CN104651316B - 一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法，首次实现了在基因工程细胞内部表达形成猪圆环病毒病毒样颗粒(VLP)，实验结果表明，该重组猪圆环病毒病毒样颗粒能够特异性地与抗猪圆环病毒抗体结合，且能够诱发动物体产生抗猪圆环病毒的免疫反应。

Description

一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，公开了一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法。

背景技术

巴斯德毕赤酵母作为一种宿主菌，其表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力等自身优势，实质越来越受到关注，其研究和商业价值也不断体现。巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。分泌表达的蛋白在培养基中会被自身分泌的蛋白酶降解，由于甲醇酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会随着细胞密度的增高而增高。此外，该分泌表达系统发酵周期较长，易污染，且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达。因此，促进重组蛋白的胞内表达并缩短发酵周期具有很重要的工业意义。

病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLP)是含有病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸(DNA/RNA)，不能自主复制，其在形态上与真正的病毒粒子相同或相似，可通过与病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VLPs产生的机体防护水平。

目前活病毒疫苗的缺陷就是一旦病毒活性恢复，安全性不能保证。同时，灭活病毒疫苗可因灭活过程不完全而导致安全性问题。但VLPs疫苗没有感染性，稳定性好，不易失活，具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；

并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLP)。

在另一优选例中，所述病毒为猪圆环病毒，优选地为猪圆环病毒2型。

在另一优选例中，所述病毒样颗粒为猪圆环病毒2型Cap蛋白形成的病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞，更优选为毕赤酵母KM71菌株。

在另一优选例中，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终止密码子。

在另一优选例中，所述的起始密码子和所述外壳蛋白的ORF序列直接相连。

在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌表达元件。

在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌肽、引导肽、或信号肽。

在另一优选例中，所述外壳蛋白基因为猪圆环病毒ORF2抗原基因。

在另一优选例中，所述猪圆环病毒ORF2抗原基因序列如SEQ ID NO.:1所示(含起始密码子和终止密码子)。

在另一优选例中，所述表达载体以毕赤酵母pPICX载体为骨架。

本发明的第二方面，提供了一种病毒样颗粒(VLP)，所述VLP由本发明第一方面所述的基因工程细胞表达。

本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第二方面所述的病毒样颗粒，和药学上可以接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

本发明的第四方面，提供了一种制备VLP的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第一方面所述的细胞，从而表达出本发明第二方面所述的病毒样颗粒(VLP)；和

分离所述病毒样颗粒(VLP)。

本发明的第五方面，提供了一种分离的经密码子优化的多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO.:2所示的多肽；并且所述多核苷酸选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的

多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个

(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明的第六方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第五方面所述的多核苷酸。

本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第六方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第五方面所述的多核苷酸。

本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第二方面所述的病毒样颗粒(VLP)、本发明第五方面所述的多核苷酸或者本发明第六方面所述的表达载体或者本发明第七方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、qui l A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。

本发明的第九方面，提供了一种分离的重组多肽，所述重组多肽中具有猪圆环病毒Cap蛋白的氨基酸序列，并且所述重组多肽被包装为病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述的重组多肽由本发明第一方面所述的基因工程细胞表达。

在另一优选例中，所述重组多肽具有如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重组多肽具有以下特性：

(1)能够特异性地与抗猪圆环病毒抗体结合；和/或

(2)能够诱发动物体产生针对猪圆环病毒的免疫反应。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了PCVCAPS基因的核苷酸及编码的氨基酸序列。

图2显示了Western blot检测PCV2cap蛋白在毕赤酵母中的表达。

图3显示了ELISA检测标准曲线图。

图4显示了PCV2VLP Optiprep密度梯度离心的结果。

图5显示了电镜负染实验观察PCV2病毒颗粒。

图6显示了VLP免疫小鼠后血清IPMA结果，其中图A、图B为阳性结果，图C为阴性结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒，首次实现了在基因工程细胞内部表达形成猪圆环病毒病毒样颗粒(VLP)，实验结果表明，该重组猪圆环病毒病毒样颗粒能够特异性地与抗猪圆环病毒抗体结合，且能够诱发动物体产生抗猪圆环病毒的免疫反应。本发明还提供了上述重组猪圆环病毒病毒样颗粒的制备方法。

