CN104560854B - 缺失phoP的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了缺失phoP的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该减毒菌株的分类命名为Pasteurella multocida subsp.multocida str pm0818 ΔphoP，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2014522，保藏时间为2014年10月29日。本发明还提供了制备该减毒菌株的方法，该方法基于自杀质粒介导的同源重组方法将phoP基因敲除掉，得到了该减毒菌株，该减毒菌株的毒性较低，可用于预防禽霍乱的活疫苗研究。本发明还公布了该减毒菌株在疫苗上的应用。

Description

缺失phoP的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及缺失phoP的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株及其构建方法和应用。

背景技术

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）能够引起多种动物患病的革兰氏阴性短杆菌。人在被猫狗抓伤也可见感染该菌病例。多杀性巴氏杆菌在世界范围内广泛流行，可经呼吸道或口腔等方式感染多种动物，给养殖业和畜牧业造成重大经济损失，其引起的疾病统称为巴氏杆菌病，被世界卫生组织定为一类重要动物传染病。

多杀性巴氏杆菌在我国呈广泛流行。该菌感染家禽引起的禽霍乱在广大农村鸡鸭中时有发生，引起以出血性败血症为特征的急性经过，1至3天便可死亡，且在南方各地常年流行，在我国禽类养殖中造成的损失仅次于新城疫。胡东良等对我国116株禽源多杀性巴氏杆菌进行了血清型的分析研究，表明引起我国禽巴氏杆菌的主要血清型是A:1型。另外分离自猪不同部位的猪源性巴氏杆菌，其血清型有差异，唐先春等对分离自猪的鼻拭子或肺脏的66株多杀性多杀巴氏杆菌进行了血清型鉴定，D组多杀性巴氏杆菌占69.7%，A组占27.3%。苑士祥等对采集至1985～1990年间我国不同地区的130株猪源巴氏杆菌进行了血清型分型鉴定，结果表明存在猪鼻腔的菌株型是D:3型，而存在于肺脏中的菌株型为A:1和D:3型。我国牛源多杀性巴氏杆菌主要存在的是B组。

多杀性巴氏杆菌具有抗原多样性和宿主广泛性的特点，给疫苗研究带来了一定的困难。现已发现一部分毒力因子。该菌最重要的毒力因子包括荚膜，脂多糖（LPS）。荚膜对细菌而言其作用主要包括粘附作用、阻止宿主的吞噬作用、抗溶菌酶、抗干燥等。荚膜的有无对多杀性巴氏杆菌的毒力有明显影响，有研究表明，荚膜普遍存在于多杀性巴氏杆菌的强毒株中，而弱毒株一般都没有。脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁最外层的由多糖和脂质 A 组成的物质，是革兰氏阴性菌表面的主要物质及内毒素的物质基础。LPS 在多杀性巴氏杆菌致病过程中起有重要作用，对嗜中性粒细胞的黏附作用起辅助作用。同时，Harper 等通过构建waaQPM 基因的突变株，使得脂多糖的结构被破坏，菌株毒力明显减弱。

一系列其他的毒力因子也被鉴定出来，包括：毒素、粘附素、铁调蛋白，外膜蛋白等。由 toxA 基因编码的一个不耐热蛋白是目前研究最多的多杀性巴氏杆菌毒素，该毒素能抑制成骨细胞的分化和骨骼的形成，引起猪萎缩性鼻炎。菌毛是多杀性巴氏杆菌的一类重要的表面黏附因子，进一步研究表明，黏附过程中起主要作用的是Ⅳ菌毛，该菌毛最初分离于 A、B、D 型多杀性巴氏杆菌。细菌铁摄取系统相关蛋白是巴氏杆菌的毒力因子之一，细菌对铁及其他游离金属物质的摄取是一套复杂的机制，有研究证明，如与铁摄取相关的蛋白 ExbB、ExbD、TonB 等是巴氏杆菌毒力所必需的。

