CN109321601B - Aqp5重组过表达载体及其构建方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途，所述重组载体通过将目的基因AQP5插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：5’末端反相重复序列，TBG启动子序列，MCS区，P2A序列，ZsGreen基因序列，3’末端反相重复序列。经过发明人深入的研究发现AQP5重组过表达载体可以缓解小鼠心衰症状，在心衰的小鼠体内注射携带有该基因的腺相关病毒，能够有效缓解小鼠的心力衰竭的症状。小鼠各项心功能以及其他指标均得到有效改善，说明本发明的技术方案适用于心衰疾病的治疗。

Description

AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途
技术领域
本发明涉及一种AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途，属于生物技术领域，特别涉及治疗心血管疾病的腺相关病毒载体的构建和对治疗效果的评估。
背景技术
1、腺相关病毒
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7～6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类(Dependovirus)，最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分，顾而得名。
AAV的生活周期有两种不同的胞内期。在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)感染时发生。辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。腺病毒(Ad)和单纯疱疹病毒(HSV)中与辅助功能有关的基因都已确定。腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a,E1b,E2a,E4和VARNA，但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物(DNA聚合酶和末端酶)。
2、AAV病毒的基因组结构和功能
人2型腺病毒伴随病毒(AAV-2)的基因组为4681个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kb mRNA，拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分别为87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例为1:1:10。没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。
3、AAV的临床应用
近年来，AAV载体在临床试验上的安全性和良好治疗效果使人们对AAV载体的研究和开发充满了信心。随着AAV载体的研究和开发不断深入，其在基因治疗中存在的免疫原性、靶向性不强和转导效率不高等问题，通过改造AAV外壳蛋白，利用药物制剂、生物材料等方法也得到了一定的解决。研究表明，AAV作为颇具前景的基因治疗载体在癌症、维化、糖尿病、癫痫等众多疾病中具有良好应用前景。
4、心力衰竭
心力衰竭(心衰)又称"心肌衰竭"，是指心脏当时不能搏出同静脉回流及身体组织代谢所需相称的血液供应。往往由各种疾病引起心肌收缩能力减弱，从而使心脏的血液输出量减少，不足以满足机体的需要，并由此产生一系列症状和体征。心衰是一种严重影响人们健康和寿命的疾病，本领域技术人员一直致力于开发能够有效治疗或预防心衰的技术。
现有技术中问题是缺少可以有效治疗心衰的手段和方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途，用于解决现有技术中心血管疾病，特别是心衰缺乏有效的治疗手段的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种AQP5重组过表达载体，所述AQP5重组载体通过将目的基因AQP5插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：
5’末端反相重复序列，TBG启动子序列，MCS区，P2A序列，ZsGreen基因序列，3’末端反相重复序列。
腺相关病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺相关病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。
AQP5基因在NCBI中的登录号为362。
本发明利用天然的腺相关病毒经过基因改造后获得一种转重组过表达载体。
所述的“操作性连接”或“可操作性连接”是指两个或者多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子区域可被“可操作性连接”到核酸序列上。
所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一些列功能性核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”序列是可以本发明中提供的，也包括他们的变体，只要这些元件上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或者删除一些碱基，或者随机或定点突变等来获得。
所述各个元件的上游及下游位置，还可包括限制性内切酶的酶切位点，这些位点有利于各个元件的有机连接。
进一步地，所述AQP5重组过表达载体序列如SEQ IDNO.1所示具体如下：
TGCTCACATGTCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGCGCTAGCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCGGCGCGCCAGGGCTGGAAGCTACCTTTGACATCATTTCCTCTGCGAATGCATGTATAATTTCTACAGAACCTATTAGAAAGGATCACCCAGCCTCTGCTTTTGTACAACTTTCCCTTAAAAAACTGCCAATTCCACTGCTGTTTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGCTGCCTCTTGGTGCTTTTGCCTATGGCCCCTATTCTGCCTGCTGAAGACACTCTTGCCAGCATGGACTTAAACCCCTCCAGCTCTGACAATCCTCTTTCTCTTTTGTTTTACATGAAGGGTCTGGCAGCCAAAGCAATCACTCAAAGTTCAAACCTTATCATTTTTTGCTTTGTTCCTCTTGGCCTTGGTTTTGTACATCAGCTTTGAAAATACCATCCCAGGGTTAATGCTGGGGTTAATTTATAACTAAGAGTGCTCTAGTTTTGCAATACAGGACATGCTATAAAAATGGAAAGATGTTGCTTTCTGAGAGACAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGAAGAAGGAGGTGTGCTCCGTGGCCTTCCTCAAGGCCGTGTTCGCAGAGTTCTTGGCCACCCTCATCTTCGTCTTCTTTGGCCTGGGCTCGGCCCTCAAGTGGCCGTCGGCGCTGCCTACCATCCTGCAGATCGCGCTGGCGTTTGGCCTGGCCATAGGCACGCTGGCCCAGGCCCTGGGACCCGTGAGCGGCGGCCACATCAACCCCGCCATCACCCTGGCCCTCTTGGTGGGCAACCAGATCTCGCTGCTCCGGGCTTTCTTCTACGTGGCGGCCCAGCTGGTGGGCGCCATTGCCGGGGCTGGCATCCTCTACGGTGTGGCACCGCTCAATGCCCGGGGCAATCTGGCCGTCAACGCGCTCAACAACAACACAACGCAGGGCCAGGCCATGGTGGTGGAGCTGATTCTGACCTTCCAGCTGGCACTCTGCATCTTCGCCTCCACTGACTCCCGCCGCACCAGCCCTGTGGGCTCCCCAGCCCTGTCCATTGGCCTGTCTGTCACCCTGGGCCACCTTGTCGGAATCTACTTCACTGGCTGCTCCATGAACCCAGCCCGCTCTTTTGGCCCTGCGGTGGTCATGAATCGGTTCAGCCCCGCTCACTGGGTTTTCTGGGTAGGGCCCATCGTGGGGGCGGTCCTGGCTGCCATCCTTTACTTCTACCTGCTCTTCCCCAACTCCCTGAGCCTGAGTGAGCGTGTGGCCATCATCAAAGGCACGTATGAGCCTGACGAGGACTGGGAGGAGCAGCGGGAAGAGCGGAAGAAGACCATGGAGCTGACCACCCGCCTCGAGGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGGCCTATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTGAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCCGCCTTGCCCTAAACGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTAATTGTTAACAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
进一步地，所述5’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第12～141位所示；
进一步地，所述TBG启动子序列如SEQ ID NO.1中第156～1173位所示；
进一步地，所述基因AQP5序列如SEQ ID NO.1中第1204～1998位所示；
进一步地，所述P2A启动子序列如SEQ ID NO.1中第2005～2061位所示；
进一步地，所述ZsGreen基因序列如SEQ ID NO.1中第2062～2757位所示；
进一步地，所述3’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第3902～4042位所示。
本发明的另外一个方面提供了上述AQP5重组过表达载体用于制备心衰治疗药物的用途。
本发明的另外一个方面提供了一种细胞，所述细胞内含有上述AQP5重组过表达载体。
本发明的另外一个方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中包括如上所述的AQP5重组过表达载体和药学上可接受的载体，或者如权利要求4所述的细胞和药学上可接受的载体/辅料。
本发明的另外一个方面提供了上AQP5重组过表达载体的构建方法，所述制备方法至少包括以下步骤：
(1)构建腺相关病毒穿梭质粒；
(2)腺相关病毒包装。
进一步的，上述方法中采用正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反相引物的序列如SEQID NO.3所示。
其中SEQ ID NO.2：ATGAAGAAGGAGGTGTGCTCCGT
SEQ ID NO.3：GCGGGTGGTCAGCTCCATGGTCTTC
如上所述，本发明的AQP5过表达腺相关病毒载体及其构建方法和用途，具有以下有益效果：
使用本发明的技术方案所包装的腺相关病毒，可以有效降低心衰造成的心肌细胞体积增大约30％，降低心衰造成的心肌纤维化约40％，说明本发明的技术方案特别适用于生产可治疗心衰的相关药物。
附图说明
图1为实施例1中使用的载体结构示意图。
图2为AQP5重组载体结构示意图。
图3为实施例1中步骤3制备的AQP5片段凝胶图谱(Lane 1：DNA Marker，Lane 2：AQP5
PCR回收)。
图4显示为实施例1中步骤6获得的AQP5单克隆鉴定PCR产物凝胶图。(其中Lane1：
DNAMarker，Lane 2-5：AQP5阳性单克隆鉴定。)
图5为TAC组和sham组心肌细胞横截面积统计结果图。
图6为TAC组和sham组心肌细胞纤维化比例统计结果图。
图7显示为实施例2中获得标准曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
表1本实验相关仪器
Figure GDA0001870567190000071
Figure GDA0001870567190000081
实施例1腺相关病毒载体构建及转化
1、pHBAAV-TBG-MCS-P2A-zsgreen载体(结构如图1)用EcoRI、MluI酶切，酶切体系如下：40μl酶切体系：37度2小时左右
Figure GDA0001870567190000082
2、载体酶切完成后回收。
3、AQP5片段PCR回收
PCR扩增AQP5序列，体系(50μl)如下表，其中正向引物的序列如SEQ IDNO.2所示，反相引物的序列如SEQ ID NO.3所示。
表2
Figure GDA0001870567190000083
Figure GDA0001870567190000091
PCR程序：表3
Figure GDA0001870567190000092
将获得后的目的片段利用凝胶电泳，其中PCR产物如图3所示。可见目的片段条带清晰。
4、处理好的目的片段与载体连接反应体系(20μl)：
表4
Figure GDA0001870567190000093
以上反应体系置于50℃在温浴20min，反应完成之后如不能马上进行后续操作可将反应样品暂存储于-20℃，详细操作请参考汉恒HB-infusionTM无缝克隆试剂盒说明书。
5、转化(感受态细胞:stbl3)。
抗性:Amp，37℃，培养过夜
6、转化后的AQP5平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。
单克隆PCR鉴定结果：其中产物的凝胶电泳图如图4所示，结果获得AQP5过表达载体测序结果如SEQIDNO.1所示。构建后的AQP5重组载体结构示意图如图2所示。
实施例2病毒包装
1、腺相关载体、包装细胞和菌株
病毒包装系统：三质粒系统，pAAV-RC，pHelper，pHBAAV-m-AQP5-GFP。
包装细胞株：AAV-293细胞，由汉恒生物公司长期保存，培养条件为DMEM+10％FBS，37℃，5％CO2，相对湿度95％。
菌株：大肠杆菌菌株Stbl3，用于扩增腺相关载体和辅助包装载体质粒。
2、实验原理和步骤
制备腺相关病毒梭质粒及其辅助包装载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提(质粒大量抽提步骤见附录部分)，共转染AAV-293细胞，转染后6h更换为完全培养基，72h后，收集富含腺相关病毒颗粒的AAV-293细胞，反复冻融裂解细胞后，收集含病毒颗粒的上清液，利用全能核酸酶处理和柱纯化方法，得到高滴度的纯化腺相关病毒颗粒。
