcttg tctga 465 SEQ ID NO:7b: atgcatctta agacatcctt taaaatcgca ttcattcagg cccgctggca cgccgacatc 60 gttgacgaag cgcgcaaaag ctttgtcgcc gaactggccg caaagacggg tggcagcgtc 120 gaggtagaga tattcgacgt gccgggtgca tatgaaattc cccttcacgc caagacattg 180 gccagaaccg ggcgctatgc agccatcgtc ggtgcggcct tcgtgatcga cggcggcatc 240 tatcgtcatg atttcgtggc gacggccgtt atcaacggca tgatgcaggt gcagcttgaa 300 acggaagtgc cggtgctgag cgtcgtgctg acgccgcacc atttccatga aagcaaggag 360 catcacgact tcttccatgc tcatttcaag gtgaagggcg tggaagcggc ccatgccgcc 420 ttgcagatcg tgagcgagcg cagccgcatc gcgcttgtct ga 462 SEQ ID NO:8b: atgcatctgg aaatccgtgc ggcgttcctg cgtcagcgta acaccgcgct gcgtaccgaa 60 gttgcggaac tggaacagga agttcagcgt ctggaaaacg aagtttctca gtacgaaacc 120 cgttacggtc cgctgggtgg tggttctctt aagacatcct ttaaaatcgc attcattcag 180 gcccgctggc acgccgacat cgttgacgaa gcgcgcaaaa gctttgtcgc cgaactggcc 240 gcaaagacgg gtggcagcgt cgaggtagag atattcgacg tgccgggtgc atatgaaatt 300 ccccttcacg ccaagacatt ggccagaacc gggcgctatg cagccatcgt cggtgcggcc 360 ttcgtgatcg acggcggcat ctatcgtcat gatttcgtgg cgacggccgt tatcaacggc 420 atgatgcagg tgcagcttga aacggaagtg ccggtgctga gcgtcgtgct gacgccgcac 480 catttccatg aaagcaagga gcatcacgac ttcttccatg ctcatttcaa ggtgaagggc 540 gtggaagcgg cccatgccgc cttgcagatc gtgagcgagc gcagccgcat cgcgcttgtc 600 tga 603 SEQ ID NO:9b: atgcataacg ccggttacgc aggcggcaag ttcaagcatc cattttctag ctttgacaag 60 gaagacaacg aacaggtttc cggttcgctt aagacatcct ttaaaatcgc attcattcag 120 gcccgctggc acgccgacat cgttgacgaa gcgcgcaaaa gctttgtcgc cgaactggcc 180 gcaaagacgg gtggcagcgt cgaggtagag atattcgacg tgccgggtgc atatgaaatt 240 ccccttcacg ccaagacatt ggccagaacc gggcgctatg cagccatcgt cggtgcggcc 300 ttcgtgatcg acggcggcat ctatcgtcat gatttcgtgg cgacggccgt tatcaacggc 360 atgatgcagg tgcagcttga aacggaagtg ccggtgctga gcgtcgtgct gacgccgcac 420 catttccatg aaagcaagga gcatcacgac ttcttccatg ctcatttcaa ggtgaagggc 480 gtggaagcgg cccatgccgc cttgcagatc gtgagcgagc gcagccgcat cgcgcttgtc 540 tga 543 SEQ ID NO:10b: atgcatgccc cgatgagcac gccgagcgcc acgagcgtcc gcggtagcct taagacatcc 60 tttaaaatcg cattcattca ggcccgctgg cacgccgaca tcgttgacga agcgcgcaaa 120 agctttgtcg ccgaactggc cgcaaagacg ggtggcagcg tcgaggtaga gatattcgac 180 gtgccgggtg catatgaaat tccccttcac gccaagacat tggccagaac cgggcgctat 240 gcagccatcg tcggtgcggc cttcgtgatc gacggcggca tctatcgtca tgatttcgtg 300 gcgacggccg ttatcaacgg catgatgcag gtgcagcttg aaacggaagt gccggtgctg 360 agcgtcgtgc tgacgccgca ccatttccat gaaagcaagg agcatcacga cttcttccat 420 gctcatttca aggtgaaggg cgtggaagcg gcccatgccg ccttgcagat cgtgagcgag 480 cgcagccgca tcgcgcttgt ctga 504 SEQ ID NO:11b: atgcatgaaa acctcaataa atcggaaata agccaagtgt ttgaaattgc gctgaagcgg 60 aatttgcctg tgaattttga ggtggcccgg gagagtggcc caccacacat gaagaacttt 120 gtgaccaggg tttcagttgg ggaatttgta ggggaaggag aagggaaaag caagaagatc 180 tccaagaaga atgcggccag ggctgttctg gagcagctta ggaggctgcc acttaagaca 240 tcctttaaaa tcgcattcat tcaggcccgc tggcacgccg acatcgttga cgaagcgcgc 300 aaaagctttg tcgccgaact ggccgcaaag acgggtggca gcgtcgaggt agagatattc 360 gacgtgccgg gtgcatatga aattcccctt cacgccaaga cattggccag aaccgggcgc 420 tatgcagcca tcgtcggtgc ggccttcgtg atcgacggcg gcatctatcg tcatgatttc 480 gtggcgacgg ccgttatcaa cggcatgatg caggtgcagc ttgaaacgga agtgccggtg 540 ctgagcgtcg tgctgacgcc gcaccatttc catgaaagca aggagcatca cgacttcttc 600 catgctcatt tcaaggtgaa gggcgtggaa gcggcccatg ccgccttgca gatcgtgagc 660 gagcgcagcc gcatcgcgct tgtctga 687 SEQ ID NO:9c: ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 60 aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 120 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 180 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 240 tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 300 aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 360 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 420 agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 480 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 540 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 600 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 660 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 720 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 780 attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 840 ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 900 taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 960 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1020 aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1080 agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1140 ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1200 ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1260 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1320 tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1380 tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1440 tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1500 tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1560 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 1620 acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 1680 ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 1740 gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 1800 ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 1860 ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 1920 taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 1980 cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2040 tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 2100 gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc 2160 gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 2220 acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 2280 cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga 2340 tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc 2400 ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg 2460 tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca 2520 cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac 2580 tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg 2640 ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga 2700 acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga 2760 agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc 2820 gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg 2880 tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga 2940 tgcgccgcgt gcggctgctg gagatggcgg acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg 3000 tttgcgcatt cacagttctc cgcaagaatt gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc 3060 cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg 3120 acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt 3180 ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt 3240 taggctggta agagccgcga gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg 3300 cctggacagc atggcctgca acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat 3360 aatggggaag gccatccagc ctcgcgtcgc gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc 3420 ggccgccatg ccggcgataa tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt 3480 gacgaaggct tgagcgaggg cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat 3540 cgtcgcgctc cagcgaaagc ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg 3600 tcctacgagt tgcatgataa agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg 3660 cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg 3720 tgcctaatga gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3780 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3840 gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc 3900 ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca 3960 ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat 4020 cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc 4080 gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct 4140 cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt 4200 ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac 4260 gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga 4320 ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg 4380 gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag 4440 caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga 4500 gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca 4560 ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg 4620 cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt 4680 gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc 4740 gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga 4800 caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt 4860 gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt 4920 ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg 4980

ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac 5040 agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg 5100 aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca 5160 cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatctcgatc 5220 ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag 5280 aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg cataacgccg gttacgcagg 5340 cggcaagttc aagcatccat tttctagctt tgacaaggaa gacaacgaac aggtttccgg 5400 ttcgcttaag acatccttta aaatcgcatt cattcaggcc cgctggcacg ccgacatcgt 5460 tgacgaagcg cgcaaaagct ttgtcgccga actggccgca aagacgggtg gcagcgtcga 5520 ggtagagata ttcgacgtgc cgggtgcata tgaaattccc cttcacgcca agacattggc 5580 cagaaccggg cgctatgcag ccatcgtcgg tgcggccttc gtgatcgacg gcggcatcta 5640 tcgtcatgat ttcgtggcga cggccgttat caacggcatg atgcaggtgc agcttgaaac 5700 ggaagtgccg gtgctgagcg tcgtgctgac gccgcaccat ttccatgaaa gcaaggagca 5760 tcacgacttc ttccatgctc atttcaaggt gaagggcgtg gaagcggccc atgccgcctt 5820 gcagatcgtg agcgagcgca gccgcatcgc gcttgtctga gctagcatga ctggtggaca 5880 gcaaatgggt cgcggatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg 5940 ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 6000 ttttgctgaa aggaggaact atatccggat atcccgcaag aggcccggca gtaccggcat 6060 aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt 6120 gttagatttc atacacggtg cctgactgcg ttagcaattt aactgt 6166

Claims (41)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Proteína quimérica aislada que consiste en un péptido, un polipéptido o un dominio proteico ligado covalentemente a una proteína lumazina sintetasa modificada de Brucella spp., en donde los primeros 8 residuos de aminoácidos N-terminales han sido eliminados y el noveno Asn (N) ha sido reemplazado por Leu (L).

2. 2.

   Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína modificada consiste en SEQ ID NO:7a.

3. 3.