目前，已有部分疫苗用于防治禽霍乱。1）弱毒活疫苗：例如，将分离自禽类无毒性的多杀性巴氏杆菌经过冷冻干燥处理做成的活疫苗得到商品化生产用于防治鸡群和火鸡禽霍乱疫病（Choleramune^®M,Multimune^®m,或M-Ninevax^®-C）。2）灭活疫苗: 例如包括血清型A:1、A:3和A:4的禽多杀性巴氏杆菌三价油乳灭活疫苗（Landavax^®）用于预防多种家禽中禽霍乱的爆发。国内也有灭活疫苗研究，如禽霍乱与大肠杆菌病蜂胶二联灭活疫苗、禽霍乱和新城疫二联油乳剂灭活疫苗等等。3）亚单位疫苗：主要是选择相关毒力因子作为免疫原。有研究表明外膜蛋白Oma87，OmpH，OmpA以及粘附蛋白Cp39能引起部分血清型的多杀性巴氏杆菌在小鼠模型或自然宿主鸡模型中的免疫保护反应。但到目前为止，只有脂蛋白PlpE才能同时在小鼠和鸡模型中提供保护效应。另外，脂多糖是多杀性巴氏杆菌主要的毒力因子和免疫原，但是在16种LPS血清型中，LPS的结构和对致病性的影响不尽相同，使其作为疫苗开发的候选靶点变得困难。以上这些疫苗都有明显的缺陷：如缺乏稳定性和安全性，弱毒苗存在毒力返强的风险；免疫途径多为注射，生产成本相对较高，需添加佐剂成分或经特殊工艺处理；覆盖毒株不全，不能达到很好的预防效果。

因此，随着对多杀性巴氏杆菌遗传学、生物化学和毒力研究的广泛深入，开发新型基因缺失疫苗成为继弱毒苗、灭活苗、亚单位疫苗之后的优先选择。这些基因缺失疫苗具有许多先天的优势：可同时激发宿主产生良好的体液免疫应答，细胞免疫应答及粘膜免疫反应，免疫保护效果好；靶基因明确，毒力不返强，安全性高；可作为递送载体递呈异源抗原防治其它疾病。在牛源巴氏杆菌中，已有将其减毒株作为递呈疫苗的可行性进行了研究；成本低廉，不需要佐剂成分便可达到较好效果。

基于沙门氏菌等其它细菌的基础性研究表明，phoP基因是细菌十分重要的一个全局调控基因，它们的生物学功能十分广泛。PhoP（由phoP基因编码合成，转录调控因子）和位于膜上的PhoQ蛋白（一种组氨酸蛋白激酶）构成双组分调节系统，参与一系列生物学过程，包括调控毒力基因的表达；增强细菌对多种限制性生长环境，如低Mg²⁺、低酸、氧化物、金属离子、盐的的适应能力；激活广谱抗生素的耐药性，增强细菌的免疫逃避能力等等。部分细菌中，phoP基因缺失菌株表现出了良好的活疫苗应用潜力。例如在鼠伤寒沙门氏菌中的研究结果显示，伤寒沙门氏菌phoP/phoQ缺失株的毒力显著降低，且十分安全，口服免疫小鼠后能引起较好的免疫应答反应。而在多杀性巴氏杆菌中涉及全局调控基因phoP研究尚未见报道，现有技术尚未将其纳入已知或潜在的毒力相关基因，更没有报道通过对phoP改造是否可以获得减毒菌株。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株，该减毒菌株缺失了phoP基因，所述phoP基因片段的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示；所述减毒菌株的分类命名为Pasteurella multocida subsp.multocida str pm0818 ΔphoP，保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2014522，保藏时间为2014年10月29日。

所述减毒菌株中的phoP基因由kan抗性基因所替代。

所述kan抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明通过敲除phoP基因得到了禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株，发现了phoP基因在构建减毒菌株的应用。任何利用其它常规方法敲除phoP基因并获得禽多杀性巴氏杆菌的方法，均没有背离本发明的保护范围和精神，仍属本发明的保护范畴。

本发明的第二个目的是提供一种禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株的构建方法，该方法包括如下步骤：

