CN109207492B

CN109207492B - 一种包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因、重组表达质粒、重组乳酸杆菌及其应用

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Publication number: CN109207492B
Application number: CN201811124173.9A
Authority: CN
Inventors: 王红宁; 杨鑫; 左磊; 吴暄; 袁齐武; 李豪
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109207492A

Abstract

本发明属于基因工程和禽病疫苗技术领域，公开了一种包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因，该重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括SpUsp45‑Tuftsin、EpiC、F‑DCpep和AcmA，所述SpUsp45‑Tuftsin、EpiC、F‑DCpep和AcmA通过linker顺次连接，所述linker为氨基酸序列如GSGGS所述的柔性短肽。本发明还公布了以该重组基因制备的重组表达质粒、重组乳酸杆菌及其应用。本发明的优点在于，本发明提供的重组基因，合理整合了IBV多表位EpiC和NDV F基因，可表达至宿主表面、增强抗原免疫原性，以此制备的重组乳酸杆菌可同时免疫IB和ND的DNA，对IBV的攻毒保护达到80％，对NDV的攻毒保护达到90％，可在鸡群内可长期定植，为鸡群提供持续的免疫保护，具有广阔的应用前景和良好的社会经济效益。

Description

一种包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因、重组表达质粒、重组乳酸杆菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和禽病疫苗技术领域，具体涉及一种包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因，同时还涉及包含该重组基因的重组表达质粒和包含该重组表达质粒的重组乳酸杆菌，此外，还涉及重组基因、重组表达质粒和重组乳酸杆菌的应用。

背景技术

禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是一种可侵染鸡的呼吸系统和生殖系统，引起鸡呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等症状的急性传染病，病原为禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)。新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种急性接触传染病，主要症状为呼吸困难、黏膜出血等，鸡高度敏感，具有很高的发病率和死亡率。IB和ND都是严重危害禽养殖业的重要传染病，给我国规模化养鸡业造成了巨大的经济损失。

疫苗免疫是目前控制IB和ND疫情的最有效手段，主要包括弱毒苗和灭活苗。弱毒苗是指通过鸡胚连续传代获得的一种具有原毒株免疫原性和侵袭性的非致病疫苗。灭活苗是指用加热或化学剂(如福尔马林)将病毒灭活得到的保持病毒免疫原性的非致病疫苗。弱毒苗免疫方式简单，但存在毒力返强和散毒的风险；灭活苗相对安全，但成本较高，只能注射免疫，费时费力，对鸡造成的应激大，影响鸡的生产性能。通过多价或联苗可以在预防IB和ND的同时减少免疫次数，提高免疫效率。而传统的新支二联苗，生产成本高、免疫时间短、生产质量不稳定。

目前，随着生物技术的逐渐更新，市面上有一些IBV或NDV的DNA疫苗、多肽苗、重组活载体苗等，这类疫苗制备过程中，影响其保护力度的因素较多，如抗原基因的选择、抗原表达的持续时间和表达位置、载体的选择等均对疫苗的保护力度有重要影响，虽然现有的疫苗对IBV或NDV疫苗的研究提供了新的思路，但在实际应用过程中，这些疫苗对鸡群的保护力度达不到传统疫苗的保护力度，无法大规模推广应用。如果能开发出一种可同时免疫IBV和ND且可提供持续的免疫保护的疫苗，将对我国规模化养鸡业产生重要的影响。

乳酸菌作为体内肠道共生菌，能耐受胃肠道的高酸和高胆盐环境，同时具有抑制致病菌活性、无病原性、定植于宿主黏膜等生物特性，被认为是构建新型口服疫苗投递载体的安全材料。乳酸菌具有明显的免疫佐剂效应，能提高机体的特异性和非特异性免疫能力，已被应用于各种疾病的预防研究。利用乳酸菌投递外源抗原蛋白，口服免疫后在气管、肠道等黏膜处定植，并将抗原蛋白呈递至宿主细胞，激发宿主产生特异性细胞免疫、体液免疫和局部黏膜免疫应答。重组乳酸菌疫苗能够在黏膜水平抵御病原侵入，从而对宿主提供持续的免疫保护。乳酸菌活载体疫苗无需分离纯化，制备方法简单，生产成本低廉，易于标准化生产，在疫苗研发方面具有很大的潜力，是在黏膜水平传递外源抗原或细胞因子的理想载体。