猪圆环病毒

本发明选取猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VLPs为报告蛋白。PCV2的感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的发生密切相关，其感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要原因之一。而且由于疫苗抗原的制备成本居高不下，导致市场供应的各种PCV2疫苗单头份价格在8～48元人民币之间，高昂的疫苗价格严重制约了PCV2疫苗的推广使用。因此，本发明提供的VLPs疫苗能够在动物病毒性传染病毒控制工作中发挥了巨大的作用，对PMWS的防治及养猪业的发展有重要的战略和现实意义。

优选地，本发明的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VLPs的氨基酸序列如下：

MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVKATTVRTPSWAVDMMRFNLDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVPKVTAQTYDPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKP(SEQ ID NO.:2)；

其优化后的编码核苷酸序列优选如下：

GGATCCAAACGATGACTTATCCAAGAAGAAGATACAGAAGAAGAAGACACAGACCTAGATCCCATCTGGGTCAGATCCTGAGAAGAAGACCTTGGCTGGTTCATCCTAGACACAGATACAGATGGAGAAGAAAGAACGGTATCTTCAACACCAGACTGTCCAGAACCTTCGGTTACACTGTCAAGGCTACCACTGTCAGAACTCCATCTTGGGCTGTCGATATGATGAGATTCAACCTGGACGACTTCGTTCCACCTGGTGGTGGTACTAACAAAATCTCCATCCCATTCGAGTACTACAGAATCAGAAAGGTCAAGGTCGAGTTCTGGCCATGCTCTCCAATCACTCAGGGTGACAGAGGTGTTGGTTCTACTGCTGTCATTCTGGATGACAACTTCGTCCCAAAGGTCACTGCACAAACCTACGATCCATACGTCAACTACTCTTCCAGACACACCATCCCACAACCATTCTCCTACCACTCCAGATACTTCACTCCTAAGCCTGTTCTGGACTCCACTATCGACTACTTCCAACCAAACAACAAGAGAAACCAGCTGTGGCTGAGATTGCAGACCTCCAGAAACGTTGATCATGTTGGTCTGGGTACTGCATTCGAGAACTCCATCTACGATCAGGACTACAACATCAGAGTCACCATGTACGTCCAGTTCAGAGAGTTCAACCTGAAGGACCCACCACTGAAGCCATAAGAGCTCGCGGCCGC(SEQ ID NO.:1)。

相关序列信息请见图1。

基因工程细胞

本发明提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；

并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLP)。

在另一优选例中，所述病毒为猪圆环病毒，优选地为猪圆环病毒2型。

在另一优选例中，所述病毒样颗粒为猪圆环病毒2型Cap蛋白形成的病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞，更优选为毕赤酵母KM71菌株。

在另一优选例中，所述的细胞不来自猪细胞。

在另一优选例中，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终止密码子。

本发明中，术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

基因工程细胞发酵方法

本发明提供一种提高重组病毒样颗粒(VLP)在毕赤酵母胞内表达量的发酵工艺，以解决发酵工艺中胞内重组蛋白表达量低的问题。

优选地，本发明的发酵方法技术方案如下：

(1)一级种子制备：将-70℃甘油管保存的菌株在YPD培养基平板上进行划线，放置于恒温培养箱中培养，培养温度接28℃，培养时间52-56小时。

(2)二级种子制备：从新鲜平板培养基上挑取一级种子菌落接入二级种子培养基(30ml/250ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间21-23小时。

(3)三级种子制备：将二级种子培养液按1％的比例转种于三级摇瓶种子培养基(200ml/1000ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间21-23小时。

(4)发酵工艺：将三级种子培养液按10％的比例转接于发酵培养基(20L/42L)中，发酵罐通过自动调节搅拌转速和通气量，控制溶解氧在30±1％，控制温度为28±1℃，流加质量浓度为25％～28％的氨水控制pH 5.0±0.1，控制搅拌转速300～600rpm/min，培养18-19小时，待甘油残余量为0～10g/L，以梯度流加的方式补加甘油或甲醇，发酵培养46-50小时。

