CN113855793A - 牛源a型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用 - Google Patents

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CN113855793A CN202111216800.3A CN202111216800A CN113855793A CN 113855793 A CN113855793 A CN 113855793A CN 202111216800 A CN202111216800 A CN 202111216800A CN 113855793 A CN113855793 A CN 113855793A
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Abstract

本发明提供牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，基于牛源A型多杀性巴氏杆菌的基因缺失株，免疫接种促进动物对不同血清型、不同动物源多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护；所述交叉保护是对牛源A型、B型、F型以及猪源、禽源、兔源A型多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护。所述基因缺失株为hyaD 基因的缺失；或为qseC基因的缺失。所述基因缺失株是通过同源重组方法，构建的牛源多杀性巴氏杆菌CQ2株（PmCQ2）hyaD基因缺失株、PmCQ2ΔhyaD或qseC基因缺失株PmCQ2ΔqseC。所述hyaD基因及qseC基因缺失均能显著降低野生株毒力，对不同血清型、不同宿主源多杀性巴氏杆菌均具有较强的交叉保护作用。为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的研发提供了候选靶标。

Description

牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD及qseC基因缺失株及应用，以及所述基因缺失株的构建。
背景技术
多杀性巴氏杆菌是一种革兰氏阴性、两级浓染短杆菌，可感染多种畜禽及野生动物，也可感染人，每年给畜牧业带来了巨大的经济损失。根据其荚膜多糖的不同可分为A、B、D、E、F五种荚膜血清型，根据其LPS差异又可分为16种血清型，不同动物主要感染的血清型不同，其导致的疾病类型也存在显著差异。多杀性巴氏杆菌可作为共生菌在动物鼻咽部、呼吸道等部定植，但在运输应激、机体抵抗力下降等条件下，多杀性巴氏杆菌大量繁殖，并扩散到肺肝脾等脏器，引发如牛出血性败血症、猪肺疫、禽霍乱和兔巴氏杆菌病等疫病。
目前，多杀性巴氏杆菌的防控主要采用疫苗预防和抗生素治疗相结合。但当前针对多杀性巴氏杆菌的商品化疫苗仅少数几种，并且各自仅对单一动物源的某血清型多杀性巴氏杆菌具有较好的免疫保护作用，其交叉免疫保护性弱或无。从多杀性巴氏杆菌的血清型和可感染动物来看，目前所具有的多杀性巴氏杆菌疫苗远不能达到有效防控多杀性巴氏杆菌感染的目的。而在抗生素治疗过程中，由于抗生素的长久大量使用，也导致了多杀性巴氏杆菌越来越多的耐药菌株出现，这也为多杀性巴氏杆菌感染的有效治疗带来了困难。因此，开发广谱型多杀性巴氏杆菌疫苗及不易产生耐药性的药物是有效防控多杀性巴氏杆菌感染的关键。目前，虽有不同类型多杀性巴氏杆菌疫苗的研究，如灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗、基因重组疫苗、DNA疫苗等，但其交叉免疫保护效果并不理想，有较好作用的通用型交叉保护性疫苗仍然欠缺。开发相关通用型疫苗在预防多杀性巴氏杆菌病，提高动物福祉、阻断人兽共患病传播方面具有重要意义。
虽然前面Homchampa等人的研究发现，aroA基因缺失能增强荚膜A型多杀性巴氏杆菌的交叉免疫保护性，但也仅发现aroA基因缺失株对荚膜A型的其他LPS血清型菌株具有一定的交叉保护作用，其交叉保护范围较窄；同时，该基因在不同菌株中缺失后，赋予菌株的交叉免疫保护性具有显著差异。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用。
进一步，还提供牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因缺失株、qseC基因缺失株及其构建方法。
实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，基于牛源A型多杀性巴氏杆菌的基因缺失株，免疫接种促进动物对不同血清型、不同动物源多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护。所述交叉保护是对牛源A型、B型、F型以及猪源、禽源、兔源A型多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护。
进一步，所述基因缺失株为hyaD基因的缺失；或者所述基因缺失株为qseC基因的缺失。所述基因缺失株为PmCQ2ΔhyaD或基因缺失株为PmCQ2ΔqseC，均保藏于中国典型培养物保藏中心。
所述基因缺失株为PmCQ2ΔhyaD通过同源重组方法构建，包括如下步骤：
(1)用试剂盒(DP302-02，购自天根生物科技有限公司)提取野生株PmCQ2基因组DNA，以PmCQ2基因组DNA为模板，采用上下游同源臂扩增引物5’hyaDARM-F/R和3’hyaDARM-F/R分别进行PCR扩增，扩增产物经核酸电泳后，切取目的片段采用胶回收试剂盒(CW2302M，购自康为世纪生物科技有限公司)回收，分别获纯化的226bp上游同源臂片段和251bp下游同源臂片段；
(2)以上下游同源臂片段为模板，采用5’hyaDARM-F和3’hyaDARM-R引物继续进行PCR扩增，经核酸电泳和胶回收后获纯化的上下游同源臂融合片段；
(3)含温敏质粒pUC19oriKanR的大肠杆菌经活化后过夜培养，采用质粒提取试剂盒(CW0500M，购自康为世纪生物科技有限公司)提取质粒，pUC19oriKanR经BamH I(1605，购自TaKaRa)和Hind III(1615，购自TaKaRa)于37℃双酶切2小时(hour，h)后，用胶回收试剂盒回收线性化载体片段；
(4)用
Figure BDA0003311061960000021
HD Cloning Kit(PT5162-1，购自Clontech)将双酶切后的线性化载体和同源臂片段于37℃恒温水浴锅中连接30分钟(minute，min)后，把连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂布在含有50μg/mL Kan抗性LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取菌落，采用引物pUC19-F/pUC19-R进行菌落PCR，筛选出阳性克隆，其后进行测序验证；
(5)制备PmCQ2电转感受态，重组质粒经电转PmCQ2感受态后，涂布在含有100μg/mLKan马丁氏肉汤培养基上，经PCR扩增，筛选出hyaD基因缺失菌株，并经连续传代30次保证Kan抗性消除和遗传稳定性。