乳酸菌载体口服疫苗具有免疫方便、成本低廉、鸡群应激小，且能同时诱导机体产生体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫等优点，逐渐受到人们的关注。目前乳酸菌作为禽用口服疫苗投递载体还不完善，其免疫效果大多比不上传统弱毒活疫苗和灭活疫苗，这主要是因为大多乳酸菌载体为标准工程菌，不能在鸡体内长期定植或定植能力差，不能为鸡提供持续的免疫保护。

由此可见，克服现有乳酸菌载体能在鸡体内长期定植或定植能力差和不能为鸡提供持续的免疫保护的缺陷，对制备重组活载体苗等有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种可表达IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因、包含该重组基因的重组表达质粒，同时还提供了可有效免疫IB和ND、能在鸡体内长期定植或定植且为鸡提供持续的免疫保护的重组乳酸杆菌，此外，还涉及重组基因、重组表达质粒和重组乳酸杆菌的应用。

本发明所采用的技术方案为：

一种包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因，为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的重组基因，该重组基因包括SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA，所述SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA通过linker顺次连接，所述linker为氨基酸序列如GSGGS所述的柔性短肽。所述linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。所述重组基因的终止密码子前的最后一个碱基和终止密码子的第一个碱基之间添加有组氨酸标签序列。

本发明还提供了一种含有前述重组基因的重组表达质粒，所述重组表达质粒由所述重组基因和表达质粒重组而成，所述表达质粒为pMG36e。

本发明还提供了一种可有效免疫IB和ND的重组乳酸杆菌，由前述的重组表达质粒转入藏鸡源唾液乳杆菌TCMM17制备而成，重组乳酸杆菌中活菌含量为1.0×10⁹CFU/mL。

本发明还提供了前述重组基因在制备免疫IB和ND的DNA疫苗、多肽疫苗或重组活载体疫苗中的应用，前述重组表达质粒在制备免疫IB和ND的多肽疫苗或重组活载体疫苗中的应用，以及前述可有效免疫IB和ND的重组乳酸杆菌在制备治疗IB和ND的药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因UTEFDA，不仅包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的序列，还包括信号肽序列SpUsp45、免疫佐剂蛋白序列Tuftsin、树突状细胞诱导肽序列DCpep及锚定序列AcmA，使得利用该重组基因制备的重组表达质粒可同时表达EpiC和NDV F基因。

本发明提供的能有效免疫IB和ND的重组乳酸杆菌，将前述重组表达质粒电转化入藏鸡源唾液乳酸杆菌，获得有效免疫IB和ND的重组乳酸杆菌。表达出的抗原片段可表达至宿主表面，诱导更强的免疫反应，增强抗原免疫原性。该重组乳酸杆菌通过口服的方式进入消化道定植后分别表达抗原蛋白IBV多表位EpiC和NDV F，保持抗原刺激状态。EpiC和NDV F被抗原呈递细胞识别，有效的诱导机体产生分泌型抗体(sIgA)以及NDV HI抗体，对IBV的攻毒保护达到80％，对NDV的攻毒保护达到90％，与传统弱毒活疫苗免疫效果相当，在鸡群内可长期定植，为鸡群提供持续的免疫保护，服用方式简单，具有广阔的应用前景和良好的社会经济效益。

附图说明

图1是本发明提供的重组乳酸杆菌的各蛋白成分SDS-PAGE的检测结果图；

图2是本发明提供的重组乳酸杆菌TCMM17-UTEFDA的各蛋白成分的Western-Blot检测结果图；

图3是本发明的实施例2中免疫程序示意图；

图4是本发明提供的IBV M41和NDV F48E9攻毒后各免疫组鸡攻毒保护率变化图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

