EA034564B1

EA034564B1 - Ротавирусная субъединичная вакцина, способ ее получения и применение

Info

Publication number: EA034564B1
Application number: EA201400914A
Authority: EA
Inventors: Рассел Ф. Бей; Рэнди Р. Симонсон; Камеш Редди Сириджиредди; Бенджамин Мэтью Хаус
Original assignee: Мериал, Инк.
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2020-02-20
Also published as: SI2814508T1; AU2013221479B2; JP2015508776A; DK2814508T3; LT2814508T; EP2814508A1; HK1200326A1; AR126891A2; CN104203274B; PH12014501795B1; BR112014020025B1; PT2814508T; CN104203274A; JP6149240B2; KR102087458B1; BR112014020025A8; US9446117B2; EP2814508B1; HUE033858T2; ES2632429T3

Abstract

Изобретение направлено на вакцинную композицию против ротавирусной инфекции, содержащую полипептиды ротавируса NSP4, VP4 и VP6 и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Изобретение также направлено на способ получения заявленной вакцинной композиции и способ вакцинации свиньи заявленной вакцинной композицией.

Description

Данная заявка испрашивает приоритет по отношению к предварительной заявке на патент США под серийным номером USNN 61/598624, представленной 14 февраля 2012 г., которая целиком включается в настоящий документ путем отсылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение в широком смысле относится к субъединичным вакцинам, в частности - к вакцинам, содержащим ротавирусные пептиды, которые сконструированы так, чтобы генетически или по антигенным свойствам быть почти идентичными пептидам, экспрессирующимися вирусами, заражающими чувствительную к ним популяцию животных. Плазмиды, обеспечивающие экспрессию антигенных пептидов или субъединичного белка (белков), поддерживаются в популяции бактериальных клеток с помощью селекционной системы токсин/антидот. Бактериальные клетки производят белок-токсин, которому противодействует белок-антидот, кодируемый плазмидой, несущей нуклеотидные последовательности для антигенных пептидов, так что не трансформированные клетки оказываются нежизнеспособными.

Уровень техники

Ротавирусы - наиболее распространенная причина тяжелой диареи у грудных и маленьких детей (Dennehy PH, 2000). Эти вирусы входят в число возбудителей инфекции, часто называемой желудочным гриппом, хотя к собственно гриппу она не имеет никакого отношения. Ротавирусы - род семейства Reoviridae; их генетический материал -двухцепочечная РНК. Известны пять видов (групп) этих вирусов, обозначаемые A, B, C, D и Е (см. классификацию вирусов Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), 2009) В табл. 1 представлены известные ротавирусные белки. Чаще всего встречается ротавирус А, на долю которого приходится 90% случаев ротавирусной инфекции у людей. Эти вирусы передаются фекально-оральным путем, заражают и повреждают клетки слизистой оболочки тонкого кишечника, вызывая гастроэнтерит. Ротавирусы поражают не только человека, но и животных; они являются патогенным агентом для домашнего скота (Dubovi EJ, 2010).

Так, по данным недавно проведенных исследований, ротавирусы часто (в 65% случаев) обнаруживаются в экскрементах или содержимом кишечника у свиней, страдающих поносом. В большинстве случаев инфекция у животных вызывается каким-то одним вирусом (A, B, C), но случается и смешанная инфекция ротавирусами более чем одной группы (Yoon, KJ, Epidemiology of rotaviruses, ISUVDL submissions, 2010-2011, Iowa State). Почти треть случаев ротавирусной инфекции у животных вызывается вирусами группы C, по меньшей мере. До сих пор профилактика ротавирусной инфекции у свиней сводилась к довольно сомнительной практике скармливания тканей инфицированных поросят здоровым животным. К этому методу вынуждало то, что ротавирусы группы C не удается культивировать in vitro, и, соответственно, нет возможности получать обычного типа вакцины на основе инактивированных/ослабленных цельных вирусных частиц. Таким образом, имеется несомненная и настоятельная необходимость в более безопасных и эффективных средствах предотвращения ротавирусной инфекции.

Таблица 1. Ротавирусные белки

Участок РНК (ген)	Размер (число нуклеотидных пар по ротавирусу группы С	Белок	Мол. масса (кДа)	Расположение	Число копий на вирион	Функция
1	3309	VP1	125	В вершинах кора	<25	РНК-зависимая РНКполимераза
2	2736	VP2	102	Образует внутреннюю часть кора	120	Активирует вирусную РНК-репликазу
3	2283	VP3	88	В вершинах кора	<25	Г уанилилтрансфераза (фермент, копирующий мРНК)
4	2166	VP4	87	Поверхностные шипики	120	Связывание с клеткой, вирулентность
5	1353	NSP1	59	Неструктурный	0	Связывание 5'РНК
6	1350	VP6	45	Внутренний капсид	780	Структурный белок, видоспецифичный антиген
7	1270	NSP3	37	Неструктурный	0	Усиливает активность вирусной мРНК и «выключает» синтез клеточных белков
8	1063	NSP2	35	Неструктурный	0	Нуклеозидтрифосфатаза, участвует в упаковке РНК
9	1037	VP7, VP7	38, 34	Поверхность	780	Структурный белок; нейтрализующий антиген
10	730	NSP4	20	Неструктурный	0	Энтеротоксин
11	613	NSP5 NSP6	22	Неструктурный	0	Модулятор NSP2, связывающий одноцепочечную и двухцепочечную РНК

- 1 034564

Альтернативный подход состоял бы в получении вакцин, содержащих иммуногенные субъединичные белки ротавирусов или антигены. На момент подачи настоящей заявки авторам данного изобретения не известно о работах, в которых описывались бы методы получения субъединичных ротавирусных вакцин (аутогенных или иных) для иммунизации свиней против ротавирусов, в частности, против ротавирусов группы С. В перечисленных ниже патентах и патентных заявках отражен достигнутый на сегодня уровень знаний в отношении ротавирусов в плане субъединичных вакцин.

В патенте США № 7790178 (Intervet) описываются трехвалентные вакцины, включающие инактивированный ротавирус собак.

В патентах США № 7311918 и 6589529 (Детская больница шт. Огайо) описываются рекомбинантные гибридные (слитые) ротавирусные белки, включающие фрагмент белка VP6, предназначенные для вакцинации людей. Данные, полученные в исследованиях на мышах, показали, что эти вакцины вызывают иммунный ответ, направленный против гибридного белка VP6.

В патенте США № 6867353 (Exploregen) в основном описывается экспрессия фрагмента кДНК, кодирующая структурный белок ротавируса человека, с использованием трансформированных томатов.

В патенте США № 6716431 (Wyeth, теперь входит в Pfizer) описываются альтернативные формы NSP4 (полиморфизмы однонуклеотидных фрагментов, приводящие к заменам аминокислот), сохраняющие антигенность, но обладающие пониженной цитотоксичностью.

Патенты США № 6673355 и US 6210682 (Медицинский колледж Бэйлора) относятся к использованию NSP4 и его фрагментов (NSP4 114-135, NSP4 120-147, NSP4 112-174 или NSP4 112-150) для предотвращения и/или лечения заболеваний, вызываемых ротавирусами. Также описаны композиции, содержащие энтеротоксин с адъювантом. В патентах США № 5891676 и US 5827696 (Медицинский колледж Бэйлора) описывается экспрессия ротавирусных белков VP2 и VP7 соответственно.

Патент США № 6187319 (Массачусетский университет) в основном относится к способам индуцирования иммунного ответа против первого ротавируса у животных путем введения изолированного полипептида VP6 второго ротавируса, который поражает другой вид, отличный от того, к которому принадлежит вакцинируемое животное.

В патенте США № 5298244 (Саскачеванский университет) описываются сборные вирусные частицы, содержащие VP4, VP6 и VP7.

В патенте США № 20110171316 (Служба здравоохранения США) описываются вирусоподобные частицы рекомбинантного ротавируса человека группы С.

В патенте США № 20100047763 (Goes et al.) описывается плазмидная ДНК, кодирующая ротавирусные белки, предназначенная для использования в диагностических наборах.

В патенте США № 5186933 (Медицинский колледж Бэйлора) описывается экспрессия ротавирусных генов, в частности, кодирующих VP3 и VP7, с использованием бакуловирусной экспрессионной системы.

До настоящего документа авторам данного изобретения не были известны эффективные ротавирусные субъединичные вакцины для свиней, полученные путем экспрессии антигенов ротавирусов типа C в клетках Е. coli. Также не было описаний способов для получения безопасных и эффективных вакцин для свиней. Таким образом, цель настоящего документа - предложить такие вакцины.

Литература

Dennehy РН (2000). Transmission of rotavirus and other enteric pathogens in the home. Pediatr. Infect. Dis. J. 19 (10 Suppl): S103-5. doi: 10.1097/00006454-200010001-00003.

PMID 11052397.

Bernstein DI (March 2009). Rotavirus overview. The Pediatric Infectious Disease Journal 28 (3 Suppl): S50-3.

Grimwood K, Lambert SB (February 2009). Rotavirus vaccines: opportunities and challenges. Human Vaccines 5 (2): 57-69. PMID 18838873.

Bishop R (October 2009). Discovery of rotavirus: Implications for child health. Journal of Gastroenterology and Hepatology 24 Suppl 3: S81-5.

Rheingans RD, Heylen J, Giaquinto C (2006). Economics of rotavirus gastroenteritis and vaccination in Europe: what makes sense?. Pediatr. Infect. Dis. J. 25 (1 Suppl): S48-55.

Simpson E, Wittet S, Bonilla J, Gamazina K, Cooley L, Winkler JL (2007). Use of formative research in developing a knowledge translation approach to rotavirus vaccine introduction in developing countries. ВМС Public Health 7: 281.

Edward J Dubovi; Nigel James MacLachlan (2010). Fenner's Veterinary Virology, Fourth

Edition. Boston: Academic Press, p. 288. ISBN 0-12-375158-6.

- 2 034564

Раскрытие изобретения

Цель данного изобретения состоит в том, чтобы предложить субъединичные вакцины, а также способы лечения и профилактики ротавирусных инфекций.

В одном аспекте данное изобретение относится к вакцинной композиции против ротавирусной инфекции, содержащей:

a) полипептиды ротавируса NSP4, VP4 и VP6 и

b) фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

В одном из вариантов осуществления указанные ротавирусные полипептиды NSP4, VP4 и VP6 слиты в рекомбинантный тройной полипептид.

В одном из вариантов осуществления указанный рекомбинантный тройной полипептид представляет собой полипептид NSP4-VP4-VP6 ротавируса С.

В одном из вариантов осуществления вакцинная композиция дополнительно содержит адъювант.

В одном из вариантов осуществления адъювант представляет собой эмульсию типа масло в воде.

В одном из вариантов осуществления рекомбинантный тройной полипептид имеет последовательность, SEQ ID NO: 95.

В одном из вариантов осуществления полипептиды NSP4, VP4 и VP6 включают аминокислотные последовательности, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 для NSP4, SEQ ID NO: 41, 43, 45, 47, 49 для VP4, SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 для VP6.

В одном из вариантов осуществления вакцинная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один антиген, ассоциированный с патогеном, отличным от ротавируса.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один указанный антиген способен вызывать у свиней иммунный ответ, направленный против Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), цирковируса свиней 2 типа (PCV2), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вируса свиного гриппа (SIV) или другого патогена, способного заражать свиней.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения предложенной вакцинной композиции, который включает следующие этапы:

(a) забор биологического образца у животного;

(b) определение ротавирусного инфекционного статуса животного;

(c) выделение РНК из образца животного, зараженного ротавирусами одного или более типов;

(d) проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипазой и праймерами, комплементарными генам NSP4, VP4 и VP6;

(e) встраивание продукта ПЦР, полученного на этапе (d), в подходящий экспрессионный вектор;

(f) введение вектора, полученного на этапе (e), в экспрессионную систему подходящего организмахозяина;

(g) выделение полипептидов ротавируса NSP4, VP4 и VP6 и (h) добавление к ротавирусным полипептидам дополнительных вакцинных компонентов.

В одном из вариантов осуществления дополнительные компоненты выбирают из адъювантов, ветеринарно приемлемых носителей, разбавителей и антигенов, ассоциированных с патогенами, отличными от ротавирусов.

В одном из вариантов осуществления дополнительным компонентом является адьювант.

В одном из вариантов осуществления указанные антигены способны вызывать у свиней иммунный ответ, направленный против Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), цирковируса свиней 2 типа (PCV2), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вируса свиного гриппа (SIV) или другого патогена, способного заражать свиней.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу вакцинации свиньи, который включает по меньшей мере однократное введение предложенной вакцинной композиции.

В одном из вариантов осуществления свинья является свиноматкой, которой осталось от около 3 до около 6 недель до опороса.

В одном из вариантов осуществления среди поросят, рождающихся у указанной свиноматки, понижены смертность и/или заболеваемость по сравнению с поросятами невакцинированных свиноматок.

Краткое описание фигур

Из остального описания, включающего ссылки на прилагаемые фигуры, явствует полное практическое раскрытие данного изобретения, в том числе наилучшего образа действия для рядового специалиста в данной области техники.

Фиг. 1 изображает рестрикционную карту вектора pStaby1.2 (предоставленную поставщиком).

Фиг. 2 изображает удаление гена устойчивости к ампициллину из вектора pStaby1.2.

Фиг. 3 изображает встраивание гена глутатион^-трансферазы (GST) в вектор pNPL1 с образованием вектора pNPL2.

Фиг. 4 представляет карту фланкирующих участков и сайтов встраивания ротавирусных генов в вектор pNPL2.

Фиг. 5 представляет схему выделения донорной ДНК.

- 3 034564

Фиг. 6 представляет схему выделения ротавирусных генов-кандидатов для аутогенной вакцины из клинических образцов.

Фиг. 7 представляет схему встраивания донорной ДНК pNPL2 с образованием pNPL2-Rota.

Фиг. 8 представляет результаты электрофореза в полиакриламидном геле, подтверждающие экспрессию и размеры ротавирусных белков VP4, VP6 и NSP4.

Фиг. 9A представляет выравнивание нуклеотидных последовательностей и последовательностей пептидов для изолятов NSP4 (в таблице указана идентичность в процентах).

Фиг. 9B представляет выравнивание нуклеотидных последовательностей и последовательностей пептидов для изолятов VP4 (в таблице указана идентичность в процентах).

Фиг. 9C представляет выравнивание нуклеотидных последовательностей и последовательностей пептидов для изолятов VP6 (в таблице указана идентичность в процентах).

Фиг. 10 - диаграмма, демонстрирующая результаты общего серологического исследования эффективности вакцины.

Фиг. 11 - диаграммы, демонстрирующие результаты специфичного по VP4, VP6, и NSP4 серологического исследования методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Фиг. 12 представляет результаты анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле, подтверждающие экспрессию тройного слитого белка Rota С NSP4-VP4-VP6. L - линейка; 1 - до индукции (OD=0,6); 2 - не индуцированные культуры (OD=1,5); 3 - индуцированные культуры (OD=1,5).

Фиг. 13 представляет результаты анализа методом вестерн-блоттинга (слева) и электрофореза в полиакриламидном геле (справа), подтверждающие экспрессию слитого белка. L - линейка; 1-BSA 1,5 мкг; 2 - слитый белок, разведение 1:20; 3 - слитый белок, разведение 1:40; 4 - GST 0,5 мкг.

Осуществление изобретения

Данное изобретение охватывает субъединицы ротавирусов (которые в настоящем документе определяются как, например, ротавирусные полипептиды, белки антигены, эпитопы или иммуногенные агенты), вызывающие у животных иммуногенную реакцию, в частности, субъединицы ротавирусов, вызывающие, индуцирующие или стимулирующие такую реакцию у свиней.

Особый интерес представляют такие субъединицы ротавирусов, как VP4, VP6 и NSP4, в частности, кодируемые нуклеотидными последовательностями, имеющимися у свиней, зараженных ротавирусом группы С. Считается, что предшественники любого из этих антигенов можно использовать при реализации данного изобретения.

В одном из воплощений данного изобретения предлагается способ амплификации ротавирусных нуклеотидных последовательностей, источником которых являются зараженные ротавирусом свиньи, и применение хорошо известных молекулярных методов для включения указанных амплифицированных последовательностей в экспрессионные векторы. В одном конкретном воплощении данного изобретения амплификация осуществляется путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, комплементарных высоко консервативным участкам ротавирусных генов, так что эти гены, принадлежащие различным штаммам ротавирусов, можно амплифицировать, используя те же праймеры. В одном из воплощений данного изобретения эти праймеры комплементарны ротавирусным нуклеотидным последовательностям, кодирующим белки VP4, VP6 и/или NSP4, и имеют последовательность, представленную SEQ ID № 8-13).

В другом аспекте данного изобретения предлагаются способы получения экспрессионных векторов, которые содержатся в прокариотическом организме-хозяине и делают возможной экспрессию гена антидота, обеспечивающего жизнеспособность бактериальных клеток, в которых экспрессируются белковые токсины. В одном из воплощений данного изобретения указанный антидот является белком ccdA, а токсин - белком ccdB.

В другом аспекте данного изобретения новые ротавирусные нуклеотидные последовательности включаются в экспрессионные векторы, чтобы производить субъединицы ротавирусов для использования в составе субъединичных вакцин.

В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые субъединичные вакцины содержат также адъювант. В одном из конкретных воплощений данного изобретения адъювант представляет собой систему масло-в-воде. В некоторых воплощениях данного изобретения адъювантом служат продукты под названиями TRIGEN, ULTRAGEN, PrimaVant, TS6, LR4 или их сочетания. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые вакцины также содержат соль алюминия в количестве, достаточном, чтобы служить адъювантом. В субъединичные вакцины по данному изобретению также можно добавлять другие вещества, способные служить адъювантом, в том числе (не ограничиваясь перечисленным здесь) сапонин и гидроксид алюминия. Эти дополнительные адъюванты могут улучшить стабильность вакцины в процессе хранения или ее эффективность, или и то и другое.

В другом аспекте данного изобретения предлагаются способы обеспечения защитного иммунитета у поросят против ротавирусов, включающие введение предлагаемых субъединичных вакцин свиноматкам и подсвинкам до опороса.

- 4 034564

Т аблица 1. Перечень праймеров, используемых для конструирования векторов по данному изобретению

SEQ ID NO: ID NO: ID #	#	Описание
2	650	GST прямой Ndel
3	651	GST обратный BamHI
4	644	Г ей AMP^r, делеция, прямой
5	645	Г ей AMP^r, делеция, обратный
6	660	Верификация продукта ПЦР, прямой
7	661	Верификация продукта ПЦР, обратный
8	652	NSP4 прямой с сайтом BamHI
9	653	NSP4, обратный с сайтом Hindlll
10	654	VP4, прямой с сайтом BamHI
11	655	VP4, обратный с сайтом Hindlll
12	656	VP6, прямой с сайтом BamHI
13	657	VP6, обратный с сайтом Hindlll
73	760	KSN760 - обратный VP4
74	761	KSN761 - прямой VP4
75	762	KSN762 - обратный VP4
76	763	KSN763 - прямой VP4
77	772	Праймер 1 для введения His Tag в pNPLl
78	773	Праймер 2 для введения His Tag в pNPLl
79	774	Rota С NSP4 прямой для pNPL3
80	775	Rota С NSP4 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl
81	776	Rota С VP4 ПРЯМОЙ для pNPL3
82	777	Rota С VP4 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl
83	778	Rota С VP6 ПРЯМОЙ для pNPL3
84	779	Rota С VP6 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl
85	780	Rota С NSP4 ПРЯМОЙ для pNPLl
86	781	Rota С VP4 ПРЯМОЙ для pNPLl
87	782	Rota С VP6 ПРЯМОЙ для pNPLl
88	783	Rota С VP7 ПРЯМОЙ для pNPL3
89	784	Rota С VP7 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl

Антигенные полипептиды или белки по данному изобретению способны защищать от ротавирусов. Это значит, что они могут стимулировать у животного иммунный ответ. Под антигеном или иммуногеном понимается вещество, вызывающее специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может представлять собой цельный организм - убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть этого организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; участок или фрагмент ДНК, способный вызывать иммунный ответ после представления в животном-хозяине; полипептид, эпитоп, гаптен или любое их сочетание. Или же иммуноген/антиген может представлять собой токсин либо антитоксин.

В настоящем документе термины белок, пептид, полипептид и фрагмент полипептида/полипептидный фрагмент употребляются взаимозаменяемо и относятся к полимерной молекулы, состоящей из мономеров - аминокислот, любой длины. Такой полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот; в нем могут быть вставки иных нежели аминокислоты химических группировок. Эти термины также включают полимеры из аминокислот, модифицированные естественным образом или путем стороннего вмешательства: например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или любых других манипуляций или модификаций, например, конъюгирования с мечеными или биологически активными компонентами.

В настоящем документе термин иммуногенный/антигенный полипептид включает полипептиды, иммунологически активные в том смысле, что, попав в организм животного-хозяина, они способны вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ, направленный против данного белка. Предпочтительно фрагмент белка берется такой, чтобы он обладал в основном такой же иммунологической активностью, что и цельный белок. Таким образом, белковый фрагмент по данному изобретению содержит эпитоп или антигенную детерминанту, или состоит в основном из эпитопа или антигенной детерминанты, или состоит по меньшей мере из одного эпитопа или одной антигенной детерминанты. Термин иммуногенный белок или иммуногенный полипептид в настоящем документе включает полную аминокислотную последовательность данного белка, его аналогов или иммуногенных фрагментов. Под иммуногенным фрагментом понимается фрагмент белка, включающий один или более эпитопов, и таким образом вызывающий иммунологическую реакцию, описанную выше. Такие фрагменты можно идентифицировать, применяя любое число методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники; см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Mor

- 5 034564 ris, Ed., 1996). Например, в случае линейных эпитопов можно параллельно синтезировать множество пептидов на твердой подложке, соответствующих участкам белковой молекулы, и с находящимися на подложке пептидами проводить реакцию с антителами. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 4708871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. В случае конформационных эпитопов идентификация достигается путем определения пространственной конформации аминокислот, например с помощью рентгеновской кристаллографии и двумерной ЯМРспектроскопии; см., например, Epitope Mapping Protocols (см. выше). Методы, особенно подходящие для белков Т. parva, исчерпывающе описаны в заявке на патент США № 2004/022605, которая целиком включается в настоящий документ путем отсылки.

В настоящем описании данное изобретение включает активные фрагменты и варианты антигенных полипептидов. Таким образом, термин иммуногенный/антигенный полипептид также охватывает делеции, вставки и замены в последовательности, если с такими изменениями данный полипептид иммунологически функционирует, то есть вызывает иммунологическую реакцию, описанную выше. Термин консервативная вариация означает замену аминокислотного остатка другим, биологически сходным, или замену нуклеотида в нуклеотидной последовательности, не приводящую к замене аминокислотного остатка или приводящую к замене на биологически сходный аминокислотный остаток. В этой связи особенно предпочтительные замены, имеющие место в природе, консервативны, то есть на место заменяемой аминокислоты встает член того же семейства аминокислот. Аминокислоты обычно разделяют на четыре семейства: (1) кислые - аспарагиновая кислота (аспартат) и глутаминовая кислота (глутамат); (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин. триптофан; (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда объединяют в группу ароматических аминокислот. Консервативные вариации включают замену одного гидрофобного аминокислотного остатка, например изолейцина, валина, лейцина или метионина, на другой гидрофобный остаток; или замену одного полярного аминокислотного остатка на другой полярный остаток, например замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты - на аспарагиновую кислоту или глутамина - на аспарагин и т.п.; Консервативной заменой будет и такая, когда аминокислота заменяется на структурно родственную, что не влияет существенно на биологическую активность. Таким образом, белки, имеющие такую же в основном аминокислотную последовательность, как и эталонная молекула, но только с незначительными заменами аминокислот, не влияющими существенно на иммуногенность белка, охватываются понятием эталонный полипептид. В эту категорию включаются все полипептиды, порожденные указанными модификациями. Термин консервативная вариация также включает использование замещенных аминокислот вместо исходных незамещенных - при условии, что антитела, образовавшиеся в ответ на такой замещенный полипептид, также реагируют с незамещенным полипептидом.

Термин эпитоп относится к участку антигена или гаптена, на который отвечают специфичные Bи/или Т-клетки. Этот термин используется как синоним (взаимозаменяемо) термину антигенная детерминанта или участок антигенной детерминанты. Антитела, узнающие один и тот же эпитоп, можно идентифицировать простым иммунологическим методом, демонстрирующим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

Иммунологическая реакция на композицию или вакцину - это развитие в организме-хозяине клеточного и/или гуморального (опосредованного антителами) иммунного ответа, направленного на данную композицию или вакцину. Обычно понятие иммунологическая реакция включает (но не ограничивается перечисленным здесь) один или более из следующих феноменов: образование антител, B-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, направленных специфично на антиген или антигены, содержащиеся в данной композиции или вакцине. Предпочтительно в организме-хозяине возникает терапевтическая иди протективная иммунологическая реакция, так что усиливается сопротивляемость новой инфекции и/или снижается степень тяжести клинических проявлений заболевания. Такая защита демонстрируется ослаблением или отсутствием симптомов и/или клинических признаков заболевания, обычно имеющих место у зараженного организма-хозяина, более быстрым выздоровлением и/или пониженной концентрацией вируса в зараженном организме-хозяине.

Термин животное в настоящем документе подразумевает млекопитающих, птиц и проч. Термины животное или хозяин в настоящем документе включают млекопитающих, в том числе человека. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из представителей семейства лошадиных (например, лошади), собачьих (например, собаки, волка, лисицы, койота, шакала), кошачьих (например, льва, тигра и других больших кошек, в том числе гепарда и рыси, домашней кошки, дикой кошки), полорогих (например, овцы и крупного рогатого скота), нежвачных парнокопытных (например, свиньи), птиц (например, курицы, утки, гуся, индейки, куропатки и перепела, фазана, попугаев, вьюрков, ястребиных, страусов, включая казуара и эму), приматов (например, полуобезьян, включая долгопятов, низших приматов, человекообразных обезьян, включая гиббонов), хорьков, тюленей и рыб. Термин животное включает также понятие особи (индивида) на всех стадиях развития, включая периоды новорожденности и внутриутробного развития.

Если особо не оговорено иного, все технические и научные термины в настоящем документе упот- 6 034564 ребляются в тех же значениях, которые общеприняты у рядовых специалистов в области техники, к которой относится данное описание. Артикли (неопределенные a/an и определенный the) при существительном в единственном числе включают значение множественного числа, если только из контекста не следует значение исключительно единственного числа. Союз или подразумевает также соединительное значение (и), если только из контекста не следует значение исключительно альтернативы.

В настоящем описании и, в особенности, в формуле изобретения и/или пунктах выражения содержать и его производные (содержащий и проч.) имеют значение, придаваемое им согласно патентному законодательству США; например, значение включать (включающий, включенный и проч.); выражение состоять в основном из и его производные (состоящий в основном из) имеют значение, придаваемое им согласно патентному законодательству США; например, они означают, что подразумеваются не только буквально названные элементы, но исключают элементы, ранее фигурировавшие в данной области техники или влияющие на основные или новые отличительные признаки данного изобретения.

Композиции

Данное изобретение относится к ротавирусным вакцинам или композициям, содержащим ротавирусный полипептид, антиген, эпитоп или иммуногенный агент, и фармацевтически (для людей или для животных) приемлемый носитель или иной эксципиент. Ротавирусный полипептид, белок, антиген, эпитоп или иммуногенный агент может быть любым ротавирусным полипептидом, белком, антигеном, эпитопом или иммуногенным агентом, например (не ограничиваясь перечисленным здесь), белком, пептидом или их фрагментом, который вызывает или стимулирует реакцию со стороны организма животного.

Данное изобретение относится к ротавирусным вакцинам или композициям, содержащим ротавирусный полипептид VP1, VP2, VP3, VP4, NSP1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4, NSP5 или NSP6 и фармацевтически (для людей или для животных) приемлемый носитель или иной эксципиент. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемый экспрессионный вектор может также содержать полинуклеотид, кодирующий полипептид VP4, VP6 или NSP4 или их комбинацию. В одном из конкретных воплощений данного изобретения полинуклеотид в составе вектора содержит последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71 или их сочетаниями.

В другом воплощении данного изобретения фармацевтически (для людей или для животных) приемлемый носитель или иной эксципиент может представлять собой эмульсию типа вода в масле. В еще одном воплощении данного изобретения эта эмульсия типа вода в масле может быть тройной эмульсией вода/масло/вода (W/0/W).

В одном из воплощений данного изобретения ротавирусный полипептид или антиген, или его фрагмент, или его вариант содержит какой-либо ротавирусный полипептид или его фрагмент, или его вариант. В одном из вариантов этого воплощения данного изобретения указанный ротавирусный полипептид или его фрагмент, или его вариант является рекомбинантным полипептидом - продуктом ротавирусного гена. В другом варианте этого воплощения указанный ротавирусный ген по меньшей мере на 70% идентичен последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71 или их сочетаниями. В другом варианте этого воплощения указанный ротавирусный ген по меньшей мере на 80% идентичен последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71, причем указанный полипептид или его фрагмент, или его вариант играет ту же функциональную роль (то есть указанный полипептид является ротавирусным полипептидом VP4, VP6 или NSP4, принадлежащим ротавирусу другого штамма группы C).

Приведенное определение охватывает также синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие производные антигенов, полученные рекомбинантным или синтетическим путем (см., например, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998). Для целей данного изобретения иммуногенные фрагменты обычно включают по меньшей мере около 3 аминокислотных остатков, по меньшей мере около 5 аминокислотных остатков, по меньшей мере около 10-15 аминокислотных остатков или по меньшей мере около 15-25 или более аминокислотных остатков исходной молекулы. Что касается длины фрагмента, то верхнего предела здесь нет: он может содержать почти всю аминокислотную последовательность данного белка или даже гибридного (слитого) белка, содержащую по меньшей мере один эпитоп данного белка.