1）重组自杀质粒pRE112-ΔphoP∷kan的构建；

2）将步骤1）所得重组自杀质粒转化入到c7213大肠杆菌中；

3）以含有重组自杀质粒pRE112-ΔphoP∷kan的c7213菌株为供体菌，Pasteurella multocida 0818株为受体菌进行接合转移；

4）通过PCR筛选得到缺失phoP基因的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株。

所述重组自杀质粒pRE112-ΔphoP∷kan的构建，包括如下步骤：

1）phoP基因的左右同源臂的引物设计：

Dp-1F:TGCCAGTTTTCAATGGTGTC

Dp-1R:CCTGCAGGGATGCGGCCGCTTTTTTGACCGCACTTTTTTC

Dp-2F:GCGGCCGCATCCCTGCAGGGCTAGGAAAAAATGATGAAATG

Dp-2R:ATTTTCCTTGATTGACTGGC

2）以多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818基因组为模板，分别对phoP基因的左右臂进行PCR扩增，回收产物用引物Dp-1F和Dp-2R进行扩增，得到左右同源臂融合片段；

3）用AhdI酶切质粒pRE112载体，回收纯化酶切产物，连接pRE112大片段与同源臂融合片段，连接产物转化入c7232感受态细胞；

4）将步骤3）所得c7232大肠杆菌摇菌培养至对数期，进行质粒抽提，得到重组质粒pRE112-ΔphoP；

5）kan抗性基因的引物设计

kan-F:ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGAACGAAAACTC

kan-R:CCTGCAGGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC

以pYA3342质粒DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增产物回收后用NotⅠ和SbfⅠ进行双酶酶切，再与经NotⅠ和SbfⅠ双酶酶切处理的pRE112-ΔphoP连接，得到重组自杀质粒pRE112-ΔphoP::kan。

在构建重组自杀质粒pRE112-ΔphoP::kan时，在步骤2）和5）中，对phoP基因上下臂以及kan抗性基因进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：于50μL反应体系中进行，具体反应体系为：模板DNA 1μL，25mmol/L MgCl₂ 0.5μL，reaction buffer 10μL ，10μmol/L 上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，DNA polymerase 0.75μL，ddH₂O 34.75μL；具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共循环30次，循环后于72℃延伸10min。

在构建禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株时，在步骤3）中，接合转移的步骤为：用LB液体培养液培养供体菌和脑心浸液培养液分别培养供体菌和受体菌过夜，各取200μL混合均匀后收集菌体，用10mM MgSO₄清洗两遍，用0.45μm滤膜过滤菌液，取下滤膜贴于含有50μg/mL的DAP（二氨基庚二酸）的脑心浸液琼脂平板，30℃培养10h；用5mL 10mM MgSO₄洗下滤膜上的菌体。

在构建禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株时，在步骤4）中，PCR筛选的步骤为：

1）以基因内引物

F:TTAATTGGCAATGGCTTACAG

R:TACCCTACACCATGCACAGT

初步鉴定突变株；

2）疑似菌落再用引物

F：TATTACACACGTTATAACCCG

R：CAATATTTTCACCTGAATCAG

和引物

F：CATTTGTGCAACTTCAGTTTG

R：CTGATTCAGGTGAAAATATTG

进一步鉴定。

本发明的第三个目的在于提供禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株在疫苗上的应用。

本发明的有益效果如下：

1、本发明通过敲除禽多杀性巴氏杆菌中的phoP基因，成功构建了缺失phoP基因的禽多杀巴氏杆菌减毒菌株；

2、本发明构建的减毒菌株可应用于疫苗研制。

附图说明

图1克隆禽多杀性巴氏杆菌潜在的phoP基因的电泳图谱，其中M代表DNA Marker；

图2是本发明中应用的相关的质粒载体图谱为A: pYA3332，B：pYA3337，C:pRE112；

图3是异源互补实验功能鉴定禽多杀性巴氏杆菌phoP基因；其中纵坐标表示菌株在多粘菌素B处理下的存活率，横坐标表示不同菌株，具体为：

UK-1Δasd：鼠伤寒沙门氏菌UK-1缺失asd基因所得，营养缺陷菌株，作为野生型对照；

UK-1ΔasdΔphoP：野生型缺失phoP基因所得；

ST-3332-p1：UK-1ΔasdΔphoP中包含连有Pm 0818 phoP1基因的质粒pYA3332-phoP1；

ST-3337-p1：UK-1ΔasdΔphoP中包含连有Pm 0818 phoP1基因的质粒pYA3337-phoP1；

ST-3332-p2：UK-1ΔasdΔphoP中包含连有Pm 0818 phoP2基因的质粒pYA3332-phoP2；

ST-3337-p2：UK-1ΔasdΔphoP中包含连有Pm 0818 phoP2基因的质粒pYA3337-phoP2

将潜在的P.multocida 0818 株phoP1、phoP2基因引入鼠伤寒沙门氏菌phoP基因缺失株，phoP2基因能恢复沙门氏菌phoP基因缺失株对多粘菌数B的抗性作用，图中UK-1 Δasd株和ST-3332-p2、ST-3337-p2株的存活率经统计学分析均无明显差异（p>0.05）；