实施例1

本实施例的目的在于提供一种重组基因UTEFDA、重组表达质粒和重组乳酸杆菌。

以Genebank中发布的乳酸乳球菌MG1363(收录号：AM406671)获得信号肽序列SpUsp45和细胞壁锚定结构域序列AcmA，选用免疫佐剂蛋白序列Tuftsin和树突状细胞诱导肽序列DCpep增强机体对抗原的免疫应答，以IBV SAIBK株的多表位基因EpiC和禽新城疫病毒F48E9株的F基因为基础材料，构建能展示宿主表面、增强抗原免疫原性的融合基因SpUsp45-Tuftsin-linker-EpiC-linker-F-DCpep-linker-AcmA(后续简写为UTEFDA)。利用同尾酶连接法和重叠延伸PCR技术等，构建得到UTEFDA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中linker的氨基酸序列为GSGGS，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。SEQ ID NO.1中划

线部分为SpUsp45序列，划

线部分为linker序列(ggttctggtggttct)，划

线部分为Epic序列，划

线部分为DCpep序列，划

线部分为AcmA序列，AcmA的终止密码子之前未划线部分为组氨酸标签，第二段linker和DCpep之间未划线部分为F基因的序列。

表1

将UTEFDA基因与pMD19T连接，得到克隆载体pMD19T-UTEFDA。将含有pMG36e空质粒和克隆载体pMD19T-UTEFDA的大肠杆菌过夜培养，提质粒，并对提取质粒进行Xba I和HindⅢ双酶切，用T4连接酶连接UTEFDA和pMG36e载体，得到重组表达质粒pMG36e-UTEFDA，将重组表达质粒pMG36e-UTEFDA电转化入藏鸡源唾液乳杆菌TCMM17感受态中，得到重组乳酸杆菌TCMM17-UTEFDA。

实施例2

本实施例的目的在于鉴定实施例1提供的重组乳酸杆菌TCMM17-UTEFDA的表达位置及免疫效力。

1主要材料

禽传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；禽新城疫病毒抗体检测试剂盒购自武汉科前；鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA抗体检测试剂盒购自南京金益柏；FITC标记的CD4+单抗、PE标记的CD8+单抗均购自NOVUS公司；IBV M41高免阳性血清购自中国兽医药品监察所。

2融合蛋白TEFDA的表达及提取

2.1融合蛋白TEFDA的提取

提取TEFDA蛋白，步骤如下：

(1)将实施例1得到的于-80℃保存的TCMM17-UTEFDA接种于5mL含200μg/mL Emr的MRS液体培养基，37℃静置培养过夜；取200μl菌液接于5mL含200μg/mL Emr的MRS液体培养基，37℃静置培养至菌液OD600值为0.4～0.6；12000rpm离心5min，分离上清液一和菌体沉淀。

(2)向上清液一中加入1/10体积预冷的100％TCA(W/V)溶液，振荡15s，冰上静置20min，12000rpm离心10min。弃上清，得到沉淀一，沉淀一用100μL预冷的丙酮洗涤两次，除去TCA。开盖室温静置10min，待丙酮挥发完全后加入50μL 50mM NaOH溶液溶解沉淀二，获得细胞外蛋白，即TCMM17-UTEFDA外蛋白。

(3)用无菌PBS洗涤步骤(1)得到的菌体沉淀2次，加入1/10体积的表面蛋白提取缓冲液(2％SDS，1％巯基乙醇)，70℃静置10min，3500rpm离心5min，分离上清液二和沉淀二，上清液二即细胞表面蛋白，即TCMM17-UTEFDA表面蛋白。

(4)取(3)得到的沉淀二，加入5mg/mL的溶菌酶，37℃振荡1h，12000rpm离心5min，取上清，获细胞内蛋白，即TCMM17-UTEFDA内蛋白。

(5)按(1)-(4)方法制备TCMM17菌株的细胞外蛋白(TCMM17外蛋白)、内蛋白(TCMM17内蛋白)及表面蛋白(TCMM17表面蛋白)，作为阴性对照。

2.2SDS-PAGE鉴定

参照《实验室SDS-PAGE操作规程》制备SDS-PAGE胶，其中分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为4.5％。取2.1制备的各蛋白成分20μl与5μl 5×SDS-PAGE loading buffer混匀后煮沸10min，12000g离心5min，取13μL上清作SDS-PAGE鉴定。电泳条件为：浓缩胶80V；分离胶120V。跑胶完成后将凝胶用考马斯亮蓝R250染色液过夜染色，然后用清水漂洗数次，最后用脱色液脱色，当出现清晰蛋白条带时照相保存。