Соответственно минимальная структура полинуклеотида, проявляющаяся как эпитоп, содержит нуклеотиды, кодирующие эпитоп, или антигенную детерминанту, ротавирусного полипептида (или состоит из этих нуклеотидов. или в основном состоит из этих нуклеотидов). Полинуклеотид, кодирующий фрагмент ротавирусного полипептида, может содержать минимум 15 нуклеотидов, около 30-45 нуклеотидов, около 45-75 или по меньшей мере 57, 87 или 150 последовательно или непрерывно расположенных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей данный полипептид (или состоять из них, или в основном состоять из них). При осуществлении на практике данного изобретения могут применяться такие подходы к определению эпитопов, как, например, создание библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer et al., 1998), пептидное сканирование (метод PEPSCAN) (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de

- 7 034564

Chiron) и использование алгоритмов (De Groot et al., 1999; PCT/US 2004/022605).

Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид относятся к РНК или ДНК-линейным или разветвленным, одно- или двухцепочечным, или их гибридам. Эти термины охватывают также гибридные молекулы ДНК/РНК. Ниже приведены примеры (не имеющие ограничительного характера) полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, матричные РНК (мРНК), транспортные РНК (тРНК), рибосомные РНК (рРНК), рибозимы, комплементарные ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированная ДНК с любой нуклеотидной последовательностью, изолированная РНК с любой нуклеотидной последовательностью, ДНК- или РНКпробы (зонды) и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, например метилированные нуклеотиды; или аналоги нуклеотидов; урацил; сахара и связывающие группировки, отличные от рибозы и дезоксирибозы, например, фторрибозу и тиолаты; и нуклеотидные ответвления. Нуклеотидная последовательность может модифицироваться после полимеризации, например, путем конъюгации с компонентом-меткой. Другие модификации такого рода включают кэпирование, замену одного или более природных нуклеотидов на аналоги, включение средств для присоединения полинуклеотида к белкам, ионам металлов, компонентам-меткам, другим полинуклеотидам или твердой подложке. Полинуклеотиды по данному изобретению могут быть получены путем химического синтеза или произведены микроорганизмами.

Термин ген употребляется в широком смысле для обозначения любого участка полинуклеотида, связанного с той или иной биологической функцией. Так, понятие гена включает интроны и экзоны как геномные последовательности или только кодирующие нуклеотидные последовательности, например, к ДНК и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, термин ген также относится к фрагментам нуклеиновых кислот, обеспечивающим образование мРНК или функциональной РНК, или кодирующим определенный белок, которые включают регуляторные последовательности.

Данное изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, комплементарные полинуклеотидам, кодирующим антиген, эпитоп или иммуногенный агент. Комплементарная последовательность может быть полимером любой длины и может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любых сочетаниях.

Определение изолированный (выделенный) применительно к биологическому компоненту (например, нуклеиновой кислоте, белку или клеточной органелле) означает, что данный компонент в основном отделен или очищен от других биологических компонентов клеток того организма, в котором данный компонент присутствует от природы, например, от других хромосомных или нехромосомных ДНК или РНК, белков и органелл. Изолированные (выделенные) нуклеиновые кислоты и белки включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными методами очистки такого рода веществ. Определение изолированный (выделенный) также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью методов рекомбинантной ДНК/РНК или путем химического синтеза.

Определение очищенный в настоящем документе не подразумевает абсолютной чистоты - это скорее относительная характеристика. Так, например, препарат частично очищенного полипептида - это такой препарат, в котором относительное содержание данного полипептида выше, чем в его естественном окружении. Иными словами, данный полипептид отделен от других клеточных компонентов. Выражение в основном очищенный (практически очищенный) подразумевает, что по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или более клеточного материала или клеточных компонентов удалены. Сходным образом определяется понятие частично очищенный полипептид. Это выражение подразумевает, что удалены менее 60% клеточного материала или клеточных компонентов. То же относится к полинуклеотидам. Описанные в настоящем документе полипептиды могут быть очищены любыми известными в данной области техники способами.

Также в объем данного изобретения входят гомологи ротавирусных полипептидов. В настоящем документе термин гомологи включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин аналог применительно к двум полипептидам или полинуклеотидам означает, что они выполняют одну и ту же функцию или сходные функции, но в ходе эволюции возникли независимо друг от друга у неродственных организмов. Термин ортологи употребляется в отношении полинуклеотидов или полипептидов из разных видов, подразумевая, что два полипептида (полинуклеотида) разделились в результате видообразования и происходят от общего предкового гена. Обычно ортологи кодируют полипептиды с одной и той же функцией или со сходными функциями. Термин паралоги употребляется в отношении полипептидов или полинуклеотидов, разделившихся в результате дупликации в геноме. У двух паралогичных полипептидов (полинуклеотидов) обычно разные функции, но эти функции могут быть связаны. Например, аналоги, ортологи и паралоги ротавирусного полипептида дикого типа могут отличаться от ротавирусного полипептида дикого типа в результате посттрансляционной модификации различий в аминокислотной последовательности или того и другого вместе. В частности, гомологи по данному изобретению в основном по меньшей мере на 80-85%, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичны по последовательности всему полипептиду или полинуклеотиду ротавируса дикого типа (или его части) и выпол

- 8 034564 няют сходные функции.

В другом аспекте данного изобретения предлагается полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности полипептида, представленного SEQ ID 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72. В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются фрагменты и варианты ротавирусных полипептидов, о которых говорилось выше (SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72); они могут быть достаточно легко получены специалистом в данной области техники с помощью хорошо известных молекулярно-биологических методов.

Варианты - это гомологичные полипептиды, у которых аминокислотная последовательность по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72.

Варианты включают аллельные варианты. Термин аллельный вариант относится к существующим в природной популяции (например, виды или штаммы вируса) полинуклеотидам или полипептидам, в которых имеются полиморфизмы, приводящие к изменениям аминокислотной последовательности белка. В силу существования таких аллельных вариантов обычно имеет место 1-5%-ная изменчивость полинуклеотидов или полипептидов. Аллельные варианты можно идентифицировать путем секвенирования данной нуклеотидной последовательности у ряда различных видов живых организмов, что можно легко осуществить с помощью гибридизационных зондов, чтобы идентифицировать у этих видов один и тот же генный локус. В объем данного изобретения входят любые (и все) такие вариации нуклеотидных последовательностей и следующий из них полиморфизм аминокислотных последовательностей или вариации, являющиеся результатом природных аллельных вариантов, которые не влияют на функциональную активность данного гена.

В настоящем документе термины производное или вариант относятся к полипептиду (или к кодирующей его нуклеиновой кислоте), в котором имеются одна или более консервативных вариаций аминокислот или иные незначительные модификации - такие, что функционирование соответствующего полипептида практически не изменяется по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитела против данного полипептида иммунореактивны в отношении полипептида дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды с незначительными модификациями по сравнению с исходными аминокислотными последовательностями ротавирусных полипептидов, в результате чего пептиды обладают практически такой же активностью, как соответствующие не модифицированные полипептиды. Такие модификации могут создаваться намеренно, например путем направленного (сайт-специфичного) мутагенеза, или же быть спонтанными. Термин вариант также включает делеции, вставки и замены в последовательности, не влияющие на функционирование полипептида, а именно на иммунологическую реакцию, как это описано в настоящем документе.

Термин консервативная вариация означает замену аминокислотного остатка на другой, биологически сходный аминокислотный остаток или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, не приводящую к замене аминокислотного остатка в соответствующем полипептиде или приводящую к замене на биологически сходный аминокислотный остаток. В этой связи особенно предпочтительные замены, как правило, консервативны, о чем говорилось выше.

Иммуногенный фрагмент ротавирусного полипептида включает по меньшей мере 8, 10, 13, 14, 15 или 20 расположенных подряд аминокислотных остатков, по меньшей мере 21 аминокислотный остаток, по меньшей мере 23 аминокислотных остатка, по меньшей мере 25 аминокислотных остатков или по меньшей мере 30 аминокислотных остатков ротавирусного полипептида с последовательностью, представленной SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или их вариантами, или функциональными фрагментами.

В другом аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий ротавирусный полипептид, например полинуклеотид, кодирующий полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или их вариантами, или функциональными фрагментами. В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид. кодирующий полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида, представленной SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или консервативным вариантом, аллельным вариантом, гомологом или иммуногенным фрагментом, содержащим по меньшей мере восемь или по меньшей мере десять расположенных подряд аминокислотных остатков одного из этих полипептидов или их сочетаний.

В другом аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47,

- 9 034564

49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71, или их вариантами, или функциональными фрагментами. В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид. кодирующий полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида, представленной SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71, или их вариантом.

В настоящем описании полинуклеотиды включают нуклеотидные последовательности, вырожденные в смысле генетического кода в результате, например, использования оптимизированных кодонов для определенного организма-хозяина. В настоящем документе определение оптимизированный относится к полинуклеотидам, которым методами генетической инженерии придана способность к усиленной экспрессии у данного вида живых организмов. Для получения кодон-оптимизированных полинуклеотидов. кодирующих ротавирусные полипептиды, последовательность ДНК ротавирусного гена может быть модифицирована, чтобы: 1) содержать кодоны, предпочтительные для генов с высоким уровнем экспрессии в экспрессионной системе данных клеток-хозяев (например, бактериальных); 2) иметь содержание А+Т или G+C близкое к обычно имеющему место у данных клеток-хозяев; 3) образовывать инициаторную последовательность указанных клеток-хозяев; 4) исключить последовательности, обусловливающие дестабилизацию, деградацию и терминацию РНК, или образовывать вторичную структуру типа шпилька, усиленная экспрессия ротавирусного белка в экспрессионной системе указанных клеток-хозяев может достигаться с учетом распределения частоты использования кодонов у прокариот.

Степень идентичности двух сравниваемых аминокислотных последовательностей может быть установлена с помощью программы BLAST с матрицей попарных сравнений BLOSUM62 NCBI (Национального центра биотехнологической информации, Бетесда, шт. Мэриленд, США) с использованием стандартных параметров (см., например, алгоритмы BLAST или BLASTX на сервере NCBI, а так же работу Altschul et al.). В настоящем документе алгоритм или BLAST, или BLASTX и матрица BLOSUM62 обозначаются словом blasts.

Термин идентичность применительно к последовательностям относится к числу положений с одинаковыми нуклеотидами или аминокислотами, деленному на число нуклеотидов или аминокислот в наиболее короткой из сравниваемых двух последовательностей. Выравнивание двух последовательностей определяют согласно алгоритму Уилбура-Липмана (Wilbur, Lipman), например, взяв размер окна 20 нуклеотидов, длину слова 4 нуклеотида и штраф за пробел 4. Компьютерный анализ и интерпретацию данных включая выравнивание можно осуществить, используя имеющиеся в продаже программы (например, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Когда говорят, что последовательности РНК сходны или имеют степень идентичности последовательностей, или гомологию с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в последовательностях ДНК считается эквивалентным урацилу (U) в последовательностях РНК. Таким образом, последовательности РНК входят в объем данного изобретения; их можно вывести их последовательностей ДНК, полагая тимидин (Т) в последовательностях ДНК эквивалентным урацилу (U) в последовательностях РНК.

Идентичность или сходство двух аминокислотных последовательностей или идентичность двух нуклеотидных последовательностей можно определять, используя пакет программ Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Карлсбад, штат Калифорния, США).

В работах перечисленных ниже авторов предлагаются алгоритмы для сравнения и определения относительной идентичности или гомологии последовательностей; для определения процента гомологии или идентичности дополнительно к изложенному выше (или вместо него) можно использовать рекомендации, данные в работах этих авторов:

Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; and, Devereux J, Haeberlie P and Smithies О. Опытный специалист в данной области техники может обойтись без ненужного экспериментирования, используя при опредекелении процента гомологии также многие другие программы или работы.

Реакции гибридизации можно проводить в условиях различной степени строгости. Условия, увеличивающие строгость гибридизации, хорошо известны (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (Sambrook et al., 1989).

Данное изобретение также охватывает ротавирусные полинуклеотиды, содержащиеся в векторных молекулах или экспрессионных векторах и функционально связанные с промоторными элементами и при необходимости с энхансерами.

Термин вектор в настоящем документе относится к рекомбинантным плазмидам (РНК или ДНК) или вирусам, содержащим гетерологичный полинуклеотид, который должен быть доставлен в клеткумишень in vitro либо in vivo. Этот гетерологичный полинуклеотид может включать нуклеотидную последовательность, нужную для профилактики или лечения и при необходимости он может быть представлен экспрессионной кассетой. В контексте данного изобретения вектор не обязательно способен к репликации в конечной клетке-мишени или организме пациента. Термин вектор включает клонирующие и ви- 10 034564 русные векторы.

Термин рекомбинантный означает, что данный полинуклеотид является полностью или частично синтетическим и не встречается в природе или связан с другим полинуклеотидом в конструкции, не встречающейся в природе.

Термин гетерологичный означает, что данный полинуклеотид происходит из объекта, генетически отличного от того объекта, с которым проводится сравнение. Например, с помощью методов генетической инженерии полинуклеотид может быть включен в плазмиду или вектор, происходящий из другого источника, и тогда он является гетерологичным. Промотор, отделенный от своей природной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличной от той, природной, является гетерологичным промотором

Полинуклеотиды по данному изобретению могут содержать дополнительные последовательности, например, дополнительные кодирующие последовательности в пределах той же транскрипционной единицы; регуляторные элементы, например, промоторы; участки связывания с рибосомой; нетранслируемые области (5'-UTR, 3'-UTR); терминаторы транскрипции; сайты полиаденилирования; дополнительные транскрипционные единицы, регулируемые тем же или иным промотором; последовательности, обеспечивающие клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина; а также любые другие подобные элементы, если они желательны для воплощения данного изобретения.

В векторе по данному изобретению предпочтительно имеются элементы, нужные для экспрессии ротавирусного полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента. Как минимум вектор содержит кодон инициации трансляции (ATG), стоп-кодон и промотор, а при необходимости также последовательность polyA - в случае некоторых векторов, например, плазмид и ряда вирусных векторов (например, отличных от поксвирусов). Когда полинуклеотид по данному изобретению кодирует фрагмент полипептида, например ротавирусного полипептида, в векторе предпочтительно инициаторный кодон ATG помещается на 5'-конце рамки считывания, а стоп-кодон - на ее 3'-конце. Могут присутствовать и другие элементы для регуляции экспрессии, например, энхансеры, стабилизирующие последовательности, интроны и сигнальные последовательности, нужные для секреции белка-продукта.

Данное изобретение относится также к препаратам, содержащим векторы (например, экспрессионные векторы), например, к терапевтическим композициям. Такие препараты могут включать один или более векторов, например, экспрессионных векторов, например, векторов для экспрессии in vivo, кодирующих и обеспечивающих экспрессию одного или более ротавирусных полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенных агентов. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемый вектор содержит (и обеспечивает экспрессию) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий и/или обеспечивающий экспрессию ротавирусного гена, эпитопа или иммуногенного агента, в фармацевтически (для людей и животных) приемлемом носителе, эксципиенте или растворителе. Таким образом, по одному из воплощений данного изобретения другой вектор (векторы) в указанном препарате содержит (содержат) полинуклеотид, кодирующий и при соответствующих обстоятельствах экспрессирующих один или более других белков помимо ротавирусного полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента - например, гемагглютинин, белок капсида, нейраминидазу, нуклеопротеин, неструктурный белок, энтеротоксин - или их фрагменты; или указанный вектор состоит в основном или целиком из указанных элементов.

В другом воплощении данного изобретения предлагаемый вектор (векторы) в препарате содержит полинуклеотид (полинуклеотиды), кодирующий один или более белков или фрагментов ротавирусного полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента полинуклеотид; или указанный вектор состоит в основном либо целиком из указанных элементов. В другом воплощении данного изобретения предлагаемый препарат содержит один, два или более векторов, содержащих полинуклеотиды, кодирующие и обеспечивающие экспрессию, предпочтительно in vivo, ротавирусных полипептидов, антигенов, гибридных (слитых) белков или их эпитопов. Данное изобретение также направлено на смеси векторов, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие различные ротавирусные полипептиды, антигены, эпитопы, гибридные (слитые) белки или иммуногенные агенты, например, ротавирусные полипептиды, антигены, эпитопы или иммуногенные агенты различных видов живых организмов, включающих (но не ограничивающихся перечисленным здесь) людей, свиней, коров и другой крупный рогатый скот, собак, кошек и птиц.

В еще одном воплощении данного изобретения экспрессионный вектор является плазмидным, в частности, для экспрессии in vivo. В одном из конкретных примеров (не имеющем ограничительного характера) в качестве вектора для внедрения полинуклеотидной последовательности могут использоваться плазмиды pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, см., например, патенты США №№ 5846946 и 6451769). Плазмида pVR1020 происходит из плазмиды pVR1012 и содержит человеческую сигнальную последовательность tPA. В одном из воплощений данного изобретения человеческая сигнальная последовательность tPA содержит аминокислоты с М(1) по S(23) в последовательности, зарегистрированной в базе данных Genbank под номером HUMTPA14. В другом конкретном примере (не имеющем ограничительного характера) указанная плазмида, используемая как вектор для внедрения полинуклеотидной последовательности, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирую- 11 034564 щую сигнальный пептид лошадиного инсулиноподобного фактора роста IGF1 с аминокислотного остатка М(24) до аминокислотного остатка А(48) в последовательности, зарегистрированной в базе данных

Genbank под номером U28070. Дополнительная информация о ДНК-плазмидах, которую можно использовать для консультирования или осуществления на практике, имеется, например, в патентах США №

6852705; 6818628; 6586412;6576243;6558674;6464984;6451770;6376473 и 6221362.

Термин плазмида в настоящем документе охватывает любые транскрипционные единицы ДНК, содержащие полинуклеотид по данному изобретению и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo в клетке или клетках нужного организма-хозяина или мишени; в этой связи следует отметить, что сверхскрученные или несверхскрученные кольцевые, а также в линейной форме плазмиды входят в объем данного изобретения.

Каждая плазмида в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему ротавирусный полипептид, антиген, эпитоп или иммуногенный агент, при необходимости содержит (или состоит в основном из указанных элементов) слитую с ним последовательность, кодирующую гетерологичный пептид, вариант, аналог или фрагмент, функционально связанную с промотором или регулируемую промотором, или зависимую от промотора. Вообще предпочтительно использовать сильные промоторы, функциональные в эукариотических клетках. Таким сильным промотором может быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) промотор предранних генов цитомегаловируса (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения или при необходимости иного происхождения, например, из морских свинок или крыс.

В более общих чертах промотор может быть вирусного либо клеточного происхождения. Сильным вирусным промотором, отличным от CMV-IE, который можно использовать для осуществления данного изобретения, является промотор ранних/поздних генов вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. Сильным клеточным промотором, который можно использовать для осуществления данного изобретения, является промотор какого-либо гена цитоскелета, например, промотор гена десмина (Kwissa et al., 2000) или промотор гена актина (Miyazaki et al., 1989).

Что касается сигнала полиаденилирования (polyA) для плазмид и вирусных векторов, отличных от поксвирусных, можно использовать сигнал полиаденилирования гена гормона роста крупного рогатого скота (bGH) (см. патент США № 5122458) или гена β-глобина кролика, или SV40.

Под клеткой-хозяином понимается прокариотическая либо эукариотическая клетка, которая генетически изменена или способна к генетическому изменению путем введения экзогенного полинуклеотида, например, рекомбинантной плазмиды или вектора. Применительно к генетически измененным клеткам данный термин относится как к клеткам, которые были изменены первыми, так и к их потомкам.

Способы применения и изделие

Данное изобретение включает следующие воплощения предлагаемого способа. В одном из воплощений раскрывается способ вакцинации животных, включающий введение животному композиции, содержащей вектор, в составе которого имеется нуклеотидная последовательность, кодирующая ротавирусный полипептид или его фрагмент, или его вариант, и фармацевтически (для людей и животных) приемлемый носитель, эксципиент или растворитель, в одном из вариантов этого воплощения способа по данному изобретению животным является свинья.

В одном из воплощений данного изобретения применяется такой режим вакцинации, когда проводят несколько иммунизации разными вакцинными препаратами (прайм-буст); при этом делается по меньшей мере одно первичное введение и по меньшей мере одна повторная иммунизация с использованием по меньшей мере одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента. Обычно иммунологическая композиция или в акцина, используемая для первичного введения отличается от тех, что используются для повторной иммунизации. Однако следует отметить, что и для первичного введения и для повторной иммунизации можно использовать одну и ту же композицию. Такой режим введения вакцины называется прайм-буст.

Режим прайм-буста включает по меньшей мере одно первичное введение и по меньшей мере одну повторную иммунизацию с использованием по меньшей мере одного общего полипептида и/или его вариантов, или его фрагментов. Вакцина, используемая для первичного введения, может отличаться от тех препаратов, которые используются для последующего усиления иммунного ответа. Первичное введение может происходить в один или более приемов. Повторное введение также может происходить в один или более приемов.

Объем дозы композиций по данному изобретению для видов-мишеней, являющихся млекопитающими, например, объем дозы для свиньи (как молодых особей, так и взрослых) в случае композиции на основе вирусного вектора, например, отличного от поксвирусного, составляет, как правило, от около 0,1 до около 2,0 мл, от около 0,1 до около 1,0 мл и от около 0,5 до около 1,0 мл.

Эффективность вакцин можно оценивать через около 2-4 недели после последней иммунизации, подвергая животных, например, свиней, контакту с вирулентным штаммом ротавируса. При проверке эффективности вакцины для заражения животных используются как гомологичные, так и гетерологичные штаммы. Животное можно заражать путем внутримышечной или подкожной инъекции, путем использования аэрозольной формы, интраназально, интраокулярно, интратрахеально и/или перорально. Инфицирующая доза вируса может составлять около 10^5-8 EID₅₀, TCID₅₀ или 10^3-8 геномных эквивалентов

- 12 034564 (по данным количественной полимеразной цепной реакции) в объеме, зависящем от пути введения. Например, если введение осуществляется воздушно-капельным путем, то суспензия вируса переводится в аэрозольную форму так, чтобы получились капли 1-100 мкм. Если введение осуществляется интраназально, интратрахеально или перорально, то объем инфицирующей дозы вируса составляет около 0,5 мл, 1-2 мл и 5-10 мл соответственно. На протяжении 14 суток после заражения животных ежедневно обследуют на предмет обнаружения клинических признаков, например, обезвоживания, поноса, неоформленного или водянистого стула, смерти и/или потери или отсутствия прироста массы тела, выделения вируса. Кроме того, группы особей можно умерщвлять и проводить патологоанатомическое исследование на предмет обнаружения поражения кишечника и атрофии кишечных ворсинок. У всех подопытных особей после заражения можно также брать мазки из прямой кишки и делать анализ кала с целью выделения или количественного определения, или выявления вируса. Присутствие или отсутствие вирусных антигенов в тканях кишечника или в экскрементах можно устанавливать с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR). До и после заражения у животных можно брать образцы крови и определять присутствие антител, специфичных к ротавирусам.

Композиции, включающие рекомбинантные антигенные полипептиды по данному изобретению, используемые для иммунизации в режиме прайм-буста, содержатся в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, разбавителе или ином вспомогательном веществе. Протоколы по данному изобретению защищают животных от ротавирусов и/или предотвращают прогрессирование заболевания у зараженных особей.

Предлагаемый препарат предпочтительно вводится с интервалом 1-6 недель. Предпочтительная продолжительность интервала между введениями составляет 3-5 недель, оптимально 4 недели. В одном из воплощений данного изобретения предусматривается ежегодное повторение иммунизации. На момент первого введения возраст подопытных животных, например, свиней, может быть по меньшей мере 8 недель.

Специалистам в данной области техники следует учесть, что настоящее описание представляется в качестве примера и данное изобретение им не ограничивается. Базируясь на настоящем описании и на знаниях в данной области техники, опытный специалист может определить число введений, путь введения и дозы, нужные для каждого протокола иммунизации без излишнего экспериментирования.

По данному изобретению предполагается по меньшей мере одно введение животному достаточного количества терапевтической композиции, приготовленной по данному изобретению. Например, это достаточное количество может составлять от около 10 до около 300 мкг белка. В одном из воплощений данного изобретения в достаточном количестве терапевтической композиции присутствует по 100 мкг каждого из трех различных белков ротавируса группы С. Подопытное животное может быть самцом, самкой, беременной самкой и новорожденным. Введение терапевтической композиции возможно различными путями, включая (но не ограничиваясь перечисленным здесь) внутримышечные (IM), интрадермальные (ID), интраперитонеальные (IP) или подкожные (SC) инъекции, или же интраназальное либо пероральное введение. Терапевтические композиции по данному изобретению можно также вводить с помощью безыгольного инъектора, например Pulse Needle Free (производство Pulse Needlefree, Ленекса, шт. Канзас, США), Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (производство Merial, шт. Гавайи, США), Vetjet или Vitajet (производство Bioject, шт. ОЛрегон, США). Для введения плазмидных композиций можно также использовать другой подход -электропорацию (см., например, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT Application No. WO 99/01158). В другом воплощении данного изобретения предлагаемая терапевтическая композиция вводится в организм животного путем бомбардировки частицами золота или с помощью генной пушки. В предпочтительном воплощении данного изобретения подопытным животным является свинья, собака, хорек или тюлень.

Другое воплощение данного изобретения представляет собой набор для практического осуществления способа возбуждения и индуцирования иммунологической или защитной реакции у животных против ротавируса; оно включает ротавирусную субъединичную иммунологическую композицию или вакцину и инструкции для практического осуществления способа доставки указанного препарата в количестве, эффективном для возбуждения иммунного ответа у животного.

Другое воплощение данного изобретения представляет собой набор для практического осуществления способа индуцирования иммунологической или защитной реакции у животных против ротавируса; оно включает композицию или вакцину, содержащую ротавирусный полипептид или антиген по данному изобретению и инструкции для практического осуществления способа доставки указанного препарата в количестве, эффективном для возбуждения иммунного ответа у животного.

В еще одном своем аспекте данное изобретения относится к набору для вакцинации в режиме прайм-буста, описанному выше в настоящем документе. Такой набор может содержать по меньшей мере две емкости: первая содержит вакцину или композицию для первичной вакцинации по данному изобретению, а вторая емкость содержит вакцину или композицию для повторной иммунизации с целью усиления иммунного ответа (бустер-иммунизации). Такой набор предпочтительно содержит дополнительную первую или вторую емкость для дополнительной первичной вакцинации или для дополнительной бустер-иммунизации.

- 13 034564

Специалистам в данной области техники хорошо известны фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или разбавители, или иные вспомогательные вещества. Например, фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем или разбавителем, или эксципиентом может служить физиологический раствор (0,9%-ный раствор хлорида натрия) или фосфатный буферный раствор. Другие фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или разбавители, или иные вспомогательные вещества, которые и использовать при осуществлении способов по данному изобретению, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) поли-(Е-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем или разбавителем, или эксципиентом может быть любое вещество или комбинация веществ, способствующая введению вектора (или белка, экспрессия которого обеспечивается вектором по данному изобретению in vitro); предпочтительно носитель или разбавитель, или иное вспомогательное вещество может способствовать трансфекции и/или улучшать сохранность вектора (или белка). Дозы и их объемы обсуждаются в настоящем документе в общем описании, из которого вместе с имеющимися знаниями и информацией специалист в данной области техники может их определить без излишнего экспериментирования.

Предпочтительные для плазмид катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония (но подходят не только эти соединения), имеют следующую формулу:

сн₃

II ⁺

R,— О — СН₂— СН—СН₂ — N —R₂ —X

I I

OR! СН₃ где Ri представляет насыщенный или ненасыщенный неразветвленный алифатический радикал, содержащий 12-18 атомов углерода, R₂ представляет другой алифатический радикал, содержащий 2-3 атома углерода, X представляет гидроксильную группу или аминогруппу, например П-(2-гидроксиэтил)П,П-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаммоний (DMRIE). В другом воплощении данного изобретения указанный катионный липид может быть связан с нейтральным липидом, например диолеоилфосфатидил-этаноламином (DOPE).

Из этих катионных липидов предпочтителен DMRIE (см. публикацию WO 96/34109), предпочтительно связанный с нейтральным липидом, предпочтительно DOPE (см. Behr, 1994), с образованием DMRIE-DOPE.

При наличии DOPE молярное отношение DMRIE:DOPE предпочтительно составляет от (около 95: около 5) до (около 5: около 95), более предпочтительно (около 1: около 1), например 1:1.

В другом воплощении данного изобретения фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем или разбавителем, или эксципиентом может служить эмульсия типа вода в масле. Примеры подходящих эмульсий типа вода в масле включают вакцинные эмульсии на масляной основе, стабильные и жидкие при 4°C, которые содержат 6-50% (объем/объем) водной фазы, содержащей антиген (предпочтительно 12-25% (объем/объем)); и 50-94% (объем/объем) масляной фазы, содержащей полностью или частично не метаболизируемое масло (например, минеральное масло - скажем, вазелиновое) и/или метаболизируемое масло (например, растительное масло или жирные кислоты, эфиры многоатомных спиртов или этилового спирта); 0,2-20% (частей на объем) поверхностно-активного агента, предпочтительно 38% (частей на объем), причем последний полностью или частично представляет собой смесь либо эфиры полиглицерина (указанные эфиры полиглицерина предпочтительно являются полиглицерол(поли)рицинолеатами), либо этоксилированное касторовое масло, либо гидрогенизированное полноксиэтиленом касторовое масло. Примеры поверхностно-активных веществ, которые можно использовать в эмульсии типа вода в масле включают этоксилированные эфиры ангидросорбита (например, полиоксиэтилен(20)-сорбитан-моноолеат, или TWEEN 80® производства AppliChem, Inc., Чешир, штат Коннектикут, США) и эфиры ангидросорбита (например, сорбитан-моноолеат, или SPAN 80® производства Sigma Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США). В отношении эмульсий типа вода в масле см. также патент США № 6919084. В некоторых воплощениях данного изобретения водная фаза, включающая антиген, содержит солевой раствор, включающий один или более забуферивающих агентов. Примером подходящего в этом смысле буферного раствора является фосфатный буфер с хлоридом натрия (PBS). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения эмульсия типа вода в масле может быть тройной эмульсией вода/масло/вода (см. патент США № 6358500). Примеры других подходящих эмульсий описаны в патенте США № 7371395.