所述基因缺失株为PmCQ2ΔqseC通过同源重组方法构建，包括如下步骤：
(1)用试剂盒(DP302-02，购自天根生物科技有限公司)提取野生株PmCQ2基因组DNA，以PmCQ2基因组DNA为模板，采用上下游同源臂扩增引物5’qseCARM-F/R和3’qseCARM-F/R分别进行PCR扩增，扩增产物经核酸电泳后，切取目的片段采用胶回收试剂盒(CW2302M，购自康为世纪生物科技有限公司)回收，分别获纯化的350bp上游同源臂片段和350bp下游同源臂片段；
(2)以上下游同源臂片段为模板，采用5’qseCARM-F和3’qseCARM-R引物继续进行PCR扩增，经核酸电泳和胶回收后获纯化的上下游同源臂融合片段；
(3)含温敏质粒pUC19oriKanR的大肠杆菌经活化后过夜培养，采用质粒提取试剂盒(CW0500M，购自康为世纪生物科技有限公司)提取质粒，pUC19oriKanR经BamH I(1605，购自TaKaRa)和Hind III(1615，购自TaKaRa)于37℃双酶切2小时(hour，h)后，用胶回收试剂盒回收线性化载体片段；
(4)用
Figure BDA0003311061960000031
HD Cloning Kit(PT5162-1，购自Clontech)将双酶切后的线性化载体和同源臂片段于37℃恒温水浴锅中连接30分钟(minute，min)后，把连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂布在含有50μg/mL Kan抗性LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取菌落，采用引物pUC19-F/pUC19-R进行菌落PCR，筛选出阳性克隆，其后进行测序验证；
(5)制备PmCQ2电转感受态，重组质粒经电转PmCQ2感受态后，涂布在含有100μg/mLKan马丁氏肉汤培养基上，经PCR扩增，筛选出qseC基因缺失菌株PmCQ2ΔqseC，并经连续传代30次保证Kan抗性消除和遗传稳定性。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明研究了牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，基于牛源A型多杀性巴氏杆菌的基因缺失株，免疫接种促进动物对不同血清型、不同动物源多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护；所述交叉保护是对牛源A型、B型、F型以及猪源、禽源、兔源A型多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护。选用牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株，分别通过对多个基因进行缺失，筛选出的与荚膜多糖合成有关的hyaD基因和群体感应基因qseC基因缺失，能赋予缺失株较强的、广谱的交叉免疫保护特性，为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的商品化应用奠定了基础。
2、所构建的多杀性巴氏杆菌基因缺失株PmCQ2Δhyad及PmCQ2ΔqseC均为无抗性marker菌株，与野生株相比，PmCQ2Δhyad毒力下降均近万倍，而PmCQ2ΔqseC毒力下降近千万倍，非致死剂量感染在动物脏器中的定殖量低，病理损伤轻微，这为其临床应用避免了生物安全风险。
3、缺失株PmCQ2Δhyad及PmCQ2ΔqseC体外培养条件简单，生长速率与野生株无差别，其荚膜产生量显著下降，与野生株相比，菌体更易于离心和沉淀，这为其疫苗制备过程中的菌体培养及浓缩提供了更有利条件。
4、本发明选取PmCQ2ΔqseC弱毒疫苗和甲醛灭活方式混以矿物油佐剂制备PmCQ2ΔhyaD灭活苗，发现两种疫苗对牛源A型、B型、F型以及猪源、禽源、兔源A型多杀性巴氏杆菌均具有良好的交叉免疫保护作用，尤其对牛源A型及B型和禽源、兔源A型多杀性巴氏杆菌感染达100％保护效果，免疫小鼠产生较高的抗体水平，并维持最高抗体水平达8周以上，免疫攻毒后小鼠肺脏未见明显病理损伤，这预示着PmCQ2ΔqseC弱毒疫苗PmCQ2ΔhyaD灭活苗可作为良好的疫苗开发候选靶标。
附图说明
图1为hyaD基因缺失株、hyaD基因回补株构建及其生物学特性。(A)基因缺失株构建示意图。(B)PCR扩增验证敲除株和回补株构建情况，1、4、7、10、13以PmCQ2基因组为模板，2、5、8、11、14以PmCQ2ΔhyaD基因组为模板，3、6、9、12、15以PmCQ2ΔhyaD/phyaD基因组为模板；1、2、3引物为KMT1-F/R，4、5、6引物为5’ARM-F/3’ARM-R，7、8、9引物为dhyaD-F/R，10、11、12引物为pUC19-F/pUC19-R，13、14、15引物为mhyaD-F/mhyaD-R。(C)hyaD荧光定量验证敲除株和回补株构建情况。(D)Western blot验证敲除株和回补株构建情况。(E)生长曲线。(F)菌落形态。(G)荚膜定量。(H)4度静置2h，3,000r/min、5min低速离心(I)生物膜定量。
图2为hyaD基因缺失株毒力分析。(A)攻毒后死亡时间曲线。(B，C)攻毒后8h、24h肺肝脾脏器定植。(D-F)攻毒后24h肺脏H&E染色。(G)感染后黏附巨噬细胞的数量。(H)感染后被巨噬细胞吞噬的数量。(I-M)感染巨噬细胞8h后炎性基因的表达情况。(N-R)感染巨噬细胞8h后炎性因子的分泌情况。
图3为ΔhyaD交叉免疫保护性测定。ΔhyaD灭活苗免疫21d后，分别采用(A)PmCQ1、(B)PmCQ2、(C)PmCQ4、(D)PmCQ5、(E)PmB、(F)PmF、(G)PmP、(H)PmQ和(I)PmR肌肉途径进行攻毒，测定免疫小鼠的存活率。
图4为ΔhyaD免疫后抗体动态变化和免疫后攻毒肺脏H&E染色。(A)anti-PmCQ1抗体动态变化。(B)anti-PmCQ2抗体动态变化。(C)anti-PmCQ4抗体动态变化。(D)anti-PmCQ5抗体动态变化。(E)anti-PmB抗体动态变化。(F)anti-PmF抗体动态变化。(G)anti-PmP抗体动态变化。(H)anti-PmQ抗体动态变化。(I)anti-PmR抗体动态变化。(J)免疫21d后抗体比较。(K)免疫后PmCQ1感染。(L)免疫后PmCQ2感染。(M)免疫后PmCQ4感染。(N)免疫后PmCQ5感染。(O)免疫后PmB感染。(P)免疫后PmF感染。(Q)免疫后PmP感染。(R)免疫后PmQ感染。(S)免疫后PmR感染。(T)免疫后未感染。
图5qRT-PCR验证ΔhyaD影响其它基因表达。(A-D)荚膜合成相关基因。(E-F)生物膜形成相关基因。(G-H)铁转运相关基因。(I-L)LPS合成、转运相关基因。(M)毒力基因Pm0442。(N)毒力基因ompA。(O)外膜蛋白相关基因。