2.3Western-blot检测

按照《实验室Western-Blot操作规程》，将跑SDS-PAGE后的蛋白电转移至PVDF膜，转膜条件为：200mA，1h；用TBST洗膜3遍，蛋白面朝下移入封闭液中，4℃静置过夜；用TBS洗膜3次，加入5mL含鸡IBV高免阳性血清或抗新城疫F基因单抗的TBS中(1：100稀释)，37℃孵育2h；用TBST洗膜3次，加入5mL HRP标记二抗(1:1000倍稀释)，37℃孵育2h；用TBST洗膜3次，用DAB试剂盒显色，观察结果并照相保存。

3结果

SDS-PAGE结果如图1所示，其中M表示Protein Marker，1表示TCMM17-UTEFDA外蛋白，2表示TCMM17-UTEFDA表面蛋白，3表示TCMM17-UTEFDA内蛋白，4表示TCMM17外蛋白，5表示TCMM17表面蛋白，6表示TCMM17内蛋白。其中泳道2、3在80-100Kda范围内有明显的目的条带，表明TCMM17-UTEFDA可成功表达UTEFDA蛋白，并且UTEFDA不仅位于位于TCMM17-UTEFDA内部，还可在TCMM17-UTEFDA表面表达。

Western-blot结果如图2所示，其中A表示TEFDA蛋白与IBV高免阳性血清反应；B表示TEFDA蛋白与抗NDV F基因单抗反应；A图和B图中M表示Protein Marker，1表示TCMM17-UTEFDA表面蛋白，2表示TCMM17-UTEFDA内蛋白，3表示TCMM17-UTEFDA外蛋白。A图和B图的泳道1和2在目标位置均有明显条带，表明TCMM17-UTEFDA表达的UTEFDA蛋白(包括TCMM17-UTEFDA表面蛋白和TCMM17-UTEFDA内蛋白)均可与NDV F基因单抗和IBV高免阳性血清反应，即TCMM17-UTEFDA蛋白有效免疫IB和ND。

实施例3

本实施例的目的在于验证重组乳酸杆菌TCMM17-UTEFDA可有效免疫IB和ND。

1鸡免疫分组及免疫程序

将孵化器进行清洗后用百毒杀消毒，将种蛋放进孵化器，37.6℃，湿度为55-60％，孵化22天后，将小鸡随机分组转移至SPF隔离器进行饲喂和免疫。设置鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗(ND LaSota+IBV H120)为疫苗对照组，本发明提供的表达IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组乳酸杆菌即唾液乳杆菌口服疫苗TCMM17-UTEFDA为实验组，野生型唾液乳杆菌TCMM17为阴性对照组，PBS为空白对照组。通过滴鼻点眼途径免疫小鸡，鸡分组及免疫方法如下表所示。

表2

将小鸡在SPF隔离器中饲养至10日龄，颈静脉采血后按照上表所示的免疫途径及剂量对小鸡进行首免，24日龄颈静脉采血后进行二免，17日龄、31日龄、38日龄进行颈静脉采血，分离血清。具体免疫程序见图3。

2鸡血清中IBV抗体检测

将前述鸡免疫分组及免疫程序中采集的鸡血液(10、17、24、31、38d)于37℃静置1h至血清析出，4℃3000g离心10min，分离浅黄色血清，将血清于-20℃保存备用。采用间接ELISA法检测鸡血清中IBV抗体。检测方法参照IDEXX禽传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒(IBV Ab)说明书进行。用SPSS软件对检测数据进行分析。各组鸡血清中IBV抗体检测结果如下表所示，同列数据肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。由表3可知，在17d-38d时，TCMM17-UTEFDA组的鸡血清中的IBV抗体水平显著低于LaSota/H120组的抗体水平，但显著高于TCMM17组或PBS组的IBV抗体水平。