Иммунологические композиции и вакцины по данному изобретению могут содержать один или более адъювантов (или состоять в основном из них). Подходящими для практического осуществления данного изобретения адъювантами являются: (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеиновый ангидрид и полимеры с алкенильными группами; (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), например, олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие один или более неметилированных элементов CpG (см. Klinman et al., 1996; WO 98/16247); (3) эмульсии типа масло в воде, например, эмульсия SPT, описанная на стр. 147 работы Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная на стр. 183 той же работы; (4) катионные липи- 14 034564 ды, содержащие соли четвертичного аммония, например, диметилдиоктадециламмоний (DDA); (5) цитокины; (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия; (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любой из цитируемых в настоящем документе работ и включаемые в данную заявку путем отсылки, или (9) любые комбинации или смеси указанных агентов.

Эмульсия типа масло в воде (3), которая особенно подходит для вирусных векторов, может быть приготовлена на основе легкого вазелинового масла (по Европейской фармакопее); изопреноидного масла, например сквалена; масла, полученного в результате олигомеризации алкенов, например изобутена или децена; эфиров кислот или спиртов с неразветвленной алкильной группой, например растительных масел, этилолеата, пропиленгликоля, ди(каприлат/капрата), глицерол-три(каприлат/капрата) и пропиленгликольолеата, или эфиров разветвленных жирных спиртов или кислот, особенно эфиров изостеариновой кислоты.

Для образования эмульсии масло используется в сочетании с эмульгирующими агентами. Эмульгирующими агентами могут быть неионные поверхностно-активные вещества, например эфиры ангидросорбита (сорбитана), маннита (например, безводный маннитолеат), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля, с одной стороны, и олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислот, с другой стороны, причем указанные эфиры при необходимости этоксилированы, или блоксополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, например плюроники (например, L121).

Из числа адъювантных полимеров типа (1) предпочтительны полимеры поперечно-сшитой акриловой или метакриловой кислоты, особенно поперечно-сшитые полиалкениловыми эфирами Сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под названием карбомеры (Европейская фармакопея, Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Специалист в данной области техники может также обратиться к патенту США № 2909462, в котором предлагаются такие акриловые полимеры, поперечно-сшитые полигидроксильным соединением с по меньшей мере тремя гидроксильными группами, предпочтительно, чтобы было не более восьми таких групп, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксильных групп замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, содержащими по меньшей мере два атома углерода. Предпочтительны такие радикалы, которые содержат 2-4 атома углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные по этилену группы, ненасыщенные радикалы могут также содержать другие заместители, например, метил. Особенно подходят продукты, имеющиеся в продаже под названием карбопол (BF Goodrich, Огайо, США), в которых поперечные сшивки образованы аллилсахарозой или алилпентаэритритолом. В их числе упомянем карбополы 974Р, 934Р и 97IP.

Что касается сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных, то предпочтителен EMA (Monsanto), который является неразветвленным или поперечно-сшитым сополимером этилена и малеинового ангидрида, например, с поперечными сшивками дивинилового эфира. Сошлемся также на работу J. Fields et al., 1960.

Со структурной точки зрения в полимерах акриловой или метакриловой кислот и ЕМА основной единицей является предпочтительно следующая:

^R1 ^R2

соон соон где

- R₁ и R₂, которые могут быть одинаковыми или же различными, представляют Н или СН3

- x = 0 или 1, предпочтительно x = 1 - y = 1 или 2, причем x + y = 2.

В случае ЕМА x = 0 и y = 2, а в случае карбомеров x = y = 1.

Эти полимеры растворимы в воде или в физиологическом солевом растворе (20 г/л NaCl) и можно довести pH такого раствора до 7,3-7,4, например, с помощью едкого натра (NaOH); в результате получится адъювантный раствор, в который можно включить экспрессионный вектор (векторы). Концентрация полимера в конечной иммунологической или вакцинной композиции может варьировать от около 0,01 до около 1,5% (мас./об.), от около 0,05 до около 1% (мас./об.) и от около 0,1 до около 0,4% (мас./об.).

Цитокин или цитокины (5) в иммунологической или вакцинной композиции могут присутствовать в форме белка или же экспрессироваться в организме-хозяине вместе с иммуногеном или иммуногенами или их эпитопом (эпитопами). Последний вариант предпочтителен: цитокин (цитокины) экспрессируются тем же вектором, что и иммуноген (иммуногены) или эпитоп (эпитопы), либо отдельным вектором.

Данное изобретение включает получение таких комбинированных композиций; например, путем смешивания активных компонентов, предпочтительно вместе с адъювантом, носителем, цитокином и/или разбавителем.

Цитокины, которые можно использовать по данному изобретению, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF), интерферон α (IFNa), интерферон β (IFNP), интерферон у, (IFNy), интерлейкин-1а (IL-1a), интерлейкин-1в (IL-1e), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин- 15 034564 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухолей α (TNFa), фактор некроза опухолей β (TNF[3) и трансформирующий фактор роста β (TGFe). Ясно, что эти цитокины можно вводить пациенту вместе и/или последовательно с иммунологической или вакцинной композицией по данному изобретению. Так, например, вакцина по данному изобретению может также содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, которая экспрессируется in vivo с образованием подходящего цитокина, например, цитокина, подходящего для данного организмахозяина, который подлежит вакцинации или в котором должна быть вызвана иммунологическая реакция (например, собачий цитокин в случае препаратов, которые предназначены для введения собакам).

Далее данное изобретение описывается с помощью следующих примеров, не имеющих ограничительного характера.

Примеры

Краткое изложение.

Вирусные вакцины обычно получают из цельных вирусных частиц, выделенных из образцов тканей зараженных животных путем его адаптации и размножения в куриных эмбрионах или in vitro в культуре клеток. Свиные ротавирусы группы С печально известны тем, что их трудно выделить обычными вирусологическими методами и притом в процессе адаптации к куриным эмбрионам или к росту культуры клеток происходит, как правило, нарушение антигенных структур, а в результате не достигается оптимальная продукция вакцины из выделенных цельных вирусных частиц. Поэтому был сконструирован экспрессионный вектор (pNPL2, SEQ ID NO: 15) для того, чтобы обеспечить продукцию вакцины, содержащей рекомбинантные белки VP4, VP6 и/или NSP4 свиного ротавируса группы С. Генетический материал ротавируса был получен с помощью полимеразной цепной реакции из клинического материала, предоставленного ветеринарами. В вектор pNPL2 добавили (способом, описанным в настоящем документе, и изображенным на фиг. 7) ген, кодирующий полипептиды/ субъединицы VP4 (18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40), VP6 (42, 44, 46, 48 или 50) или NSP4 (52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 или 72), в результате чего образовались векторы pNPL2-RotaC, каждый из которых кодировал и обеспечивал экспрессию в бактериальной клетке-хозяине участка NSP4, VP4 или же VP6. Эти векторы размножали в клетках Е. coli SE1, в которых конститутивно экспрессируется белковый токсин ccdB, который убивает клетки, не содержащие вектор. Клетки выращивали и инактивировали, затем собирали экспрессировавшиеся рекомбинантные белки ротавируса и объединяли с адъювантом для использования в качестве неживой субъединичной белковой аутогенной вакцины. Вакцинные композиции по данному изобретению вызывали у свиней защитный иммунитет против ротавируса.

Пример 1. Конструирование вектора для аутогенного образования или промышленного производства ротавирусных субъединичных вакцин

Конструирование экспрессионных векторов pNPL1 и 2

Экспрессионный вектор pNPL2 (SEQ ID NO: 15) был получен из вектора pStaby1.2 (SEQ ID NO: 1) (Delphi Genetics, pStaby1.2 руководство пользователя, 2011) путем делеции гена устойчивости к ампициллину и вставки гена глутатион S-трансферазы (GST), чтобы способствовать процессингу ниже (в направлении 3') расположенных последовательностей в процессе образования белка-продукта. Этот вектор не содержит и не обеспечивает экспрессию никаких известных признаков вирулентности для млекопитающих, а кроме того в процессе его конструирования были удалены все гены устойчивости к антибиотикам. Вектор pNPL2 размножали в клетках SE1 Е. coli,; вместе они составляют систему продукции хозяин/вектор штамма В Е. coli (pStaby).

Рестрикционная карта pStaby1.2 представлена на фиг. 1; указано, что данный вектор содержит промотор Т7 для обеспечения экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный белок. Эта плазмида содержит также ген ccdA, который кодирует нестабильный белок-антидот, подавляющий экспрессию стабильного белка ccdB, инактивирующего гиразу, который токсичен для клеток бактерий семейства Enterobacteriaceae. Белок ccdB кодируется геном ccdB, который имеется в хромосоме клеток SE1 Е. coli (в плазмиде pStaby1.2 ген ccdB отсутствует). После трансформации благодаря наличию гена ccdA в указанной плазмиде успешно трансформированные клетки жизнеспособны, тогда как в клетках SE1, не несущих плазмиду, образуется токсин, а антидота к нему в них нет, и они, таким образом, не жизнеспособны.

Присутствовавший в векторе pStaby1.2 ген устойчивости к ампициллину не желателен при получении субъединичных ротавирусных вакцин, поэтому он был удален при помощи обратной полимеразной цепной реакции (фиг. 2). В табл. 1 представлен перечень праймеров, использовавшихся во всех описанных в настоящем документе способах. Конечный продукт ПЦР фосфорилировали и сшивали его концы с образованием кольцевой формы pNPL1 (SEQ ID NO: 14). Затем к pNPL1 добавляли последовательность, кодирующую глутатион^-трансферазу (GST), для увеличения размеров экспрессирующегося белка и для облегчения процессинга в сторону 3'/инлайн-анализа.

Последовательность GST амплифицировали путем ПЦР, используя pGEX4T.l (GE Life Sciences) с праймерами #650 (SEQ ID NO: 2) и #651 (SEQ ID NO: 3); затем ампликон (SEQ ID NO: 16) расщепляли и клонировали в векторе NdeI-BamHI-линеаризованный pNPL1, в результате получали pNPL2 (фиг. 2-4). Вектор pNPL2 расщепляли рестриктазами BamHI и HindIII, так что в агарозном геле видно две полосы

- 16 034564 (5682 п.н. и 25 п.н.).

Конструирование экспрессионного вектора pNPL3

ПНР проводили с праймерами KSN772 (SEQ ID NO: 77) и KSN773 (SEQ ID NO: 78), используя pNPLl в качестве матрицы. Продукт ПЦР фосфорилировали и сшивали концы, так что получалась кольцевая форма pNPL3, содержащая гексагистидиновую метку (тэг). Гены NSP4, VP4, VP6 или VP7 можно клонировать в векторе pNPL3, расщепленном рестриктазами BamHI и HindIII, методом In-Fusion (с рекомбиназой), используя продукты ПЦР, образовавшиеся с использованием праймеров, представленных SEQ ID NO: 79-89. Вектор pNPL3 сходен с pNPL2, за тем исключением, что в pNPL3 нет последовательности, кодирующей глутатион^-трансферазу (GST), вместо которой имеется последовательность, кодирующая гистидиновую метку (тэг), благодаря чему образуются гибридные (слитые) пептиды с гистидиновой меткой (тэгом) на N-конце.

Пример 2. Получение аутогенных ротавирусных субъединичных вакцин

Выделяли ротавирусные РНК, проводя очистку непосредственно клинических образцов, взятых у зараженных свиней, и использовали их для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RTPCR); при этом брали праймеры, специфичные для генов, кодирующих VP4 (праймеры SEQ ID NO: 10, 11), VP6 (праймеры SEQ ID NO: 12, 13) и NSP4 (праймеры SEQ ID NO: 8, 9). Каждая пара праймеров была такой, чтобы связываться с высококонсервативными участками на каждом из концов гена-мишени (фиг. 5), что обеспечивало амплификацию генов ротавирусов группы C из многих разных изолятов вируса. Если эти гены невозможно амплифицировать, используя праймеры, специфичные для генов ротавирусов группы C, представленные SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12 и 13, то специалист в данной области техники, применяя известные методы, сумеет подобрать и использовать другие праймеры. Например, можно использовать дегенерированные праймеры, при этом критические положения праймера (например, 3концевой нуклеотид) можно варьировать, чтобы нивелировать отклонения матрицы от консервативных последовательностей. Праймеры с последовательностями, представленными SEQ ID NO: 73, 74, 5 и 76, можно использовать, чтобы амплифицировать и клонировать последовательности VP4 в векторах pNPL1 и/или pNPL2. Последовательности SEQ ID NO: 73 и 74 можно использовать, чтобы амплифицировать последовательность VP4 и клонировать ее векторе ТОРО. Затем можно использовать SEQ ID NO: 75 и 76, чтобы включить последовательность VP4 в вектор pNPL2 для последующего получения субъединичной вакцины.

У каждого праймера на 5'-конце имелась последовательность из 15 нуклеотидов, обеспечивающая встраивание в вектор pNPL2 в ходе последующей реакции по методу In-Fusion. Выделение и амплификация генов ротавирусов природного происхождения для получения донорной ДНК, предназначенной для использования в экспрессионной системе показаны на фиг. 4, 5 и 6. Когда в трансформированных клетках SE1 присутствует как ген ccdA (в векторе), так и ген ccdB (в клеточном геноме), клеточная культура жизнеспособна и стабильна и в ней экспрессируется ротавирусный ген. Не трансформированные клетки или клетки, подвергнутые удалению плазмид, нежизнеспособны. Внедрение гена характеризовали и проверяли путем секвенирования. Экспрессию белка проверяли путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS PAGE) (фиг. 8); этот метод позволяет определить приблизительную молекулярную массу, а именно 36 кДа (NSP4), 52 кДа (VP4), и 68 кДа (VP6). Такой подход предположительно применим к любому природному ротавирусному штамму, имеющему достаточную степень гомологии с праймерами клонирования в консервативных участках.

Для проведения эксперимента в большем масштабе отдельные колонии или множество одинаковых колоний переносили в среду LB (объем 10-200 000 мл). Когда оптическая плотность при 600 нм достигала 0,4-1,0, прибавляли изопропил-P-D-тиогалактопиранозид (IPTG, Sigma Aldrich, каталожный номер 15502 или эквивалентный продукт) до конечной концентрации 1 мМ. Культуры инкубировали еще 2-6 ч. Клетки можно культивировать в ферментере при следующих условиях:

a) Температура культуры поддерживается 36° ± 3°C.

b) Фильтрованный воздух подается под давлением с постоянной скоростью 0,1-300 л/мин.

c) pH культуры поддерживается 7,4 ± 0.3.

d) Когда оптическая плотность при 600 нм достигает 0,4-1,0, прибавляют IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Культуры инкубируют еще 2-6 ч.

Процедура сбора продукта

Путем центрифугирования или фильтрации отделяли отработанную культуральную среду от клеток Е. coli, и клетки концентрировали путем фильтрования, используя фильтр с порами 0,1-0,45 мкм. Концентрированные клетки подвергали лизису под действием реагента для экстракции белков B-PER (производство Thermo Scientific, каталожный номер 78248 или эквивалентный продукт), затем перемешивали или встряхивали раствор в течение 0,5-2 ч. Лизированные клетки концентрировали путем центрифугирования при 5000-10000 g в течение 15-30 мин или путем фильтрации, используя фильтр с порами 0,1-0,45 мкм; супернатант/фильтрат отбрасывали. Полученный осадок/концентрат ресуспендировали в буферном растворе для промывания (20 мМ Tris-HCL, 2 мМ EDTA, 0,1% Triton Х-100, pH доводят до 7,5-8,5) путем перемешивания или встряхивания в течение 0,1-0,5 ч. Полученную суспензию концентрировали путем

- 17 034564 центрифугирования при 5000-10000 g в течение 15-30 мин или путем фильтрации, используя фильтр с порами 0,1-0,45 мкм. Полученный осадок/концентрат ресуспендировали в буферном растворе для промывания (20 мМ Tris-HCL, 2 мМ EDTA, pH доводят до 7,5-8,5) путем перемешивания или встряхивания в течение 0,1-0,5 ч. Полученную суспензию концентрировали путем центрифугирования при 5000-10000 g в течение 15-30 мин или путем фильтрации, используя фильтр с порами 0,1-0,4 мкм. Концентрат суспендировали в растворе (8 М) мочевины (производства Sigma-Aldrich, каталожный номер U6504 или эквивалентный продукт) и перемешивали или встряхивали в течение 0,5-2 ч. Конечную суспензию разбавляли стерильным раствором PBS.

Вакцинные композиции

Собранные ротавирусные субъединицы объединяли с эмульсией TRIGEN (масло в воде) и консервирующими агентами (гентамицин в концентрации <30,0 мкг/мл и амфотерицин В в концентрации <2,50 мкг/мл или полимиксин В в концентрации <30 мкг/мл). К этой смеси прибавляли а) гель гидроксида алюминия (ALHYDROGEL® 85, производства Brenntag Biosector, каталожный номер EMS 2485-2 или REHYDRAGEL HPA, производства Reheis, каталожный номер 203130070600, REHYDRAGEL LV, производства Reheis, каталожный номер 203120070602 или эквивалентные продукты), что обеспечивало от около 0,1 до около 0,5% Al₂O₃ в конечном продукте. Или же в состав композиции включали адъювант Quil А в соотношении 0,5-2,5% инактивированной жидкости с адъювантом масло в воде. На долю адъювантов приходится от около 10 до около 50% конечного продукта.

Пример 3. Иммунизация свиней аутогенными ротавирусными субъединичными вакцинами

Краткое изложение.

В исследовании эффективности вакцины взяли 48 самок свиней с хронической инфекцией ротавирусом C и сходным числом родов в прошлом. Из них 26 особей получали вместо вакцины плацебо (контроль), а 22 особи получали ротавирусную субъединичную вакцину, содержащую смесь VP4, VP6, NSP4 и эмульсию/дополнительные адъюванты. Состав вакцины был таков, что в каждой дозе вакцины содержалось около 100 мкг каждого из указанных белков (суммарно 300 мкг белка) и 10% Trigen. Вакцину вводили внутримышечно за 6 и 3 недели до опороса. До вакцинации и опороса у животных брали сыворотку крови, также брали сыворотку крови у поросят через 7 суток после опороса.

Результаты.

Среди поросят, родившихся от непривитых самок смертность составляла 21%, а в потомстве привитых свиней - 14% (то есть на 33% меньше). Заболеваемость среди детенышей привитых особей также была значительно ниже, чем непривитых. Кроме того, у поросят вакцинированных самок по сравнению с контрольными был значительно (р<0,05) более высокий титр антител (фиг. 9).

Пример 4. Эффективность новой вакцины на основе ротавирусов группы C в снижении частоты поноса и улучшении состояния у подсосных поросят

Краткое изложение.

Для оценки эффективности новой ротавирусной (ротавирусы группы С) вакцины было отобрано стадо из 3600 свиней с поросятами до отъема от вскармливания молоком. Стадо состояло из самок PIC L03, которые скрещивались с самцами линии 02. Животные получали корм, состав которого соответствовал установленным пищевым потребностям (NRC, 1998) или несколько превышал их. Свиноматок и подсвинок случайным образом распределяли на две группы: контрольную (CON) и получавшую вакцину (Rota С RS VACC), с учетом даты спаривания и сходства физических показателей. Животные вакцинируемой группы получали 2 мл вакцины внутримышечно за 3 недели; за 3 и 5 недель или же за 3, 5 и 8 недель до опороса. В первые сутки после рождения всех поросят подсаживали к другим свиноматкам (перекрестное вскармливание). Ежедневно начиная с дня опороса и по 5-й день жизни характеризовали случаи поноса у поросят по балловой системе: 0 - отсутствие поноса, 1 - мало случаев, 2 - понос отмечается у 50% детенышей, 3 - понос отмечается более чем у 50% детенышей. Регистрировали число поросят, умерших из-за поноса. Не отмечалось разницы в частоте поноса или в связанной с ним смертности между потомством самок, получавших вакцину за 3 недели до опороса и за 3, 5 и 8 недель до опороса. А между контрольной группой и группой, получавшей вакцину за 3 и 5 недель до опороса, была заметная разница: во втором случае показатели были меньше (0,56 против 0,41; Р < 0,05). Кроме того, в потомстве самок, вакцинированных за 3 и 5 недель до опороса, доля детенышей с поносом снижалась от 1-го дня жизни к 5-му. Можно заключить, что новая ротавирусная (ротавирусы группы C) вакцина не влияла на частоту случаев поноса и смерти из-за поноса у детенышей свиноматок, получавших вакцину один или три раза. Однако при вакцинации за 3 и 5 недель до опороса частота поноса у поросят снижалась.

Воздействие.

Свиноматок и подсвинок случайным образом распределяли на четыре группы: контрольную (CON) и три получавших вакцины (Newport) (VACC 1-3), с учетом даты спаривания и сходства физических показателей. В состав вакцины входило по 100 мкг каждого из следующих полипептидов: VP4 (SEQ ID NO: 42), VP6 (SEQ ID NO: 52) и NSP4 (SEQ ID NO: 18), происходивших из изолята 1 ротавирусов. Эти белковые субъединицы объединяли с 10% TRIGEN (состоявшего приблизительно из 1,6% полноксиэтиленсорбитан-моноолеата, 10% геля гидроксида алюминия, 38% воды/физиологического раствора, 45% очищенного минерального масла и 5% сорбитан-моноолеата) в объеме 2 мл. В группе VACC 1 животные

- 18 034564 получали 2 мл вакцинного препарата внутримышечно за 3 недели до опороса; в группе VACC 2 - 2 мл вакцинного препарата внутримышечно за 5 недель до опороса и еще раз за 3 недели до опороса; в группе

VACC 3 - 2 мл вакцинного препарата внутримышечно за 7, 5 и 3 недели до опороса. В первые сутки после рождения всех поросят подсаживали к другим свиноматкам (перекрестное вскармливание).

Сбор данных.

Частоту поноса по балловой системе определяли ежедневно с первого по пятый день жизни. Персоналу, собиравшему данные, изначальное распределение животных по группам не было известно. Регистрировали число поросят, умерших из-за поноса, в день смерти и включали эти данные в оценку смертности/заболеваемости.

Анализ данных.

Показатели смертности/заболеваемости и результаты оценки поноса по балловой системе анализировали с помощью обобщенной линейной модели (GLM). Учитывались также размещение и сходство животных.

Результаты.

В потомстве свиней, получавших две дозы вакцины до опороса, по сравнению с соответствующей контрольной группой смертность и заболеваемость поросят были меньше, хотя и не значительно. В потомстве свиней, получавших одну либо три дозы вакцины, разницы не отмечалось. В случае двукратной вакцинации балловый показатель поноса существенно отличался только в первый день после опороса. Никаких других различий в результатах оценки поноса ни в другие моменты времени, ни между тремя схемами вакцинации не наблюдалось. Интересно, что в этом исследовании эффект вакцины проявлялся при двукратной вакцинации, а при введении одной или трех доз - нет.

Таблица 2. Показатели состояния животных при двукратной вакцинации

	Контроль	Вакцинация	Р
Смертность из-за поноса, число особей	37	23
Смертность из-за поноса, %	1,72	1,02	0,19
Негативные последствия, %	0,69	0,92	0,53

Таблица 3. Средняя балловая оценка поноса в разные дни жизни поросят при

двукратной вакцинации
	Контроль	Вакцинация	Стандартная ошибка среднего	Р
День 1	0,56	0,41	0,06	0,05
День 2	0,87	0,84	0,07	0,77
День 3	1,01	1,00	0,08	0,98
День 4	0,51	0,40	0,10	0,41
День 5	0,29	0,24	0,04	0,37

Таблица 4. Средняя балловая оценка поноса в разные дни жизни поросят при трехкратной вакцинации

	Контроль	Вакцинация	Стандартная ошибка среднего	Р
День 1	0,30	0,32	0,10	0,84
День 2	0,61	0,40	0,12	0,15
День 3	0,80	0,76	0,13	0,79
День 4	0,25	0,15	0,09	0,32
День 5	0,02	0,00	0,02	0,31

Пример 5. Получение тройной слитой вакцины на основе ротавирусов группы С

Краткое изложение.

Как говорилось выше, субъединичную вакцину Rota С получали путем клонирования трех разных генов (NSP4, VP4 и VP6) в трех разных векторах и выращивания трех разных культур Е. coli. Для упрощения процедуры все три гена включали в один плазмидный вектор (тандемно, в одной рамке считывания) что позволяло использовать одну серию культур Е. coli. Эту конструкцию получали путем клонирования генов Rota С (изолят 12-1260-5) в векторе pNPL2 (тэг GST в рамке считывания на N-конце). Три слитых гена (без тэга GST) имели последовательность, представленную SEQ ID NO: 94. Кодируемый ею полипротеин имеет последовательность, представленную SEQ ID NO: 95.

Материалы и методы.

РНК выделяли из клинических образцов, используя набор Qiagen для выделения вирусной РНК согласно инструкции производителя. Концентрацию и чистоту РНК проверяли, определяя поглощение при 260 и 280 нм с помощью спектрофотометра для микрообъемов Nanodrop. РНК считалась достаточно чистой, если отношение поглощения 260/280 составляло по меньшей мере 1,7. а концентрация РНК была по меньшей мере 50 нг/мкл. Ротавирусные гены амплифицировали (праймеры представлены в таблице 5) и продукты ПЦР очищали, используя набор для очистки продуктов ПНР Qiagen. Размеры продуктов ПЦР подтверждали путем гель-электрофореза (NSP4 - 300 п.н., VP4 - 750 п.н., VP6 - 1200 п.н.); концентрацию определяли с помощью Nanodrop.

- 19 034564

Таблица 5. Праймеры для тройного слитого Rota C

SEQID	Обозначение	Ориентация	Последовательность
8	KSN652	NSP4 прямой	GGTTCCGCGTGGATCCATCACCTCAAAAACTG
13	KSN657	VP6 обратный	GTGCGGCCGCAAGCTTCTACATCACCATTCTCTTC
96	KSN859	NSP4 обратный	AAGTGAGGACGCCCTTAGACAAACTTCCGTCTCC
97	KSN860	VP4 прямой	AGGGCGTCCTCACTTTATC
98	KSN861	VP4 обратный	TGAAAACAGCACGTCTAACACCATCATTCTC
99	KSN862	VP6 прямой	GACGTGCTGTTTTCAATTGC

Клонирование продуктов ПЦР в векторе pNPL2

Все три продукта клонировали в векторе одновременно. Реакцию проводили, как описано ниже, инкубировали 15 мин при температуре 50°C, после чего держали при 4°C. Для трансформации компетентных клеток CYS21 Е. coli (Cat # GE-STCB-22) брали около 5 мкл продуктов реакции согласно рекомендациям производителя (Delphi Genetics). Рекомбинантные клетки Е. coli, содержащие плазмиду, культивировали в среде LB. Последовательность плазмидной ДНК определяли, используя праймеры, указанные в табл. 5 наряду с праймерами к промотору Т7 и терминатору Т7 (стандартные свободные праймеры). Последовательности выравнивали, чтобы получилась большая открытая рамка считывания и проверяли точность; открытая рамка считывания содержала все три гена с тэгом GST (GST-NSP4-VP4-VP6; около 2,9 т.п.н.).

Таблица 6. Смесь для реакции лигирования

Метка	Объем, мкл
pNPL2, разрезанный BamH I и Hind III (~50 нг/мкл)	3
Продукт ПЦР NSP4 (~50 нг/мкл)	0,5
Продукт ППР VP4 (~50 нг/мкл)	1
Продукт ПЦР VP6 (~50 нг/мкл)	1,5
Смесь для клонирования 5Х In-Fusion HD (Cat # 639646, Clontech)	2
Безнуклеазная вода	2

Анализ экспрессии полипротеина NSP4-VP4-VP6

Экспрессию белка индуцировали в клетках штамма SE1 Е. coli путем добавления IPTG по стандартным протоколам. Культуральную жидкость подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле, чтобы убедиться в экспрессии слитого белка (фиг. 12). Слитый белок присутствовал во фракции, растворимой в мочевине, но не во фракции, растворимой в B-PER (электрофорез в полиакриламидном геле; данные не показаны). Растворимый в мочевине слитый белок разбавляли водой в соотношении 1:20 и 1:40 и разгоняли в полиакриламидном геле для последующего вестерн-блоттинга. В качестве зонда использовали моноклональные антитела против GST (Genscript Cat A00866) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл, следуя стандартному протоколу (фиг. 13).

Приведенное в настоящем документе подробное описание предпочтительных воплощений данного изобретения следует принимать к сведению с учетом того, что изложенное выше не ограничивает данное изобретение приведенными в этом описании конкретными деталями, поскольку возможно много очевидных вариантов, не отклоняющихся от сущности и объема изобретения.