图6为qseC基因缺失株(ΔqseC)、qseC基因回补株(C-qseC)构建及其生物学特性。(A)突变株和互补株的PCR确认。M：DNA标记；Lanes1-3：PmCQ2；Lanes 4–6：ΔqseC；Lanes 7–9：C-qseC。Lanes 1、4、7：利用物种特异性引物KMT1-F/R检测多杀性巴氏杆菌(阳性对照)；第2、5、8泳道:利用引物comqseC-F/R检测qseC基因；第3、6、9泳道:利用引物qseC5’ARM-F/R检测qseC基因。(B)采用qRT-PCR检测qseC基因转录本。(C)菌株在37℃、200r/min摇瓶培养的生长曲线。(D)在马丁肉汤琼脂平板上培养PmCQ2、ΔqseC和C-qseC的菌落形态。(E)荚膜多糖的生产。(F)细菌细胞在10,000r/min离心5min后的离心包装状态。(G)生物膜生成的定量。(H)分别用5mM、10mM或20mM的H2O2在37℃下处理1小时。(I)将细菌细胞在37℃下分别暴露于100mM、200mM和300mM NaCl下1h。
图7为qseC基因缺失株毒力分析。(A)分别感染野生菌株PmCQ2、ΔqseC和C-qseC的小鼠存活率，n＝10只/组。(B-D)小鼠PmCQ2、ΔqseC和C-qseC感染24h后肺组织病理学变化。(B)静脉及肺泡壁毛细血管严重扩张充血，炎性细胞浸润；(C)肺泡壁毛细血管轻微扩张充血，部分肺泡腔内有少量红细胞；(D)充血出血，肺泡腔内有大量红细胞和纤维素渗出。
图8为ΔqseC免疫后抗体测定。分别用灭活的PmCQ2、灭活的ΔqseC和活的ΔqseC免疫小鼠。免疫后21天采用尾静脉采血进行血清分离。检测血清抗(A)PmCQ1、(B)PmCQ2、(C)PmCQ4、(D)PmCQ5、(E)PmB、(F)PmF、(G)PmP、(H)PmQ、(I)PmR抗体。用(J)PmCQ2灭活苗、(K)ΔqseC灭活苗、(L)ΔqseC弱毒苗免疫小鼠，分析其IgG抗体滴度。
图9为qseC基因缺失株交叉保护性测定。ΔqseC灭活苗和PBS皮下途径分别免疫小鼠21天后，其后采用(A)PmCQ1，(B)PmCQ2，(C)PmCQ4，(D)PmCQ5，(E)PmB，(F)PmF，(G)PmP，(H)PmQ和(I)PmR分别肌肉感染小鼠的存活率。用ΔqseC弱毒苗和PBS肌肉途径免疫小鼠21d后，其后采用(J)PmCQ1、(K)PmCQ2、(L)PmCQ4、(M)PmCQ5、(N)PmB、(O)PmF、(P)PmP、(Q)PmQ和(R)PmR分别肌肉感染小鼠的存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
一、实施例
1材料和方法
1.1菌株、质粒和培养条件
牛源A型多杀性巴氏杆菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)、牛源F型多杀性巴氏杆菌(PmF)、禽源A型多杀性巴氏杆菌(PmQ)及兔源A型多杀性巴氏杆菌(PmR)均由西南大学动物医学院预防兽医学实验室分离并暂存；牛源B型多杀性巴氏杆菌(PmB，CVCC470)及猪源A型多杀性巴氏杆菌(PmP，CVCC1662)均购自中国兽医药品监察所兽医微生物菌种保藏中心；E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。用于基因缺失的质粒pUC19oriKanR为实验室前期构建保藏，质粒pMc-Express由四川农业大学曹三杰教授馈赠。多杀性巴氏杆菌采用马丁氏肉汤琼脂培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)划线活化，37℃恒温培养24h后，挑取单菌落到5mL马丁氏肉汤液体培养基中于220r/min、37℃摇床中培养12h备用。含不同抗性质粒的大肠杆菌菌株分别接种50μg/mL卡那霉素(Kan，购自生工生物工程股份有限公司)、100μg/mL氨苄霉素(Amp，购自生工生物工程股份有限公司)和50μg/mL氯霉素(Cl，购自生工生物工程股份有限公司)抗性的Luria-Bertani(LB，购自北京奥博星生物技术有限责任公司)琼脂培养基上，37℃培养箱中培养24h活化。
1.2试验动物及伦理陈述
本试验所用动物为6-8周龄、18-22g昆明小鼠和C57/BL6雌性小鼠，购自恩斯维尔公司。对试验动物采取的所有饲喂和试验方式均符合西南大学动物福利和伦理委员会相关文件要求，受西南大学实验动物伦理审查委员会监督(PermitNumber:IACUC-20200803-01)。
1.3基因缺失株及回补株的构建
构建hyaD、qseC基因缺失株及回补株所用引物分别列于表1与表2。
采用试剂盒(DP302-02，购自天根生物科技有限公司)提取野生株PmCQ2基因组，以PmCQ2基因组为模板、上下游同源臂5’ARM-F/R和3’ARM-F/-R引物分别扩增其同源序列，经核酸电泳后用胶回收试剂盒(CW2302M，购自康为世纪生物科技有限公司)分别获取上游同源臂片段和下游同源臂片段；以上下游同源臂为模板、用5’ARM-F和3’ARM-R引物进行PCR扩增，经核酸电泳和胶回收后获上下游同源臂融合片段。质粒pUC19oriKanR经活化后过夜培养，用试剂盒(CW0500M，购自康为世纪生物科技有限公司)提取质粒，经BamH I(1605，购自TaKaRa)和Hind III(1615，购自TaKaRa)于37℃、2小时(hour，h)双酶切后用胶回收试剂盒回收线性化载体。用
Figure BDA0003311061960000061
HD Cloning Kit(PT5162-1，购自Clontech)
将双酶切后的线性化载体和同源臂片段于37℃恒温水浴锅中连接30分钟(minute，min)后，把连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中并涂布在含有50μg/mL Kan抗性LB平板上过夜培养，用引物pUC19-F/R验证阳性克隆pUC19oriKanR-hyad上游+下游同源臂。重组质粒经电转PmCQ2后涂布在含有100μg/mL Kan马丁氏肉汤培养基上，经PCR扩增筛选出敲除菌株，并经连续传代30次保证Kan抗性消除和遗传稳定性。构建回补株时利用pMc质粒上egfp基因的启动序列，首先以PmCQ2为模板，用引物comhyaD-F/R和comqseC-F/R分别扩增出hyaD基因和qseC基因全长，同时以质粒pMc为模板、用引物egfp-F和egfp-R扩增出该片段并与之前BamH I和Hind III双酶切的pUC19oriKanR线性化载体连接获得重组质粒pUC19oriKanR-egfp，再经Sal I(F301da0001，购自生工生物工程股份有限公司)和Xba I(F927DA0002，购自生工生物工程股份有限公司)双酶切后与胶回收的hyaD基因片段用连接酶连接、转化，筛选得到重组质粒pUC19oriKanR-comhyaD和pUC19oriKanR-comqseC。同样将重组质粒电转至敲除株菌株内，并在含有100μg/mL Kan马丁氏肉汤培养基上经PCR扩增筛选出回补菌株，并连续传代30次保证遗传稳定性。
表1 hyaD基因缺失株株和回补株构建所需引物
Figure BDA0003311061960000071
表2 qseC基因缺失株株和回补株构建所需引物
Figure BDA0003311061960000081