图4是自杀质粒介导的同源重组构建突变株示意图；wide type: P.multocida 0818野生型；phoP mutant：利用同源重组的方法将卡那霉素基因盒kan（两侧引入酶切位点NotⅠ和SbfⅠ）置换P.multocida 0818 phoP全基因；

图5是禽多杀性巴氏杆菌phoP基因缺失株PCR鉴定电泳图谱；各标记含义为：widetype: 以野生型多杀性巴氏杆菌基因组为模板所得电泳图谱，作为对照；phoP mutant：以phoP基因缺失株基因组为模板所得电泳图谱；各泳道所用引物不同，具体为：1：Op-F/Inkan-R；2：Op-R/Inkan-F；3：Dp-1F/ Inkan-R；4: Dp-4R/ Inkan-F；5: inphoP-F/inphoP-R ；6: 巴氏杆菌保守基因扩增；

图6是禽多杀性巴氏杆菌亲本株与野生株生长特性对比；WT：禽多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818野生型；ΔphoP: P.multocida 0818 phoP基因缺失株；

图7是禽多杀性巴氏杆菌亲本株与野生株脂多糖特征对比；泳道1：P.multocida0818脂多糖银染图谱；泳道2：P.multocida 0818 ΔphoP银染图谱；

图8禽多杀性巴氏杆菌亲本株与野生株外膜蛋白特征对比；其中，M：Pierceunstained protein MW marker(Thermo)；1: 禽多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818野生型外膜蛋白SDS-PAGE图谱；2：禽多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818 ΔphoP株外膜蛋白SDS-PAGE图谱；

图9是免疫禽多杀性巴氏杆菌phoP基因缺失株后抗体水平变化；其中，A：血清IgY抗体水平检测；**：p<0.01，***：p<0.001；B：胆汁IgA抗体水平检测。**：p<0.01。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1多杀性巴氏杆菌phoP基因的功能鉴定

1、引物设计（用于功能鉴定）

根据生物信息学分析，将鼠伤寒沙门氏菌UK-1株PhoP蛋白氨基酸序列比对公开发表的禽多杀性巴氏杆菌Pm 70全基因组序列获得两段潜在的多杀性巴氏杆菌phoP基因序列，分别命名为phoP1和phoP2。phoP1的核苷酸序列如 SEQ ID No.5所示；phoP2的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示。

根据序列SEQ ID No.5,和序列SEQ ID No.1，分别设计引物（phoP1-F/phoP1-R和phoP2-F/phoP2-R，见表1），以禽多杀性巴氏杆菌强毒株Pasteurlla multocida 0818基因组为模板，分别扩增潜在的phoP1和phoP2基因，并在产物两端分别引入了NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点。引物由北京六合华大有限公司合成。

2、多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818潜在phoP基因的克隆

模板的制备：将保存的鸭源多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818接种于脑心浸液琼脂（BD公司，50g脑心浸液培养基，15g琼脂粉，蒸馏水定溶至1000mL，121℃高压20min）培养基上，37℃培养过夜，挑去单菌落接种于脑心浸液培养液中，37℃、180r/min振荡培养16h。收集适量菌体，按细菌基因组提取试剂盒（购于北京天根公司）说明书提取基因组为PCR模板。

PCR反应体系与条件：phoP1和phoP2基因的克隆均在50μL反应体系中进行，DNA聚合酶购自NEB公司，具体反应体系为：模板DNA 1μL，25mmol/L MgCl₂ 0.5μL，buffer 10μL ，10μmol/L 上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，DNA polymerase 0.75μL，ddH₂O 34.75μL。具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共循环30次。循环后72℃延伸10min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析后，由DNA纯化回收试剂盒（购于北京天根公司）纯化PCR产物。