- 20 034564

Список последовательностей <110> Merial

Bey, Russell

Si ri gi reddy, Kamesh

Hause, Benjamin

Simonson, Randy <120> РОТАВИРУСНАЯ СУБЪЕДИНИЧНАЯ ВАКЦИНА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ <130> MER 2012-192 <160> 99 <170> Patentin version 3.5 <210:> 1 <211:> 5932 <212:> ДНК <213:> искусственная последовательность <220:>

<223> pstabyl полазмида

<400> 1 tggcgaatgg	gacgcgccct	gtagcggcgc	attaagcgcg	gcgggtgtgg	tggttacgcg	60
cagcgtgacc	gctacacttg	ccagcgccct	agcgcccgct	cctttcgctt	tcttcccttc	120
ctttctcgcc	acgttcgccg	gctttccccg	tcaagctcta	aatcgggggc	tccctttagg	180
gttccgattt	agtgctttac	ggcacctcga	ccccaaaaaa	cttgattagg	gtgatggttc	240
acgtagtggg	ccatcgccct	gatagacggt	ttttcgccct	ttgacgttgg	agtccacgtt	300
ctttaatagt	ggactcttgt	tccaaactgg	aacaacactc	aaccctatct	cggtctattc	360
ttttgattta	taagggattt	tgccgatttc	ggcctattgg	ttaaaaaatg	agctgattta	420
acaaaaattt	aacgcgaatt	ttaacaaaat	attaacgttt	acaatttcag	gtggcacttt	480
tcggggaaat	gtgcgcggaa	cccctatttg	tttatttttc	taaatacatt	caaatatgta	540
tccgctcatg	agacaataac	cctgataaat	gcttcaataa	tattgaaaaa	ggaagagtat	600
gagtattcaa	catttccgtg	tcgcccttat	tccctttttt	gcggcatttt	gccttcctgt	660
ttttgctcac	ccagaaacgc	tggtgaaagt	aaaagatgct	gaagatcagt	tgggtgcacg	720
agtgggttac	atcgaactgg	atctcaacag	cggtaagatc	cttgagagtt	ttcgccccga	780
agaacgtttt	ccaatgatga	gcacttttaa	agttctgcta	tgtggcgcgg	tattatcccg	840
tattgacgcc	gggcaagagc	aactcggtcg	ccgcatacac	tattctcaga	atgacttggt	900
tgagtactca	ccagtcacag	aaaagcatct	tacggatggc	atgacagtaa	gagaattatg	960
cagtgctgcc	ataaccatga	gtgataacac	tgcggccaac	ttacttctga	caacgatcgg	1020
aggaccgaag	gagctaaccg	cttttttgca	caacatgggg	gatcatgtaa	ctcgccttga	1080
tcgttgggaa	ccggagctga	atgaagccat	accaaacgac	gagcgtgaca	ccacgatgcc	1140
tgcagcaatg	gcaacaacgt	tgcgcaaact	attaactggc	gaactactta	ctctagcttc	1200
ccggcaacaa	ttaatagact	ggatggaggc	ggataaagtt	gcaggaccac	ttctgcgctc	1260
ggcccttccg	gctggctggt	ttattgctga	taaatctgga	gccggtgagc	gtgggtctcg	1320

- 21 034564

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac	1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc	1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt	1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac	1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa	1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc	1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt	1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg	1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc	1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt	1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga	1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct	2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg	2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca	2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa	2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt:	2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga	2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga	2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg	2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat:	2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct:	2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct	2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct	2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt	2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg	2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa	2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc	2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa	3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta	3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg	3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag	3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac	3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca	3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg	3360

- 22 034564

gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc	3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg	3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca	3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag	3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt	3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag	3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc	3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc	3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct	3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta	3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg	4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct	4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga	4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc	4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg	4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct	4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt	4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc	4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc	4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc	4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact	4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga	4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc	4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg	4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag	4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgct caccagtccc	4920
tgttctcgtc agcaaaagag ccgttcattt caataaaccg ggcgacctca gccatccctt	4980
cctgattttc cgctttccag cgttcggcac gcagacgacg ggcttcattc tgcatggttg	5040
tgcttaccag accggagata ttgacatcgt atgccttgag caactgatag ctgtcgctgt	5100
caactgtcac tgtaatacgc tgcttcatgc ctgcccctcc cttttggtgt ccaaccggct	5160
cgacgggggc agcgcaaggc ggtgcctccg gcgggccact caatgcttga gtatactcac	5220
tagactttgc ttcgcaaagt cgtgaccgcc tacggcggct gcggcgccct acgggcttgc	5280
tctccgggct tcgccctgcg cggtcgctgc gctcccttgc cagcccgtgg atatgtggac	5340
gatggccgcg agcggccacc ggctggctcg cttcgctcgg cccgtggaca acgcatgcaa	5400

- 23 034564 ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca 5460 agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt cggcgatata 5520 ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag 5580 gatcgagatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat 5640 aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatggcta 5700 gcatgactgg tggacagcaa atgggtcgcg gatccgaatt cgagctccgt cgacaagctt 5760 gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga 5820 aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 5880 tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg at 5932 <210> 2 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> GST прямой праймер Ndei <400> 2 gtccatatgt cccctatact aggttattg <210> 3 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> gst обратный праймер ватнт <400> 3 gtcggatccg gatccacgcg gaaccagatc <210> 4 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Ген AmpR, делеция, прямой праймер <400> 4 actcttcctt tttcaatatt attgaagc <210> 5 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> ген AmpR, делеция, обратный праймер <400> 5 ctgtcagacc aagtttactc atatatac

- 24 034564 <210> 6 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> верификация продукта ПЦР, прямой праймер <400> 6 ctcgatcccg cgaaattaat acgactcac 29 <210> 7 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> верификация продукта ПЦР, обратный праймер <400> 7 cagccaactc agcttccttt cgggctttg 29 <210> 8 .

<211> 32* <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 прямой праймер с сайтом BamHI <400> 8 ggttccgcgt ggatccatca cctcaaaaac tg 32 <210> 9 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 обратный праймер с сайтом Hindlil <400> 9 gtgcggccgc aagctttcat agacaaactt ccgtctc 37 <210> 10 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP4 прямой праймер с сайтом BamHI <400> 10 ggttccgcgt ggatccaggg cgtcctcact ttatc 35 <210> 11 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 обратный праймер с сайтом Hindlil

- 25 034564 <400> 11 gtgcggccgc aagcttttat aacaccatca ttctc <210> 12 <211> 35 <212:> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 прямой праймер с сайтом BamHl <400> 12 ggttccgcgt ggatccgacg tgctgttttc aattg 35 <210> 13 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 обратный праймер с сайтом Hindlli <400:> 13 gtgcggccgc aagcttctac atcaccattc tcttc <210> 14 <211> 5071 <212> ДНК <213:> Искусственная последовательность <22О:>

<223> pNPLl полазмида (pstabyl без гена AmpR) <400> 14 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtct600 gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa660 aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt720 ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt780 ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg840 tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca900 gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt960

- 26 034564

agcaccgcct	acatacctcg	ctctgctaat	cctgttacca	gtggctgctg	ccagtggcga	1020
taagtcgtgt	cttaccgggt	tggactcaag	acgatagtta	ccggataagg	cgcagcggtc	1080
gggctgaacg	gggggttcgt	gcacacagcc	cagcttggag	cgaacgacct	acaccgaact	1140
gagataccta	cagcgtgagc	tatgagaaag	cgccacgctt	cccgaaggga	gaaaggcgga	1200
caggtatccg	gtaagcggca	gggtcggaac	aggagagcgc	acgagggagc	ttccaggggg	1260
aaacgcctgg	tatctttata	gtcctgtcgg	gtttcgccac	ctctgacttg	agcgtcgatt	1320
tttgtgatgc	tcgtcagggg	ggcggagcct	atggaaaaac	gccagcaacg	cggccttttt	1380
acggttcctg	gccttttgct	ggccttttgc	tcacatgttc	tttcctgcgt	tatcccctga	1440
ttctgtggat	aaccgtatta	ccgcctttga	gtgagctgat	accgctcgcc	gcagccgaac	1500
gaccgagcgc	agcgagtcag	tgagcgagga	agcggaagag	cgcctgatgc	ggtattttct	1560
ccttacgcat	ctgtgcggta	tttcacaccg	catatatggt	gcactctcag	tacaatctgc	1620
tctgatgccg	catagttaag	ccagtataca	ctccgctatc	gctacgtgac	tgggtcatgg	1680
ctgcgccccg	acacccgcca	acacccgctg	acgcgccctg	acgggcttgt	ctgctcccgg	1740
catccgctta	cagacaagct	gtgaccgtct	ccgggagctg	catgtgtcag	aggttttcac	1800
cgtcatcacc	gaaacgcgcg	aggcagctgc	ggtaaagctc	atcagcgtgg	tcgtgaagcg	1860
attcacagat	gtctgcctgt	tcatccgcgt	ccagctcgtt	gagtttctcc	agaagcgtta	1920
atgtctggct	tctgataaag	cgggccatgt	taagggcggt	tttttcctgt	ttggtcactg	1980
atgcctccgt	gtaaggggga	tttctgttca	tgggggtaat	gataccgatg	aaacgagaga	2040
ggatgctcac	gatacgggtt	actgatgatg	aacatgcccg	gttactggaa	cgttgtgagg	2100
gtaaacaact	ggcggtatgg	atgcggcggg	accagagaaa	aatcactcag	ggtcaatgcc	2160
agcgcttcgt	taatacagat	gtaggtgttc	cacagggtag	ccagcagcat	cctgcgatgc	2220
agatccggaa	cataatggtg	cagggcgctg	acttccgcgt	ttccagactt	tacgaaacac	2280
ggaaaccgaa	gaccattcat	gttgttgctc	aggtcgcaga	cgttttgcag	cagcagtcgc	2340
ttcacgttcg	ctcgcgtatc	ggtgattcat	tctgctaacc	agtaaggcaa	ccccgccagc	2400
ctagccgggt	cctcaacgac	aggagcacga	tcatgcgcac	ccgtggggcx	gccatgccgg	2460
cgataatggc	ctgcttctcg	ccgaaacgtt	tggtggcggg	accagtgacg	aaggcttgag	2520
cgagggcgtg	caagattccg	aataccgcaa	gcgacaggcc	gatcatcgtc	gcgctccagc	2580
gaaagcggtc	ctcgccgaaa	atgacccaga	gcgctgccgg	cacctgtcct	acgagttgca	2640
tgataaagaa	gacagtcata	agtgcggcga	cgatagtcat	gccccgcgcc	caccggaagg	2700
agctgactgg	gttgaaggct	ctcaagggca	tcggtcgaga	tcccggtgcc	taatgagtga	2760
gctaacttac	attaattgcg	ttgcgctcac	tgcccgcttt	ccagtcggga	aacctgtcgt	2820
gccagctgca	ttaatgaatc	ggccaacgcg	cggggagagg	cggtttgcgt	attgggcgcc	2880
agggtggttt	ttcttttcac	cagtgagacg	ggcaacagct	gattgccctt	caccgcctgg	2940
ccctgagaga	gttgcagcaa	gcggtccacg	ctggtttgcc	ccagcaggcg	aaaatcctgt	3000

- 27 034564

ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact	3060
accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc	3120
gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc	3180
atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga	3240
atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa	3300
cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg	3360
cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag	3420
acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg	3480
tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc	3540
gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc	3600
agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga	3660
ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg	3720
ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa	3780
acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct	3840
gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg	3900
cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg	3960
ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag	4020
caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgctc accagtccct gttctcgtca gcaaaagagc:	4080
cgttcatttc aataaaccgg gcgacctcag ccatcccttc ctgattttcc gctttccagc	4140
gttcggcacg cagacgacgg gcttcattct gcatggttgt gcttaccaga ccggagatat	4200
tgacatcgta tgccttgagc aactgatagc tgtcgctgtc aactgtcact gtaatacgct	4260
gcttcatgcc tgcccctccc ttttggtgtc caaccggctc gacgggggca gcgcaaggcg	4320
gtgcctccgg cgggccactc aatgcttgag tatactcact agactttgct tcgcaaagtc	4380
gtgaccgcct acggcggctg cggcgcccta cgggcttgct ctccgggctt cgccctgcgc	4440
ggtcgctgcg ctcccttgcc agcccgtgga tatgtggacg atggccgcga gcggccaccg	4500
gctggctcgc ttcgctcggc ccgtggacaa cgcatgcaag gagatggcgc ccaacagtcc	4560
cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga gcccgaagtg	4620
gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa ccgcacctgt	4680
ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atcgagatct cgatcccgcg	4740
aaattaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc tctagaaata	4800
attttgttta actttaagaa ggagatatac atatggctag catgactggt ggacagcaaa	4860
tgggtcgcgg atccgaattc gagctccgtc gacaagcttg cggccgcact cgagcaccac	4920
caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct	4980
gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt	5040

- 28 034564

tttttgctga aaggaggaac tatatccgga t

5071

<210> 15 <211> 5707 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> PNPL2 SEQ ID N0:15

<400> 15 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg	60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc	120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg	180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc	240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt	300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc	360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta	420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt	480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta	540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtct	600
gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa	660
aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt	720
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt	780
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg	840
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca	900
gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt	960
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga	1020
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc	1080
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact	1140
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga	1200
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg	1260
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt	1320
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt	1380
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga	1440
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac	1500
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct	1560
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatatggt gcactctcag tacaatctgc	1620
tctgatgccg catagttaag ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg	1680

- 29 034564

ctgcgccccg	acacccgcca	acacccgctg	acgcgccctg	acgggcttgt	ctgctcccgg	1740
catccgctta	cagacaagct	gtgaccgtct	ccgggagctg	catgtgtcag	aggttttcac	1800
cgtcatcacc	gaaacgcgcg	aggcagctgc	ggtaaagctc	atcagcgtgg	tcgtgaagcg	1860
attcacagat	gtctgcctgt	tcatccgcgt	ccagctcgtt	gagtttctcc	agaagcgtta	1920
atgtctggct	tctgataaag	cgggccatgt	taagggcggt	tttttcctgt	ttggtcactg	1980
atgcctccgt	gtaaggggga	tttctgttca	tgggggtaat	gataccgatg	aaacgagaga	2040
ggatgctcac	gatacgggtt	actgatgatg	aacatgcccg	gttactggaa	cgttgtgagg	2100
gtaaacaact	ggcggtatgg	atgcggcggg	accagagaaa	aatcactcag	ggtcaatgcc	2160
agcgcttcgt	taatacagat	gtaggtgttc	cacagggtag	ccagcagcat	cctgcgatgc.	2220
agatccggaa	cataatggtg	cagggcgctg	acttccgcgt	ttccagactt	tacgaaacac	2280
ggaaaccgaa	gaccattcat	gttgttgctc	aggtcgcaga	cgttttgcag	cagcagtcgc	2340
ttcacgttcg	ctcgcgtatc	ggtgattcat	tctgctaacc	agtaaggcaa	ccccgccagc	2400
ctagccgggt	cctcaacgac	aggagcacga	tcatgcgcac	ccgtggggcc	gccatgccgg	2460
cgataatggc	ctgcttctcg	ccgaaacgtt	tggtggcggg	accagtgacg	aaggcttgag	2520
cgagggcgtg	caagattccg	aataccgcaa	gcgacaggcc	gatcatcgtc	gcgctccagc	2580
gaaagcggtc	ctcgccgaaa	atgacccaga	gcgctgccgg	cacctgtcct	acgagttgca	2640
tgataaagaa	gacagtcata	agtgcggcga	cgatagtcat	gccccgcgcc	caccggaagg	2700
agctgactgg	gttgaaggct	ctcaagggca	tcggtcgaga	tcccggtgcc	taatgagtga	2760
gctaacttac	attaattgcg	ttgcgctcac	tgcccgcttt	ccagtcggga	aacctgtcgt	2820
gccagctgca	ttaatgaatc	ggccaacgcg	cggggagagg	cggtttgcgt	attgggcgcc	2880
agggtggttt	ttcttttcac	cagtgagacg	ggcaacagct	gattgccctt	caccgcctgg	2940
ccctgagaga	gttgcagcaa	gcggtccacg	ctggtttgcc	ccagcaggcg	aaaatcctgt	3000
ttgatggtgg	ttaacggcgg	gatataacat	gagctgtctt	cggtatcgtc	gtatcccact	3060
accgagatat	ccgcaccaac	gcgcagcccg	gactcggtaa	tggcgcgcat	tgcgcccagc	3120
gccatctgat	cgttggcaac	cagcatcgca	gtgggaacga	tgccctcatt	cagcatttgc	3180
atggtttgtt	gaaaaccgga	catggcactc	cagtcgcctt	cccgttccgc	tatcggctga	3240
atttgattgc	gagtgagata	tttatgccag	ccagccagac	gcagacgcgc	cgagacagaa	3300
cttaatgggc	ccgctaacag	cgcgatttgc	tggtgaccca	atgcgaccag	atgctccacg	3360
cccagtcgcg	taccgtcttc	atgggagaaa	ataatactgt	tgatgggtgt	ctggtcagag	3420
acatcaagaa	ataacgccgg	aacattagtg	caggcagctt	ccacagcaat	ggcatcctgg	3480
tcatccagcg	gatagttaat	gatcagccca	ctgacgcgtt	gcgcgagaag	attgtgcacc	3540
gccgctttac	aggcttcgac	gccgcttcgt	tctaccatcg	acaccaccac	gctggcaccc	3600
agttgatcgg	cgcgagattt	aatcgccgcg	acaatttgcg	acggcgcgtg	cagggccaga	3660
ctggaggtgg	caacgccaat	cagcaacgac	tgtttgcccg	ccagttgttg	tgccacgcgg	3720

- 30 034564

ttgggaatgt	aattcagctc	cgccatcgcc	gcttccactt	tttcccgcgt	tttcgcagaa	3780
acgtggctgg	cctggttcac	cacgcgggaa	acggtctgat	aagagacacc	ggcatactct	3840
gcgacatcgt	ataacgttac	tggtttcaca	ttcaccaccc	tgaattgact	ctcttccggg	3900
cgctatcatg	ccataccgcg	aaaggttttg	cgccattcga	tggtgtccgg	gatctcgacg	3960
ctctccctta	tgcgactcct	gcattaggaa	gcagcccagt	agtaggttga	ggccgttgag	4020
caccgccgcc	gcaaggaatg	gtgcatgctc	accagtccct	gttctcgtca	gcaaaagagc	4080
cgttcatttc	aataaaccgg	gcgacctcag	ccatcccttc	ctgattttcc	gctttccagc	4140
gttcggcacg	cagacgacgg	gcttcattct	gcatggttgt	gcttaccaga	ccggagatat	4200
tgacatcgta	tgccttgagc	aactgatagc	tgtcgctgtc	aactgtcact	gtaatacgct	4260
gcttcatgcc	tgcccctccc	ttttggtgtc	caaccggctc	gacgggggca	gcgcaaggcg	4320
gtgcctccgg	cgggccactc	aatgcttgag	tatactcact	agactttgct	tcgcaaagtc	4380
gtgaccgcct	acggcggctg	cggcgcccta	cgggcttgct	ctccgggctt	cgccctgcgc	4440
ggtcgctgcg	ctcccttgcc	agcccgtgga	tatgtggacg	atggccgcga	gcggccaccg	4500
gctggctcgc	ttcgctcggc	ccgtggacaa	cgcatgcaag	gagatggcgc	ccaacagtcc	4560
cccggccacg	gggcctgcca	ccatacccac	gccgaaacaa	gcgctcatga	gcccgaagtg	4620
gcgagcccga	tcttccccat	cggtgatgtc	ggcgatatag	gcgccagcaa	ccgcacctgt	4680
ggcgccggtg	atgccggcca	cgatgcgtcc	ggcgtagagg	atcgagatct	cgatcccgcg	4740
aaattaatac	gactcactat	aggggaattg	tgagcggata	acaattcccc	tctagaaata	4800
attttgttta	actttaagaa	ggagatatac	atatgtcccc	tatactaggt	tattggaaaa	4860
ttaagggcct	tgtgcaaccc	actcgacttc	ttttggaata	tcttgaagaa	aaatatgaag	4920
agcatttgta	tgagcgcgat	gaaggtgata	aatggcgaaa	caaaaagttt	gaattgggtt	4980
tggagtttcc	caatcttcct	tattatattg	atggtgatgt	taaattaaca	cagtctatgg	5040
ccatcatacg	ttatatagct	gacaagcaca	acatgttggg	tggttgtcca	aaagagcgtg	5100
cagagatttc	aatgcttgaa	ggagcggttt	tggatattag	atacggtgtt	tcgagaattg	5160
catatagtaa	agactttgaa	actctcaaag	ttgattttct	tagcaagcta	cctgaaatgc	5220
tgaaaatgtt	cgaagatcgt	ttatgtcata	aaacatattt	aaatggtgat	catgtaaccc	5280
atcctgactt	catgttgtat	gacgctcttg	atgttgtttt	atacatggac	ccaatgtgcc	5340
tggatgcgtt	cccaaaatta	gtttgtttta	aaaaacgtat	tgaagctatc	ccacaaattg	5400
ataagtactt	gaaatccagc	aagtatatag	catggccttt	gcagggctgg	caagccacgt	5460
ttggtggtgg	cgaccatcct	ccaaaatcgg	atctggttcc	gcgtggatcc	gaattcgagc	5520
tccgtcgaca	agcttgcggc	cgcactcgag	caccaccacc	accaccactg	agatccggct	5580
gctaacaaag	cccgaaagga	agctgagttg	gctgctgcca	ccgctgagca	ataactagca	5640
taaccccttg	gggcctctaa	acgggtcttg	aggggttttt	tgctgaaagg	aggaactata	5700

tccggat 5707

- 31 034564 <210> 16 <211> 687 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> GST ампликон, полученный с использованием SEQ ID NOs 2 and 3 (праймеры) <400> 16

gtccatatgt	cccctatact aggttattgg aaaattaagg gccttgtgca acccactcga	60
cttcttttgg	aatatcttga agaaaaatat gaagagcatt tgtatgagcg cgatgaaggt	120
gataaatggc	gaaacaaaaa gtttgaattg ggtttggagt ttcccaatct tccttattat	180
attgatggtg	atgttaaatt aacacagtct atggccatca tacgttatat agctgacaag	240
cacaacatgt	tgggtggttg tccaaaagag cgtgcagaga tttcaatgct tgaaggagcg	300
gttttggata	ttagatacgg tgtttcgaga attgcatata gtaaagactt tgaaactctc	360
aaagttgatt	ttcttagcaa gctacctgaa atgctgaaaa tgttcgaaga tcgtttatgt	420
cataaaacat	atttaaatgg tgatcatgta acccatcctg acttcatgtt gtatgacgct	480
cttgatgttg	ttttatacat ggacccaatg tgcctggatg cgttcccaaa attagtttgt	540
tttaaaaaac	gtattgaagc tatcccacaa attgataagt acttgaaatc cagcaagtat	600
atagcatggc	ctttgcaggg ctggcaagcc acgtttggtg gtggcgacca tcctccaaaa	660
tcggatctgg	ttccgcgtgg atccgac	687

<210> 17 <211> 297 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 1 <400> 17 atcacctcaa aaactgtgat tggtaaattc aagactgaaa acaatattag tcatcagaat60 gacgacattc ataaagaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgacat gagagttcat120 gtaactgcac tatttaatag tatacataag gataatatgg agtggagaat gagtgaatcg180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa acaaatacgg tcgagaatga agttaagaat240 cacgtagatg atgtaaatat atgtggtacg tctggattag agacggaagt ttgtcta297 <210> 18 <211> 99 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 1 <400> 18 lie Thr Ser Lys Thr val lie Gly Lys Phe Lys Thr Glu Asn Asn lie

10 15

- 32 034564

Ser

His

Gin

Asn 20

Asp

ASP

He

His

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg

Asp

Met

Arg

val

His

val

Thr

Ala

Leu

Phe

Asn

Ser

ile

35

40

45

His

Lys 50

Asp

Asn

Met

Glu

Trp 55

Arg

Met

Ser

Glu

Ser 60

Ile

Arg

Glu

Lys 65

Lys

Arg

Glu

Met

Lys 70

Thr

Asn

Thr

val

Glu 75

Asn

Glu

val

Lys

Asn 80

His

val

Asp

ASP

val

Asn

lie

cys

Gly

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

90 95

val cy<	; Leu
<210>	19
<211>	297
<212>	ДНК

<213> Искусственная последовательность <22О>

<223> NSP4 изолят 63 <400> 19 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aatgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatacaa ccgggaatga agtcaagaat240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta297 <210> 20 <211> 99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 63 <400> 20

Ile 1

Thr

Ser

Lys

Thr 5

val

Ile

Ser

Lys

Phe 10

Lys

Thr

Glu

Asn

ASp 15

Ile

Ser

His

Gin

Asn 20

Asn

Asp

lie

Asn

2?^S

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg

Glu

Met

Arg

val

His

Met

Thr

Ala

Leu

Phe

ASn

Ser

He

40 45

- 33 034564

His

Lys 50

Asp

Asn

Met Glu

Trp Arg Met Ser Glu sen

He

Arg

Glu

55

60

Lys

Arg

Glu

Met

Lys

Ser

Asn

Thr

Gly

Asn

Glu

val

Lys

Asn

65

70

75

80

His

Thr

Asn

Asp

val

ASH

val

Cys

Asp

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

90 95 val cys Leu <210:> 21 <211> 297 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 64 <400:> 21 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg aatggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagatt240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta297 <210> 22 <211> 99 <212> Белок <213> искусственная последовательность <22О>

<223> NSP4 изолят 64 <400> 22

lie Thr 1

Ser

Lys Thr val 5

lie

Ser

Lys Phe Lys 10

Thr

Glu

Asn

Asp 15

lie

Ser

His

Gin

Asn 20

Asn

ASP

He

Asn

Glu

Tyr

Glu

Val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg

Glu

Met

Arg

val

His

Met

Thr

Ala

Leu

Phe

Asn

Ser

lie

35

40

45

Hl s

i-ys

Asp

Asn

Met

Glu

Trp

Arg

Met

Ser

Glu

Ser

lie

Arg

Glu

50

55

60

Lys

Arg

Glu

Met

Lys

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly

ASn

Glu

val

Lys

lie

65

70

75

80

Hi s

Thr

Asn

Asp

val

Asn

val

cys

Asp

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

85

90

95

- 34 034564 val Cys Leu <210:> 23 <211> 297 <212> ДНК <213:> искусственная последовательность <220:>

<223> NSP4 изолят 66 <400:> 23 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagatt240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta297 <210> 24 <211> 99 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 66 <400> 24

lie 1

Thr

ser

Lys

Thr 5

val

Ile

ser

Lys

Phe 10

Lys

Thr

Glu

Asn

Asp 15

Ile

Ser

His

Gin

Asn 20

Asn

ASP

He

Asn

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg 35

Glu

Met

Arg

val

His 40

Met

Thr

Ala

Leu

Phe 45

ASn

Ser

Ile

His

Lys 50

Asp

Asn

Met

Glu

Trp 55

Arg

Met

Ser

Glu

Ser 60

lie

Arg

Glu

Lys 65

i-ys

Arg

Glu

Met

Lys 70

ser

Asn

Ala

Thr

Gly 75

ASn

Glu

val

Lys

ile 80

His

Thr

Asn

Asp

val 85

Asn

val

cys

ASP

Thr 90

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr 95

Glu

val

Cys

Leu

<210> 25 <211> 297 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность

- 35 034564 <220>

<223> NSP4 изолят 67 <400> 25 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggta atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagaat240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agatggaggt ttgtcta297 <210> 26 <211> 99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 67 <400> 26

He 1

Thr

ser

Lys

Thr 5

val

He

Ser

Lys

Phe 10

Lys

Thr

Glu

Asn

Asp 15

lie

Ser

His

Gin

ASn

Asn

ASP

He

Asn

Lys

Glu

Tyr

Glu

val

Met

Lys

20

25

30

Gin

Met

Arg

Glu

Met

Arg

Val

His

Met

Thr

Ala

Leu

Phe

Asn

Ser

He

35

40

45

His

Lys 50

Asp

Asn

Met

Glu

Arg

Met

Ser

Glu

Ser 60

He

Arg

Glu

Lys

Arg

Glu

Met

Lys

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly

ASn

Glu

val

Lys

Asn

65

70

75

80

His

Thr

Asn

Asp

val

Asn

val

Cys

Asp

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Met

Glu

85

90

95

Val Cys Leu <210> 27 <211> 297 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 68 <400> 27 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180

- 36 034564 atccgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagaat cacacgaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta

240

297 <210> 28 <211> 99 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 68 <400> 28 ile Thr Ser Lys Thr val lie ser Lys Phe Lys Thr Glu Asn Asp lie

10 15 ser His Gln Asn Asn Asp ile Asn Lys Glu Tyr Glu Glu Val Met Lys

Gln Met Arg Glu Met Arg val His Met Thr Ala Leu Phe Asn Ser Ile

His Lys Asp Asn Met Glu Trp Arg Met Ser Glu Ser Ile Arg Arg Glu 50 5560

Lys Lys Arg Glu Met Lys Ser Asn Ala Thr Gly Asn Glu val Lys Asn 65 70 7580

His Thr Asn Asp val Asn val cys Asp Thr ser Gly Leu Glu Thr Glu 85 9095 val cys Leu <210> 29 <211> 297 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 69 <400> 29 atcacctcga agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 atccgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagaat240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta297 <210> 30 <211> 99 <212> Белок <213> искусственная последовательность

- 37 034564 <220>

<223> NSP4 изолят 69 <400> 30

lie 1

Thr

Ser

Lys

Thr 5

val

lie

ser

Lys

Phe 10

Lys

Thr

Glu

Asn

Asp 15

lie

ser

His

Gin

Asn 20

Asn

ASp

He

Asn

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg 35

Glu

Met

Arg

val

His 40

Met

Thr

Ala

Leu

Phe 45

ASH

Ser

He

His

Lys 50

ASp

Asn

Met

Glu

Arg

Met

ser

Glu

ser 60

lie

Arg

Glu

Lys 65

Lys

Arg

Glu

Met

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly 75

Asn

Glu

val

Lys

Asn 80

His

Thr

Asn

Asp

val 85

Asn

val

Cys

Asp

Thr 90

ser

Gly

Leu

Glu

Thr 95

Glu

val cys Leu <210> 31 <211> 297 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 70 <400> 31 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaaacg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagaat240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta297 <210> 32 <211> 99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 70 <400> 32 lie Thr Ser Lys Thr Val lie Ser Lys Phe Lys Thr Glu Asn Asp lie