以PmCQ2基因组为模板，上下游引物wbhyaD-F/R进行扩增，经胶回收后获取hyaD基因截短表达片段。同时采用上述方法在Amp抗性平板上活化pET32a(+)质粒，经试剂盒提取质粒和BamH I和Hind III双酶切后与截短hyaD片段连接，转化到E.coli DH5α感受态细胞中筛选阳性克隆，再次提取质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。按照实验室前期方法进行蛋白诱导表达和纯化。同时采用超声破碎的方法制备PmCQ2、PmCQ2ΔhyaD、PmCQ2ΔhyaD/phyaD全菌蛋白。
首免将纯化的蛋白和弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)按照1：1比例混合使得混合液中蛋白终浓度为50μg/μL，用涡旋振荡仪充分乳化，将100μL混合液在小鼠背部皮下多点免疫；再将纯化的蛋白和弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司)按相同体积混合制备成相同浓度混合液，并于首免14天后在背部皮下多点免疫100μL混合液加强免疫，二免14天后采集小鼠尾静脉血。将采集后的尾静脉血于37℃培养箱静置1h，放置在4℃过夜析出血清。
分别以PmCQ2、PmCQ2ΔhyaD、PmCQ2ΔhyaD/phyaD三种全菌蛋白作为抗原、HyaD截短表达蛋白免疫小鼠血清作为抗体、羊抗鼠IgG-HRP(购自Thermo scientific公司)作为酶标二抗，按照实验室前期方法western blot验证该蛋白在野生株、敲除株和回补株体内的表达情况。
生长曲线
挑取野生株、基因缺失株和回补株单菌落到5mL马丁氏肉汤培养基中于培养箱中220r/min、37℃培养10h。将上述菌液稀释计数后用马丁氏肉汤培养基稀释到2×108CFU/mL后按照1：100接种量转接到新鲜的马丁氏肉汤培养基中置于37℃、220r/min培养，并每隔两个小时测定OD600 nm处吸光度。
荚膜定量
分别吸取培养到对数生长期的野生株、基因缺失株和回补株三种菌液各1mL到1.5mL离心管中，于13,000r/min、10min离心后弃去上清，并用磷酸盐缓冲液(PBS，购自索莱宝科技有限公司)清洗两次后加入1mLPBS溶液重悬菌体并置于42℃金属浴中放置1h，对金属浴前后菌液分别进行计数。之后将各管菌液再次于13,000r/min、10min离心，保留上清。分别将100μL上清加入到由0.2mg/mL的stains all粉末(7423-31-6，购自生工生物工程股份有限公司)、50％甲酰胺(75-12-7，购自科隆化学品有限公司)和0.06％冰醋酸溶液(购自科龙化工试剂厂)配制成的900μL荚膜染色液中振荡混匀，同时将0、0.5、1、2、3、4、5μg/100μL不同浓度梯度的标准透明质酸溶液样品加入到900μL体积的荚膜染色液中，同时测定其OD640 nm处的吸光度，并以标准样品作标准曲线计算该三种待测样本释放的透明质酸含量。
生物膜定量
将培养到对数生长期的野生株、基因缺失株和回补株三种菌液进行计数，并用脑心浸液肉汤(BHI，购自青岛海博生物技术有限公司)培养基稀释至菌含量为1×108CFU/mL，分别转移400μL细菌稀释液到48孔细胞培养板上，同时阴性对照为400μLBHI肉汤培养基，水平振荡混匀后置于37℃培养箱中培养48h。吸出细菌培养液并加入200μLPBS溶液清洗两次去除杂质和未黏附细菌，室温干燥后加入200μL甲醇(67-56-1，购自科隆化学品有限公司)固定液于室温固定1h，200μLPBS溶液轻柔清洗三次并室温干燥后按200μL/孔加入1％结晶紫(548-62-9，购自生工生物工程股份有限公司)于37℃染色30min，同样加入200μL/孔PBS溶液轻柔清洗三次并室温晾干，最后加入200μL/孔33％冰醋酸溶液于37℃溶解30min，用酶标仪读取OD630 nm处吸光值，未加入菌液作空白对照。
LD50测定
将培养到对数生长期的基因缺失株和回补株进行计数，并按照不同浓度梯度进行肌肉攻毒，连续观察一周，待小鼠出现明显炸毛、精神沉郁状态视为死亡并及时安乐死处理。统计小鼠死亡情况，并应用bliss法计算基因缺失株和回补株的半数致死量。
脏器定植和H&E染色
将培养到对数生长期的野生株、基因缺失株和回补株三种菌液计数后以2.0×106CFU肌肉注射到小鼠体内，每组6只昆明小鼠。将攻毒后8、24h的小鼠安乐死并采集肺脏、肝脏和脾脏三种脏器匀浆、稀释涂板，检测其含菌量，同时采集感染24h后小鼠肺脏送至里来佳诺生物科技有限公司制作病理切片。
感染巨噬细胞
按照实验室前期建立的方法采集小鼠腹腔巨噬细胞并于37℃、5％CQ2培养箱中培养。在48孔细胞板内每孔接种2×105个巨噬细胞，贴壁2h后，分别将PmCQ2、PmCQ2ΔhyaD、PmCQ2ΔhyaD/phyaD按1MOI感染巨噬细胞，8h后一组弃去培养液，加入PBS清洗三次后，每孔加入500μL终浓度为100μg/mL的环丙沙星处理30min杀死胞外菌，向各孔加入500μL PBS清洗三次后，向每孔加入含0.1％TritonX-100(购自Solarbio)的PBS溶液充分裂解细胞，分别进行计数，测定各种菌黏附巨噬细胞数量以及被巨噬细胞吞噬数量。
在6孔细胞板内每孔接种2×106个巨噬细胞，贴壁2h后，分别将PmCQ2、PmCQ2ΔhyaD、PmCQ2ΔhyaD/phyaD按1MOI感染巨噬细胞，8h后收集培养液按照ELISA检测试剂盒说明书(购自赛默飞公司)分别检测TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A炎性因子分泌情况，同时按照细胞RNA提取试剂盒说明书提取RNA，经反转录后qRT-PCR测定炎性基因TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A表达情况。
弱毒疫苗及灭活苗制备
PmCQ2ΔqseC弱毒疫苗制备是直接将PmCQ2ΔqseC培养值稳定期，计数按一定剂量直接活菌免疫。而两个基因缺失株的灭活苗制备如下：将培养至对数生长期的野毒株和基因缺失株分别按1：100转接至三角瓶中进行大量培养至OD600＝1.4-1.5，进行纯粹性检验并计数后将其浓缩，加入终浓度为0.15％甲醛溶液(购自成都科隆化学品有限公司)置于37℃培养箱灭活24h，其中每间隔3h适当涡旋振荡使其充分灭活，灭活完成后与15AVG矿物油乳化剂(重庆澳龙生物制品有限公司赠送)按照4∶1体积比混合使得灭活苗终浓度为5×109CFU/mL。将100μL灭活苗涂布在马丁平板上，另选取6只小鼠分别接种100μL灭活苗到背部皮下进行疫苗安全性评价。
交叉保护测定
将昆明小鼠随机分组，每组小鼠10只，制备的疫苗免疫接种程序分别按照表3及表4进行，其中为了加强灭活苗免疫效果，间隔初免7d后进行二次免疫。于初免21d后,hyaD基因缺失疫苗组分别以3.6×107CFU PmCQ1(肌肉途径：LD50＝3.8×102CFU)、3.2×107CFUPmCQ2(肌肉途径：LD50＝3.4×103CFU)、4.6×107CFU PmCQ4(肌肉途径：LD50＝2.1×103CFU)、2.9×107CFU PmCQ5(肌肉途径：LD50＝4.5×103CFU)、1.2×107CFU PmB(肌肉途径：LD50＝5.0×103CFU)、4.4×108CFU PmF(肌肉途径：1.0×108CFU)、10CFU PmQ(肌肉途径：LD50≈1CFU)、10CFU PmP(肌肉途径：LD50≈1CFU)、2.2×106CFU PmR(肌肉途径：1.0×104CFU)肌肉攻毒并连续观察一周，而qseC基因缺失疫苗组分别以3.8×107CFU PmCQ1、4.8×107CFU PmCQ2、3.6×107CFU PmCQ4、4.5×107CFU PmCQ5、1.0×107CFU PmB、2.0×108CFUPmF、10CFU PmP、10CFU PmQ、1.0×106CFU PmR肌肉攻毒并连续观察一周，小鼠有明显炸毛、精神沉郁等现象判定死亡并及时安乐死。免疫程序和攻毒如表3和4所示。