   Secuencias de nucleótidos aisladas que comprenden las secuencias codificantes para las proteínas quiméricas y modificadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde las secuencias de nucleótidos codificantes para los primeros 8 residuos N-terminales de la proteína modificada comprenden sitios de restricción para las enzimas Nsi y Afl II.

4. 4.

   Las secuencias de ADN aisladas, de acuerdo con la reivindicación 3, que consisten en las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:1b, SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b, SEQ ID NO:7b, SEQ ID N0:9b, SEQ ID NO:10b y SEQ ID NO:11b.

5. 5.

   Vectores utilizados como un vehículo que comprenden las secuencias de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4.

6. 6.

   Los vectores, de acuerdo con la reivindicación 5, en donde los vectores son virales o plasmídicos.

7. 7.

   Vectores de acuerdo con la reivindicación 5, siendo el plásmido de SEQ ID NO:9c.

8. 8.

   Los vectores plasmídicos, de acuerdo con la reivindicación 6, siendo el plásmido pBLS-OMP31, número de depósito DSM 15546.

9. 9.

   Células transformadas con los vectores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

10. 10.

    Células transformadas de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las células son células Eucariotas o Procariotas.

11. 11.

    Células transformadas, de acuerdo con la reivindicación 9, siendo células de Escherichia coli

12. 12.

    Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido, polipéptido o dominio proteico ligado es un antígeno, toxina, agente o segmento de los mismos, capaz de inducir una respuesta inmune en un organismo Eucariota.

13. 13.

    Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antígeno es OMP-31, KET C1 o RBD3 o segmento de OMP-31, KET C 1 o RBD3.

14. 14.

    Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 13, que tienen la secuencia SEQ ID NO:9a.

15. 15.

    Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 13, que tienen la secuencia SEQ ID NO:10a.

16. 16.

    Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 13, que tienen la secuencia SEQ ID NO:11a.

17. 17.

    Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la respuesta inmune es humoral o celular.

18. 18.

    Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el organismo Eucariota es de especie mamífera tal como especie murina, conejuna o humana.

19. 19.

    La combinación de dos o más proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los dominios peptídicos, polipeptídicos o protéicos ligados a cada proteína modificada es diferente.

20. 20.

    La combinación de dos o más proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los dominios peptídicos, polipeptídicos o protéicos ligados a cada proteína modificada es idéntico.

21. 21.

    Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

22. 22.

    Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende un excipiente farmacéutico aceptable.

23. 23.

    Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el excipiente farmacéutico aceptable es un adyuvante.

24. 24.

    Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el adyuvante consiste de un adyuvante de Freund, un dipéptido MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de aluminio, citoquinas linfáticas, la proteína salvaje de lumazina sintetasa de Brucella spp o las proteínas modificadas de lumazina sintetasa de Brucella spp.

25. 25.

    Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-4.

26. 26.

    Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende un excipiente farmacéutico aceptable.

27. 27.

    Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el excipiente farmacéutico aceptable es un adyuvante.

28. 28.

    Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el adyuvante consiste de un adyuvante de Freund, un dipéptido MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de aluminio, citoquinas linfáticas, la proteína salvaje de lumazina sintetasa de Brucella spp o las proteínas modificadas de lumazina sintetasa de Brucella spp.

29. 29.

    Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y al menos una de las secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-4.

30. 30.

    Una composición farmacéutica, de acuerdo con las reivindicaciones 23 o 27, para uso en inducción de una respuesta inmune en un organismo Eucariota.

31. 31.

    Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la respuesta inmune es humoral

    o celular.

32. 32.

    Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la composición farmacéutica es para ser administrada de manera simultánea o secuencial.

33. 33.

    Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el organismo Eucariota es de especie mamífera tal como una especie murina, conejuna o humana.

34. 34.

    Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la composición farmacéutica es para ser administrada por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, oral o nasal o mediante un sistema de inyección sin aguja.

35. 35.

    Un biosensor que comprende: (a) un soporte donde se fija al menos una proteína quimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 1 y (b) dicho soporte está conectado a medios de medición que permiten determinar si un ligando se ha unido a, o reaccionado con, la proteína quimérica aislada.

36. 36.

    Un biosensor, de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el ligando es un anticuerpo.

37. 37.

    Conjugados de proteína que comprenden un ligando ligado al péptido, polipéptido o dominio proteico conectado a las proteínas modificadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. de acuerdo con la reivindicación 1.

38. 38.

    Conjugados de proteína, de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el enlace es un enlace covalente, tal como un enlace peptídico.

39. 39.

    Conjugados de proteína, de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el enlace es no covalente.

40. 40.

    Conjugados de proteína, de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el ligando y la proteína quimérica están enlazados mediante secuencias conectoras de un dominio de heterodimerización, tal como secuencias que codifican para zipper de leucina.

41. 41.

    Proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde su estructura cuaternaria es un decámero.