10 15

- 38 034564

Ser

His

Gin

Asn 20

Asn

ASP

Ile

Asn

2^L?^S

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg

Glu

Met

Arg

val

His

Met

Thr

Ala

Leu

Phe

Asn

ser

lie

35

40

45

His

Lys

ASP

Asn

Met

Glu

Trp

Arg

Met

Ser

Glu

Ser

He

Arg

Glu

50

55

60

LYS

Arg

Glu

Met

Lys 70

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly 75

ASH

Glu

val

Lys

Asn 80

HIS

Thr

Asn

Asp

val

Asn

val

cys

Asp

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

85

90

95

val cys Leu <210> 33 <211> 297 <212:> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 71 <400> 33 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaaacg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagaat240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta297 <210> 34 <211:> 99 <212:> Белок <213:> Искусственная последовательность <220:>

<223> NSP4 изолят 71 АА последовательность <400:> 34

Ile 1

Thr

ser

LYS

Thr 5

val

Ile

ser

Lys

Phe 10

Lys

Thr

Glu

Asn

Asp 15

He

Ser

His

Gin

Asn 20

Asn

Asp

Ile

Asn

Lys 25

Glu

Tyr

Glu

Val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg 35

Glu

Met

Arg

val

His 40

Met

Thr

Ala

Leu

Phe 45

Asn

Ser

lie

His

Lys 50

ASP

ASn

Met

Glu

Trp 55

Arg

Met

Ser

Glu

Ser 60

lie

Arg

Glu

- 39 034564

Lys	Lys	Arg	Glu	Met	Lys	Ser	Asn	Ala Thr	Gly	Asn Glu val Lys	Asn
65					70				75		80
His	Thr	Asn	Asp	val	ASn	val	cys	Asp Thr	Ser	Gly Leu Glu Thr	Glu

90 95 val Cys Leu <210> 35 <211> 297 <212:> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> NSP4 изолят 72 <400> 35 atcacctcaa agactgtgat tagtaagttc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagatt240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaggt ttgtcta297 <210> 36 <211> 99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 72 <400> 36

Ile

Thr

Ser

Lys

Thr

val

He

Ser

Lys

Phe

Lys

Thr

Glu

Asn

Asp

lie

1

5

10

15

Ser

His

Gin

Asn

Asp

Ile

Asn

Lys

Glu

Tyr

Glu

val

Met

Lys

20

25

30

Gin

Met

Arg

Glu

Met

Arg

val

His

Met

Thr

Ala

Leu

Phe

Asn

ser

lie

35

40

45

His

Lys 50

Asp

ASH

Met

Glu

Trp 55

Arg

Met

Ser

Glu

Ser 60

Ile

Arg

Glu

IT

Lys

Arg

Glu

Met

Lys 70

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly 75

ASH

Glu

val

Lys

He 80

His

Thr

Asn

ASP

val

ASn

val

cys

Asp

Thr

ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

85

90

95

- 40 034564 val cys Leu <210> 37 <211:> 297 <212> ДНК <213:> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 изолят 3882 <400> 37 atcacctcaa aaactgtgat tggtaaattc aagactgaaa acaatattag tcatcagaat60 gacgacattc ataaagaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgacat gagagttcat120 gtaactgcac tatttaatag tatacataag gataatatgg agtggagaat gagtgaatcg180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa acaaatacgg tcgagaatga agttaagaat240 cacgtagatg atgtaaatat atgtgatacg tctggattag agacggaagt ttgtcta297 <210> 38 <211> 99 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<22;

J> 1

NSP4

ИЗОЛЯТ :

3882

<400>

38

He 1

Thr

Ser

Lys

Thr 5

val

He

Gly

Lys

Phe 10

Lys

Thr

Glu

Asn

Asn 15

He

ser

His

Gin

Asn 20

Asp

He

His

zF

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg

Asp

Met

Arg

val

His

val

Thr

Ala

Leu

Phe

Asn

ser

He

35

40

45

His

Lys 50

ASP

Asn

Met

Glu

Trp 55

Arg

Met

Ser

Glu

Ser 60

He

Arg

Glu

Lys

Arg

Glu

Met

Lys

Thr

Asn

Thr

val

Glu

ASn

Glu

val

Lys

Asn

65

70

75

80

His

val

Asp

val

ASn

He

cys

Asp

Thr

ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

85

90

95

val Cys Leu <210> 39 <211> 297 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 41 034564 <223> NSP4 изолят 3509 <400> 39 atcacctcaa aaactgtgat tggtaaattc aagactgaaa atgacattag ccaccagaac60 aacgatatca ataaggaata tgaagaggtg atgaaacaaa tgcgtgaaat gagagttcat120 atgactgcat tatttaatag tatacataaa gataatatgg agtggagaat gagtgaatca180 attcgcagag aaaagaagcg tgaaatgaaa tcaaatgcaa ccgggaatga agtcaagatt240 cacaccaatg atgtaaatgt atgtgatacg tctggattag agacggaagt ttgtcta297 <210> 40 <211:> 99 <212:> Белок <213:> искусственная последовательность <220>

<223:> NSP4 изолят 3509 <400> 40

He 1

Thr

Ser

Lys

Thr 5

val

Ile

Gly

Lys

Phe 10

Lys

Thr

Glu

Asn

Asp 15

Ile

Ser

His

Gin

Asn 20

Asn

Asp

lie

Asn

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg

Glu

Met

Arg

val

His

Met

Thr

Ala

Leu

Phe

Asn

Ser

Ile

35

40

45

His

Lys 50

Asp

Asn

Met

Glu

Trp 55

Arg

Met

Ser

Glu

ser 60

Ile

Arg

Glu

Lys

Arg

Glu

Met

Lys 70

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly 75

Asn

Glu

val

Lys

He 80

His

Thr

Asn

ASP

val

Asn

val

cys

Asp

Thr

ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

85

90

95

val cys Leu <210> 41 <211> 732 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP4 изолят 1 <400> 41 agggcgtcct cactttatca tcaattaatt tctcagaatt attattcaac tgggaatgag60 atcttaaaag atttacaaac gactaaaact actgttgact atgtagatgc tgggaattat120 acatatgctc aattgccgcc aacgaagtgg ggagctggag ctaccttcga atcagtcttt180 agcgcagctg aaataacagg accgcacaca aatagagtta tagagtggaa gaatttacta240

- 42 034564

aattctgacc	agtggttgct	gtttccaaaa	ccagctgaca	cagttaaatt	acttaaacat	300
ggacctcaaa	catatgatag	cactttagcg	gcatgtgaat	tgtggtatgg	gaaggctaat	360
actatagtga	catcagaaca	ctattcatca	ttaagtgata	atcaggtgaa	tgtaaatgcc	420
gattcattag	tattattttg	gaatgctgga	gggacaacat	tcgataaaca	aatagttaat	480
tttgcttggg	atatgggtgg	aattctgatt	aagccgtcaa	gtcaacaacc	tagattagat	540
atatacatgg	ccaacatgaa	taatttcaat	agtgataatt	tcaattggga	agagtggcgt	600
ttcacactac	ctcgcagtaa	tgcaacaatt	aacatataca	ctgattatta	cctagctagc	660
agtgatccat	acaatcagct	gaaagaatta	caacagtcaa	ctattaccac	attcgaaatg	720
agaatgatgg	tg					732

<210> 42 <211> 244 <212> Белок <213:> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 изолят 1 <400:> 42

Arg 1

Ala Ser

Ser

Leu 5

Tyr H1S

Gin

Leu

lie Ser 10

Gin Asn

Tyr

Ser

Thr

Gly

Asn

Glu 20

He

Leu

Lys

Asp

Leu 25

Gin

Thr

Lys

Thr 30

Thr

val

Asp

Tyr

val 35

ASP

Ala

Gly

ASn

Tyr 40

Thr

Tyr

Ala

Gin

Leu 45

Pro

Thr

Lys

Trp

Gly

Ala

Gly

Ala

Thr

Phe

Glu

Ser

val

Phe

Ser

Ala

Glu

50

55

60

lie

Thr

Gly

Pro

His

Thr

Asn

Arg

val

lie

Glu

Trp

Lys

ASn

Leu

65

70

75

80

Asn

ser

Asp

Gin

Trp

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Ala

Asp

Thr

val

Lys

85

90

95

Leu

Lys

His 100

Gly

Pro

Gin

Thr

Tyr 105

Asp

Ser

Thr

Leu

Ala 110

Ala

cys

Glu

Leu

Trp 115

Tyr

Gly

Lys

Ala

Asn 120

Thr

He

val

Thr

Ser 125

Glu

His

Tyr

Ser

Leu

Ser

Asp

Asn

Gin

val

Asn

val

Asn

Ala

Asp

Ser

Leu

Val

130

135

140

Leu

Phe

Trp

Asn

Ala

Gly

Thr

Phe

Asp

Lys

Gin

He

val

ASn

145

150

155

160

- 43 034564

Phe

Ala

Trp

Asp

Met 165

Gly Gly

He

Leu

He 170

Lys

Pro

Ser

Gln 175

Gln

pro

Arg

Leu

Asp 180

Ile

Tyr

Met

Ala

Asn 185

Met

ASn

Phe

Asn 190

Ser

Asp

Asn

Phe

Asn 195

Trp

Glu

Trp

Arg 206

Phe

Thr

Leu

pro

Arg 205

Ser

Asn

Ala

Thr

He 210

Asn

ile

туг

Thr

21?

туг

Leu

Ala

ser 220

Ser

Asp

Pro

Tyr

Asn

Gln

Leu

Lys

Glu

Leu

Gln

ser

Thr

He

Thr

Phe

Glu

Met

225

230

235

240

Arg Met Met val <210> 43 <211> 735 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP4 изолят 66 <400> 43

agggcgtcct	cactttatca	gcaattaatt	tcacagaatt	attattcaac	tggaaatgat	60
attttactgg	atcagcaaac	aaataacaca	actgttgact	atatagatat	aggaaattat	120
tcgtatacac	aattaccgcc	gacatcatgg	ggagcaggaa	tgacttttaa	gtctgcattt	180
aatgcagagg	aaattacagg	acccaataca	ggtgatatag	atttgaataa	tttgacaaat	240
gcgaatgggt	ggatattgta	tgacaaacca	actgatacaa	aacgattgtt	aaaactagga	300
ccagaaagtt	atgacagtgt	gtacgcagca	ttcgaattat	ggtatggtaa	agcaaatact	360
gtagtcacat	caatatacta	ttcatcagtg	caaaactctg	aaaacactgt	aacagtacaa	420
catgactcat	tagtgttatt	ctttaatgtt	ggttatactg	gtctaactaa	gcaaatagtt	480
aaatttaact	ggaatatggg	aggcatatta	gttagaccga	ctgctgatgg	tagagtggat	540
atttgtatgg	ctgacatgaa	tgattttaat	agtgataatt	ttaattggga	atcttggaaa	600
cgtagttttc	cacgtagcaa	cattaacatg	tacactgaat	attatttagc	gaatgttgat	660
ccatataatc	aactaaaaat	attaaaccaa	ctaactgcaa	aaaatgtaga	aattagaatg	720
atgaaggcaa	ttaag					735

<210> 44 <211> 245 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

- 44 034564 <223:> VP4 изолят 66 <400* 44

Arg

Ala

Ser

Leu 5

Tyr

Gin

Leu

ile 10

Ser

Gin

ASn

Tyr

Tyr 15

Ser

Thr

Gly

Asn

Asp 20

lie

Leu

Asp

Gin 25

Gin

Thr

Asn

ASn

Thr 30

Thr

val

Asp

Tyr

Ile 35

Asp

Ile

Gly

Asn

Tyr 40

Ser

Tyr

Thr

Gin

Leu 45

Pro

Thr

Ser

Trp

Gly

Ala

Gly

Met

Thr

Phe

Lys

ser

Ala

Phe

Asn

Ala

Glu

50

55

60

ile

Thr

Gly

Pro

Asn

Thr

Gly

Asp

Ile

Asp

Leu

Asn

L.eu

Thr

Asn

65

70

75

80

Ala

Asn

Gly

Trp

lie 85

Leu

Tyr

Asp

Lys

Pro 90

Thr

Asp

Thr

Lys

Arg 95

Leu

Lys

Leu

Gly

Pro

Glu

Ser

Tyr

Asp

Ser

Val

Tyr

Ala

Phe

Glu

100

105

110

Leu

Trp

Tyr 115

Gly

Lys

Ala

Asn

Thr 120

val

Thr

Ser

He 125

Tyr

туг

Ser

val

Gin

Asn

ser

Glu

Asn

Thr

val

Thr

val

Gin

His

Asp

Ser

Leu

130

135

140

val

Leu

Phe

Asn

val

Gly

Tyr

Thr

Gly

Leu

Thr

Lys

Gin

He

Val

145

150

155

160

Lys

Phe

Asn

Trp

Asn 165

Met

Gly

lie

Leu 170

val

Arg

Pro

Thr

Ala 175

Asp

Gly

Arg

val

Asp 180

Ile

cys

Met

Ala

18?

Met

ASn

Asp

Phe

Asn 190

Ser

ASp

Asn

Phe

ASn

Trp

Glu

Ser

Trp

Lys

Arg

Ser

Phe

Pro

Arg

Ser

Asn

lie

195

200

205

Asn

Met 210

Tyr

Thr

Glu

Tyr

Tyr 215

Leu

Ala

Asn

val

Asp 220

Pro

Tyr

Asn

Gin

Leu

Lys

Ile

Leu

Asn

Gin

Leu

Thr

Ala

Lys

Asn

val

Glu

lie

Arg

Met

225

230

235

240

Met Lys Ala lie Lys

245

- 45 034564 <210> 45 <211> 735 <212:> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP4 изолят 71 <400> 45

agggcgtcct cactttatca gcaattaatc tcacagaatt attattcaac tggaaatgat	60
attttactgg atcagcaaac aaataacaca actgttgact atatagatat aggaaattac	120
tcgtatacac aattaccgcc gacatcatgg ggagcaggaa tgacttttaa gtctgcattt	180
aatgcagagg aaattacagg acccaatacg ggtgatatag atttgaataa tttgacaaat	240
gcgaatggat ggatattgta tgacaaacca actgatacaa aacgattgtt aaaactagga	300
ccagaaagtt atgacagtgt gtacgcagca ttcgaattat ggtatggtaa agcaaatact	360
gtagtcacat caatatacta ttcatcagtg caaaactctg aaaacactgt aacagtacag	420
catgactcat tagtgttatt ctttaatgtt ggttatactg gtctaactaa gcaaatagtt	480
aaatttaatt ggaatatggg aggcatatta gttagaccga ctactgatgg tagagtggat	540
atttgtatgg ctgacatgaa tgattttagt agtgataatt ttaattggga atcttggaaa	600
cgtagttttc cacgtagcaa cattaacatg tacactgaat attatttagc gaatgttgat	660
ccatataatc aactaaaaat attaaaccaa ctaactgcaa aaaatgtaga aattagaatg	720
atgaaggcaa ttaag	735

<210> 46 <211> 245 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 изолят 71 <400> 46

Arg

Ala

Ser

Leu 5

Tyr

Gin

Leu

He 10

ser

Gin

Asn

Tyr

s^r

Ser

Thr

Gly

Asn

Asp 20

lie

Leu

Asp

Gin 25

Gin

Thr

Asn

ASH

Thr 30

Thr

val

Asp

Tyr

lie 35

Asp

lie

Gly

Asn

туг 40

ser

Tyr

Thr

Gin

Leu 45

pro

Pro

Thr

Ser

Trp 50

Gly

Ala

Gly

Met

Thr 55

Phe

Lys

Ser

Ala

Phe 60

Asn

Ala

Glu

He 65

Thr

Gly

pro

Asn

Thr 70

Gly

Asp

He

Asp

Leu 75

ASn

Asn

Leu

Thr

Asn 80

Ala

Asn

Gly

Trp

lie 85

Leu

Tyr

Asp

Lys

Pro 90

Thr

ASP

Thr

Lys

Arg 95

Leu

- 46 034564

Leu Lys Leu Gly Pro Glu ser Tyr Asp Ser val Tyr Ala A|a Phe Glu

Leu Trp Tyr Gly Lys Ala Asn Thr Val Val Thr Ser lie Tyr Tyr Ser

115 120125

Ser Val Gin Asn Ser Glu Asn Thr val Thr val Gin His Asp Ser Leu 130 135140 val Leu Phe Phe Asn val Gly туг Thr Gly Leu Thr Lys Gin lie val

145 150 155160

Lys Phe Asn Trp Asn Met Gly Gly lie Leu Val Arg Pro Thr Thr Asp

165 170175

Gly Arg Val Asp lie Cys Met Ala Asp Met Asn Asp Phe Ser Ser Asp

180 185190

Asn Phe Asn Trp Glu Ser Trp Lys Arg

195200

Ser Phe Pro Arg Ser Asn lie

205

Asn Met Tyr Thr Glu Tyr Tyr Leu Ala Asn val Asp Pro туг Asn Gin 210 215220

Leu Lys lie Leu Asn Gin Leu Thr Ala Lys Asn val Glu lie Arg Met

225 230 235240

Met Lys Ala lie Lys

245 <210> 47 <211> 735 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 изолят 3509 <400> 47 agggcgtcct cactttatca gcaattaatc tcacagaatt attattcaac tggaaatgat60 attttactgg atcagcaaac aaataacaca actgttgact atatagatat aggaaattat120 tcgtatacac aattaccgcc gacatcatgg ggagcaggaa tgacttttac gtctgcattt180 aatgcagagg aaattacagg acccaataca ggtgatatag atttgaataa tttgacaaat240 gcgaatgggt ggatattgta tgacaaacca actgatacaa aacgattgtt aaaactagga300 ccagaaagtt atgacagtgt atacgcagca ttcgaattat ggtatggtaa agcaaatact360 gtagtcacat caatatacta ttcatcagtg caaaactctg aaaacactgt aacagtacag420 catgactcat tagtgttatt ctttaatgtt ggttatactg gtctaactaa gcaaatagtt480 aaatttaact ggaatatggg aggcatatta gttagaccga ctactgatgg tagagtggat540

- 47 034564 atttgcatgg ctgacatgaa tgattttaat agtgataatt ttaattggga atcttggaaa 600 cgtagttttc cacgtagcaa cattaacatg tacactgaat attatttagc gaatgttgat 660 ccatataatc aactaaaaat attaaaccaa ctaactgcaa aaaatgtaga aattagaatg 720 atgaaggcaa ttaag 735 <210> 48 <211> 245 <212:> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223:> VP4 изолят 3509 <400:> 48

Arg 1

Ala Ser

Ser

Leu туг

Gin Gin Leu lie Ser 10

Gin

Asn

Tyr

IT

ser

Thr

Gly

Asn

Asp

He

Leu

Asp

Gin

Thr

Asn

Thr

val

20

25

30

Asp

туг

He

Asp

He

Gly

Asn

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Gin

Leu

Pro

pro

Thr

35

40

45

Ser

Trp

Gly

Ala

Gly

Met

Thr

Phe

Thr

Ser

Ala

Phe

ASn

Ala

Glu

50

55

60

He

Thr

Gly

Pro

Asn

Thr

Gly

Asp

He

Asp

Leu

Asn

Leu

Thr

Asn

65

70

75

80

Ala

Asn

Gly

Trp

lie 85

Leu

Tyr

Asp

Lys

pro 90

Thr

ASP

Thr

Lys

Arg 95

Leu

Lys

Leu

Gly

Pro

Glu

Ser

туг

is?

Ser

val

Tyr

Ala

Phe

Glu

100

110

Leu

Trp

Tyr 115

Gly

Lys

Ala

Asn

Thr 120

val

Thr

ser

lie 125

Tyr

Ser

val

Gin

Asn

Ser

Glu

Asn

Thr

val

Thr

val

Gin

His

ASP

ser

Leu

130

135

140

val

Leu

Phe

Asn

val

Gly

Tyr

Thr

Gly

Leu

Thr

Lys

Gin

He

val

145

150

155

160

Lys

Phe

Asn

Trp

Asn 165

Met

Gly Gly

He

Leu 170

val

Arg

Pro

Thr

Thr 175

ASP

Gly

Arg

val

Asp

He

Cys

Met Ala

Asp

Met

Asn

Asp

Phe

Asn

Ser

ASp

180

185

190

- 48 034564

Asn

Phe

Asn 195

Trp

Glu

Ser

Trp

Lys 200

Arg

ser

Phe

Pro

20?

ser

Asn

He

Asn

Met 210

Tyr

Thr

Glu

Tyr

Tyr 215

Leu

Ala

Asn

Val

ASP 220

Pro

Tyr

ASn

Gin

Leu

Lys

Ile

Leu

Asn

Gin

Leu

Thr

Ala

Lys

ASn

val

Glu

He

Arg

Met

225

230

235

240

Met

Lys

Ala

He

Lys

245 <210:> <211> <212> <213>

735

ДНК

Искусственная последовательность <220>

<223>

VP4 изолят 3882 <220>

<221> прочий признак <222> (59)..(59) <223> η - а, с, д, или t <220>

<221> прочий признак <222> (690)..(690) <223> η - а, с, д, или t <220>

<221> прочий признак <222> (699)..(700) <223> η - а, с, д, или t <400> 49

agggcgtcct	cactttatca	gcaattaatc	tcacaaaatt	attattcaac	tgggaatgnt	60
atattattgg	atcagcaaac	gaataaaaca	actgttgatt	atgtagatgt	gggaaattat	120
tcatatacac	aattaccacc	aacatcatgg	ggagcaggaa	tgacttttaa	gtctgcattt	180
aatgcagaag	aaatgacggg	acctaacaca	ggtgatatag	atctgagtaa	tctcacaact	240
gcgaatggat	ggatattata	tgagaagccg	acaattacca	aacggttatt	aaaactaggg	300
ccagatgttt	acgatagtgt	ttatgccgca	tttgaactgt	ggtatggtaa	agcaaataca	360
gtagttacat	caatatatta	tgcatcagca	caaaattctg	agaatactgt	aacattacag	420
tatgactcat	tagtactatt	tttcaatgtt	ggttacactg	gtctgactaa	gcaaatagtt	480
agatttaatt	gggatatggg	aggcatatta	gttaggccaa	ctgctgatgg	tagagtagat	540
atctgtatgg	cagacatgaa	tgattttagc	agcgacaatt	ttaattggga	gaaatggact	600
cgtagctttc	cacgcagtaa	tattaatatg	tatgctgaat	attacttagc	aaatgttgac	660
ccgtatagtc	aattaaaagc	attaaatcan	ctcacaacnn	aaaatataga	aattagaatg	720
atgaagtcaa	ttaag					735

- 49 034564 <210> 50 <211> 245 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 изолят 3882 <220>

<221> прочий признак <222> (20)..(20) <223> хаа - любая аминокислота <220>

<221> прочий признак <222:> (230)..(230) <223> Хаа - любая аминокислота <22О:>

<221> прочий признак <222> (233)..(234) <223> хаа - любая аминокислота <220:>

<221> прочий признак <222:> (245)..(245) <223> Хаа - любая аминокислота <400:> 50

Arg Ala Ser Ser Leu Tyr Gin Gin Leu lie Ser Gin Asn Tyr Tyr Ser

15

Thr Gly Asn xaa lie Leu Leu Asp Gin

25

Gin Thr Asn Lys Thr Thr val

Asp Tyr Val Asp Val Gly Asn Tyr Ser 35 40

Tyr Thr Gin Leu Pro Pro Thr

Ser Trp Gly Ala Gly Met Thr Phe Lys 50 55

Ser Ala Phe Asn Ala Glu Glu 60

Met Thr Gly Pro Asn Thr Gly Asp lie 65 70

Asp Leu Ser Asn Leu Thr Thr

80

Ala Asn Gly Trp lie Leu Tyr Glu Lys

Pro Thr lie Thr Lys Arg Leu

95

Leu Lys Leu Gly Pro Asp val Tyr Asp

100 105

Ser val Tyr Ala Ala Phe Glu

110

Leu тгр Tyr Gly Lys Ala Asn Thr Val

115 120

Val Thr ser lie Tyr Tyr Ala 125

Ser Ala Gin Asn Ser Glu Asn Thr Val 130 135

Thr Leu Gin Tyr Asp Ser Leu 140

Val Leu Phe Phe Asn val Gly Tyr Thr

Gly Leu Thr Lys Gin Ile val

145

150

155

160

Arg

Phe

Asn

Trp

Asp 165

Met

Gly

He

Leu 170

Val

Arg

Pro

Thr

Ala 175

Asp

Gly

Arg

val

Asp 180

He

Cys

Met

Ala

Asp 185

Met

Asn

Asp

Phe

Ser 190

Ser

Asp

Asn

Phe

Asn 195

Trp

Glu

Lys

Trp

Thr 200

Arg

Ser

Phe

Pro

Arg 205

Ser

Asn

lie

Asn

Met 210

Tyr

Ala

Glu

Tyr

Tyr 215

Leu

Ala

Asn

val

Asp 220

Pro

Tyr

Ser

Gin

Leu

Lys

Ala

Leu

Asn

xaa

Leu

Thr

xaa

Xaa

Asn

lie

Glu

lie

Arg

Met

225

230

235

240

Met

Lys

ser

lie

xaa

245

<210> 51 <211> 1182 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 1 <400> 51

gacgtgctgt tttcaattgc gaaaactgta tctgaactca aaaagaaagt tgtagttggt	60
actatttaca ctaatgtaga agatataatt caacaaacca atgaactgat tagaactttg	120
aatggtaata cgtttcatac aggtggtatt ggaacacagc ctcaggaaga gtggaatttt	180
caattaccgc agctaggtac gacactctta aatttagatg acaactatgt tcaagccact	240
agaagtgtta ttgattattt ggcttcattt atagaatcag tatgtgatga tgaaattgtc	300
agagaagcat ctagaaatgg aatgcagcca cagtcgccag cacttataac gctgtcatca	360
tcaaagttta agactatcaa ctttaataac agttcacaat caattaaaaa ttggagtgct	420
caatcaagac gtgaaaatcc agtctatgaa tacagaaatc caatgatatt cgaatataga	480
aattcataca ttcttcagcg tgctaatcca caatttggaa tcgtaatggg attgaggtat	540
tatacaactg gtaacacctg tcaagttgca gcttttgatt caacatttgc tgaaaatgct	600
cctaataata ctcaacgttt tatctataat ggaagactta agagaccaac ttctaatgca	660
ttgatgaaaa ttgaggctgg cgctcagaac atcagtattc caacagtttt gcctgatctg	720
gcaaatcaaa caacatggtt atttaatcca gtgcaagtaa tgaatggaac attctctatt	780
gaattttata acaatggaca actagttgat atgattagaa atatgggagt agttactgtt	840
agaacttttg attcttacag aataacaatc gatgtgatta gaccagcagc tatgacacaa	900
tacgttcaga gaacattccc gcaaggtggt ccttatccat accaagctgc atacatgttg	960

- 51 034564 acgctcagtg tattagatgc gacaacggaa tctgtcctat gcgattcaca ctctgtggat 1020 tattcaattg ttgcaaacgt tagaagagac tcagcaatgc cagctggaac agtatttcaa 1080 ccagggtttc catgggaaca gacattatcc aactacactg ttgctcagga agataattta 1140 gaaagacttt tactagttgc gtccgtgaag agaatggtga tg 1182 <210> 52 <211> 394 <212> Белок <213> искусственная последовательность <22О>

<223> VP6 изолят 1 <400> 52

Asp 1

val

Leu

Phe

Ser 5

lie

Ala

Lys

Thr

val 10

Ser

Glu

Leu

Lys

val

Gly

Thr

lie

Tyr

Thr

Asn

val

Glu

ASp

He

lie

Gin

20

25

30

Thr

Asn

Glu 35

Leu

He

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe 45

His

Thr

Gly

lie

Gly

Thr

Gin

Pro

Gin

Glu

Trp

Asn

Phe

Gin

Leu

Pro

Gin

50

55

60

Leu

Gly

Thr

Leu

А5П

Leu

Asp

Asn

Tyr

val

Gin

Ala

Thr

65

70

75

80

Arg

ser

val

He

Asp 85

Tyr

Leu

Ala

Ser

Phe 90

He

Glu

ser

Val

cys 95

ASp

Asp

Glu

He

val

Arg

Glu

Ala

ser

Arg

Asn

Gly

Met

Gin

pro

Gin

Ser

100

105

110

Pro

Ala

Leu

He

Thr

Leu

Ser

ser

Lys

Phe

Lys

Thr

lie

Asn

Phe

115

120

125

Asn

Ser

Gin

Ser

He

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala

Gin

ser

Arg

130

135

140

Glu 145

Asn

Pro

val

Tyr

Glu 150

Tyr

Arg

Asn

Pro

Met 155

He

Phe

Glu

Tyr

Arg 160

ASn

Ser

туг

He

Leu

Gin

Arg

Ala

Asn

Pro

Gin

Phe

Gly

He

val

Met

165

170

175

Gly

Leu

Arg

Tyr 180

Tyr

Thr

Gly

Asn 185

Thr

Cys

Gin

val

Ala 190

Ala

Phe

ASp

Ser

Thr

Phe

Ala

Glu

Asn

Ala

pro

Asn

ASn

Thr

Gin

Arg

Phe

lie

- 52 034564

195

200

205

Tyr Asn

210

Gly Arg Leu Lys Arg Pro Thr Ser Asn Ala Leu Met Lys Ile 215220

Glu Ala Gly Ala Gin Asn Ile Ser Ile Pro Thr val Leu Pro Asp Leu 225 230 235240

Ala Asn Gin Thr Thr Trp Leu phe Asn Pro Val Gin val Met Asn Gly

245 250255

Thr Phe ser lie Glu Phe Tyr Asn Asn Gly Gin Leu val Asp Met lie

260 265270

Arg Asn Met Gly Val Val Thr val Arg Thr Phe Asp Ser Tyr Arg Ile 275 280285

Thr lie Asp val lie Arg Pro Ala Ala Met Thr Gin Tyr val Gin Arg 290 295300

Thr Phe Pro Gin Gly Gly Pro Tyr Pro Tyr Gin Ala Ala Tyr Met Leu

305 310 315320

Thr Leu ser val Leu Asp Ala Thr Thr Glu ser val Leu Cys Asp ser

325 330335

His Ser val Asp Tyr ser lie val Ala Asn Val Arg Arg Asp Ser Ala

340 345350

Met Pro Ala Gly Thr val Phe Gin Pro Gly Phe Pro Trp Glu Gin Thr 355 360365

Leu Ser Asn Tyr Thr val Ala Gin Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu 370 375380