表3 hyaD基因缺失疫苗免疫程序和攻毒
Figure BDA0003311061960000111
表4 qseC基因缺失疫苗免疫程序和攻毒
Figure BDA0003311061960000112
疫苗初次免疫后，分别间隔初次免疫7、14、21、28、42、56、70、84、98、105天采集小鼠尾静脉血液分离血清，并按照实验室前期建立的间接ELISA方法进行抗体效价判定。采用超声破碎的方法分别获得PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5、PmB、PmF、PmQ、PmP和PmR全菌蛋白，并用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，标定pH9.6)按照1μg/孔稀释全菌蛋白于4℃包被过夜。次日PBST(PBS溶液加入0.05％吐温20，吐温20购自生工生物工程股份有限公司)洗涤3次、每次5min，再在每孔加入5％的脱脂奶粉(购自赛国生物科技公司)于37℃封闭1h。一抗为疫苗免疫小鼠血清，第一个孔1:100稀释，即2μL血清加入到198μLPBST中，倍比稀释用100μL排枪上下吹吸5次混匀，再吸100μL到第二孔，重复同样操作直到最后一孔，最后一孔弃去100μL液体，再次于37℃、1h孵育后PBST洗涤3次、每次5min。将HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)二抗(购自Sigma公司)用PBST 1:10,000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h后再次用PBST洗涤3次、每次5min，拍干孔内剩余液体。每孔加入100μLTMB显色液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，购自Beyotime公司)，室温避光显色10min后加入100μL 1M硫酸(购自重庆川东化工)终止液，酶标仪读取OD450值。
免疫后攻毒肺脏H&E染色
经PmCQ2ΔhyaD灭活苗免疫后，分别采集攻毒12h后小鼠肺脏和未攻毒小鼠肺脏送至里来佳诺生物科技有限公司制作病理切片。
qRT-PCR荧光定量分析
将培养到对数生长期的野生株、缺失株和回补株三种菌液离心收集菌体，按照细菌RNA提取试剂盒(TR214-50，购自天漠生物)说明书分别提取其总RNA，经酶标仪测定浓度后调节野生株、缺失株和回补株总RNA浓度为同一浓度后再用反转录试剂盒(KR118-02，购自天根生物)合成cDNA。分别以cDNA为模板，相关引物(表5、表6)进行qRT-PCR荧光定量。
表5 hyaD基因缺失株qRT-PCR荧光定量所需引物
Figure BDA0003311061960000121
Figure BDA0003311061960000131
表6 qseC基因缺失株qRT-PCR荧光定量所需引物
Figure BDA0003311061960000132
Figure BDA0003311061960000141
数据统计分析
采用Graphpad Prism 6软件进行试验数据分析处理，t检验分析，p>0.05为无显著差异(ns)；p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)、p<0.0001(****)为显著差异。
二、实施例验证结果
(一)hyaD基因缺失株相关验证结果
1、hyaD基因缺失构建及其生物学特性
本发明研究hyaD基因在牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2中的作用，构建PmCQ2 hyaD基因缺失株，相关引物结合位点如图1A所示，并经PCR扩增、qRT-PCR荧光定量和Westernblot分别在DNA、RNA和蛋白水平上验证该基因在敲除株中不表达，野生株、回补株中可以表达(图1B-D)。并经体外传代30次后，敲除株和回补株仍能稳定遗传。敲除株在马丁肉汤液体培养基中生长时，第6h显著快于野生株和回补株，而回补株和野生株生长速度趋于一致(图1E)。在马丁氏肉汤平板上生长24h后，PmCQ2ΔhyaD菌落形态较野生株相比明显减小，PmCQ2ΔhyaD/phyaD菌落形态大小介于二者之间(图1F)。敲除株荚膜含量显著降低，而回补株荚膜含量高于敲除株但仍比野生株少(图1G)，并且敲除株极易离心和沉降(图1H)。同时PmCQ2ΔhyaD与PmCQ2和PmCQ2ΔhyaD/phyaD相比，其生物膜含量显著提高，回补株介于二者之间(图1I)。
2、hyaD影响PmCQ2毒力
为了探究hyaD基因对多杀性巴氏杆菌PmCQ2的毒力影响，分别以不同浓度梯度肌肉攻毒测定PmCQ2ΔhyaD和PmCQ2ΔhyaD/phyaD半数致死量，经bliss法计算得敲除株PmCQ2ΔhyaD LD50＝2.30×107CFU，约为野生株PmCQ2半数致死量(LD50＝3.43×103CFU)6700倍，而回补株PmCQ2ΔhyaD/phyaD LD50＝1.43×104CFU约为野生株4倍(表7)。以2.0×106CFUPmCQ2、PmCQ2ΔhyaD和PmCQ2ΔhyaD/phyaD肌肉攻毒后发现野生株一天以内快速死亡，敲除株仅在第5天死亡一只，回补株7天以内全部死亡但死亡时间较野生株相比要滞后(图2A)。同时分别以2.0×106CFU PmCQ2、PmCQ2ΔhyaD和PmCQ2ΔhyaD/phyaD肌肉攻毒分别采集8h、24h的肺、肝、脾脏器，经匀浆、稀释涂板和计数后发现，野生株在各个脏器中定植量最高，敲除株定植量最低，回补株在不同脏器中的定植量介于二者之间，并且随着时间的延长其定植量均有所升高(图2B-C)。以相同剂量感染小鼠，敲除株引起肺脏病理损伤较轻，(图2D-F)
表7 PmCQ2ΔhyaD和PmCQ2ΔhyaD/phyaD LD50
Figure BDA0003311061960000151
3、感染巨噬细胞毒性作用结果
为了进一步验证敲除株毒力作用，在细胞水平上继续验证，PmCQ2、PmCQ2ΔhyaD和PmCQ2ΔhyaD/phyaD分别感染细胞后发现，敲除株更易黏附在巨噬细胞表面，并且容易被吞噬，回补株黏附和被巨噬细胞吞噬数量介于野生株和敲除株二者之间(图2G-H)，而且更能促进巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A炎性基因的表达和TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A炎性因子的分泌，而回补株与野生株相比无明显差异(图2I-R)。
4、灭活疫苗的检测