3、异源互补质粒的构建

选用低拷贝质粒pYA3332和pYA3337作为异源互补载体，质粒图谱见图2。将上步纯化的PCR产物和质粒pYA3332、pYA3337分别用NcoⅠ、BamHⅠ（购于NEB公司）双酶切，酶切体系按说明书进行，酶切后的产物经回收纯化后，分别用phoP1和phoP2酶切产物连接pYA3332、pYA3337酶切产物（连接试剂盒购于大连宝生物公司），转化大肠杆菌c6212感受态细胞。转化后的细菌涂布于固体LB平板，37℃培养16h后用引物phoP1-F/R或phoP2-F/R经菌落PCR鉴定阳性菌落。挑取阳性菌落于LB液体培养基中扩大培养，抽提质粒送北京华大公司测序，以确定构建成功异源互补质粒pYA3332-p1、pYA3332-p2、 pYA3337-p1和 pYA3337-p2。

4、异源功能互补鉴定多杀性巴氏杆菌phoP基因（多粘菌素B抗性实验）

在鼠伤寒沙门氏菌中，对于phoP基因的相关研究较为深入，其背景较为清晰，因此选用鼠伤寒沙门氏菌UK-1株异源鉴定多杀性巴氏杆菌的phoP基因。鼠伤寒沙门氏菌对多粘菌素B的抗性作用由phoP基因的调控，缺失phoP基因的沙门氏菌对多粘菌素B的抗性显著降低。

将构建好的异源互补质粒电转化入鼠伤寒沙门氏菌UK-1 ΔasdΔphoP株（该菌株由本实验室构建保存），鼠伤寒沙门氏菌UK-1 ΔasdΔphoP株在asd基因缺失条件下使沙门氏菌成为一种营养缺陷菌株，与携带asd基因的外来质粒pYA332、pYA3337形成平衡致死系统，便于质粒保存。含有互补质粒的菌株分别命名为ST-3332-P1，ST-3332-P2， ST-3337-P1和ST-3337-P2。

为验证各组菌对多粘菌素B的抗性能力，分别接UK-1Δasd、UK-1 ΔasdΔphoP、ST-3332-P1、ST-3332-P2、 ST-3337-P1和ST-3337-P2单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃静置过夜，测量600nm下光密度值，用LB液体稀释菌液至10⁶CFU/mL。各组细菌分别取1mL菌液分为实验组和对照组。实验组加入10μL多粘菌素B（10μg/mL），然后将对照组和实验组置于37℃培养箱静置1h，然后稀释适宜倍数后涂于LB平板计数，将各组菌的实验组菌落数除以对照组菌落数，得到该菌在多粘菌素B存在的情况下的存活情况。

根据实验结果，多杀性巴氏杆菌phoP2基因能恢复鼠伤寒沙门氏菌phoP突变株对多粘菌素B的抗性，因此phoP2基因为多杀性巴氏杆菌真正的phoP基因。

实施例2 多杀性巴氏杆菌phoP基因缺失株的构建

1、引物设计（用于突变株的构建和鉴定）

根据实施例1中结果，参考禽多杀性巴氏杆菌Pm 70全基因组序列，设计2对引物（Dp-1F/Dp-1R，Dp-2F/Dp-2R）从禽多杀性巴氏杆菌Pm 0818中分别扩增phoP基因的上下游片段：up-phoP(上臂)和down-phoP（下臂），扩增片段大小分别为402bp和435bp，上臂的末端和下臂的前端包含18bp相同的重复序列，便于上下同源臂的融合。设计一对引物（kan-F/kan-R）从pYA4372质粒DNA扩增卡那霉素基因片段（kan）。设计三对引物用于突变株的鉴定，一对位于phoP基因内部（inphoP-F/inphoP-R），一对位于同源臂外侧（Op-F/Op-R），一对位于卡那霉素基因内部（Inkan-F/ Inkan-R）。以上引物见表2。

2、多杀性巴氏杆菌同源臂up-phoP、down-phoP和kan片段的克隆

以制备的禽多杀性巴氏杆菌Pm 0818基因组为模板，分别用用引物Dp-1F/Dp-1R、Dp-2F/Dp-2R克隆上下同源臂片段up-phoP和down-phoP。以抽提的pYA4372质粒DNA为模板，用引物kan-F/kan-R克隆kan片段。