(5)甘油补料：发酵培养进行到18-19小时，以10-70g/(L.h)的流速补加500ml/L的甘油补料液(含12ml/L PTM1诱导液)，在开始补加的前3-4小时内，使发酵液中的甘油残量在2-10g/L，后续补加过程中，维持发酵液中的甘油残量为0。

(6)甲醇诱导：发酵培养进行到29-31小时，菌体湿重达到380g/L-410g/L时，进行饥饿处理2小时后，以1-7g/(L.h)的流速补加纯甲醇(含12ml/L PTM1诱导液)诱导产PCV2Cap VLPs。诱导14-17小时。

在另一优选例中，所述一级种子培养基的组成为(g/L)：含蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，琼脂粉15-20，pH自然。

在另一优选例中，所述二级和三级种子培养基的组成为(g/L)：含蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，pH自然。

在另一优选例中，所述发酵培养基的组成为：40g/L甘油，0.93g/L CaSO₄，18.2g/LK₂SO₄，14.9g/L MgSO₄，4.13g/L KOH，10g/L(NH₄)₂SO₄，26.7ml/L85％的磷酸，4.35ml/LPTM₁。

在另一优选例中，所述PTM1诱导液的组成为：CuSO₄·5H₂O 6g/L，NaI 0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄5ml/L。

在另一优选例中，所述甘油残余量的测定方法：取一定量发酵液12000rpm/min离心2min，将获得的1ml发酵液上清液、9ml纯化水和10ml高碘酸钠(0.1M)混合，并加入2滴酚酞后摇匀，暗反应5min；在反应后的溶液中加入5ml乙二醇(25％)，摇匀后暗反应5min；反应结束后用NaOH(0.05M)滴定，记录NaOH消耗体积V；甘油残余量(g/L)＝(V-8)*4.6。发酵培养18-19小时后，每个1.5小时，对发酵液中甘油残余量进行一次测定，根据测定结果调整补加甘油的流速，在开始补加的前3-4小时内，使发酵液中的甘油残量在2-10g/L，后续补加过程中，维持发酵液中的甘油残量为0。

本发明采用诱导控制工艺结合恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵控制工艺，提高了目的蛋白的胞内表达量。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组病毒样颗粒(VLP)或本发明的可编码重组病毒样颗粒的多核苷酸，以及(i i)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组病毒样颗粒或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组病毒样颗粒或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(1)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组病毒样颗粒或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予重组病毒样颗粒疫苗，即重组病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：猪圆环病毒感染等。

在各疫苗剂份中所选用的重组病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点在于：

(1)首次实现了在基因工程细胞内部表达形成猪圆环病毒病毒样颗粒(VLP)；

(2)本发明的重组猪圆环病毒病毒样颗粒能够特异性地与抗猪圆环病毒抗体结合，可以用于猪圆环病毒抗体的检测。

(3)本发明的重组猪圆环病毒病毒样颗粒能够诱发动物体产生抗猪圆环病毒的免疫反应。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1基因工程细胞的构建

猪圆环病毒ORF2抗原基因经化学合成后，定名为PCVCAPS(图1)，带有合成基因的质粒编号为YR1765(质粒骨架为pUC18质粒，购自上海铭睿生物科技有限公司)，PCVCAPS基因两端的限制性内切酶切点分别为BamHI和NotI。

YR1765质粒经过BamHI和NotI酶切后，回收727bp的片段，和同样双酶切并回收载体的毕赤酵母pPICX载体(购自Invitrogen公司)连接，构成重组载体pPICX[PCVCAPS]，定名为YR2590。

对YR2590质粒进行BglII酶切，酶切产物与毕赤酵母菌株KM71[his4,aox1::ARG4；arg4](购自于Invitrogen公司)混合后进行电转,随后将酵母转化子塗在含G418的平板进行筛选生长。对长出的单个酵母克隆分别进行摇瓶扩增和表达分析，成功获得了能够稳定表达PCV2 Cap VLPs的工程菌株。

实施例2目标蛋白的发酵

1.种子培养:

一级种子培养：将-70℃甘油管保存的菌株在YPD培养基平板上进行划线，放置于恒温培养箱中培养，培养温度接28℃，培养时间56小时。

二级种子培养：从新鲜平板培养基上挑取一级种子菌落接入二级种子培养基(30ml/250ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间23小时。

三级种子培养：将二级种子培养液按1％的比例转种于三级摇瓶种子培养基(200ml/1000ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间21小时。

2.发酵产目的蛋白:

分批发酵阶段：三级种子培养液按10％的比例转接于发酵培养基(20L/42L)中，发酵罐通过自动调节搅拌转速和通气量，控制溶解氧在30％，控制温度为28℃，流加质量浓度为28％的氨水控制pH 5.0，培养19小时。

补料发酵阶段：发酵培养进行到19小时，开始梯度恒速流加500ml/L的甘油补料液(含12ml/L PTM1诱导液)，在流加的前3个小时内，以10-40g/(L.h)的流速补加甘油补料液，使发酵液中的甘油残量在2-10g/L，后续补加过程中，维持发酵液中的甘油残量为0，在发酵培养进行到22-25.5小时，以22-50g/(L.h)的流速补加甘油补料液，在发酵培养进行到25.5-29小时，以44-52g/(L.h)的流速补加甘油补料液，使菌体以0.15-0.06h^-1的比生长速率进行生长。

诱导培养阶段：发酵培养进行到29小时，菌体湿重达到380g/L-410g/L时，进行饥饿处理2小时后，以1-7g/(L.h)的流速补加纯甲醇(含12ml/L PTM1诱导液)诱导产PCV2CapVLPs。诱导16小时左右，胞内目标蛋白相对阳性标准品的表达量是0.7。

实施例3目标蛋白的发酵

1.种子培养：

一级种子培养：将-70℃甘油管保存的菌株在YPD培养基平板上进行划线，放置于恒温培养箱中培养，培养温度接28℃，培养时间56小时。

二级种子培养：从新鲜平板培养基上挑取一级种子菌落接入二级种子培养基(30ml/250ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间23小时。

三级种子培养：将二级种子培养液按1％的比例转种于三级摇瓶种子培养基(200ml/1000ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间21小时。

2.发酵产目的蛋白：

分批发酵阶段：三级种子培养液按10％的比例转接于发酵培养基(20L/42L)中，发酵罐通过自动调节搅拌转速和通气量，控制溶解氧在30％，控制温度为28℃，流加质量浓度为28％的氨水控制pH 5.0，培养19小时。

补料发酵阶段：发酵培养进行到19小时，开始梯度恒速流加500ml/L的甘油补料液(含12ml/L PTM1诱导液)，在流加的前3个小时内，以10-40g/(L.h)的流速补加甘油补料液，使发酵液中的甘油残量在2-10g/L，后续补加过程中，维持发酵液中的甘油残量为0，在发酵培养进行到22-25.5小时，以22-50g/(L.h)的流速补加甘油补料液，在发酵培养进行到25.5-29小时，以46-65g/(L.h)的流速补加甘油补料液，使菌体以0.16-0.07h^-1的比生长速率进行生长。

诱导培养阶段：发酵培养进行到29小时，菌体湿重达到380g/L-410g/L时，进行饥饿处理2小时后，以1-7g/(L.h)的流速补加纯甲醇(含12ml/L PTM1诱导液)诱导产PCV2CapVLPs。诱导16小时左右，胞内目标蛋白相对阳性标准品的表达量是1.43。

实施例4目标蛋白的发酵

1.种子培养：

一级种子培养：将-70℃甘油管保存的菌株在YPD培养基平板上进行划线，放置于恒温培养箱中培养，培养温度接28℃，培养时间56小时。

二级种子培养：从新鲜平板培养基上挑取一级种子菌落接入二级种子培养基(30ml/250ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间23小时。

三级种子培养：将二级种子培养液按1％的比例转种于三级摇瓶种子培养基(200ml/1000ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm/min，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间21小时。