Leu val Ala Ser val Lys Arg Met val Met

385390 <210> 53 <211> 1182 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 63 <400> 53 gatgtgctgt tctccattgc gaagactgtc tcagatctta agaagaaagt tgtagttggt60 actatttata caaatgtaga agatataatc caacagacta atgaattgat tagaactttg120 aatggcaaca cattccatac tggtggaatt ggaacacaac ctcagaaaga atggaatttt180 caactaccac agctaggtac aacacttttg aatttagatg ataactatgt tcaagcaact240

- 53 034564

agaagtatca tcgattattt ggcctcattt atagaagctg tgtgtgatga cgaaattgtt	300
agagaagcgt caagaaatgg aatgcaacct caatctcctg cacttatagc gttatcttca	360
gcaaaattta agactattaa ttttaacaat agttcacaat ccattaagaa ttggagtgct	420
cagtcaagac gtgaaaatcc agtgtatgaa tataaaaatc caatggtgtt tgagtataga	480
aattcatata ttcttcagcg tgccaatgca caatatggga acgtaatggg gctgagatat	540
tacacagcca gcaatgcctg tcagattgca gcttttgatt caactttagc tgaaaatgct	600
cctaatggca ctcaacggtt tatttataat ggaagactta aaagaccaat ttctaatgtg	660
ttgatgaaaa ttgaggcggg tgctccaaac attagtaatc caacaatact acctgatcca	720
gcaaatcaga caacatggct atttaatcca gtgcagataa tgaatggaac atttactatt	780
gagttttata ataatgggca gttagttgat ttgattagaa atatgggagt agttactgtt	840
agaacatttg atacgtacag aattacaatt gacatgatta gaccagcaac catgacacag	900
tatgtacaaa gactgtttcc acagggtggc ccatatcaac atcaagccgc atatatgata	960
actcttagta tattggatgc cacaacagaa tcagtcatgt gtgattcaca ttcagtagat	1020
tattcaatcg tcgcaaatgt cagaagagac tcagcaatgc cagctggaac agtatttcaa	1080
ccaggatttc catgggaaca gatattatcc aactacactg ttgctcagga ggataattta	1140
gaaagacttt tgttagttgc gtctgtgaag agaatggtga tg	1182

<210> 54 <211> 394 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 63 <400> 54

Asp 1

val

Leu

Phe

Ser 5

lie

Ala

Lys

Thr

val 10

Ser

Asp

Leu

Lys

LYS 15

LYS

Val

val

Gly 20

Thr

lie

Tyr

Thr

Asn 25

val

Glu

Asp

He

lie 30

Gin

Thr

ASfl

Glu 35

Leu

lie

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe 45

His

Thr

Gly

lie 50

Gly

Thr

Gin

Pro

Gin 55

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe 60

Gin

Leu

Pro

Gin

Leu 65

Gly

Thr

Leu

Leu 70

Asn

Leu

Asp

ASP

Asn 75

Tyr

val

Gin

Ala

Thr 80

Arg

ser

lie

Ile

Asp 85

Tyr

Leu

Ala

Ser

Phe 90

lie

Glu

Ala

val

Asp

Glu

lie

val

Arg

Glu

Ala

ser

Arg

ASn

Gly

Met

Gin

Pro

Gin

Ser

- 54 034564

100

105

110

Pro

Ala

Leu

lie

Ala

Leu

Ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Thr

lie

Asn

Phe

115

120

125

ASH

ASn

Ser

Gin

Ser

He

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala

Gin

Ser

Arg

130

135

140

G1U 145

ASn

pro

val

туг

Glu 150

Tyr

Lys

Asn

Pro

Met 155

val

Phe

Glu

Tyr

Arg 160

Asn

ser

Tyr

lie

Leu 165

Gin

Arg

Ala

Asn

Ala 170

Gin

Tyr

Gly

Asn

val 175

Met

Gly

Leu

Arg

Tyr 180

Tyr

Thr

Ala

Ser

Asn 185

Ala

Cys

Gin

He

Ala 190

Ala

Phe

ASp

Ser

Thr 195

Leu

Ala

Glu

ASn

Ala 200

Pro

Asn

Gly

Thr

Gin 205

Arg

Phe

He

туг

Asn

Gly

Arg

Leu

Lys

Arg

Pro

He

Ser

Asn

val

Leu

Met

Lys

He

210

215

220

G1U

Ala

Gly

Ala

Pro

Asn

He

Ser

ASn

Pro

Thr

He

Leu

Pro

ASp

Pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

ASn

pro

val

Gin

He

Met

Asn

Gly

245

250

255

Thr

Phe

Thr

lie

Glu

Phe

Tyr

Asn

Gly

Gin

Leu

val

Asp

Leu

He

260

265

270

Arg

Asn

Met 275

Gly

Val

Thr

val 280

Arg

Thr

Phe

Asp

Thr 285

Tyr

Arg

lie

Thr

He 290

ASp

Met

lie

Arg

pro 295

Ala

Thr

Met

Thr

Gin 300

Tyr

val

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Gin

Gly

Pro

Tyr

Gin

His

Gin

Ala

Tyr

Met

He

305

310

315

320

Thr

Leu

Ser

He

Leu

ASp

Ala

Thr

Glu

Ser

val

Met

cys

Asp

Ser

325

330

335

His

Ser

val

Asp

Tyr

Ser

He

val

Ala

Asn

val

Arg

Asp

Ser

Ala

340

345

350

Met

Pro

Ala

Gly

Thr

val

Phe

Gin

Pro

Gly

Phe

Pro

Trp

Glu

Gin

He

355

360

365

Leu

ser

Asn

Tyr

Thr

val

Ala

Gin

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Arg

Leu

- 55 034564

370 375 380

Leu val Ala Ser val Lys Arg Met val Met

385 390 <210> 55 <211> 1182 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 64 <400> 55

gatgtgctgt	tctccattgc	gaagactgtc	tcagatctta	agaagaaagt	tgtagttggt	60
actatttata	caaatgtaga	agatataatc	caacagacta	atgaattgat	tagaactttg	120
aatggcaaca	catttcatac	tggtggaatt	ggaacacaac	ctcagaaaga	atggaatttt	180
caactaccac	agctaggtac	aacacttttg	aatttagatg	ataactatgt	tcaagcaact	240
agaagtatca	tcgattattt	ggcctcattt	atagaagctg	tgtgtgatga	cgaaattgtt	300
agagaagcgt	caagaaatgg	aatgcaacct	caatctcctg	cacttatagc	gttatcttca	360
gcaaaattta	agactattaa	ttttaacaat	agttcacaat	ccattaagaa	ttggagtgct	420
cagtcaagac	gtgaaaatcc	agtgtatgaa	tataaaaatc	caatggtgtt	tgagtataga	480
aattcatata	ttcttcagcg	tgctaatgca	caatatggga	atgtaatggg	gctgagatat	540
tacacagcga	gtaatgcctg	tcagattgca	gcttttgatt	caactttagc	tgaaaatgcc	600
cctaatggta	ctcaacggtt	tatttataat	ggaagactta	aaagaccaat	ttctaatgtg	660
ttgatgaaaa	ttgaggcggg	tgctccaaac	attagtaatc	caacaatact	acctgatcca	720
gcaaatcaga	caacatggct	atttaatcca	gtacagataa	tgaatggaac	atttactatt	780
gagttttata	ataatgggca	gttagttgat	ttaattagaa	atatgggagt	agttactgtt	840
agaacatttg	atacgtacag	aattacaatt	gacatgatta	gaccagcagc	catgacacag	900
tatgtacaaa	gactgtttcc	acagggtggc	ccatatcaac	atcaagccgc	atatatgata	960
actcttagta	tattggatgc	cacaacagaa	tcagtcatgt	gtgattcaca	ttcagtagat	1020
tattcaatcg	tcgcaaatgt	cagaagagac	tcagcaatgc	cagctggaac	agtatttcaa	1080
ccaggctttc	catgggaaca	gatattatcc	aactacactg	ttgctcagga	ggataattta	1140
gaaagacttt	tgttagttgc	gtctgtgaag	agaatggtga	tg		1182

<210> 56 <211> 394 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 64 АА последовательностьз <400> 56

Asp val Leu Phe Ser lie Ala Lys Thr val Ser Asp Leu Lys Lys Lys

- 56 034564 ίο

val val val

Gly Thr lie 20

туг Thr Asn val Glu 25

Asp lie lie 30

Gin Thr

Gin Gly

Thr

Asn

Glu 35

Leu lie

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly Asn

Thr

Phe 45

His

Gly

lie 50

Gly

Thr

Gin

pro

Gin 55

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe 60

Gin

Leu

Pro

Gin

Leu

Gly

Thr

Leu

Asn

Leu

ASP

Asp

Asn

Tyr

val

Gin

Ala

Thr

65

70

75

80

Arg

Ser

lie

Asp 85

туг

Leu

Ala

Ser

Phe 90

He

Glu

Ala

val

Cys 95

Asp

Glu

He

val

Arg

Glu

Ala

ser

Arg

ASn

Gly

Met

Gin

Pro

Gin

Ser

100

105

110

Pro

Ala

Leu

He

Ala

Leu

ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Thr

lie

Asn

Phe

115

120

125

Asn

Asn 130

Ser

ser

Gin

Ser

He 135

Lys

Asn

тгр

Ser

Ala 140

Gin

ser

Arg

Glu

ASn

Pro

val

Tyr

Glu

Tyr

Lys

Asn

Pro

Met

val

Phe

Glu

Tyr

Arg 160

145

150

155

ASn

Ser

Tyr

lie

Leu 165

Gin

Arg

Ala

ASn

Ala 170

Gin

туг

Gly

Asn

val 175

Met

Gly

i_eu

Arg

Tyr

Thr

Ala

ser

Asn

Ala

Cys

Gin

He

Ala

Phe

180

185

190

ASP

Ser

Thr

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala

Pro

ASn

Gly

Thr

Gin

Arg

Phe

lie

195

200

205

Tyr

Asn 210

Gly

Arg

Leu

Lys

21?

Pro

He

Ser

ASn

val 220

Leu

Met

Lys

He

G1U

Ala

Gly

Ala

Pro

ASn

He

ser

Asn

Pro

Thr

He

Leu

Pro

ASP

Pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

ASn

Pro

val

Gin

He

Met

Asn

Gly

245

250

255

Thr

Phe

Thr

lie 260

Glu

phe

туг

Asn

Asn 265

Gly

Gin

Leu

val

Asp 270

Leu

He

Arg

Asn

Met

Gly

val

Thr

val

Arg

Thr

Phe

Asp

Thr

туг

Arg

He

- 57 034564

275

280

285

Thr

lie 290

ASP

Met

lie

Arg

Pro 295

Ala

Met

Thr

Gin 300

Tyr

val

Gin

Arg

Leu 305

Phe

pro

Gin

Gly

&

Pro

Tyr

Gin

His

Gin 315

Ala

Tyr

Met

lie 320

Thr

Leu

Ser

Ile

Leu 325

Asp

Ala

Thr Thr

Glu 330

ser

val

Met

cys

Ser

H1S

ser

val

Asp 340

туг

Ser

Ile

val

Ala 345

Asn

val

Arg

Asp 350

Ser

Ala

Met

Pro

Ala

Gly

Thr

val

Phe

Gin

Pro

Gly

Phe

Pro

Trp

Glu

Gin

He

355

360

365

Leu

Ser

Asn

туг

Thr

val

Ala

Gin

Glu

ASP

Asn

Leu

Glu

Arg

Leu

370

375

380

Leu val 385	Ala Ser val	Lys Arg Met val Met 390
<210>	57
<211>	1182
<212>	ДНК

<213> искусственная последовательность <220:>

<223> VP6 изолят 65 <400> 57

gatgtgctgt	tttcaattgc	gaagactgtc	tcagaactca	aaaagaaagt	tgtagttggt	60
actatttaca	ctaatgtaga	agatataatt	cagcaaacta	atgaattaat	tagaactttg	120
aatggcaaca	cgtttcatac	aggtggtatt	ggaacgcagc	ctcaaaaaga	gtggaatttt	180
caattaccac	agctaggtac	aacactcttg	aatttagatg	ataactatgt	ccaagctact	240
agaagtgtta	ttgactattt	ggcctcattc	atagaagcag	tatgtgatga	tgagattgtc	300
agagaagcat	cgagaaatgg	aatgcagcct	caatcaccta	cacttatagc	gctgtcctca	360
tcaaaattta	aaactattaa	ttttaataac	agttcacaat	ctattaaaaa	ctggagtgct	420
caatcaagac	gcgaaaatcc	agtctacgag	tacagaaatc	cgatgatatt	cgaatataga	480
aattcataca	ttcttcagcg	cgctaatcca	caatttggaa	atgtaatggg	gttgaggtat	540
tatacaacta	gtaacacttg	tcaaatcgca	gcttttgact	caacatttgc	tgagaatgct	600
cctaataata	ctcaacgttt	catctataat	ggaagactta	agagaccaat	ttctaatgtg	660
ctaatgaaaa	ttgaggctgg	tgctcagaac	atcagtagtc	caacagtcct	acctgatccg	720
acaaatcaaa	caacatggct	atttaatcca	gtacaagtaa	tgaatggaac	ttttactatt	780
gagttttata	ataatggaca	attagttgat	atgattagaa	acatgggagt	agttactgtt	840

- 58 034564 agaacttttg attcttatag aataacaatt gatatgatca gaccagcagc tatgacacaa 900 tacgttcaga gaacattccc acaaggtggt ccttatccat accaagctgc atacatgttg 960 acactcagtg tattagatgc tacaacagaa tctgtcctat gcgattcaca ctctgtagac 1020 tattcaattg ttgcaaacat tagaagagac tcagcaatgc cagctggaac agtatttcaa 1080 ccaggatttc catgggaaca gacattatcc aactacactg ttgctcagga ggataattta 1140 gaaagacttc tactagttgc gtccgtgaag agaatggtga tg 1182 <210> 58 <211> 394 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 65 <400:> 58

Asp val 1

Leu

Phe

Ser 5

He

Ala Lys Thr val 10

Ser

Glu Leu

Lys

Lys 15

Lys

val

Gly 20

Thr

lie

Tyr

Thr

Asn 25

val

Glu

Asp

lie

He 30

Gin

Thr

Asn

Glu 35

Leu

lie

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe 45

His

Thr

Gly

lie

Gly

Thr

Gin

Pro

Gin

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe

Gin

Leu

Pro

Gin

50

55

60

Leu 65

Gly

Thr

Leu

Leu 70

Asn

Leu

Asp Asp

Asn 75

Tyr

val

Gin

Ala

Thr 80

Arg

Ser

val

lie

Asp 85

Tyr

Leu

Ala

Ser

Phe 90

He

Glu

Ala

Val

8^s

ASp

Asp

Glu

lie

val

Arg

Glu

Ala

Ser

Arg

Asn

Gly

Met

Gin

Pro

Gin

Ser

100

105

110

Pro

Thr

Leu

lie

Ala

Leu

Ser

LyS

Phe

Lys

Thr

He

ASn

Phe

115

120

125

Asn

Asn 130

Ser

Gin

Ser

lie 135

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala 140

Gin

Ser

Arg

Glu 145

ASn

pro

val

Tyr

Glu 150

Tyr

Arg

Asn

Pro

Met 155

He

Phe

Glu

туг

Arg 160

Asn

Ser

Tyr

He

Leu

Gin

Arg

Ala

Asn

Pro

Gin

Phe

Gly

Asn

val

Met

165

170

175

Gly

Leu

Arg

туг

Thr

Ser

Asn

Thr

cys

Gin

lie

Ala

Phe

- 59 034564

180

185

190

Asp Ser Thr Phe Ala Glu Asn Ala Pro Asn Asn Thr Gin Arg Phe lie 195 200205

Tyr Asn Gly Arg Leu 210

Lys Arg Pro ile ser Asn val Leu Met Lys lie

215220

Glu Ala Gly Ala Gin Asn Ile Ser Ser Pro Thr Val Leu Pro Asp Pro 225 230 235240

Thr Asn Gin Thr Thr Trp Leu Phe Asn Pro val Gin val Met Asn Gly

245 250255

Thr Phe Thr lie Glu Phe Tyr Asn Asn Gly Gin Leu Val Asp Met lie 260 265270

Arg Asn Met Gly val Val Thr val Arg Thr Phe Asp Ser Tyr Arg lie 275 280285

Thr lie Asp Met lie Arg Pro Ala Ala Met Thr Gin Tyr val Gin Arg 290 295300

Thr Phe Pro Gin Gly Gly Pro Tyr Pro Tyr Gin Ala Ala Tyr Met Leu 305 310 315320

Thr Leu Ser val Leu Asp Ala Thr Thr Glu Ser Val Leu Cys Asp Ser

325 330335

His Ser val Asp Tyr ser ile val Ala Asn lie Arg Arg Asp ser Ala

340 345350

Met Pro Ala Gly Thr val Phe Gin Pro Gly Phe Pro Trp Glu Gin Thr 355 360365

Leu Ser Asn Tyr Thr Val Ala Gin Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu 370 375380

Leu val Ala Ser val Lys Arg Met val Met

385390 <210> 59 <211> 1182 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 66 <400> 59 gatgtgctgt tttcaattgc gaagactgtc tcagatctta agaagaaagt tgtagttggt 60 actatttata caaatgtaga agatataatc caacagacta atgaattgat tagaactttg 120

- 60 034564

aatggcaaca	catttcatac	tggtggaatt	ggaacacaac	ctcagaaaga	atggaatttt	180
caactaccac	agctaggtac	aacacttttg	aatttagatg	ataactatgt	tcaagcaact	240
agaagtatca	tcgattattt	ggcctcattt	atagaagctg	tgtgtgatga	cgaaattgtt	300
agagaggcgt	caagaaatgg	aatgcaacct	caatctcctg	cacttatagc	gttatcttca	360
gcaaaattta	agactattaa	ttttaacaat	agttcacaat	ccattaagaa	ttggagtgct	420
cagtcaagac	gtgaaaatcc	agtgtatgaa	tataaaaatc	caatggtgtt	tgagtataga	480
aattcatata	ttcttcagcg	tgctaatgca	caatatggga	atgtaatggg	gctgagatat	540
tacacagcga	gtaatgcctg	tcagattgca	gcttttgatt	caactttagc	tgaaaatgcc	600
cctaatggta	ctcaacggtt	tatttataat	ggaagactta	aaagaccaat	ttctaatgtg	660
ttgatgaaaa	ttgaggcggg	tgctccaaac	attagtaatc	caacaatact	acctgatcca	720
gcaaatcaga	caacatggct	atttaatcca	gtacagataa	tgaatggaac	atttactatt	780
gagttttata	ataatgggca	gttagttgat	ttaattagaa	atatgggagt	agttactgtt	840
agaacatttg	atacgtacag	aattacaatt	gacatgatta	gaccagcagc	catgacacag	900
tatgtacaaa	gactgtttcc	acagggtggc	ccatatcaac	atcaagccgc	atatatgata	960
actcttagta	tattggatgc	cacaacagaa	tcagtcatgt	gtgattcaca	ttcagtagat	1020
tattcaatcg	tcgcaaatgt	cagaagagac	tcagcaatgc	cagctggaac	agtatttcaa	1080
ccaggctttc	catgggaaca	gatattatcc	aactacactg	ttgctcagga	ggataattta	1140
gaaagacttt	tgttagttgc	gtctgtgaag	agaatggtga	tg		1182

<210> 60 <211> 394 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 66 <400> 60

ASP

Val

Leu

Phe

ser

He

Ala

Lys

Thr

val

Ser

Asp

Leu

Lys

1

5

10

15

Val

val

Gly 20

Thr

He

Tyr

Thr

ASn 25

val

Glu

Asp

He

He 30

Gin

Thr

Asn

Glu 35

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe 45

His

Thr

Gly

lie 50

Gly

Thr

Gin

pro

Gin 55

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe 60

Gin

Leu

pro

Gin

Leu

Gly

Thr

Leu

ASn

Leu

Asp

Asn

Tyr

val

Gin

Ala

Thr

65

70

75

80

Arg

ser

He

lie

Asp

Tyr

Leu

Ala

ser

Phe

He

Glu

Ala

val

cys

Asp

- 61 034564

90 95

Asp Glu lie val Arq Glu Ala Ser Arg

Asn Gly Met

Gin

Pro 110

Gin

Ser

100

105

Pro

Ala

Leu

lie

Ala

Leu

ser

Ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Thr

He

Asn

Phe

115

120

125

Asn

Ser

Gin

Ser

He

Lys

Asn

Trp

ser

Ala

Gin

Ser

Arg

130

135

140

Glu 145

Asn

Pro

val

Tyr

Glu 150

Tyr

Lys

ASn

Pro

Met 155

val

Phe

Glu

Tyr

Arg 160

Asn

Ser

Tyr

He

Leu

Gin

Arg

Ala

Asn

Ala

Gin

Tyr

Gly

Asn

val

Met

165

170

175

Gly

Leu

Arg

Tyr 180

туг

Thr

Ala

ser

ASn 185

Ala

cys

Gin

He

Ala 190

Ala

Phe

ASP

Ser

Thr 195

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala 200

Pro

Asn

Gly

Thr

Gin 205

Arg

Phe

He

туг

Asn 210

Gly

Arg

Leu

Lys

Arg 215

Pro

He

Ser

Asn

val 220

Leu

Met

Lys

He

Glu

Ala

Gly

Ala

Pro

Asn

He

Ser

Asn

Pro

Thr

He

Leu

Pro

Asp

Pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

Asn

pro

val

Gin

He

Met

ASn

Gly

245

250

255

Thr

Phe

Thr

lie

Glu

Phe

туг

Asn

Gly

Gin

Leu

val

Asp

Leu

lie

260

265

270

Arg

Asn

Met 275

Gly

val

Thr

val 280

Arg

Thr

Phe

Asp

Thr 285

Tyr

Arg

lie

Thr

He 290

ASP

Met

lie

Arg

Pro 295

Ala

Met

Thr

Gin 300

Tyr

val

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Gin

Gly

Pro

туг

Gin

His

Gin

Ala

туг

Met

He

305

310

315

320

Thr

Leu

Ser

lie

Leu 325

Asp

Ala

Thr

Glu 330

ser

val

Met

cys

ser

His

Ser

val

ASP 340

Tyr

Ser

lie

val

Ala 345

Asn

val

Arg

Asp 350

Ser

Ala

Met

Pro

Ala

Gly

Thr

val

Phe

Gin

Pro

Gly

Phe

Pro

Trp

Glu

Gin

He

- 62 034564

355 360365

Leu Ser Asn туг Thr val Ala Gin Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu 370 375380

Leu val Ala Ser val Lys Arg Met val Met

385390 <210> 61 <211> 1182 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 67 <400> 61

gatgtgctgt tctctattgc gaagactgtc tcagatctta agaagaaagt	tgtagttggt	60
actatttata caaatgtaga agatataatc caacaaacta atgaattgat	tagaactttg	120
aatggcaaca cattccatac tggtggaatt ggaacacaac ctcagaaaga	atggaatttt	180
caactaccgc agctaggtac aacacttttg aatttagatg ataactatgt	tcaagcaact	240
agaagtatca tcgattattt gacctcattt atagaagctg tgtgtgatga	cgaaattgtt	300
agagaagcgt caagaaatgg aatgcaacct caatctcctg cacttatagc	gttatcttca	360
gcaaaattta agactattaa ttttaacaat agttcacaat ccattaagaa	ttggagtgct	420
cagtcaagac gtgaaaatcc agtgtatgaa tataaaaatc caatggtgtt	tgagtataga	480
aattcatata ttcttcagcg tgccaatgca caatatggga acgtgatggg	gctgagatat	540
tacacagcta gcaatgcctg tcagattgca gcttttgatt caactttagc	tgaaaatgcc	600
cctaatggta ctcaacggtt tatttataat gggagactta aaagaccaat	ttctaatgtg	660
ttgatgaaaa ttgaggcggg tgctccaaac attagtactc caacaatact	acctgatcca	720
gcaaatcaga caacatggct atttaatcca gtacagataa tgaatggaac	atttactatt	780
gagttttata ataatgggca gttagttgat ttaattagaa atatgggagt	agttactgtt	840
agaacattcg atacgtacag aattacaatt gacatgatta gaccagcagc	catgacacag	900
tatgtacaaa gactgtttcc acagggtggc ccatatcaac atcaagccgc	atatatgata	960
actcttagta tattggatgc cacaacagaa tcagtcatgt gtgattcaca	ttcagtagat	1020
tattcaatcg tcgcaaatgt cagaagagac tcagcaatgc cagctggaac	agtatttcaa	1080
ccaggctttc catgggaaca gatattatcc aactacactg ttgctcagga	ggataattta	1140
gaaagacttt tgttagttgc gtctgtgaag agaatggtga tg		1182

<210> 62 <211> 394 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 67

- 63 034564 <400> 62

ASP 1

val

Leu Phe Ser He 5

Ala Lys Thr val 10

Ser Asp

Leu

Lys

Й⁵

Lys

val

Gly

Thr

He

Tyr

Thr

Asn

val

Glu

ASP

He

Ile

Gin

20

25

30

Thr

Asn

Glu

Leu

He

Arg

Thr

Leu

ASn

Gly

Asn

Thr

Phe

HIS

Thr

Gly

35

40

45

Gly

He 50

Gly

Thr

Gin

pro

Gin 55

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe 60

Gin

Leu

Pro

Gin

Leu 65

Gly

Thr

Leu

Leu 70

Asn

Leu

Asp

Asn 75

Tyr

val

Gin

Ala

Thr 80

Arg

Ser

Ile

He

Asp 85

Tyr

Leu

Thr

ser

Phe 90

He

Glu

Ala

val

8^s

ASp

Asp

Glu

Ile

val 100

Arg

Glu

Ala

Ser

Arg 105

ASn

Gly

Met

Gin

Pro 110

Gin

Ser

pro

Ala

Leu

He

Ala

Leu

Ser

Ala

LYS

Phe

Lys

Thr

Ile

ASn

Phe

115

120

125

Asn

Asn 130

ser

Ser

Gin

Ser

He 135

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala 140

Gin

ser

Arg

Glu 145

Asn

Pro

val

Tyr

Glu 150

Tyr

Lys

Asn

Pro

Met 155

val

Phe

Glu

туг

Arg 160

Asn

Ser

туг

He

Leu 165

Gin

Arg

Ala

Asn

Ala 170

Gin

туг

Gly

Asn

val 175

Met

Gly

Leu

Arg

Tyr 180

Tyr

Thr

Ala

Ser

Asn 185

Ala

cys

Gin

He

Ala 190

Ala

Phe

Asp

Ser

Thr

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala

Pro

Asn

Gly

Thr

Gin

Arg

Phe

Ile

195

200

205

Tyr

Asn 210

Gly

Arg

Leu

Lys

Arg 215

Pro

He

Ser

Asn

val 220

Leu

Met

Lys

He

Glu

Ala

Gly

Ala

Pro

Asn

He

ser

Thr

Pro

Thr

He

Leu

pro

Asp

pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

Asn

Pro

val

Gin

lie

Met

ASn

Gly

245

250

255

Thr

Phe

Thr

He

Glu

Phe

Tyr

Asn

Gly

Gin

Leu

val

Asp

Leu

He

- 64 034564

260

265

270

Ara Asn Met Gly Val Val Thr val Arg Thr Phe Asp Thr Tyr Arg lie 275 280285

Thr lie Asp Met lie Arg Pro Ala Ala Met Thr Gin Tyr val Gin Arg 290 295300

Leu Phe Pro Gin Gly Gly Pro Tyr Gin His Gin Ala Ala Tyr Met lie

305 310 315320

Thr Leu Ser lie Leu Asp Ala Thr Thr Glu ser Val Met Cys Asp Ser

325 330335

His Ser val Asp Tyr Ser lie val Ala Asn val Arg Arg Asp ser Ala

340 345350

Met Pro Ala Gly Thr val Phe Gin Pro Gly Phe Pro Trp Glu Gin lie 355 360365

Leu Ser Asn Tyr Thr val Ala Gin Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu 370 375380

Leu val Ala Ser Val Lys Arg Met Val Met 385390

390 <210> 63 <211> 1182 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> VP6 изолят 68 <400> 63 gatgtgctgt tctccattgc gaagactgtc tcagatctta agaagaaagt tgtagttggt60 actatttata caaatgtaga agatataatc caacagacta atgaattgat tagaactttg120 aatggcaaca cattccatac tggtggaatt ggaacacaac ctcagaaaga atggaatttt180 caactaccac agctaggtac aacacttttg aatttagatg ataactatgt tcaagcaact240 agaagtatca tcgattattt ggcctcattt atagaagctg tgtgtgatga cgaaattgtt300 agagaagcgt caagaaatgg aatgcaacct caatctcctg cacttatagc gttatcttca360 gcaaaattta agactattaa ttttaacaat agttcacaat ccattaagaa ttggagcgct420 cagtcaagac gtgaaaatcc agtgtatgaa tataaaaatc caatggtgtt tgagtataga480 aattcatata ttcttcagcg tgccaatgca caatatggga acgtaatggg gctgagatat540 tacacagcca gcaatgcctg tcagattgca gcttttgatt caactttagc tgaaaatgcc600 cctaatggca ctcaacggtt tatttataat ggaagactta aaagaccgat ttctaatgtg660 ttgatgaaaa tcgaggcggg tgctccaaac attagtaatc caacaatact acctgatcca720