PCR反应体系为：50μL反应体系中进行，具体反应体系为：模板DNA 1μL，25mmol/LMgCl₂ 0.5μL，buffer 10μL ，10μmol/L 上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，DNApolymerase 0.75μL，ddH₂O 34.75μL。具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共循环30次。循环后72℃延伸10min。扩增的产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析后，由DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物。

3、重组自杀质粒的构建

融合片段的构建：以混合的上下同源臂up-phoP和down-phoP为模板，用引物Dp-1F/Dp-2R扩增融合片段。PCR反应体系为：50μL反应体系中进行，具体反应体系为：模板DNA1μL，25mmol/L MgCl₂ 0.5μL，buffer 10μL ，10μmol/L 上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs1μL，DNA polymerase 0.75μL，ddH₂O 34.75μL。具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共循环30次；循环后72℃延伸10min。扩增的产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析后，由DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物。

自杀质粒pRE112-ΔphoP的构建：用AhdⅠ酶切质粒pRE112载体，回收纯化酶切产物，连接pRE112大片段与同源臂融合片段。连接产物转化c7232感受态细胞，涂于终浓度为25μg/mL氯霉素抗性的LB固体平板，37℃培养16h，PCR鉴定阳性菌落。挑取阳性菌落到LB液体培养基，37℃、200r/min培养过夜，小量抽提质粒pRE112-ΔphoP。

重组自杀质粒pRE112-ΔphoP::kan的构建：用NotⅠ和SbfⅠ分别双酶切pRE112-ΔphoP质粒和卡那霉素基因片段kan，纯化回收酶切产物。用连接试剂盒连接pRE112-ΔphoP和kan酶切回收产物，连接产物转化c7232感受态细胞，涂于含氯霉素（12.5μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB平板，37℃培养16h，PCR鉴定阳性菌落。挑取鉴定成功的阳性菌落到LB液体培养基扩大培养，37℃、200r/min培养过夜，小量抽提质粒pRE112-ΔphoP::kan，送至北京华大公司测序。

4、禽多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818 phoP基因缺失株的构建

突变株构建策略如附图4。将构建成功的重组自杀质粒pRE112-ΔphoP::kan转化入c7213感受态细胞。以含有该重组自杀质粒的c7213菌株为供体菌，P.multocida 0818株为受体菌进行接合转移。接合转移步骤如下：用LB液体培养基培养供体菌和脑心浸液培养基培养受体菌过夜，各取200μL混合均匀后收集菌体，用10mM MgSO₄清洗两遍，用0.45μm滤膜过滤菌液，取下滤膜贴于脑心浸液琼脂平板（添加DAP：50μg/mL），37℃培养10h。用5mL10mM MgSO₄洗下滤膜上的菌体。吸取适量菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的BHI琼脂平板，37℃培养20h，用基因内引物inphoP-F/inphoP-R 菌落PCR初步鉴定突变株，疑似菌落再用引物Op-F/Inkan-R和Op-R/Inkan-F进一步鉴定。鉴定结果如附图5所示。

实施例3. 禽多杀性巴氏杆菌P.multocia 0818 ΔphoP基因缺失株的生物学特性研究

1、基因缺失株生化特性鉴定

将基因缺失株分别接入葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、甘露醇等生化管验证碳源代谢能力，并进行H₂S试验、MR试验及VP试验观察其生化反应特性。

实验结果显示：Pasteurella multocida 0818 ΔphoP及其亲本株均能利用葡萄糖、甘露醇和蔗糖；不能利用乳糖、鼠李糖及麦芽糖。H₂S试验、MR试验及VP试验均为阴性。

2、基因缺失株的生长特性测定

将野生株、基因缺失株菌液接种于脑心浸液培养基，摇匀后分装于多支试管，将这一时间设置为0。然后，置于空气浴恒温振荡器上振荡培养。分别在0、2、4、6、8、10、12、14h时任取一管）测定OD₆₀₀值。最后，以光密度值为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制细菌生长曲线。