表3

3鸡血清中NDV抗体及血凝抑制(HI)抗体检测

3.1鸡血清中NDV抗体检测

采用间接ELISA法检测前述鸡免疫分组及免疫程序中采集的鸡血液的血清样品中的NDV抗体。检测方法参照武汉科前新城疫病毒ELISA抗体检测试剂盒说明书进行。用SPSS软件对检测数据进行分析。各组鸡血清中NDV抗体检测结果如下表所示，同列数据肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。由表4可知，在17d-38d，TCMM17-UTEFDA组的鸡血清中的NDV抗体水平与LaSota/H120组的抗体水平基本相同，差异不显著，但二者显著高于TCMM17组或PBS组的NDV抗体水平。

表4

3.2鸡血清中NDV血凝抑制(HI)抗体检测

参照《GB/T 17999.2-2008SPF鸡红细胞凝集抑制试验》对鸡血清样品进行NDVHI抗体检测，方法如下：

(1)取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1～12列中每孔加入25μL PBS；

(2)向第1列中加入25μL/孔血清样品，充分混匀后移取25μL至第2列中，混匀后移取25μL至第3列，依次进行倍比稀释至第11列，每孔吹打3～5次充分混匀，将第11列吸取25μL/孔弃掉，设置第12列为对照列。

(3)每孔加入25μL 4个血凝单位(HAU)的NDV标准抗原，轻轻混匀，室溫作用30min；

(4)每孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液，轻轻混匀，室温(20-25℃)静置45min后观察结果。用SPSS软件对数据进行分析。

各组鸡血清中NDV HI抗体检测结果如在下表所示，同列数据肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。由表5可知，在17d-38d，TCMM17-UTEFDA组的鸡血清中的HI抗体水平与LaSota/H120组的抗体水平，但二者显著高于TCMM17组或PBS组的HI抗体水平。

表5

4鸡气管和肠道中分泌型抗体(sIgA)检测

分别于10、17、24、31、38d扑杀各免疫组小鸡3只，采集气管和肠管，用无菌PBS清洗干净，收集气管内冲洗液和肠管内冲洗液，作鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)检测，操作方法参照鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA抗体检测试剂盒说明书进行。用SPSS软件对数据进行分析。

表6

表7

各免疫组气管冲洗液中sIgA抗体水平测定结果如表6所示，各免疫组肠管冲洗液中sIgA抗体水平测定结果如表7所示。表6和表7中，同列数据肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。由表6和表7可知，在17d-38d，TCMM17-UTEFDA组的气管和肠管冲洗液中sIgA抗体水平均显著高于LaSota/H120组的sIgA抗体水平，LaSota/H120组显著高于TCMM17组或PBS组的sIgA抗体水平。

5鸡血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞检测

于38d采集各组鸡翅静脉鲜血，作CD4+、CD8+T淋巴细胞检测，操作方法如下：

(1)采集鸡翅静脉鲜血2mL，注入盛有肝素的无菌小管中，加盖后立即轻轻摇匀，使血液抗凝；加入2mL无菌PBS，将血液等倍稀释后沿管壁缓慢加入装有2mL聚蔗糖－泛影葡胺分层液的离心管上层。

(2)将离心管置于水平式离心机内，2000rpm离心20min。用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出灰白色层的淋巴细胞，装入新的离心管中；加入5mL PBS，混匀，1500rpm离心10min，弃上清，PBS重复洗涤细胞1次，用PBS重悬细胞，调整细胞悬液浓度为1×10⁶个/mL。

(3)往每管淋巴细胞悬液中加入CD4+、CD8+单克隆抗体，室温作用20-30min，离心5min，弃上清，加入300μL PBS重悬细胞；用流式细胞仪进行T淋巴细胞检测。用SPSS软件对数据进行分析。

表8

组别	PBS	TCMM17	LaSota/H120	TCMM17-UTEFDA
					CD4+(％)	5.44±0.37<sup>c</sup>	5.67±0.47<sup>c</sup>	33.03±1.62<sup>b</sup>	40.62±1.72<sup>a</sup>
CD8+(％)	4.82±0.39<sup>c</sup>	5.28±0.40<sup>c</sup>	24.85±1.4<sup>b</sup>	33.86±1.84<sup>a</sup>
					CD4+/CD8+	1.13	1.07	1.32	1.20