2.发酵产目的蛋白：

分批发酵阶段：三级种子培养液按10％的比例转接于发酵培养基(20L/42L)中，发酵罐通过自动调节搅拌转速和通气量，控制溶解氧在30％，控制温度为28℃，流加质量浓度为28％的氨水控制pH 5.0，培养19小时。

补料发酵阶段：发酵培养进行到19小时，开始梯度恒速流加500ml/L的甘油补料液(含12ml/L PTM1诱导液)，在流加的前3个小时内，以10-40g/(L.h)的流速补加甘油补料液，使发酵液中的甘油残量在2-10g/L，后续补加过程中，维持发酵液中的甘油残量为0，在发酵培养进行到22-25.5小时，以22-50g/(L.h)的流速补加甘油补料液，在发酵培养进行到25.5-29小时，以52-70g/(L.h)的流速补加甘油补料液，使菌体以0.16-0.11h^-1的比生长速率进行生长。

诱导培养阶段：发酵培养进行到29小时，菌体湿重达到380g/L-410g/L时，进行饥饿处理2小时后，以1-7g/(L.h)的流速补加纯甲醇(含12ml/L PTM1诱导液)诱导产PCV2CapVLPs。诱导16小时左右，胞内目标蛋白相对阳性标准品的表达量是0.37。

实施例5

一、Western blot检测PCV2VLP蛋白在毕赤酵母中的表达

1实验材料：

器材：电泳仪，转膜仪，离心机，振荡器，PVDF膜；

试剂：anti-PCV2cap antibody，anti-mouse HRP antibody，脱脂奶粉，DAB显色液，5xSDS-PAGE loading buffer，protein lysi s buffer，Tri s-Glycine runningbuffer，Tris-Glyc ine transfering buffer，TBST washing buffer，1.5M Tris(PH8.8)，1.0M Tris(PH6.8)，10％APS，TEMED，10％SDS，聚丙稀酰胺。

2试验方法：

1)称取100mg诱导表达后的毕赤酵母(实施例3中方法制备)在1.5mlEP管中，加入一定量的玻璃珠，量取500ul加有蛋白酶抑制剂的裂解液到1.5mlEP管中；

2)将1)的EP管在振荡器上振荡30s后在冰上放置30s，重复振荡10次，在4℃，12000rpm离心10min，取上清做western blot；

3)取2)上清80ul，加入5xSDS-PAGE loading buffer混匀，在100℃煮沸5min；

4)将准备好的蛋白胶安装在电泳架上，放入电泳槽中，灌入电泳buffer，拔去梳子，在加样孔中加入30ul处理好的蛋白样品，加样完后进行电泳：100V，20min后150V，1h；

5)电泳完毕后采用湿转移法将蛋白转移到PVDF膜上，200mA，1h；

6)转膜结束将膜放入塑料小盒中，加入5％脱脂奶粉在室温摇床摇荡封闭1h以消除非特异背景；

7)封闭完毕，TBST洗3次，每次5min；

8)加入1％脱脂奶粉稀释的anti-PCV2cap一抗，于室温摇床摇荡孵育2h(或4℃孵育过夜)；

9)孵育结束回收一抗，用TBST洗3次，5min/次；

10)加anti-mouse HRP二抗，于摇床上室温孵育1h；

11)用TBST洗3次，每次5min；

12)将PVDF膜放入显色液中，观察显色结果。

3实验结果

将表达PCV2cap蛋白的毕赤酵母用甲醇进行诱导表达，称取100mg诱导表达的菌体进行机械破碎，离心取上清进行样品处理，做western blot检测PCV2cap蛋白在毕赤酵母中的表达情况，结果如图2所示，PCV2cap蛋白在毕赤酵母中的到成功表达，蛋白大小在32.8kDa左右。

二、ELISA检测PCV2VLP蛋白在毕赤酵母中的表达

1实验材料：

器材：酶标仪，酶标板，37℃温箱。

试剂：PCV2ELISA检测试剂盒(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)，1％BSA稀释液，PBST，PCV2阴性对照，PCV2阳性对照，anti-PCV2HRP抗体(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)，0.5M碳酸盐缓冲液，PCV2高免血清，5％蔗糖，2％BSA，PBS。