实验结果显示：phoP基因缺失后，不会影响禽多杀性巴氏杆菌的生长特性。

3、基因缺失株的表型特征鉴定

我们将对突变株和野生株的外膜蛋白和脂多糖进行对比观察，它们是多杀性巴氏杆菌重要的免疫原或毒力因子。

外膜蛋白的提取与SDS-PAGE观察：将突变株和野生株接种于BHI培养液中，37℃振荡培养过夜。第二天以1:100的比例将培养液稀释至新鲜的10ml BHI培养液中，37℃ 180r/min振荡培养至OD600≈1，6000r/min离心收集菌体；用2mL 10mM HEPES buffer在冰上重悬沉淀；用超声破碎仪裂解细胞，将细胞液转移至微量离心管；于4℃ 14,600×g离心30min，弃上清收集沉淀，并用0.2mL预冷的HEPES buffer重悬；加入0.2mL 2% Sarkosyl buffer，然后在室温下微量振荡仪上轻柔的振荡30min；于4℃ 15,600×g离心30min，弃上清；用0.5mL HEPES buffer轻轻的清洗沉淀表面一次（不要重悬）；于4℃ 15,600×g离心5min，弃上清；用50-100μL HEPES buffer将沉淀重悬，保存于-20℃。取10μL样品上样，SDS-PAGE观察。

脂多糖的提取和银染观察：提取小量LPS用于银染观察，具体步骤为：取过夜培养的突变株和野生株菌液各2-3mL，1,2000×g离心1min ，收集菌体；用PBS或超纯水洗菌体2到3次；取150μL裂解Buffer（1mL 0.5 M Tris-cl PH=6.8，0.8mL甘油，1.6mL 10% SDS，0.4mL β-巯基乙醇，4.2mL超纯水），混匀菌体后用沸水煮10min；样品冷却至室温，于1,2000×g ，4℃离心10min ；取上清液10μL加入到90μL上样Buffer中（1mL 0.5 M Tris-cl PH=6.8，0.8mL甘油，0.005g溴酚蓝，6.2mL超纯水），加入1μL蛋白酶K，37℃消化1h。进行SDS-PAGE电泳，银染观察。

实施例4 禽多杀性巴氏杆菌phoP基因缺失株疫苗评价

1、禽多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818ΔphoP株的毒力测定

为测定构建的基因缺失株P.multocida 0818ΔphoP对鸭的毒力，分别采用口服和滴鼻的方式比较基因缺失株和亲本株对鸭的毒力变化。一周龄四川麻鸭数只被采用进行口服途径攻毒，二周龄四川麻鸭数子被选用做滴鼻攻毒实验。实验动物购自商品化的孵化场，一日龄雏鸭饲养一周适应环境后，做口服途径攻毒，二周龄鸭做滴鼻攻毒。口服剂量为500μL含适宜菌落数的稀释液，滴鼻剂量为100μL含适宜菌落数的稀释液。用脑心浸液培养基将缺失株及其野生株培养至对数生长期，无菌PBS稀释至适宜浓度。攻毒后记录死亡情况，按照Reed and Muench法计算鸭子半数致死量（50% lethal dose,LD₅₀），评价基因缺失株较亲本株毒力减弱程度，结果见表3和表4。

经口服途径攻毒，突变株的毒力较野生株减毒约32倍。

经鼻途径攻毒，突变株的毒力较野生株减毒约154倍。

2、禽多杀性巴氏杆菌基因缺失株P.multocida0818 ΔphoP对鸭的免疫保护效力检测

免疫程序：使用1周龄的四川麻鸭作为动物模型进行免疫效力评价。根据实验要求分实验组20只鸭子，对照组17只鸭子。实验组口服免疫P.multocida0818 ΔphoP活菌，对照组为无菌PBS，免疫剂量为500μL （含活菌10⁵CFU）。购买的1日龄鸭子适应环境1周，1周后进行第一次免疫，10天后加强免疫一次，免疫期间死亡鸭子3只，其余健康。第20天进行P.multocida 0818野生毒株攻毒，剂量为500μL （含活菌10⁸CFU），观察期10天。实验结果如表5：