各免疫组血液CD4+、CD8+T淋巴细胞检测结果如表8所示，表8中，同行数据肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。由表8可知，在38d，TCMM17-UTEFDA组的CD4+和CD8+水平均显著高于LaSota/H120组，LaSota/H120组显著高于TCMM17组或PBS组的CD4+和CD8+水平。

6IBV和NDV攻毒保护试验

38日龄，将实验鸡群分为A组(A1-A4)和B组(B1-B4)，每组10只，进行攻毒保护实验。

A组：攻毒毒株为IBV M41毒株，攻毒剂量为10³EID₅₀/0.2mL，攻毒方式为滴鼻点眼。攻毒后弃掉24h内死亡鸡只，统计2周内每天鸡只发病情况和死亡情况。2周后(52日龄)，将鸡全部进行安乐死，解剖后采鸡气管、心脏、肝脏、肺、肾脏，通过RT-PCR方法对IBV病毒进行检测，计算保护率。保护率＝IBV RT-PCR阴性数/总数。RT-PCR检测方法参照实施例1中方法进行。用SPSS软件对数据进行分析。

B组：攻毒毒株为NDV F48E9毒株，攻毒剂量为10⁶EID₅₀/0.2mL。攻毒方式为滴鼻点眼。攻毒后弃掉24h内死亡鸡只，统计2周内每天鸡只发病情况和死亡情况。2周后(52日龄)，将鸡全部进行安乐死，解剖后采鸡气管、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏，通过RT-PCR方法对NDV病毒进行检测，计算保护率。保护率＝NDV RT-PCR阴性数/总数。用SPSS软件对数据进行分析。

表9

攻毒后各免疫组鸡的发病和保护情况统计结果表9和图4所示。由表9和图4可知，A组鸡群攻IBV M41毒株后，重组疫苗TCMM17-UTEFDA可为免疫鸡群提供90％的保护率，与LaSota/H120保护率相当(90％)；B组鸡群攻NDV F48E9毒株后，TCMM17-UTEFDA可为免疫鸡群提供90％的保护率，略低于LaSota/H120组(100％)，PBS和TCMM17对IBV和NDV均不能提供免疫保护，表明重组乳酸杆菌TCMM17-UTEFDA能够为免疫鸡提供较高的对IBV和NDV攻毒保护，均达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001版)》关于IBV活疫苗和NDV活疫苗对鸡的攻毒保护的要求(IBV：80％；NDV：90％)。

IBV血清型众多，我国主要有Mass型、T型、Hotle型和Gray型等，在病毒复制过程中易发生突变和重组，且常规IBV疫苗对不同血清型IBV的交叉保护能力较弱。发明人前期研究发现，由IBV SAIBk毒株的S1和S2基因中相对保守的B细胞表位(E1：540-563；E2：237-252)、N基因的T细胞表位(E3：66-82)和进化保守的N蛋白C端120个残基序列(E4：289-409)经柔性linker(AAY)串联而成的IBV多表位EpiC基因，该多表位基因具有高度的亲水性、抗原指数性和表面可能性。利用IBV多表位EpiC制备的多肽苗和DNA疫苗免疫鸡群后能激发SPF鸡产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应，能为IBV不同血清型毒株提供高水平的交叉保护。因此，本发明中选择IBV多表位EpiC基因作为IBV抗原基因。NDVF基因是NDV的主要抗原基因，F蛋白决定NDV感染细胞的能力和NDV毒力。不同NDV毒株F基因具有高度同源性和较高的遗传稳定性，是研究鸡新城疫基因工程疫苗的首选抗原基因，能为NDV不同血清型毒株提供交叉保护。因此，本研究选择NDVF48E9株F基因作为NDV抗原基因。