3、滴度检测原理、方法
在PCR扩增过程中，掺入荧光染料，通过染料发出的荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
本实验中采用SYBRGreenⅠ法来检测AAV基因组含量，从而测定AAV滴度。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而游离的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。
4、滴度检测结果
4.1原始实验数据。Roche LC96实时荧光定量PCR仪所测Ct值数据如下：
表5
Figure GDA0001870567190000101
4.2标准曲线制作。以每组AAV标准品的Ct(average)为纵坐标Y，其对应的拷贝数的对数为横坐标X，做标准曲线，如图7，得出标准曲线的函数公式及R平方值。
4.3待测样品滴度计算。将待测AAV样品ct均值，代入4.2所得公式，计算所加入AAV模板拷贝数X，再换算成滴度。换算算公式为：AAV病毒滴度＝10x×40000(稀释倍数)v.g./mL测定结果：
HBAAV2/9-m-AQP5-GFP滴度＝107.48×40000＝1.2×1012v.g./mL
对照病毒HBAAV2/9-TBG-GFP滴度＝107.55×40000＝1.4×1012v.g./mL
5、实验结论
腺相关病毒滴度测定为1.2×1012v.g./mL，达到动物实验要求。
实施例3高表达AQP5的腺相关病毒注射心衰模型鼠改善小鼠心衰症状
1、实验材料
C57BL/6小鼠(该质粒可购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)。
2、实验方法
2.1小鼠心衰造模
取24只小鼠，其中12只小鼠取右胸前外切口开胸,暴露升主动脉,在主动脉上方1cm处，用缩窄环对升主动脉进行缩窄，4周后即可造成小鼠心衰，另12只小鼠作为假手术组(Sham)仅开胸但是不做主动脉缩窄手术。
2.2取上步骤中12只心衰模型手术小鼠和12只假手术对照小鼠，尾静脉分别注射实施例1制备的重组腺病毒AAV-NTCP和对照腺相关病毒AAV-GFP(不表达AQP5蛋白，仅表达GFP绿色荧光蛋白)，每组6只，具体分组见下表。采用5号针头注射器，每只小鼠注射1x1011v.g的腺相关病毒。注射病毒之后1个月取小鼠心脏检测心肌细胞横截面面积和纤维化面积。结果显示小鼠行主动脉狭窄手术后心肌横截面积增加2.5倍以上，心肌纤维化比例增加3.5倍以上，而注射AAV-NTCP病毒可以将上述两个指标降低40％和50％。
表6
小鼠模型 AAV-GFP AAV-NTCP
假手术(Sham) 6 6
心衰手术(TAC) 6 6
3、实验结果
AAV-NTCP实验组可以显著改善心衰造成的心肌肥大和心肌纤维化。
图5中，Sham实验组为假手术组，TAC实验组为主动脉弓狭窄组。从图中可以看出，在Sham实验组中，心肌肥大症状改善不明显。而在TAC实验组中，与对照组相比，施用本发明的重组腺相关病毒的实验组，心肌细胞横截面积降低了约30％，显示了心肌肥大症状有了及其显著的改善。
图6中，Sham实验组为假手术组，T AC实验组为主动脉弓狭窄组。从图中可以看出，在Sham实验组中，心肌纤维化症状改善不明显。而在TAC实验组中，与对照组相比，施用本发明的重组腺相关病毒的实验组，心肌纤维化程度降低了约40％，显示了心肌纤维化症状有了及其显著的改善。
实验表明通过腺相关病毒高表达AQP5能够有效缓解小鼠的心力衰竭的症状。小鼠各项心功能以及其他指标均得到有效改善，说明本发明的技术方案适用于心衰疾病的治疗。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 汉恒生物科技（上海）有限公司
<120> AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctcacatg tcctgcaggc agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgcgctag caggttaatt tttaaaaagc 180
agtcaaaagt ccaagtggcc cttggcagca tttactctct ctgtttgctc tggttaataa 240
tctcaggagc acaaacattc cagatccagg ttaattttta aaaagcagtc aaaagtccaa 300
gtggcccttg gcagcattta ctctctctgt ttgctctggt taataatctc aggagcacaa 360
acattccaga tccggcgcgc cagggctgga agctaccttt gacatcattt cctctgcgaa 420
tgcatgtata atttctacag aacctattag aaaggatcac ccagcctctg cttttgtaca 480
actttccctt aaaaaactgc caattccact gctgtttggc ccaatagtga gaactttttc 540
ctgctgcctc ttggtgcttt tgcctatggc ccctattctg cctgctgaag acactcttgc 600
cagcatggac ttaaacccct ccagctctga caatcctctt tctcttttgt tttacatgaa 660
gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaag ttcaaacctt atcatttttt gctttgttcc 720
tcttggcctt ggttttgtac atcagctttg aaaataccat cccagggtta atgctggggt 780
taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga catgctataa aaatggaaag 840
atgttgcttt ctgagagaca gctttattgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc 900
agtcagtgct tctgacacaa cagtctcgaa cttaagctgc agaagttggt cgtgaggcac 960
tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga aactgggctt 1020
gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta ctgacatcca 1080
ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt aaggctagag 1140
tacttaatac gactcactat aggctagcct cgaagaggat ctatttccgg tgaattcgcc 1200
accatgaaga aggaggtgtg ctccgtggcc ttcctcaagg ccgtgttcgc agagttcttg 1260
gccaccctca tcttcgtctt ctttggcctg ggctcggccc tcaagtggcc gtcggcgctg 1320
cctaccatcc tgcagatcgc gctggcgttt ggcctggcca taggcacgct ggcccaggcc 1380
ctgggacccg tgagcggcgg ccacatcaac cccgccatca ccctggccct cttggtgggc 1440