将灭活疫苗涂布在马丁氏肉汤培养基上于37℃培养48h后并未发现平板上有任何菌落长出，示意疫苗灭活效果良好。将灭活疫苗3,000r/min，3min离心后并未有分层，说明疫苗乳化效果较好。将灭活疫苗预接种小鼠后，小鼠精神状态、食欲良好，背部皮下无明显肿块，表明疫苗安全性良好。
5、交叉保护效果
为了评估PmCQ2ΔhyaD的交叉保护特性，将其制备成灭活疫苗，免疫21天后进行肌肉攻毒，对牛源A型多杀性巴氏杆菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)和牛源B型多杀性巴氏杆菌PmB具有100％免疫保护，对牛源F型多杀性巴氏杆菌PmF有80％保护率；对兔源A型多杀性巴氏杆菌PmR、禽源A型多杀性巴氏杆菌PmQ和猪源A型多杀性巴氏杆菌PmP分别有90％、100％和100％的保护率(图3A-I)，说明PmCQ2ΔhyaD可以用作灭活苗抵御多杀性巴氏杆菌的感染，尤其是抵御牛源B型多杀性巴氏杆菌的感染。
6、抗体动态变化
为了监测PmCQ2ΔhyaD灭活苗免疫小鼠血清中抗体水平动态变化，采用间接ELISA方法进行抗体效价判定。结果表明抗血清对各种病原菌均有较高的抗体水平，并且基本在初免21d后抗体水平达到最高，并维持8周左右(图4A-I)，比较灭活苗免疫小鼠21d后血清抗体水平发现，抗牛源A型、B型多杀性巴氏杆菌IgG抗体水平与抗PmCQ2抗体水平无显著差异，而抗其它血清型和其它宿主来源多杀性巴氏杆菌抗体效价都低于PmCQ2(图4J)。
7、免疫攻毒后病理损伤结果评估
为了进一步验证灭活苗免疫效果，采集免疫小鼠攻毒12h后肺脏，H&E染色表明与免疫后未攻毒小鼠肺脏相比(图4T)，免疫后攻毒小鼠肺脏无明显病理损伤，部分有轻微病理损伤(图4K-S)。
8、hyaD影响PmCQ2基因表达
基于PmCQ2ΔhyaD相关生物学特性的改变，通过qRT-PCR荧光定量比较PmCQ2、PmCQ2ΔhyaD和PmCQ2ΔhyaD/phyaD相关基因表达量发现，敲除株与野生株、回补株相比其相关荚膜合成基因hexA、hexC、hexD、phyB下调；生物膜合成相关基因cya、oxyR表达上调；脂多糖LPS合成与转运相关基因lpxD、wzzE、kdsA、lptG表达下调；铁转运相关基因fecC、fecE表达下调以及其它毒力基因Pm0442、ompA表达下调；外膜蛋白相关基因metQ、plp4、plpE、lolA、lolB、lppB、pal、bamA、bamD、bamE、fbpB、fbpC、ompW、ompH、pcp、skp、hemR、fhaB2表达上调。
结果发现，与野生株相比，ΔhyaD荚膜显著减少，生物膜上升，毒力显著降低，LD50上升约6700倍，感染导致的病理损伤及其在脏器中的定植量显著降低，感染巨噬细胞，其细胞黏附量增加并易被吞噬，进而促进了细胞炎性因子表达的显著上调；以制备的ΔhyaD灭活菌苗免疫小鼠(灭活苗加强免疫1次)，每5d尾静脉采血分离血清抗体检测，免疫后21天，分别攻毒不同型和不同动物源多杀性巴氏杆菌，ΔhyaD灭活苗对牛源A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的保护率分别达到100％、100％、80％，对兔源、猪源和禽源A型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别达到90％、100％、100％。免疫攻毒后肺脏无明显病理损伤并且抗体水平在21d达到最高，并维持8周左右。因此，hyaD基因敲除后能够显著降低野生株毒力，并且对不同血清型、不同宿主来源多杀性巴氏杆菌具有交叉保护作用，为多杀性巴氏杆菌疫苗的研发提供候选靶标。
(二)qseC基因缺失株相关验证结果
1.qseC基因缺失构建及其生物学特性
本发明研究qseC基因在牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2中的作用，构建PmCQ2 qseC基因缺失株，为了研究QseC在多杀性巴氏杆菌中的作用，我们在牛多杀性巴氏杆菌荚膜血清型A菌株CQ2中构建了一个无抗性标记的qseC基因缺失株(ΔqseC)，以及来自qseC基因缺失株的qseC基因互补菌株C-qseC。PCR扩增表明qseC基因不在ΔqseC和C-qseC的染色体中，而是存在于C-qseC的质粒中(图6A)。为了进一步确认突变体和互补菌株，进行了RT-PCR，结果表明qseC基因转录物仅存在于野生型和互补菌株中，而不存在于突变体中(图6B)。ΔqseC稳定超过30代(数据未显示)，生长曲线与WT菌株相似(图6C)。ΔqseC的菌落形态远小于PmCQ2和C-qseC(图6D)。考虑到三株菌生长速度相近，且PmCQ2中荚膜多糖丰富，突变体的菌落大小可能与细胞中荚膜多糖含量降低有关。检测到从PmCQ2中提取的荚膜多糖、ΔqseC和C-qseC。与野生型相比，ΔqseC的荚膜多糖产量显着减少，其次是C-qseC(图6E)。由于荚膜多糖含量也会影响细菌的离心状态，ΔqseC细胞更容易离心到管底，上清液清澈透明(图6F)。P.multocida荚膜血清A型中荚膜多糖的产生趋势与菌株产生生物膜的倾向相反。生物膜定量检测表明，与PmCQ2和C-qseC相比，ΔqseC中的生物膜形成显着增加(图6G)，QseC正调节副猪嗜血杆菌的氧化应激、渗透压和热激抗性。然而，多杀性巴氏杆菌中的QseC参与氧化应激和渗透压抗性的负调节(图6H-I)，与副猪嗜血杆菌相反。
2.QseC对多杀性巴氏杆菌毒力的影响
QseC可以调节许多细菌病原体的毒力。为了研究其对多杀性巴氏杆菌毒力的影响，分别给小鼠注射PmCQ2、ΔqseC和C-qseC(3.48×105CFU)。感染ΔqseC的小鼠存活率明显高于感染PmCQ2或C-qseC的小鼠(图7A)。与WT和C-qseC相比，qseC突变体诱导小鼠肺内的炎症反应较弱(图7B-C)，qseC突变体感染小鼠肺内的细菌载量明显低于PmCQ2和C-qseC感染小鼠(图7D-F)。为了进一步量化qseC突变体毒力的下降，进行了50％致死剂量测定。ΔqseC经腹腔途径的LD50为5.28×107CFU，比PmCQ2(腹腔途径LD50≈1CFU)高5.28×107倍，比C-qseC(腹腔途径LD50＝2.48×104CFU)高2.1×103倍(表8)。
表8 LD50测定
Figure BDA0003311061960000171
3.ΔqseC能激发更强的抗体反应
为探讨qseC基因缺失对抗体产生的影响，采用ELISA法测定灭活PmCQ2、灭活ΔqseC和活灭活ΔqseC免疫小鼠血清IgG滴度。ΔqseC的抗体滴度显著高于PmCQ2(图8A-I)，且与灭活PmCQ2和灭活ΔqseC相比，ΔqseC活免疫产生的抗广谱多杀性巴氏杆菌菌株的抗体水平要高得多(图8A-I)。免疫小鼠抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌血清抗体滴度明显高于抗牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型、F型和其他动物多杀性巴氏杆菌荚膜A型血清抗体滴度(图8J-L)。结果表明，活的ΔqseC比灭活的PmCQ2和灭活的ΔqseC能诱导更多的交叉反应抗体。
4.ΔqseC交叉保护性测定