2实验方法

(1)ELISA包被板的制备：

①包被液的配制：0.5M碳酸盐缓冲液(pH9.6)

Na₂CO₃：0.159g

NaHCO₃：0.293g

加去离子水或蒸馏水至100ml，溶解混匀，调pH至9.6。

②将PCV2高免血清用包被液稀释1000倍后，酶标板上每孔加入100ul，置于温盒中37℃孵育1h，再置于4℃过夜。

③次日洗涤，弃去孔内液体，用PBST洗涤液洗涤1次，3min，每孔加入洗涤液300ul。

④封闭：甩掉PBST。再用吸水纸叩甩干，加入含5％蔗糖和2％BSA的PBS，即封闭液中，每孔100ul，37℃温箱封闭2h。

⑤倒掉封闭液，冷风将96孔酶标板吹干，可使用吹风机。

⑥用抽真空机对包被好的酶标板进行抽真空，并密封，-20℃保存。

⑦对包被板进行效果验证：用包好的板检测标准阳性对照，如果效价与标准阳性对照一致，表示包被板的质量可靠。

(2)ELISA检测：

①预温：根据需要检测的样品量，取出适量的ELISA反应条(包被好的ELISA板)，洗涤液，稀释液恢复致室温，轻轻混匀。

②浸板:向ELISA反应条中加入200ul的洗涤液，室温5min，取出洗涤液，吸水纸上轻叩。

③样品稀释：用样品稀释液将待检测样品，阳性对照样品和阴性对照样品作1:10倍稀释(270ul+30ul)，再进行2倍稀释(150ul+150ul)，每一步都要混匀。

④与待检测样品反应：确定好每个样品要检测的稀释梯度，取上述的待检测的抗原样品100ul，加入反应孔中，放入温盒内，37℃孵育1h。

⑤洗板：每孔加300ul洗涤液，静置3min，重复3次。

⑥与酶标抗体反应：每孔加100ul一1:500稀释好的HRP标记的抗体，放入湿盒内，37℃孵育1h。

⑦洗板：按步骤5进行。

⑧底物显色：每孔加入100ul底物显色液(现用现配)，室温反应30min。

⑨终止反应：每孔加入50ul终止液，室温。

⑩在405nm波长下测定OD值，计算蛋白浓度。

3实验结果：

根据实验操作方法将western blot检测的样品进行ELISA检测，同时设立阳性、阴性和空白对照，并根据阳性标准品绘制标准曲线，用于样品中有效蛋白浓度计算。在OD405测定样品的OD值，并计算蛋白浓度，结果如图3所示：图3为标准曲线制作，表1为样品OD值和蛋白浓度结果，结果显示PCV2cap蛋白在毕赤酵母中成功得到诱导表达。

表1 ELISA检测结果

三、超速离心纯化(Optiprep ^TM Density Gradient Medium)SOP

1实验材料:

仪器：Backman超速离心机，注射器，吸管，枪头，移液器，SW 41Ti Rotor，离心管装量

试剂：PBS(pH＝7.4左右)，Optiprep，ddH₂O

10xPBS配方：

B液(10XPBS-MK)：

10xPBS中加入

MgCl2.6H₂O 2g

KCl 1.9g

加去离子水定容至1L。

C液(PBS-MK)：取B液100mL，加入去离子水定容至1L，0.22um过滤除菌。

D液：116.8gNaCl加入100ml B液中，补加去离子水定容至1L，0.22um过滤除菌。

E液现用现配：9体积的Optiprep加1体积的溶液B。

3操作步骤

1)病毒处理：反复冻融后，4度离心4000rpm，去细胞碎片。

2)密度梯度液配制(需要4个离心管)

(54％Optiprep，即E液)：27ml Optiprep+3mlB液。

(40％Optiprep)：12ml E液+4.2ml C液。

(25％Optiprep)：8ml E液+9.2mlC液。

(15％Optiprep)：5mlE液+11.2ml D液+4ml C液。

3)操作过程：

①利用长金属针头的注射器，按照由高浓度到低浓度的顺序，贴着管壁自管底而上加入：顺序依次是54％，40％，25％，15％，每层2ml，最后加入离心后的病毒液，约3.5ml。总体积为11.5ml，共做6管。进行称量配平。