本发明提供的重组基因UTEFDA：SpUsp45信号肽序列(81bp)能高效、稳定地引导外源蛋白在乳酸杆菌内的表达和分泌；N-乙酰胞壁质酶AcmA是乳酸乳球菌合成的一种自溶素，可将外源蛋白锚定至细菌表面实现抗原的表面展示；Tuftsin是IgG重链Fc片段经酶解后获得的一个四肽(Thr-Lys-Pro-Arg)，能够被巨噬细胞表面受体特异性识别，从而引导目的蛋白被巨噬细胞递呈，增强外源蛋白的免疫原性，诱导机体对外源抗原蛋白产生更强的免疫应答；树突状细胞诱导肽(DCpep)是由36个碱基组成的短肽，能依据树突状细胞(DCs)对目的抗原基因的修饰进而发挥增强DCs递呈抗原的效果，引发肠道内高效的粘膜免疫反应，提高目的抗原的免疫保护作用。

为了充分发挥各基因元件的功能，提高IBV多表位EpiC和NDVF基因的免疫原性，本发明在各元件之间添加间隔序列柔性短肽“GSGGS”，以提高蛋白酶水解和抗原递呈的效率，同时避免了产生新的表位，实施例2中验证数据表明柔性短肽的添加，有效防止Tuftsin蛋白、EpiC蛋白、F蛋白和AcmA蛋白之间的空间位阻，不影响各蛋白独立的生物活性，有效消除了两表位连接处形成新的表位，防止蛋白质之间彼此缠绕折叠，维持其独立的空间构象，发挥各自的生物活性，避免了对原有表位的影响。

质粒pMG36e是目前应用较多的一个乳酸菌表达载体，能够高效表达外源基因，安全性高，但是质粒pMG36e中不含信号肽序列和锚定序列，不能实现外源蛋白的分泌和锚定，一定程度上限制了其作为疫苗载体的应用。本发明首次在构建融合抗原基因(重组基因)时引入了SpUsp45信号肽序列、锚定序列AcmA、免疫增强序列Tuftsin和DCpep序列，并克隆至质粒pMG36e中，成功实现了IBV多表位EpiC和NDVF基因在重组乳酸菌中的高效表达、分泌和锚定，并成功制备了与传统弱毒活疫苗免疫效果相当，在鸡群内可长期定植，为鸡群提供持续的免疫保护，服用方式简单的重组活载体疫苗(重组乳酸杆菌TCMM17-UTEFDA)。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因、重组表达质粒、重组乳酸杆菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatgaagaag aagattattt ctgctatttt aatgtctaca gttattttat ctgctgctgc 60