研究了ΔqseC对其他多杀性性巴氏杆菌血清型的交叉保护作用。昆明小鼠肌内分别接种活ΔqseC、灭活ΔqseC和灭活PmCQ2。在第一次免疫后第21天，小鼠分别受到9株多杀性性巴氏杆菌的攻击(表4)。活毒ΔqseC和灭活ΔqseC均对小鼠对多杀性性巴氏杆菌的强交叉保护作用(图9A-R)。然而，失活的PmCQ2表现出非常弱的交叉保护。用ΔqseC弱毒疫苗免疫小鼠，对牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型(图9J-M)和B型(图9N)、猪多杀性巴氏杆菌荚膜A型(图9P)和兔多杀虫荚膜A型(图9R)的感染具有100％的保护作用。而liveΔqseC对牛多杀性巴氏杆菌荚膜F型血清感染的保护率仅为30％(图9O)，对家禽多杀性巴氏杆菌荚膜A型血清感染的保护率为80％(图9Q)。虽然灭活的ΔqseC也表现出良好的交叉保护，但活的ΔqseC表现得更好(图9A-R)。结果表明，liveΔqseC有潜力作为一种抗多杀性性巴氏杆菌同源株和异源株感染的减毒疫苗。
综上，本发明通过构建PmCQ2ΔhyaD敲除株和PmCQ2ΔqseC敲除株发现，hyaD和qseC基因均能够影响PmCQ2荚膜合成、生物膜形成、生长速度和毒力，并且敲除株可以对牛源A型、B型和F型血清型以及禽源、猪源和兔源不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌毒株提供交叉保护，预示着PmCQ2ΔhyaD和PmCQ2ΔqseC灭活苗可能成为一种新的疫苗用于该类疾病的防控。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
<120> 牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2919
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hyaD基因
<400> 1
atgaatacat tatcacaagc aataaaagca tataacagca atgactatca attagcactc 60
aaattatttg aaaagtcggc ggaaatctat ggacggaaaa ttgttgaatt tcaaattacc 120
aaatgcaaag aaaaactctc agcacatcct tctgttaatt cagcacatct ttctgtaaat 180
aaagaagaaa aagtcaatgt ttgcgatagt ccgttagata ttgcaacaca actgttactt 240
tccaacgtaa aaaaattagt actttctgac tcggaaaaaa acacgttaaa aaataaatgg 300
aaattgctca ctgagaagaa atctgaaaat gcggaggtaa gagcggtcgc ccttgtacca 360
aaagattttc ccaaagatct ggttttagcg cctttacctg atcatgttaa tgattttaca 420
tggtacaaaa agcgaaagaa aagacttggc ataaaacctg aacatcaaca tgttggtctt 480
tctattatcg ttacaacatt caatcgacca gcaattttat cgattacatt agcctgttta 540
gtaaaccaaa aaacacatta cccgtttgaa gttatcgtga cagatgatgg tagtcaggaa 600
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aaagataacg gttttcaagc cagtgccgct cggaatatgg gattacgctt agcaaaatat 720
gactttattg gcttactcga ctgtgatatg gcgccaaatc cattatgggt tcattcttat 780
gttgcagagc tattagaaga tgatgattta acaatcattg gtccaagaaa atacatcgat 840
acacaacata ttgacccaaa agacttctta aataacgcga gtttgcttga atcattacca 900
gaagtgaaaa ccaataatag tgttgccgca aaaggggaag gaacagtttc tctggattgg 960
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ttagtttcaa tttatatccc agcttataac tgtgcaaact atattcaacg ttgcgtagat 1380
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tattacattg ggcagttaga ttcagatgat tatcttgagc ctgatgcagt tgaactgtgt 1620
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attgatagtg tgccagaata taacactgag gatatttggt tccaatttgc acttttaatc 2760
ttagaaaaga aaaccggcca tgtatttaat aaaacatcga ccctgactta tatgccttgg 2820
gaacgaaaat tacaatggac aaatgaacaa attgaaagtg caaaaagagg agaaaatata 2880
cctgttaaca agttcattat taatagtata actctataa 2919
<210> 2
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> qseC基因
<400> 2
atgaaatggc ttaagcaaac aagtttacga gttcgtttaa ttttcacgtt atcgttgacc 60
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cataatatgc tgattgctcg tgcccctcat aatgtgaata aacagctcaa gaaagttcgg 240
cactatgatg acgatgctct tgcttttgca atttttaatc atcgcggtga tcttctttta 300
agcgatggga ataatgggga aaatttcatt tttgcaccgc acagtggttt ttcagtcagt 360
gctatccgtg aagatgacga tcgttggcgg attttttggt tgccagtcaa tcaaggaaaa 420
tggattattg ccgtagggca agaaatggac tatcgcgaag atctgattaa ccaaatggtg 480
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gtgattagcc gtgagctgcg accgctaaaa caagtgaatg cgcagttaat gcaacgccgt 600