②超速离心前，空转一下，查看运行情况，后设置离心程序：4℃，35000rpm(105000g)，离心24h。

③待转速升高至设定的速度后，操作人员方可离开。

④离心结束后，小心的取出离心管，可以看出离心管中出现白色条带。用枪头小心的吸出液体，进行拍照和ELISA测定。

4、实验结果

将表达PCV2VLP蛋白的毕赤酵母破碎，通过离子交换的方法进行纯化，取3ml纯化的蛋白样品进行密度梯度离心，结果如图4所示，PCV2VLP蛋白密度梯度离心后在40％Optiprep这个密度层。

四、电镜负染实验

将密度梯度离心的样品取出，做电镜负染实验，结果如图5：负染之后在电镜下能观察到明显的病毒颗粒，结果表明在毕赤酵母中表达的PCV2cap蛋白能够组装成病毒颗粒。

实施例6动物免疫实验

圆环疫苗在小鼠上免疫：

1、动物：选用6－周雌性BABL/c小鼠。

2、免疫方法：一免背部皮下注射疫苗0.2ml(分2点)，隔21天后用同样方法进行二免；二免后14天采血，分离血清。对血清进行IPMA检测。

IPMA法检测PCV2血清抗体操作步骤

1、血清样品准备

采自同一动物免前和疫苗免后双份血清，单份血清也可以用于检测，血清样品使用前置－20℃备用，无需补体灭活。

2、IPMA反应板的制备

用PCV2毒种稀释成10^4.0TCID₅₀/ml，同步接种于新消化的PK15细胞(猪肾上皮细胞，可以购自ATCC)悬液(2*10⁵/ml)，以100ul/孔分注于96孔板的奇数列，偶数列设未接种病毒细胞对照。置37℃5％CO₂条件下培养形成单层细胞，进行丙酮－PBS液固定、干燥后将反应板经真空密封袋内，置－20℃备用。

3、IPMA反应操作程序

临用前将IPMA反应板放于室温，用PBS浸洗1次。将待检血清用PBS液从1:50起作2倍系列稀释，以PVC2阳性、阴性血清作对照，每份稀释血清分别加入1个抗原孔和1个细胞对照孔(100ul/孔)，置37℃湿盒孵育1小时，PBS洗涤3次，加入1:3000稀释的HRP－SPA液(100ul/孔)，置37℃湿盒孵育1小时，PBS洗涤3次，加AEC反应液显色，用光学显微镜判断结果。

4、结果判定

PCV2阳性血清与病毒感染细胞染色呈棕红色，与细胞对照孔染色无着色判为阳性；用PCV2阴性血清与细胞对照和抗原感染细胞孔均无着色反应判为阴性。已建成血清阳性终点时最高稀释度的倒数表示抗体效价，经检测，抗体效价在600-1600之间。

实验结果如图6所示，图6显示了VLP免疫小鼠后血清IPMA结果，其中图A、图B为阳性结果，图C为阴性结果。图6A、B的结果证明，采用本发明的猪圆环病毒病毒样颗粒(VLP)免疫动物，能够成功诱导动物机体产生针对猪圆环病毒的抗体。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为毕赤酵母细胞，并且所述细胞的基因组中整合有猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；

并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒；

并且所述的表达盒不含有分泌表达元件；和

所述外壳蛋白基因为序列如SEQ ID NO.:1所示的猪圆环病毒ORF2抗原基因。

2.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述细胞为毕赤酵母KM71菌株。

3.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终止密码子。

4.如权利要求3所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的起始密码子和所述外壳蛋白的ORF序列直接相连。

5.一种制备猪圆环病毒病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求1所述的细胞，从而表达出所述的病毒样颗粒；和

分离所述病毒样颗粒。

6.一种分离的经密码子优化的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如SEQ IDNO.:2所示的多肽；并且所述多核苷酸选自下组：

序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种毕赤酵母细胞，其特征在于，所述的毕赤酵母细胞含有权利要求7所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。