- 65 034564

gcaaatcaga caacatggct gtttaatcca gtgcagataa tgaatggaac atttactatt	780
gagttttata ataatgggca gttagttgat ttgattagaa atatgggagt agttactgtt	840
agaacatttg atacgtacag aattacaatt gacatgatta gaccagcaac catgacacag	900
tatgtacaaa gactgtttcc acagggtggc ccatatcaac atcaagccgc atatatgata	960
actcttagta tattggatgc cacaacagaa tcagtcatgt gtgattcaca ttcagtagat	1020
tattcaatcg tcgcaaatgt cagaagagac tcagcaatgc cagctggaac agtatttcaa	1080
ccaggatttc catgggaaca gatattatcc aactacactg ttgctcagga ggataattta	1140
gaaagacttt tgttagttgc gtctgtgaag agaatggtga tg	1182

<210> 64 <211:> 394 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220:>

<223> VP6 изолят 68 <400> 64

ASp 1

val

Leu

Phe

Ser 5

lie Ala

Lys Thr

val 10

ser Asp Leu

Lys

if

Lys

val

Gly 20

Thr

lie

Tyr

Thr

Asn 25

val

Glu

Asp

lie

He 30

Gln

Thr

Asn

Glu

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe

His

Thr

Gly

35

40

45

Gly

He 50

Gly

Thr

Gln

Pro

Gln 55

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe 60

Gln

Leu

Pro

Gln

Leu

Gly

Thr

Leu

Asn

Leu

Asp

Asn

Tyr

val

Gln

Ala

Thr

65

70

75

80

Arg

Ser

He

Asp 85

туг

Leu

Ala

Ser

Phe 90

He

Glu

Ala

val

cys 95

ASp

Asp

Glu

He

val 100

Arg

Glu

Ala

ser

Asn

Gly

Met

Gln

Pro 110

Gln

Ser

pro

Ala

Leu

He

Ala

Leu

Ser

Ala

LyS

Phe

Lys

Thr

Ile

Asn

Phe

115

120

125

Asn

ASn 130

Ser

ser

Gln

Ser

He 135

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala 140

Gln

Ser

Arg

Glu

Asn

Pro

val

Tyr

Glu

Tyr

Lys

Asn

Pro

Met

val

Phe

Glu

Tyr

Arg

145

150

155

160

ASn

Ser

туг

He

Leu

Gln

Arg

Ala

Asn

Ala

Gln

туг

Gly

Asn

val

Met

- 66 034564

165

170

175

Gly Leu Arg Tyr Tyr Thr Ala Ser

180

Asn Ala cys Gin lie Ala Ala Phe 185 190

Asp ser Thr Leu Ala Glu Asn Ala

195 200

Pro Asn Gly Thr Gin Arg Phe lie

205

Tyr Asn Gly Arg Leu Lys Arg Pro 210 215 lie ser Asn val Leu Met Lys lie

220

Glu Ala Gly Ala Pro Asn lie ser

225 230

Asn Pro Thr lie Leu Pro Asp Pro

235 240

Ala Asn Gin Thr Thr Trp Leu Phe

245

Asn Pro Val Gin lie Met Asn Gly 250 255

Thr Phe Thr lie Glu Phe Tyr Asn

260

Asn Gly Gin Leu val Asp Leu lie 265 270

Arg Asn Met Gly val Val Thr val

275 280

Arg Thr Phe Asp Thr Tyr Arg lie

285

Thr lie Asp Met lie Arg Pro Ala

290 295

Thr Met Thr Gin Tyr val Gin Arg

300

Leu Phe pro Gin Gly Gly Pro Tyr

305 310

Gin His Gin Ala Ala Tyr Met lie

315 320

Thr Leu ser lie Leu Asp Ala Thr

325

Thr Glu ser val Met cys Asp ser 330 335

His Ser val Asp Tyr ser lie Val

340

Ala Asn val Arg Arg Asp Ser Ala

345 350

Met Pro Ala Gly Thr Val Phe Gin

355 360

Pro Gly Phe Pro Trp Glu Gin lie

365

Leu Ser Asn Tyr Thr val Ala Gin

370 375

Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu

380

Leu Val Ala Ser Val Lys Arg Met Val Met

385 390 <210> 65 <211> 1182 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 69 <400> 65

- 67 034564

gatgtgctgt tctccattgc gaagactgtc tcagatctta agaagaaagt	tgtagttggt	60
actatttata caaatgtaga agatataatc caacagacta atgaattgat	tagaactttg	120
aatggcaaca cattccatac tggtggaatt ggaacacaac ctcagaaaga	atggaatttt	180
caactaccac agctaggtac aacacttttg aatttagatg ataactatgt	tcaagcaact	240
agaagtatca tcgattattt ggcctcattt atagaagctg tgtgtgatga	cgaaattgtt	300
agagaagcgt caagaaatgg aatgcaacct caatctcctg cacttatagc	gttatcttca	360
gcaaaattta agactattaa ttttaacaat agttcacaat ccattaagaa	ttggagtgct	420
cagtcaagac gtgaaaatcc agtgtatgaa tataaaaatc caatggtgtt	tgagtataga	480
aattcatata ttcttcagcg tgccaatgca caatatggga acgtaatggg	gctgagatat	540
tacacagcca gcaatgcctg tcagattgca gcttttgatt caactttagc	tgaaaatgcc	600
cctaatggca ctcaacggtt tatttataat ggaagactta aaagaccaat	ttctaatgtg	660
ttgatgaaaa tcgaggcggg tgctccaaac attagtaatc caacaatact	acctgatcca	720
gcaaatcaga caacatggct atttaatcca gtgcagataa tgaatggaac	atttactatt	780
gagttttata ataatgggca gttagttgat ttgattagaa atatgggagt	agttactgtt	840
agaacatttg atacgtacag aattacaatt gacatgatta gaccagcaac	catgacacag	900
tatgtacaaa gactgtttcc acagggtggc ccatatcaac atcaagccgc	atatatgata	960
actcttagta tattggatgc cacaacagaa tcagtcatgt gtgattcaca	ttcagtagat	1020
tattcaatcg tcgcaaatgt cagaagagac tcagcaatgc cagctggaac	agtatttcaa	1080
ccaggatttc catgggaaca gatattatcc aactacactg ttgctcagga	ggataattta	1140
gaaagacttt tgttagttgc gtctgtgaag agaatggtga tg		1182

<210> 66 <211> 394 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 69 AA последовательность <400> 66

Asp 1

val

Leu

Phe

set 5

lie

Ala

Lys

Thr

val 10

Ser

Asp

Leu

Lys

iF

Lys

val

Val

val

Gly

Thr

lie

Tyr

Thr

Asn

val

Glu

Asp

Ile

lie

Gin

20

25

30

Thr

Asn

Glu 35

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe 45

His

Thr

Gly

lie 50

Gly

Thr

Gin

pro

Gin 55

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe 60

Gin

Leu

Pro

Gin

Leu

Gly

Thr

Leu

Asn

Leu

Asp

ASP

Asn

туг

Val

Gin

Ala

Thr

- 68 034564

70 75 80

Arg Ser lie lie

ASP Tyr 85

Leu Ala Ser Phe lie Glu Ala 90

val pro 110

$^S Asp

Asp

Glu lie

val 100

Arg

Glu

Ala ser

Arg 105

Asn

Gly

Met Gin

Gin

ser

pro

Ala

Leu

He

Ala

Leu

Ser

ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Thr

He

ASn

Phe

115

120

125

Asn

Asn 130

ser

Ser

Gin

Ser

lie 135

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala 140

Gin

Ser

Arg

Glu 145

Asn

pro

val

туг

Glu 150

Tyr

Lys

Asn

Pro

Met 155

val

Phe

Glu

Tyr

Arg 160

ASI1

Ser

туг

He

Leu 165

Gin

Arg

Ala

Asn

Ala 170

Gin

Tyr

Gly

Asn

val 175

Met

Gly

Leu

Arg

Tyr 180

Tyr

Thr

Ala

Ser

Asn 185

Ala

Cys

Gin

He

Ala 190

Ala

Phe

ASP

Ser

Thr

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala

Pro

ASn

Gly

Thr

Gin

Arg

Phe

He

195

200

205

Tyr

Asn

Gly

Arg

Leu

Lys

Arg

Pro

He

Ser

Asn

val

Leu

Met

Lys

He

210

215

220

G1U

Ala

Gly

Ala

Pro

ASn

lie

Ser

Asn

Pro

Thr

He

Leu

Pro

ASP

Pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

Asn

Pro

val

Gin

lie

Met

ASn

Gly

245

250

255

Thr

Phe

Thr

lie 260

Glu

Phe

Tyr

Asn

Asn 265

Gly

Gin

Leu

val

Asp 270

Leu

He

Arg

Asn

Met 275

Gly

val

Thr

val 280

Arg

Thr

Phe

Asp

Thr 285

туг

Arg

He

Thr

lie 290

ASp

Met

He

Arg

pro 295

Ala

Thr

Met

Thr

Gin 300

Tyr

val

Gin

Arg

Leu 305

Phe

pro

Gin

Gly

ax

Pro

туг

Gin

His

Gin 315

Ala

туг

Met

He 320

Thr

Leu

Ser

He

Leu

Asp

Ala

Thr

Glu

Ser

Val

Met

cys

Asp

ser

325

330

335

His

Ser

val

ASp

Tyr

Ser

lie

val

Ala

ASn

val

Arg

ASP

ser

Ala

- 69 034564

340

345

350

Met Pro Ala Gly Thr val Phe Gin Pro Gly Phe Pro Trp Glu Gin lie 355 360365

Leu Ser Asn Tyr Thr val Ala Gin Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu 370 375380

Leu Val Ala Ser Val Lys Arg Met Val Met 385390

390 <210:> 67 <211:> 1182 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 70 <400> 67 gatgtgctgt tctccattgc gaagactgtc tcagatctta agaagaaagt tgtagttggt60 actatttata caaatgtaga agatataatc caacagacta atgaattgat tagaactttg120 aatggcaaca cattccatac tggtggaatt gggacacaac ctcagaaaga atggaatttt180 caactaccac agctaggtac aacacttttg aatttagatg ataactatgt tcaagcaact240 agaagtatca tcgattattt ggcctcattt atagaagctg tgtgtgatga tgaaattgtt300 agagaagcgt caagaaatgg aatgcaacct caatctcctg cacttatagc gttatcttca360 gcaaaattta agactattaa ttttaacaat agttcacaat ccattaagaa ttggagtgct420 cagtcaagac gtgaaaatcc agtgtatgaa tataaaaatc caatggtgtt tgagtataga480 aattcatata ttcttcagcg tgccaatgca caatatggga atgtaatggg gctgagatat540 tatacagcca gtaatgcctg tcagattgca gcttttgatt caactttagc tgaaaatgcc600 cctaatggta ctcaacggtt tatttataat ggaagactta aaagaccaat ttctaatgtg660 ttgatgaaaa ttgaggcggg tgctccaaac attagtaatc taacaatact acctgatcca720 gcaaatcaga caacatggct atttaatcca gtacaaataa tgaatggaac atttactatt780 gagttttata ataatgggca gttagttgat ttgattagaa atatgggagt agttactgtt840 agaacatttg atacgtacag aatcacaatt gacatgatta gaccagcagc catgacacag900 tatgtacaaa gactgtttcc acagggtggc ccatatcaac atcaagccgc atatatgata960 actcttagta tattggatgc cacaacagaa tcagtcatgt gtgattcaca ttcagtagat1020 tattcaatcg tcgcaaatgt cagaagagac tcagcaatgc cagctggaac agtatttcaa1080 ccaggttttc catgggaaca gatattatcc aactacactg ttgctcagga ggataattta1140 gaaagacttt tgttagttgc gtctgtgaag agaatggtga tg1182 <210> 68 <211> 394 <212> Белок

- 70 034564 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 70 <400> 68

Asp val 1

Leu

Phe Ser lie 5

Ala Lys Thr

val 10

Ser

Asp

Leu Lys

if

Lys

val

Gly

Thr

lie

Tyr

Thr

Asn

val

Glu

Asp

He

Gin

20

25

30

Thr

Asn

Glu 35

Leu

He

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe 45

His

Thr

Gly

ile 50

Gly

Thr

Gin

Pro

Gin 55

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe 60

Gin

Leu

pro

Gin

Leu 65

Gly

Thr

Leu

Leu 70

Asn

Leu

Asp

Asn 75

Tyr

val

Gin

Ala

Thr 80

Arg

ser

lie

Asp

Tyr

Leu

Ala

Ser

Phe

Ile

Glu

Ala

val

cys

Asp

85

90

95

Asp

Glu

He

val

Arg

Glu

Ala

ser

Arg

Asn

Gly

Met

Gin

Pro

Gin

Ser

100

105

110

pro

Ala

Leu

He

Ala

Leu

Ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Thr

lie

Asn

Phe

115

120

125

Asn

ser

Ser

G1 n

ser

lie

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala

Gin

Ser

Arg

130

135

140

Glu

Asn

Pro

val

Tyr

Glu

Tyr

Lys

Asn

Pro

Met

val

Phe

Glu

туг

Arg

145

150

155

160

ASn

Ser

Tyr

He

Leu 165

Gin

Arg

Ala

Asn

Ala 170

Gin

туг

Gly

Asn

val 175

Met

Gly

Leu

Arg

туг Tyr

Thr

Ala

Ser

ASH

Ala

Cys

Gin

He

Ala

Phe

180

185

190

Asp

Ser

Thr 195

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala 200

Pro

Asn

Gly

Thr

Gin 205

Arg

Phe

He

Tyr

Asn

Gly

Arg

Leu

Lys

Arg

Pro

lie

Ser

Asn

val

Leu

Met

Lys

Ile

210

215

220

Glu

Ala

Gly

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

ASn

Leu

Thr

He

Leu

pro

Asp

pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

Asn

Pro

val

Gin

lie

Met

Asn

Gly

- 71 034564

245

250

255

Thr

Phe

Thr

He

Glu

Phe

туг

Asn

Gly

Gin

Leu

val

ASp

Leu

He

260

265

270

Arg

Asn

Met 275

Gly

val

Thr

val 280

Arg

Thr

Phe

Asp

Thr 285

Tyr

Arg

He

Thr

He 290

ASp

Met

lie

Arg

pro 295

Ala

Met

Thr

Gin 300

Tyr

val

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Gin

Gly

Pro

Tyr

Gin

His

Gin

Ala

Tyr

Met

lie

305

310

315

320

Thr

Leu

Ser

He

Leu 325

Asp

Ala

Thr

Glu 330

Ser

val

Met

cys

Ser

HIS

ser

val

Asp 340

туг

Ser

He

val

Ala 345

Asn

val

Arg

ASP 350

Ser

Ala

Met

Pro

Ala

Gly

Thr

val

Phe

Gin

Pro

Gly

Phe

pro

Trp

Glu

Gin

He

355

360

365

Leu Ser Asn Tyr Thr Val Ala Gin Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu 370 375 380

Leu val Ala Ser val Lys Arg Met val Met
385	390
<210>	69
<211>	1182
<212>	ДНК
<213>	искусственная последовательность

<220>

<223> VP6 изолят 71 <400> 69

gatgtgctgt tctccattgc gaaaactgtc tcagatctta agaagaaagt tgtagttggt	60
actatttata caaatgtaga agatataatc caacagacta atgaattaat tagaactttg	120
aatggcaaca cattccatac tggtggaatt ggaacacaac ctcagaaaga atggaatttt	180
caactaccac agctaggtac aacacttttg aatttagatg ataactatgt tcaagcaact	240
agaagtatca tcgattattt ggcctcattt atagaagctg tgtgtgatga cgaaattgtt	300
agagaagcgt caagaaatgg aatgcaacct caatctcctg cacttatagc gttatcttca	360
gcaaaattta agactattaa ttttaacaat agttcacaat ccattaagaa ttggagtgct	420
cagtcaagac gtgaaaatcc agtgtatgaa tataaaaatc caatggtgtt tgagtataga	480
aattcatata ttcttcagcg tgccaatgca caatatggga atgtaatggg gctgagatat	540
tacacagcca gtaatgcctg tcagattgca gcttttgatt caactttagc tgaaaatgcc	600

- 72 034564

cctaatggta	ctcaacggtt	tatttataat	ggaagactta	aaagaccaat	ttctaatgta	660
ttgatgaaaa	ttgaggcggg	tgctccaaac	attagtaatc	caacaatact	acctgatcca	720
gcaaatcaga	caacatggct	atttaatcca	gtacagataa	tgaatggaac	atttactatt	780
gagttttata	ataatgggca	gttagttgat	ttgattagaa	atatgggagt	agttactgtt	840
agaacatttg	atacgtacag	aattacaatt	gacatgatta	gaccagcagc	catgacgcag	900
tatgttcaaa	gactgtttcc	acagggtggc	ccatatcaac	atcaagccgc	atatatgata	960
actcttagta	tattggatgc	cacaacagaa	tcagtcatgt	gtgattcaca	ttcagtagat	1020
tattcaatcg	tcgcaaatgt	cagaagagac	tcagcaatgc	cagctggaac	agtatttcaa	1080
ccaggctttc	catgggaaca	gatattatcc	aactacactg	ttgctcagga	ggataattta	1140
gaaagacttt	tgttagttgc	gtctgtgaag	agaatggtga	tg		1182

<210> 70 <211:> 394 <212:> Белок <213:> искусственная последовательность <220>

<223> VP6 изолят 71 <400> 70

Asp 1

val

Leu

Phe Ser lie Ala Lys

Thr

val 10

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys 15

Lys

val

Gly

Thr

Ile

туг

Thr

Asn

val

Glu

Asp

He

Ile

Gin

20

25

30

Thr

ASn

Glu

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe

His

Thr

Gly

35

40

45

Gly

He 50

Gly

Thr

Gin

Pro

Gin 55

Lys

G1U

Trp

Asn

Phe 60

Gin

Leu

Pro

Gin

Leu

Gly

Thr

Leu

Asn

Leu

Asp

Asn

Tyr

val

Gin

Ala

Thr

65

70

75

80

Arg

Ser

lie

Ile

Asp 85

туг

Leu

Ala

Ser

Phe 90

He

Glu

Ala

Val

8^s

Asp

Glu

lie

val

Arg

Glu

Ala

Ser

Arg

Asn

Gly

Met

Gin

Pro

Gin

ser

100

105

110

Pro

Ala

Leu

Ile

Ala

Leu

Ser

ser

Ala

Lys

Phe

Lys

Thr

Ile

Asn

Phe

115

120

125

Asn

ser

Ser

Gin

ser

He

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala

Gin

Ser

Arg

130

135

140

Glu

Asn

Pro

Val

Tyr

Glu

Tyr

Lys

Asn

Pro

Met

val

Phe

Glu

туг

Arg

- 73 034564

145 150 155 160

Asn

Ser

Tyr

ile

Leu 165

Gin

Arg

Ala

Asn

Ala 170

Gin

Tyr

Gly

Asn

val 175

Met

Gly

Leu

Arg

Tyr

туг

Thr

Ala

Ser

Asn

Ala

cys

Gin

lie

Ala

Phe

180

185

190

Asp

Ser

Thr

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala

Pro

Asn

Gly

Thr

Gin

Arg

Phe

He

195

200

205

туг

Asn 210

Gly

Arg

Leu

Lys

Arg 215

Pro

lie

ser

Asn

val 220

Leu

Met

Lys

He

Glu

Ala

Gly

Ala

Pro

Asn

He

ser

Asn

Pro

Thr

He

Leu

Pro

Asp

Pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

Asn

Pro

val

Gin

lie

Met

Asn

Gly

245

250

255

Thr

Phe

Thr

He

Glu

Phe

Tyr

Asn

Gly

Gin

Leu

val

Asp

Leu

He

260

265

270

Arg

Asn

Met 275

Gly

val

Thr

val 280

Arg

Thr

Phe

Asp

Thr 285

Tyr

Arg

Ile

Thr

lie

Asp

Met

lie

Arg

pro

Ala

Met

Thr

Gin

Tyr

val

Gin

Arg

290

295

300

Leu

Phe

Pro

Gin

Gly

Pro

Tyr

Gin

His

Gin

Ala

туг

Met

Ile

305

310

315

320

Thr

Leu

Ser

lie

Leu 325

ASP

Ala

Thr

Glu 330

ser

val

Met

Cys

Ser

His

Ser

val

Asp 340

туг

Ser

He

val

Ala 345

Asn

val

Arg

Asp 350

Ser

Ala

Met

Pro

Ala

Gly

Thr

val

Phe

Gin

Pro

Gly

Phe

Pro

Trp

Glu

Gin

lie

355

360

365

Leu

Ser

Asn

Tyr

Thr

val

Ala

Gin

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Arg

Leu

370

375

380

Leu

val

Ala

Ser

val

Arg

Met

val

Met

<210> 71 <211> 1182 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 74 034564 <220>

<223> VP6 изолят 72 <400> 71

gatgtgctgt	tctccattgc	gaaaactgtc	tcagatctta	agaagaaagt	tgtagttggt	60
actatttata	caaatgtaga	agatataatc	caacagacta	atgaattaat	tagaactttg	120
aatggcaaca	cattccatac	tggtggaatt	ggaacacaac	ctcagaaaga	atggaatttt	180
caactaccac	agctaggtac	aacacttttg	aatttagatg	ataactatgt	tcaagcaact	240
agaagtatca	tcgattattt	ggcctcattt	atagaagctg	tgtgtgatga	cgaaattgtt	300
agagaagcgt	caagaaatgg	aatgcaacct	caatctcctg	cacttatagc	gttatcttca	360
gcaaaattta	agactattaa	ttttaacaat	agttcacaat	ccattaagaa	ttggagtgct	420
cagtcaagac	gtgaaaatcc	agtgtatgaa	tataaaaatc	caatggtgtt	tgagtataga	480
aattcatata	ttcttcagcg	tgccaatgca	caatatggga	atgtaatggg	gctgagatat	540
tacacagcca	gtaatgcctg	tcagattgca	gcttttgatt	caactttagc	tgaaaatgcc	600
cctaatggta	ctcaacggtt	tatttataat	ggaagactta	aaagaccaat	ttctaatgta	660
ttgatgaaaa	ttgaggcggg	tgctccaaac	attagtaatc	caacaatact	acctgatcca	720
gcaaatcaga	caacatggct	atttaatcca	gtacagataa	tgaatggaac	atttactatt	780
gagttttata	ataatgggca	gttagttgat	ttgattagaa	atatgggagt	agttactgtt	840
agaacatttg	atacgtacag	aattacaatt	gacatgatta	gaccagcagc	catgacgcag	900
tatgttcaaa	gactgtttcc	acagggtggc	ccatatcaac	atcaagccgc	atatatgata	960
actcttagta	tattggatgc	cacaacagaa	tcagtcatgt	gtgattcaca	ttcagtagat	1020
tattcaatcg	tcgcaaatgt	cagaagagac	tcagcaatgc	cagctggaac	agtatttcaa	1080
ccaggctttc	catgggaaca	gatattatcc	aactacactg	ttgctcagga	ggataattta	1140
gaaagacttt	tgttagttgc	gtctgtgaag	agaatggtga	tg		1182

<210> 72 <211:> 394 <212> Белок <213:> искусственная последовательность <220:>

<223:> VP6 изолят 72 <400> 72

Asp 1

val

Leu

Phe

Ser 5

He

Ala

Lys

Thr

val 10

Ser

Asp

Leu

Lys

Val

val

Gly

Thr

He

Tyr

Thr

Asn

val

Glu

Asp

He

Gin

20

25

30

Thr

Asn

Glu 35

Leu

He

Arg

Thr

Leu 40

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe 45

His

Thr

Gly

He

Gly

Thr

Gin

Pro

Gin

Lys

Glu

Trp

Asn

Phe

Gin

Leu

Pro

Gin

- 75 034564

55 60

Leu 65

Gly Thr

Thr

Leu Leu Asn Leu Asp Asp Asn

туг

val

Gin

Ala

Thr 80

70

75

Arg

Ser

He

ASp 85

Tyr

Leu

Ala

Ser

Phe 90

He

Glu

Ala

val

8^s

ASP

Asp

Glu

He

val 100

Arg

Glu

Ala

ser

Arg 105

ASn

Gly

Met

Gin

Pro 110

Gin

ser

pro

Ala

Leu

lie

Ala

Leu

ser

Ser

Ala

LyS

Phe

Lys

Thr

lie

ASn

Phe

115

120

125

Asn

Ser

Gin

Ser

lie

Lys

Asn

Trp

Ser

Ala

Gin

Ser

Arg

130

135

140

Glu

ASn

Pro

val

Tyr

Glu

Tyr

Lys

ASn

Pro

Met

val

Phe

Glu

туг

Arg

145

150

155

160

ASn

Ser

туг

lie

Leu

Gin

Arg

Ala

ASn

Ala

Gin

Tyr

Gly

Asn

val

Met

165

170

175

Gly

Leu

Arg

Tyr 180

Tyr

Thr

Ala

Ser

ASn 185

Ala

cys

Gin

lie

Ala 190

Ala

Phe

Asp

ser

Thr

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala

Pro

ASn

Gly

Thr

Gin

Arg

Phe

lie

195

200

205

Tyr

Asn

Gly

Arg

Leu

Lys

Arg

Pro

lie

Ser

Asn

Val

Leu

Met

Lys

He

210

215

220

G1U

Ala

Gly

Ala

pro

Asn

He

ser

Asn

pro

Thr

lie

Leu

Pro

ASp

pro

225

230

235

240

Ala

Asn

Gin

Thr

Trp

Leu

Phe

Asn

pro

val

Gin

lie

Met

Asn

Gly

245

250

255

Thr

Phe

Thr

lie 260

Glu

Phe

туг

Asn

Asn 265

Gly

Gin

Leu

val

Asp 270

Leu

He

Arg

Asn

Met 275

Gly

val

Thr

val 280

Arg

Thr

Phe

Asp

Thr 285

Tyr

Arg

He

Thr

lie 290

ASp

Met

He

Arg

Pro 295

Ala

Met

Thr

Gin 300

Tyr

Val

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Gin

Gly

Pro

туг

Gin

His

Gin

Ala

Tyr

Met

lie

305

310

315

320

Thr

Leu

Ser

He

Leu

Asp

Ala

Thr

Glu

Ser

Val

Met

Cys

ASp

Ser

- 76 034564

325

330

335

His Ser val Asp Tyr ser lie val Ala Asn val Arg Arg Asp Ser Ala

340 345 350

Met Pro Ala Gly Thr val Phe Gin Pro Gly Phe Pro Trp Glu Gin He 355 360 365

Leu ser Asn Tyr Thr Val Ala Gin Glu Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu 370 375 380

Leu val Ala ser val Lys Arg Met val Met 385 390

390 <210> 73 <211> 33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> KSN760 - обратный праймер VP4 <400> 73 cyttrmtyay yacttyatyh rmdttdattr dbc 33 <210> 74 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> KSN761 - прямой праймер VP4 <400> 74 atggcgtcct cactttatca gcarttraty tcac <210> 75 <211> 52 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> KSN762 - обратный праймер VP4 <400> 75 gtgcggccgc aagcttttac yttrmtyayy acttyatyhr mdttdattrd be 52 <210> 76 <211> 47 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> KSN763 - прямой праймер VP4 <400> 76 ggttccgcgt ggatccgcgt cctcacttta tcagcarttr atytcac <210> 77

- 77 034564 <211> 30 <212:> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223:> Праймер 1 для введения His Tag в pNPLl <400> 77 atgatgatgc atatgtatat ctccttctta 30 <210> 78 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Праймер 2 для введения His Tag в pNPLl <400> 78 catcatcatg gatccgaatt cgagctcc 28 <210> 79 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Rota C NSP4 прямой праймер для pNPl_3 <400> 79 tcatcatcat ggatccatca cctcaaaaac tg 32 <210> 80 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Rota C NSP4 обратный праймер для pNPL3 или pNPLl <400> 80 gtgcggccgc aagctttcat agacaaactt ccgtctc 37 <210> 81 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Rota C VP4 прямой праймер для pNPL3 <400> 81 tcatcatcat ggatccaggg cgtcctcact ttatc 35 <210> 82 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Rota C VP4 обратный праймер для pNPL3 или pNPLl <400> 82

- 78 034564 gtgcggccgc aagcttttat aacaccatca ttctc <210> 83 <211> 35 <212:> ДНК <213:> искусственная последовательность <220>

<223:> Rota C VP6 прямой праймер для pNPL3 <400> 83 tcatcatcat ggatccgacg tgctgttttc aattg 35 <210> 84 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Rota C VP6 обратный праймер для pNPl_3 или pNPLl <400> 84 gtgcggccgc aagcttctac atcaccattc tcttc <210> 85 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Rota C NSP4 прямой праймер для pNPLl <400> 85 aatgggtcgc ggatccatca cctcaaaaac tg 32 <210> 86 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Rota C VP4 прямой праймер для pNPLl <400> 86 aatgggtcgc ggatccaggg cgtcctcact ttatc <210> 87 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Rota C VP6 прямой праймер для pNPLl <400> 87 aatgggtcgc ggatccgacg tgctgttttc aattg 35 <210> 88 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 79 034564 <220>

<223> Rota С VP7 прямой праймер для pNPL3 <400> 88 tcatcatcat ggatccgttt gtgcaacatt g 31 <210:> 89 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220:>

<223> Rota C VP7 обратный праймер для pNPL3 или pNPLl <400> 89 gtgcggccgc aagcttttac gcgtatctta gcatc 35 <210:> 90 <211> 996 <212> ДНК <213:> Искусственная последовательность <220:>