ccagatgata cttcactttt accgagcgaa aatttaccga cagaaatttt accgttaatc 660
cacaatttaa atcatttctt tgagcgaact gccacgatgt tattgcgtga gagacgtttt 720
acttcagatg ccgcacatga attacgtagt ccattggcgg cattgcgcat tcaaactgaa 780
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aatttagctg agttagatga aatggaagcg attcattggg agccgttaat tgcgtcttta 960
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ggacagcgtt tttatcgtcc tgcagggcaa aatgaaaagg gaagtggatt gggtttatcg 1260
attgttcagc gcattgccac cctacatcat tatcaattcc ggttagaaaa tgtgaaagat 1320
gataagggtt atataaaagg atttagatca ttgattttat taaataaaat ttaa 1374

Claims (8)

1.牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，基于牛源A型多杀性巴氏杆菌的基因缺失株，免疫接种促进动物对不同血清型、不同动物源多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护。
2.根据权利要求1所述牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，所述交叉保护是对牛源A型、B型、F型以及猪源、禽源、兔源A型多杀性巴氏杆菌感染的交叉保护。
3.根据权利要求1所述牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，所述基因缺失株为hyaD 基因的缺失。
4.根据权利要求1所述牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，所述基因缺失株为qseC基因的缺失。
5.根据权利要求3所述牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，所述基因缺失株为PmCQ2ΔhyaD，保藏于中国典型培养物保藏中心。
6.根据权利要求4所述牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，所述基因缺失株为PmCQ2ΔqseC，保藏于中国典型培养物保藏中心。
7.根据权利要求5所述牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，所述基因缺失株为PmCQ2ΔhyaD通过同源重组方法构建，包括如下步骤：
（1）用试剂盒（DP302-02，购自天根生物科技有限公司）提取野生株PmCQ2基因组DNA，以PmCQ2基因组DNA为模板，采用上下游同源臂扩增引物5’hyaDARM-F/ R和3’hyaDARM-F/R分别进行PCR扩增，扩增产物经核酸电泳后，切取目的片段采用胶回收试剂盒（CW2302M，购自康为世纪生物科技有限公司）回收，分别获纯化的226bp上游同源臂片段和251bp下游同源臂片段；
（2）以上下游同源臂片段为模板，采用5’ hyaDARM-F和3’ hyaDARM-R引物继续进行PCR扩增，经核酸电泳和胶回收后获纯化的上下游同源臂融合片段；
（3）含温敏质粒pUC19oriKanR的大肠杆菌经活化后过夜培养，采用质粒提取试剂盒（CW0500M，购自康为世纪生物科技有限公司）提取质粒，pUC19oriKanR经BamHI（1605，购自TaKaRa）和HindIII（1615，购自TaKaRa）于37℃双酶切2小时（hour，h）后，用胶回收试剂盒回收线性化载体片段；
（4）用In-Fusion® HD Cloning Kit (PT5162-1，购自Clontech)将双酶切后的线性化载体和同源臂片段于37℃恒温水浴锅中连接30分钟（minute，min）后，把连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂布在含有50 μg/mL Kan抗性LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取菌落，采用引物pUC19-F/pUC19-R进行菌落PCR，筛选出阳性克隆，其后进行测序验证；
（5）制备PmCQ2电转感受态，重组质粒经电转PmCQ2感受态后，涂布在含有100 μg/mLKan马丁氏肉汤培养基上，经PCR扩增，筛选出hyaD基因缺失菌株，并经连续传代30次保证Kan抗性消除和遗传稳定性。
8.根据权利要求6所述牛源A型多杀性巴氏杆菌基因缺失株的应用，其特征在于，所述基因缺失株为PmCQ2ΔqseC通过同源重组方法构建，包括如下步骤：
（1）用试剂盒（DP302-02，购自天根生物科技有限公司）提取野生株PmCQ2基因组DNA，以PmCQ2基因组DNA为模板，采用上下游同源臂扩增引物5’ qseCARM-F/ R和3’ qseCARM-F/R分别进行PCR扩增，扩增产物经核酸电泳后，切取目的片段采用胶回收试剂盒（CW2302M，购自康为世纪生物科技有限公司）回收，分别获纯化的350 bp上游同源臂片段和350 bp下游同源臂片段；
（2）以上下游同源臂片段为模板，采用5’ qseCARM-F和3’ qseCARM-R引物继续进行PCR扩增，经核酸电泳和胶回收后获纯化的上下游同源臂融合片段；
（3）含温敏质粒pUC19oriKanR的大肠杆菌经活化后过夜培养，采用质粒提取试剂盒（CW0500M，购自康为世纪生物科技有限公司）提取质粒，pUC19oriKanR经BamHI（1605，购自TaKaRa）和HindIII（1615，购自TaKaRa）于37℃双酶切2小时（hour，h）后，用胶回收试剂盒回收线性化载体片段；
（4）用In-Fusion® HD Cloning Kit (PT5162-1，购自Clontech)将双酶切后的线性化载体和同源臂片段于37℃恒温水浴锅中连接30分钟（minute，min）后，把连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂布在含有50 μg/mL Kan抗性LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取菌落，采用引物pUC19-F/pUC19-R进行菌落PCR，筛选出阳性克隆，其后进行测序验证；
（5）制备PmCQ2电转感受态，重组质粒经电转PmCQ2感受态后，涂布在含有100 μg/mLKan马丁氏肉汤培养基上，经PCR扩增，筛选出qseC基因缺失菌株PmCQ2ΔqseC，并经连续传代30次保证Kan抗性消除和遗传稳定性。
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