tccattatct ggtgtttacg ctacaaagcc acgtggttct ggtggttctg aaaacgttgc 120

taactgtcca tacgtttcgt acggtaagtt ctgcattaag ccagatggtt ctattgctac 180

agctgcttac caatacaaca caggtaactt ttctgatggt ttttacccat ttacaaacgc 240

tgcttaccaa catggttact ggcgtcgtca agctcgttac aagccaggta agggtggttc 300

tggtagttta caaccagatg gtctccattt aaagtttgaa tttacaacag ttgttccatg 360

tgatgatcca caatttgata actacgttaa gatttgtgat caatgtgttg atggtgttgg 420

tacacgtcca aaggatgatg aaccacgtcc aaagtctcgt tcttcttctc gtccagctac 480

acgtggtaac tctccagctc cacgtcaaca acgtccaaag aaggaaaaga agccaaagac 540

acaagatgat gaagttgata aggctttaac accagatgaa gaacgtaaca acgctcaatt 600

agaatttgat gatgaaccaa aggttattaa ctggggtgat tctgctttag gtgaaaacga 660

attaggttct ggtggttcta tgggccccaa atcttctacc aatgtcccag cacctctgat 720

gctgaccgtc aggattgcgc tggcactgag ctgtgtccgt ctgacaaatt ctctcgatgg 780

aaggcctctt gcagctgcag ggattgtagt aacgggagac aaagcagtca acatatacac 840

ctcatctcag acagggtcaa taatagtcaa gttactccca aatatgccta aggataaaga 900

ggcgtgtgca aaagccccgt tggaggcata caacaggaca ctgactactt tgctcacccc 960

ccttggtgat tctatccgca ggatacaaga gtctgcgact acgtccggag gaaggaggca 1020

gagacgcttt ataggtgcca ttatcggcag tgtagctctt ggggttgcca cagatgccca 1080

gataacagca gcctcagctc tgatacaagc caaccagaat gctgccaaca tcctccggct 1140

taaagagagc attgctgcaa ctaatgaagc tgtacatgaa gtcactgacg gattatcgca 1200

actagcagtg gcagttggga agatgcagca gtttgttaat gaccagttta ataacacagc 1260

tcaggaattg gactgtataa aaattacaca gcaggttggt gtagaactca acctgtacct 1320

aactgaattg actacagtat tcgggccaca aatcacttcc cctgccttaa ctcagctgac 1380

tatccaggcg ctttacaatc tagctggtgg taatatggat tatttgttga ctaagttagg 1440

tgttgggaac aaccaactca gctcattaat cggtagcggc ttgatcaccg gtaaccctat 1500

tctgtacgat tcacagactc aactcttagg tatacaggta actttaccct cagtcggtaa 1560

cctaaataat atgcgtgcta cctacttgga gaccttgtct gtaagcacaa ccaagggatt 1620

tgcctcagca cttgtcccaa aagtggtgac acaggtcggg tctgtgatag aggaacttga 1680

cacctcatac tgtgtagaga ccgatttgga tttatattgt acaagaatag tgacattccc 1740

tatgtctcct ggtatttatt cctgtctgag cggtaataca tcagcttgca tgtattcaaa 1800

gactgaaggt gcacttacta cgccatatat gactatcaag ggctcagtta ttgccaattg 1860

caagatgaca acatgcagat gtgcagaccc tccgggtatc atatcgcaaa attatggaga 1920

agctgtgtct ctaatagata ggcactcatg caatgtctta tccttagacg ggataacttt 1980

gaggctcagt ggagaatttg acgtaactta tcaaaagaat atctcaatat tagattctca 2040

ggtaatagtg acaggcaatc tcgatatctc aactgaactt gggaatgtca acaactcgat 2100

aagtaatgct ttggataagt tagaggaaag caatagcaaa cttgacaaag tcaatgtcaa 2160

gctgaccggc acgtctgctc tcattaccta tatagtttta actatcatat ctcttgtttg 2220

tggtatactt agcctggttc tagcatgcta tctgatgtat aagcaaaagg cgcaacaaaa 2280

gaccttatta tggcttggga ataataccct aaatcagatg agggccacta caagaatctt 2340

ctacccatca taccattcaa ctccacaacg tccaggttct ggtggttctg atggtgcttc 2400

ttctgctggt aacacaaact ctggtggttc tacaacaaca aacacaaaca acaactctgg 2460

tacaaactct tcttctacaa catacacagt taagtctggt gatacattat ggggtatttc 2520

tcaacgttac ggtatttctg ttgctcaaat tcaatctgct aacaacttaa agtctacaat 2580

tatttacatt ggtcaaaagt tattattaac aggttctgct tcttctacaa actctggtca 2640

tcatcatcat catcactag 2659

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttctggtg gttct 15

Claims

1.一种包含IBV多表位EpiC和NDV F基因的重组基因，其特征在于：为核苷酸序列如SEQID NO.1所示的重组基因，该重组基因包括SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA，所述SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA通过linker顺次连接，所述linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种含有权利要求1所述的重组基因的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒由所述重组基因和表达质粒重组而成，所述表达质粒为pMG36e。

3.一种可有效免疫IB和ND的重组乳酸杆菌，其特征在于：由权利要求2所述的重组表达质粒转入宿主菌制备而成。

4.一种权利要求1所述的重组基因在制备免疫IB和ND的DNA疫苗、多肽疫苗或重组活载体疫苗中的应用。

5.一种权利要求2所述的重组表达质粒在制备免疫IB和ND的多肽疫苗或重组活载体疫苗中的应用。

6.一种权利要求3所述的可有效免疫IB和ND的重组乳酸杆菌在制备治疗IB和ND的药物中的应用。