aaccagatct cgctgctccg ggctttcttc tacgtggcgg cccagctggt gggcgccatt 1500
gccggggctg gcatcctcta cggtgtggca ccgctcaatg cccggggcaa tctggccgtc 1560
aacgcgctca acaacaacac aacgcagggc caggccatgg tggtggagct gattctgacc 1620
ttccagctgg cactctgcat cttcgcctcc actgactccc gccgcaccag ccctgtgggc 1680
tccccagccc tgtccattgg cctgtctgtc accctgggcc accttgtcgg aatctacttc 1740
actggctgct ccatgaaccc agcccgctct tttggccctg cggtggtcat gaatcggttc 1800
agccccgctc actgggtttt ctgggtaggg cccatcgtgg gggcggtcct ggctgccatc 1860
ctttacttct acctgctctt ccccaactcc ctgagcctga gtgagcgtgt ggccatcatc 1920
aaaggcacgt atgagcctga cgaggactgg gaggagcagc gggaagagcg gaagaagacc 1980
atggagctga ccacccgcct cgaggcaaca aacttctcac tactcaaaca agcaggtgac 2040
gtggaggaga atcccgggcc tatggcccag tccaagcacg gcctgaccaa ggagatgacc 2100
atgaagtacc gcatggaggg ctgcgtggac ggccacaagt tcgtgatcac cggcgagggc 2160
atcggctacc ccttcaaggg caagcaggcc atcaacctgt gcgtggtgga gggcggcccc 2220
ttgcccttcg ccgaggacat cttgtccgcc gccttcatgt acggcaaccg cgtgttcacc 2280
gagtaccccc aggacatcgt cgactacttc aagaactcct gccccgccgg ctacacctgg 2340
gaccgctcct tcctgttcga ggacggcgcc gtgtgcatct gcaacgccga catcaccgtg 2400
agcgtggagg agaactgcat gtaccacgag tccaagttct acggcgtgaa cttccccgcc 2460
gacggccccg tgatgaagaa gatgaccgac aactgggagc cctcctgcga gaagatcatc 2520
cccgtgccca agcagggcat cttgaagggc gacgtgagca tgtacctgct gctgaaggac 2580
ggtggccgct tgcgctgcca gttcgacacc gtgtacaagg ccaagtccgt gccccgcaag 2640
atgcccgact ggcacttcat ccagcacaag ctgacccgcg aggaccgcag cgacgccaag 2700
aaccagaagt ggcacctgac cgagcacgcc atcgcctccg gctccgcctt gccctaaacg 2760
cgtctggaac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 2820
ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 2880
tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 2940
tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 3000
aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 3060
ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 3120
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 3180
atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 3240
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 3300
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 3360
tggaattaat tgttaacaga tctacgggtg gcatccctgt gacccctccc cagtgcctct 3420
cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa aattaagttg 3480
catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg gggtggaggg gggtggtatg 3540
gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc ggggtctatt gggaaccaag 3600
ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc gcctcctggg ttcaagcgat 3660
tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca tgcatgacca ggctcagcta 3720
atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg gccaggctgg tctccaactc 3780
ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg ctgggattac aggcgtgaac 3840
cactgctccc ttccctgtcc ttctgatttt gtaggtaacc acgtgcggac cgagcggccg 3900
caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 3960
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 4020
cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 4080
ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa 4140
gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 4200
ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 4260
ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 4320
aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 4380
gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 4440
cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 4500
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 4560
cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 4620
agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 4680
ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 4740
catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg 4800
tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 4860
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 4920
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 4980
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 5040
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 5100
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 5160
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 5220
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 5280
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 5340
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 5400
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 5460
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 5520
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 5580
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 5640
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 5700
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 5760
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 5820
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 5880
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 5940
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 6000
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 6060
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 6120
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 6180
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 6240
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 6300
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 6360
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 6420
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 6480
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 6540
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 6600
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt 6639
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagaagg aggtgtgctc cgt 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgggtggtc agctccatgg tcttc 25

Claims (1)

1.AQP5重组过表达载体在制备治疗心衰药物中的用途，所述AQP5重组载体是通过将目的基因AQP5插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：
5’末端反相重复序列，TBG启动子序列，MCS区，P2A序列，ZsGreen基因序列，3’末端反相重复序列；
所述AQP5重组过表达载体序列如SEQ ID NO.1所示，
所述5’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第12～141位所示；
所述TBG启动子序列如SEQ ID NO.1中第156～1173位所示；
所述基因AQP5序列如SEQ ID NO.1中第1204～1998位所示；
所述P2A启动子序列如SEQ ID NO.1中第2005～2061位所示；
所述ZsGreen基因序列如SEQ ID NO.1中第2062～2757位所示；
所述3’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第3902～4042位所示。
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CN104877971A (zh) * 2015-06-02 2015-09-02 汉恒生物科技（上海）有限公司 一种可以缓解小鼠心衰症状的携带mg53基因的腺相关病毒载体

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AQP5重组腺病毒载体构建及其临床作用;王梁等;《浙江医学》;20101231;第32卷(第9期);摘要、第1372页右栏第1段至第1374页左栏第1段 *
王梁等.AQP5重组腺病毒载体构建及其临床作用.《浙江医学》.2010,第32卷(第9期),摘要、第1372页右栏第1段至第1374页左栏第1段. *

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