<223> VP7 последовательность: полная ORF <220>

<221:> прочий признак <222> (781)..(781) <223> n - a, c, g, или t <400> 90

atggtttgtg	caacattgta	cactgtttgc	gttatactct	gcattctttt	tatatacact	60
ttactgttta	gaaaaatgtt	ccacctaatt	actgatacat	taatcataac	tttaataata	120
tctaactgta	ttggatggac	acatggtcaa	atgtttattg	atgacatgaa	ttataatgga	180
aacgttgaaa	tagtcattaa	cgctactgat	ccattcaatg	tagaatctct	atgtatatat	240
tttccaaatg	ctgttgtagg	atcacaagga	cctggtcaaa	cgaatggcca	tttaaatgat	300
ggaaattatg	ctcaaacaat	tgctacctta	tttgagacaa	aaggattccc	aaaaggctca	360
gtaacactta	aaacatacat	taaagcttca	gattttatta	gttcagtaga	gatgacttgt	420
tcgtataatg	tagttataat	acctgatgat	ccaaataagt	cagaggagat	tgaacaaata	480
gcagaatgga	ttctgaatgt	ttggagatgt	gatgatatgg	atttaactat	ttatacttac	540
gaacaaacag	gaatagataa	tttgtgggct	gcttttggtg	acgattgtga	tatatctgtt	600
tgtccactag	acactacaat	gcatggaatt	ggatgttcac	ctgcaagtac	agaaacatat	660
gaagtattat	caaataacac	gcaagtagcg	ttaattaatg	ttgtagataa	tgtaaaacac	720
agaattcaaa	tgaatactgg	tcattgtaag	ttaaagaatt	gtgtgaaagg	cgaagcaaga	780
ntaaatactg	caatagtaag	aatttcaaag	tcatcaagct	ttgataattc	attgtcacca	840
ttaaataatg	gtcaaactac	acgatcattt	aaaataaacg	ctaagaaatg	gtggacaata	900
ttttatacaa	taattgatta	cattaataca	attgtacaga	caatgactcc	tagacatagg	960
gccatttacc	cagaaggttg	gatgctaaga	tacgcg			996

- 80 034564 <210> 91 <211> 332 <212:> Белок <213> искусственная последовательность <22О>

<223> VP7 последовательность: полная ORF <22О>

<221> прочий признак <222> (261)..(261) <223> хаа - любая аминокислота <400> 91

Met 1

val

cys

Ala

Thr 5

Leu

Tyr

Thr

val

Cys 10

val

ile

Leu

cys

He 15

Leu

Phe

lie

Tyr

Thr 20

Leu

Phe

Arg

Met

Phe

His

Leu

He 30

Thr

Asp

Thr

Leu

He 35

ile

Thr

Leu

lie

Ile 40

Ser

Asn

Cys

Ile

Gly 45

Trp

Thr

His

Gly

Gin

Met

Phe

ile

Asp

Met

Asn

Tyr

ASH

Gly

ASn

Val

Glu

He

50

55

60

val

lie

Asn

Ala

Thr

Asp

Pro

Phe

Asn

val

G1U

Ser

Leu

Cys

He

туг

65

70

75

80

Phe

Pro

Asn

Ala

val 85

val

Gly

ser

Gin

Gly 90

Pro

Gly

Gin

Thr

Asn 95

Gly

His

Leu

Asn

Asp

Gly

Asn

Tyr

Ala

Gin

Thr

ile

Ala

Thr

L.eu

Phe

Glu

100

105

110

Thr

Lys

Gly 115

Phe

Pro

Lys

Gly

Ser 120

val

Thr

Leu

Lys

Thr 125

Tyr

He

Lys

Ala

Ser 130

Asp

Phe

Ile

Ser

Ser 135

val

Glu

Met

Thr

cys 140

Ser

туг

Asn

val

Ile

lie

Pro

ASP

Asp

Pro

ASn

LyS

Ser

Glu

He

Glu

Gin

He

145

150

155

160

Ala

Glu

Trp

lie

Leu 165

ASn

val

Trp

Arg

ASP

Asp

Met

Asp

Leu 175

Thr

Ile

Tyr

Thr

туг

Glu

Gin

Thr

Gly

lie

Asp

Asn

Leu

Trp

Ala

Phe

180

185

190

Gly

Asp

cys

Asp

ile

ser

val

Cys

Pro

Leu

Asp

Thr

Met

His

195

200

205

- 81 034564

Gly

lie 210

Gly

cys

ser

Pro

Ala 215

Ser

Thr

Glu

Thr

Й5

Glu

val

Leu

ser

ASn

Asn

Thr

Gin

val

Ala

Leu

Ile

Asn

val

Asp

Asn

val

Lys

His

225

230

235

240

Arg

He

Gin

Met

Asn 245

Thr

Gly

HIS

cys

Lys 250

Leu

Lys

Asn

cys

val 255

Lys

Gly

Glu

Ala

Arg

xaa

Asn

Thr

Ala

lie

val

Arg

Ile

Ser

Lys

ser

260

265

270

ser

Phe

Asp

ASH

ser

Leu

ser

pro

Leu

Asn

Gly

Gin

Thr

Arg

275

280

285

Ser

Phe

Lys

lie

Asn

Ala

Lys

Trp

Thr

lie

Phe

Tyr

Thr

He

290

295

300

lie 305

Asp

Tyr

lie

Asn

Thr 310

lie

val

Gin

Thr

Met 315

Thr

pro

Arg

His

£8

Ala

lie

Tyr

Pro

Glu

Gly

Trp

Met

Leu

Arg

Tyr

Ala

325

330

<210> 92 <211> 2208 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 полная ORF GenBank (M74218) <400> 92

atggcgtcct	cactttatca	gcagttaatt	tcacaaaatt	attattctat	tggaaacgaa	60
atattaacag	atcaacagac	aacagaaact	gtagtagatt	atgtagatgc	tggtaattat	120
acatacgcgc	aattaccacc	tactaaatgg	ggagcacgtg	ggacttttaa	gtctgcattt	180
aatgtatcaa	atataactgg	acctcatacg	aatacaataa	tagaatggag	taatttacta	240
aattctaacg	gatgggtcat	ttatcaaaaa	ccggccaata	ctacaaaatt	atttaaacat	300
ggaccagaaa	cttataacag	taacttggca	gcatttgaat	tatggtatgg	taaagctggt	360
acatcagtta	catcagacta	ttattcttca	ttacagaata	atgaaaaaac	tgtgacagct	420
acttcagatt	cattgatact	attttggaat	gaaggatcta	cagtgttagc	taataaaaag	480
gtaaatttta	gctgggacat	gggtggtatg	ttaataaaac	ctacgagagg	caatagagtg	540
gacatctgca	tggcaaacat	gaatgatttc	aatagtagca	tatttaattg	ggaagaatgg	600
aaacatgaat	ttccacgcag	tgatgttaat	ataaatgtta	atatgtatac	agattattat	660
cttgcgagtg	aagatcctta	tactgaactt	aaagcactac	agcaaccaaa	cattacaact	720
tttgagatga	aaatgatgaa	aataatccgt	aatgggtcaa	taaacttgaa	tgaagtagta	780

- 82 034564 agtaaagact cactatggca ggaggtaaga tatgctaggg atataacgtt agagtgtaag atagaatcag aagtagtcaa aggtggtgga tggggttatg actacacgag tgtagctttt.

aaaactgtta atcatacata cacgtatact cgagctggtg aaatagtaaa tgcacatgtt

840

900

960 accattagtt ttaataatat gaaagaacga tcatacgggg gttcattacc gactgatttc1020 aaaataggaa ggtttgatgt aattgatact gatacttata tgtatataga ttattgggac1080 gattcagaaa ttttcaaaaa tatggtgtat gtgcgtgatt taagtgctaa cattggtggt1140 ttcttttatt atgctgaaat gtcatattat tttcaaattc ctgtaggtgc acatccagga1200 ttacattcat caggagtaag atttgtatat gaaagatgtc ttttatcaca acaattcact1260 gaccaagttg cacttaactc tatgaggttc atatttagag tgacagaatc aaatggttgg1320 tttatgacat caggtaatat taatactaga cggatagcat caggaactgg atttgcatat1380 gcagacgggc atacttctca aacagttgga aatattactt tcatatcatt gatcccaagt1440 aatccaaatt atcagacacc aatagcatca tcaagcacag tcaggatgga tttagaaagg1500 aagataaatg atttacgtaa tgattttaat cagctagcta attcagtcgc attaggtgac1560 attctatctt tggcaacttc accactaact tttgctaatt tgcttgaatc agtgcctgct1620 atcgcttcat cagttaaaga tgttgcagct aatgtaatga aaaaatttag aaacactaaa1680 atgtttaaaa aagctacaaa agctaaatat agtgagttta ttattggaga tttgttggaa1740 gatgtaacga atgttgcacg aaattcaaat ggcatgaatt ttgatgacat tacatccgct1800 gtgatggtat caactactaa taaactacaa cttactgacg tagacacact ctcagagatt1860 gtcgctagat cagctgataa ttttatccct aacagatctt acagaatgat agaagacggt1920 attgtgtatg aagcaacacc aaaacgaact ttctcatacg atcttacaac attgcaacag1980 agggaatttg acatagataa gttcatgcga ttggcatcta aatcaccagt aatatctgca2040 atagtagatt ttgcaacatt aaaggctatg agagaaacat atggtgtagg aacggacgta2100 atatacaaat tagtagcctc agatgctcca acgatattat cattcatcga taacaacaat2160 ccgttgatta aaagtagaat tgaggaacta ttaagacaat gcagatta2208 <210> 93 <211> 736 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 полная ORF GenBank (M74218) <400> 93

Met Ala Ser ser Leu Tyr Gin Gin Leu lie ser Gin Asn Tyr Tyr Ser 15 10 15

He Gly Asn Glu lie Leu Thr Asp Gin Gin Thr Thr Glu Thr Val Val

Asp Tyr val Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Tyr Ala Gin Leu Pro Pro Thr

- 83 034564

45

Lys Trp Gly Ala Arg Gly Thr

55

Phe Lys ser Ala Phe Asn val Ser Asn 60 lie Thr Gly Pro His Thr Asn

70

Thr lie lie Glu Trp ser Asn Leu Leu

80

Asn Ser Asn Gly Trp val lie

Tyr Gin Lys Pro Ala Asn Thr Thr Lys 90 95

Leu Phe Lys His Gly Pro Glu

100

Thr Tyr Asn ser Asn Leu Ala Ala Phe 105 110

Glu Leu Trp Tyr Gly Lys Ala

Gly Thr ser val Thr ser Asp Tyr Tyr 120 125

Ser Ser Leu Gin Asn Asn Glu

130 135

Lys Thr val Thr Ala Thr Ser Asp Ser

140

Leu lie Leu Phe Trp Asn Glu

145 150

Gly ser Thr Val Leu Ala Asn Lys Lys

155 160

Val Asn Phe Ser Trp Asp Met

165

Gly Gly Met Leu Ile Lys Pro Thr Arg

170 175

Gly Asn Arg val Asp lie Cys

180

Met Ala Asn Met Asn Asp Phe Asn Ser 185 190

Ser lie Phe Asn Trp Glu Glu 195

Trp Lys His Glu Phe Pro Arg ser Asp 200 205

Val Asn He Asn val Asn Met

210 215

Tyr Thr Asp Tyr Tyr Leu Ala Ser Glu

220

Asp Pro Tyr Thr Glu Leu Lys

225 230

Ala Leu Gin Gin Pro Asn Ile Thr Thr

235 240

Phe Glu Met Lys Met Met Lys

245 ile Ile Arg Asn Gly Ser Ile Asn Leu

250 255

Asn Glu val val ser Lys Asp

260

Ser Leu Trp Gin Glu Val Arg Tyr Ala 265 270

Arg Asp lie Thr Leu Glu cys

275

Lys lie Glu ser Glu val val Lys Gly

280 285

Gly Gly Trp Gly Tyr Asp Tyr

290 295

Thr Ser Val Ala Phe Lys Thr Val Asn

300

His Thr Tyr Thr Tyr Thr Arg

Ala Gly Glu ile val Asn Ala His val

- 84 034564

315

320

305

310

Thr

He

ser

Phe

Asn 325

Asn

Met

Lys

Glu

»3

Ser

туг

Gly

Ser 335

Leu

pro

Thr

Asp

Phe 340

Lys

He

Gly

Arg

Phe 345

Asp

val

lie

Asp

Thr 350

ASp

Thr

туг

Met

Tyr 355

lie

ASp

Tyr

Trp

Asp 360

ASP

Ser

Glu

He

Phe 365

Lys

ASn

Met

val

Ио

val

Arg

ASp

Leu

Ser 375

Ala

ASn

He

Gly

Gly 380

Phe

туг

Ala

Glu

Met

Ser

туг

Tyr

Phe

Gin

He

Pro

val

Gly

Ala

His

Pro

Gly

385

390

395

400

Leu

HIS

Ser

Gly 405

val

Arg

Phe

val

туг 410

Glu

Arg

Cys

Leu

Leu 415

Ser

Gin

Phe

Thr

Asp

Gin

val

Ala

Leu

Asn

ser

Met

Arg

Phe

lie

Phe

420

425

430

Arg

val

Thr

Glu

Ser

Asn

Gly

Trp

Phe

Met

Thr

Ser

Gly

Asn

He

Asn

435

440

445

Thr

Arg 450

Arg

lie

Ala

Ser

Gly 455

Thr

Gly

Phe

Ala

Tyr 460

Ala

ASP

Gly

His

Thr

Ser

Gin

Thr

val

Gly

Asn

He

Thr

Phe

lie

ser

Leu

lie

Pro

ser

465

470

475

480

ASn

Pro

Asn

Tyr

Gin

Thr

pro

lie

Ala

Ser

Thr

val

Arg

Met

485

490

495

ASp

Leu

Glu

Arg 500

Lys

He

Asn

Asp

Leu 505

Arg

Asn

Asp

Phe

Asn 510

Gin

Leu

Ala

Asn

Ser

val

Ala

Leu

Gly

Asp

lie

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

515

520

525

Leu

Thr

Phe

Ala

Asn

Leu

Glu

Ser

Val

Pro

Ala

He

Ala

Ser

530

535

540

val 545

Lys

Asp

val

Ala

Ala 550

Asn

val

Met

Lys

Phe

Arg

ASn

Thr

Lys 560

Met

Phe

Lys

Ala 565

Thr

LyS

Ala

Lys

Tyr 570

Ser

Glu

Phe

He

He 575

Gly

Asp

Leu

Glu

Asp

val

Thr

ASn

val

Ala

Arg

Asn

Ser

ASn

Gly

Met

- 85 034564

580

585

590

ASH

Phe

Asp

He

Thr

Ser

Ala

val

Met

val

Ser

Thr

Asn

Lys

595

600

605

Leu

Gln

Leu

Thr

Asp

val

Asp

Thr

Leu

Ser

Glu

ile

val

Ala

Arg

ser

610

615

620

Ala 625

ASP

Asn

Phe

Ile

Pro 630

Asn

Arg

Ser

Tyr

Met

Ile

Glu

Asp

Gly 640

Ile

val

Tyr

Glu

Ala 645

Thr

Pro

Lys

Arg

Thr 650

Phe

ser

Tyr

Asp

Leu 655

Thr

Leu

Gln

Gln 660

Arg

Glu

Phe

ASp

He 665

Asp

Lys

Phe

Met

Arg 670

Leu

Ala

Ser

Lys

Ser 675

Pro

val

Ile

Ser

Ala 680

ile

val

Asp

Phe

Ala 685

Thr

Leu

Lys

Ala

Met 690

Arg

Glu

Thr

Tyr

Gly 695

Val

Gly

Thr

ASp

val 700

Ile

Tyr

Lys

Leu

val

Ala

Ser

ASp

Ala

Pro

Thr

ile

Leu

Ser

Phe

ile

Asp

Asn

705

710

715

720

Pro

Leu

lie

Lys

Ser

Arg

lie

Glu

Leu

Arg

Gln

Cys

Arg

Leu

725

730

735

<210> 94 <211> 2229 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Тройной слитый белок Rota С NSP4-VP4-VP6 <400> 94

atcacctcaa aaactgtgat tgaaagattt aaaactgaaa acaatactaa tgatcaaagc	60
ggtaatattc atgaagaata tgaagaggta atgaaacaaa tgcgtgagat gaaaattcat	120
ttgactgcgc tatttaataa tatacacaaa gataatatgg agtggaggat gagtgaatca	180
attcgcagag aaaagaaacg tgaaatgaaa gcgaatacag ccgagaatgt aattaaaaat	240
gatgtaaata atgttaacat atgtgatacg tcaggactgg agacggaagt ttgtctaagg	300
gcgtcctcac tttatcagca attaatctca caaaattatt attcaactgg taatgaaatt	360
ttgttggata gacagactac cagaaccact aaagattacg tagaagctgg aaattataca	420
tatgctcaat taccaccaac ggagtgggga gcagggtcaa cctttgaatc tacattcaaa	480
tcatcaaata taactggtcc acacaataac acagtcattg aatggagtaa tttaatgaat	540
tctgatattt ggttattgta tcaaaaacca ttggatataa ctgcaccaat cagattatta	600

- 86 034564 aaacatggac cggaaaatca tgctgatgta gcagcttttg aattatggta tggtaaagct 660 ggtcataccg tgacatcaat atattattca gcaatatcta atcctaataa tactgttacg 720 ttaacgtcgg attcattagt tctattttgg aacgaaggtc aaacgatact ggatacaaag 780 acagtcaatt ttaattggaa tatgggtggt atattagtta gaccgtcaag aggtacacgt 840 gtggacattt gtatgtctga tatggacaat acagatggta ctaattttaa ttggattcaa 900

tggaagcatg agttcccccg tagtagtagt aatgctaatg ttagtatgta tgttgaatat	960
tatctagcaa gtagtgatcc ataccatgaa ctcaaagagt tgcaaagacc agcagtaaca	1020
actataaata tgagaatgat ggtgttagac gtgctgtttt caattgcaaa gactgtttca	1080
gatctcaaga agaaagttgt agttggtact atttatacaa atgtagaaga tataattcaa	1140
cagactaacg aattgattag aactttaaat ggcaacacat tccatactgg tggaattgga	1200
acacaacctc aaaaagaatg gaactttcag ctaccacagc taggtacaac actcttgaat	1260
ttggatgata actatgttca agcaactaga agtattattg attacttagc ctcattcata	1320
gaagcagtgt gtgatgacga aattgttaga gaagcgtcaa gaaatggaat gcaacctcaa	1380
tcccctgcat ttatagcatt atcttcatca aaatttaaga ctattaattt taacaatagt	1440
tcgcaatcca ttaaaaattg gagtgctcaa tcaagacgtg agaatccagt ttatgaatac	1500
aaaaatccga tggtatttga atatagaaat tcgtacattc ttcagcgtgc taatgcacaa	1560
tttgggaacg taatgggact gagatattac acagccagca atgtctgtca gattgcagct	1620
tttgattcaa ctcttgctga aaatgctcct aatggcgctc aacggtttat ctataatgga	1680
agacttaaga gaccaatttc taatgtgttg atgaaaattg aagcaggcgc tccaaatatt	1740
aataatccaa caatactacc tgatccagca aaccaaacta catggttatt taatccagtg	1800
cagataatga atggaacgtt cactattgaa ttttacaaca atggacaatt ggtcgatttg	1860
attagaaata tgggagtggt tactgttaga acgtttgata catacagaat tacaattgat	1920
atgattagac cagcagccat gacacagtat gtacaaagac tgttcccaca aggtggccca	1980
tatcaacatc aagctgcata tatgatgaca cttagtatat tagatgctac aacagaatca	2040
gttatgtgcg attcacattc agtagactat tcaattgttg caaatgtcag aagagattca	2100
gcgatgccag ctggaacagt atttcagcca ggctttccat gggaacagac gttatccaac	2160
tacactgttg ctcaggaaga caatttagaa agacttttat tggttgcgtc tgtgaagaga	2220
atggtgatg	2229

<210> 95 <211> 743 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> тройной слитый белок Rota C NSP4-VP4-VP6 <400> 95 ile Thr ser Lys Thr val lie Glu Arg Phe Lys Thr Glu Asn Asn Thr

- 87 034564

1

5

10

15

ASn

ASP

Gin

Ser 20

Gly

Asn

He

His

Glu 25

Glu

Tyr

Glu

val 30

Met

Lys

Gin

Met

Arg

Glu

Met

Lys

lie

His

Leu

Thr

Ala

Leu

Phe

ASn

Asn

He

35

40

45

His

Lys 50

Asp

Asn

Met

Glu

Trp 55

Arg

Met

Ser

Glu

Ser 60

He

Arg

Glu

LYS 65

Lys

Arg

Glu

Met

Ala

Asn

Thr

Ala

Glu 75

ASn

val

lie

Lys

Asn 80

Asp

val

Asn

val

ASn

lie

cys

Asp

Thr

ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Glu

85

90

95

val

Cys

Leu

Arg 100

Ala

Ser

Leu

Tyr 105

Gin

Leu

He

ser 110

Gin

Asn

Tyr

туг

Ser 115

Thr

Gly

Asn

Glu

He 120

Leu

Asp

Arg

Gin 125

Thr

Arg

Thr

Thr 130

Lys

Asp

туг

val

Glu 135

Ala

Gly

Asn

Tyr

Thr 140

туг

Ala

Gin

Leu

Pro

Thr

Glu

Trp

Gly

Ala

Gly

Ser

Thr

Phe

Glu

ser

Thr

Phe

Lys

145

150

155

160

Ser

ser

Asn

He

Thr

Gly

Pro

His

Asn

Thr

val

lie

Glu

Trp

Ser

165

170

175

Asn

Leu

Met

Asn 180

ser

Asp

He

Trp

Leu 185

Leu

Tyr

Gin

Lys

pro 190

Leu

Asp

lie

Thr

Ala 195

pro

He

Arg

Leu

Leu 200

Lys

His

Gly

pro

Glu 205

Asn

His

Ala

Asp

val 210

Ala

Phe

Glu

Leu 215

Trp

Tyr

Gly

Lys

Ala 220

Gly

His

Thr

val

Thr

Ser

lie

Tyr

Ser

Ala

lie

Ser

Asn

Pro

ASn

Asn

Thr

val

Thr

225

230

235

240

Leu

Thr

ser

Asp

Ser 245

Leu

val

Leu

Phe

Trp 250

Asn

Glu

Gly

Gin

Thr 255

He

Leu

Asp

Thr

Lys

Thr

val

Asn

Phe

Asn

Trp

Asn

Met

Gly

He

Leu

260

265

270

val

Arg

Pro

ser

Arg

Gly

Thr

Arg

val

Asp

He

cys

Met

ser

ASP

Met

- 88 034564

280

285

275

ASp

Asn 290

Thr

Asp

Gly

Thr

Asn 295

Phe

Asn

Trp

He

Gin 300

Trp

Lys

His

Glu

Phe 305

Pro

Arg

Ser

Ser 310

Asn

Ala

ASn

val

Ser 315

Met

туг

val

Glu

Tyr

Leu

Ala

Ser

ser

ASP

Pro

Tyr

HIS

Glu

Leu

Lys

Glu

Leu

Gin

Arg

325

330

335

Pro

Ala

val

Thr

He

Asn

Met

Arg

Met

val

Leu

Asp

val

Leu

340

345

350

Phe

ser

He 355

Ala

Lys

Thr

val

ser 360

Asp

Leu

Lys

Lys 365

val

Val

Gly

Thr 370

He

Tyr

Thr

Asn

val 375

Glu

ASp

lie

He

Gin 380

Gin

Thr

Asn

Glu

Leu

He

Arg

Thr

Leu

Asn

Gly

Asn

Thr

Phe

His

Thr

Gly

He

Gly

385

390

395

400

Thr

Gin

Pro

Gin

Lys

Glu

Trp

ASn

Phe

Gin

Leu

pro

Gin

Leu

Gly

Thr

405

410

415

Thr

Leu

Asn

Leu

Asp

Asn

Tyr

val

Gin

Ala

Thr

Arg

Ser

He

420

425

430

lie

Asp

Tyr 435

Leu

Ala

Ser

Phe

He 440

Glu

Ala

Val

cys

Asp 445

ASp

Glu

lie

val

Arg

Glu

Ala

ser

Arg

Asn

Gly

Met

Gin

Pro

Gin

Ser

pro

Ala

Phe

450

455

460

He

Ala

Leu

Ser

Lys

Phe

Lys

Thr

He

Asn

Phe

ASn

Asn

ser

465

470

475

480

ser

Gin

ser

He

Lys 485

Asn

Trp

ser

Ala

Gin 490

ser

Arg

G1U

Asn 495

Pro

val

Tyr

Glu

Tyr 500

Lys

Asn

Pro

Met

val 505

Phe

Glu

Tyr

Arg

ASn 510

Ser

туг

He

Leu

Gin 515

Arg

Ala

Asn

Ala

Gin 520

Phe

Gly

Asn

val

Met 525

Gly

Leu

Arg

Tyr

Thr

Ala

Ser

Asn

val 535

Cys

Gin

lie

Ala

Ala 540

Phe

Asp

Ser

Thr

Leu

Ala

Glu

ASn

Ala

Pro

Asn

Gly

Ala

Gin

Arg

Phe

He

туг

Asn

Gly

- 89 034564

545 550 555 560

Arg Leu Lys Arg Pro 565 Ala Pro Asn lie Asn

He Asn

Ser Asn val

Leu Met Lys lie Glu 570

Ala Gly 575

Pro

Thr

He 585

Leu Pro

Asp

Pro

Ala 590

ASn

Gin

580

Thr

Trp

Leu

Phe

Asn

pro

val

Gin

lie

Met

Asn

Gly

Thr

Phe

Thr

595

600

605

He

Glu 610

Phe

Tyr

Asn

ASn

Gly 615

Gin

Leu

val

ASp

Leu 620

He

Arg

Asn

Met

$

val

Thr

val

Arg 630

Thr

Phe

Asp

Thr

Tyr 635

Arg

lie

Thr

lie

ASp 640

Met

lie

Arg

Pro

Ala

Met

Thr

Gin

Tyr 650

Val

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

645

655

Gin

Gly Gly

Pro 660

туг

Gin

HIS

Gin

Ala 665

Ala

Tyr

Met

Thr 670

Leu

ser

He

Leu

Asp

Ala

Thr

Glu

Ser

val

Met

Cys

Asp

ser

His

Ser

val

675

680

685

Asp

Tyr 690

Ser

lie

val

Ala

Asn 695

val

Arg

Asp

Ser 700

Ala

Met

Pro

Ala

Gly

Thr

val

Phe

Gin

Pro

Gly

Phe

Pro

Trp

G1U

Gin

Thr

L.eu

Ser

Asn

705

710

715

720

Tyr

Thr

Val

Ala

Gin

Glu

ASp

Asn

Leu

Glu

Arg

Leu

val

Ala

725

730

735

Ser val Lys Arg Met Val Met <210> 96 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> NSP4 прямой праймер <400> 96 aagtgaggac gcccttagac aaacttccgt ctcc 34 <210> 97 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP4 прямой праймер <400> 97 agggcgtcct cactttatc 19

<210>	98
<211:>	31
<212>	ДНК
<213>	искусственная	последовательность
<220>
<22 3>	VP4 обратный	праймер
<400>	98

tgaaaacagc acgtctaaca ccatcattct c 31 <210> 99 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VP6 прямой праймер <400> 99 gacgtgctgt tttcaattgc 20

Claims

1. Вакцинная композиция против ротавирусной инфекции, содержащая:

a) полипептиды ротавируса NSP4, VP4 и VP6 и

2. Композиция по п.1, в которой указанные ротавирусные полипептиды NSP4, VP4 и VP6 слиты в

- 90 034564 рекомбинантный тройной полипептид.

3. Композиция по п.2, в которой указанный рекомбинантный тройной полипептид представляет собой полипептид NSP4-VP4-VP6 ротавируса C.

4. Композиция по любому из пп.1-3, дополнительно содержащая адъювант.

5. Композиция по п.4, в которой адъювант представляет собой эмульсию типа масло в воде.

6. Композиция по любому из пп.2-5, в которой указанный рекомбинантный тройной полипептид имеет последовательность SEQ ID NO: 95.

7. Композиция по любому из пп.1-5, в которой полипептиды NSP4, VP4 и VP6 включают аминокислотные последовательности, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 для NSP4, SEQ ID NO: 41, 43, 45, 47, 49 для VP4, SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 для VP6.

8. Композиция по любому из пп.1-7, дополнительно содержащая по меньшей мере один антиген, ассоциированный с патогеном, отличным от ротавируса.

9. Композиция по п.8, в которой по меньшей мере один указанный антиген способен вызывать у свиней иммунный ответ, направленный против Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), цирковируса свиней 2 типа (PCV2), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вируса свиного гриппа (SIV) или другого патогена, способного заражать свиней.

10. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп.1-9, включающий следующие этапы:

(d) проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой и праймерами, комплементарными генам NSP4, VP4 и VP6;

11. Способ по п.10, в котором указанные дополнительные компоненты выбирают из адъювантов, ветеринарно приемлемых носителей, разбавителей и антигенов, ассоциированных с патогенами, отличными от ротавирусов.

12. Способ по п.11, в котором дополнительным компонентом является адьювант.

13. Способ по п.11, в котором указанные антигены способны вызывать у свиней иммунный ответ, направленный против Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), цирковируса свиней 2 типа (PCV2), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вируса свиного гриппа (SIV) или другого патогена, способного заражать свиней.

14. Способ вакцинации свиньи, включающий по меньшей мере однократное введение композиции по любому из пп.1-9.

15. Способ по п.14, в котором свинья является свиноматкой, которой осталось от около 3 до около 6 недель до опороса.

16. Способ по п.15, в котором среди поросят, рождающихся у указанной свиноматки, понижены смертность и/или заболеваемость по сравнению с поросятами невакцинированных свиноматок.