抗体水平检测：分别于首免后0天、首免后10天、20天随机抽取实验组和对照组各3只鸭子采集样品，样品包括血清和胆汁。采用间接ELISA方法检测鸭子免疫后体液免疫IgA和粘膜免疫IgG水平。包被抗原为鸭源多杀性巴氏杆菌P.multocida 0818 OMPs。分别将血清和胆汁稀释至合适浓度作为一抗。与血清对应，二抗采用鼠抗鸭IgY抗体；与胆汁对应，二抗采用鼠抗鸭IgA抗体。采用碱性磷酸酶作为显色底物。结果如图9。从结果可以看出，P.multocida 0818 ΔphoP株经口服免疫后能刺激机体产生较强的体液免疫和粘膜免疫水平实验。

Claims (9)

1.缺失phoP的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株，其特征在于：所述减毒菌株缺失了phoP基因，所述phoP基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述减毒菌株的分类命名为Pasteurella multocida subsp.multocida str pm0818ΔphoP，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2014522，保藏时间为2014年10月29日。

2.根据权利要求1所述的减毒菌株，其特征在于：所述减毒菌株中的phoP基因由kan抗性基因所替代。

3.根据权利要求2所述的减毒菌株，其特征在于：所述kan抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)重组自杀质粒pRE112-ΔphoP∷kan的构建；

2)将步骤1)所得重组自杀质粒转化入c7213大肠杆菌中；

3)以含有重组自杀质粒pRE112-ΔphoP∷kan的c7213菌株为供体菌，P.multocida0818株为受体菌进行接合转移；

4)通过PCR筛选得禽多杀性巴氏杆菌phoP基因缺失菌株。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述重组自杀质粒pRE112-ΔphoP∷kan的构建，包括如下步骤：

1)phoP基因的上下同源臂的引物设计：

Dp-1F:TGCCAGTTTTCAATGGTGTC

Dp-1R:CCTGCAGGGATGCGGCCGCTTTTTTGACCGCACTTTTTTC

Dp-2F:GCGGCCGCATCCCTGCAGGGCTAGGAAAAAATGATGAAATG

Dp-2R:ATTTTCCTTGATTGACTGGC

上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

2)以多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida 0818基因组为模板，分别对phoP基因的上下同源臂进行PCR扩增，回收产物混合后共同作为模板用引物Dp-1F和Dp-2R进行扩增，得到左右同源臂融合片段；

3)用AhdⅠ酶切质粒pRE112载体，回收纯化酶切产物，连接pRE112大片段与同源臂融合片段，连接产物转化入c7232感受态细胞；

4)将步骤3)所得c7232大肠杆菌摇菌培养至对数期，进行质粒抽提，得到重组质粒pRE112-ΔphoP；

5)kan抗性基因的引物设计

kan-F:ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGAACGAAAACTC

kan-R:CCTGCAGGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC

以pYA4372质粒DNA为模板，用kan-F/R引物进行PCR扩增，扩增产物回收后用NotⅠ和SbfⅠ进行双酶酶切，再与同样经NotⅠ和SbfⅠ双酶酶切处理的pRE112-ΔphoP连接，得到重组自杀质粒pRE112-ΔphoP::kan。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)和5)中，对phoP基因的上下同源臂以及kan抗性基因进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：于50μL反应体系中：模板DNA 1μL，25mmol/L MgCl₂ 0.5μL，reaction buffer 10μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，DNA polymerase 0.75μL，ddH₂O 34.75μL；具体条件为：98℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共循环30次，循环后于72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中，接合转移的步骤为：用LB液体培养基培养供体菌和脑心浸液培养基培养受体菌过夜；各取200μL混合均匀后收集菌体，用10mM MgSO₄清洗两遍，用0.45μm滤膜过滤菌液，取下滤膜贴于含有50μg/mL的DAP的脑心浸液琼脂培养基，30℃培养10h；用5mL 10mM MgSO₄洗下滤膜上的菌体，涂于含50μg/mL卡那霉素的脑心浸液琼脂培养基上。

8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中，PCR筛选的步骤为：

1)以phoP基因内引物

F:TTAATTGGCAATGGCTTACAG

R:TACCCTACACCATGCACAGT

初步鉴定突变株；

2)疑似菌落再用引物

F：TATTACACACGTTATAACCCG

R：CAATATTTTCACCTGAATCAG

和引物

F：CATTTGTGCAACTTCAGTTTG

R：CTGATTCAGGTGAAAATATTG

进一步鉴定。

9.如权利要求1所述的禽多杀巴氏杆菌减毒菌株在制备疫苗上的应用。