KR102217387B1 - 재조합 효모 전세포(yeast whole cell)을 이용한 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신과 그의 제조 방법 - Google Patents

재조합 효모 전세포(yeast whole cell)을 이용한 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신과 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효모 전세포를 이용한 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 효모 전세포 또는 이의 파쇄물은 백신조성물로써 뛰어난 효과가 있을 뿐만 아니라, 효모의 다양한 장점 및 재조합 미생물을 사용한 돼지 써코바이러스 백신 제조 과정에서 피할 수 없었던 세포파쇄나 항원 추출, 정제, 안정화 등 백신 제조 공정을 획기적으로 단순화시킬 수 있다.

Description

재조합 효모 전세포(yeast whole cell)을 이용한 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신과 그의 제조 방법{ＰＯＲＣＩＮＥ ＣＩＲＣＯＶＩＲＵＳ２ ＶＡＣＣＩＮＥ ＵＳＩＮＧ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＹＥＡＳＴ ＷＨＯＬＥ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ ＴＨＥＲＥＯＦ}
본 발명은 재조합 효모 전세포를 이용한 PCV 관련 질병(Porcine circovirus associated diseases)을 예방할 수 있는 모돈 및 자돈 접종용 재조합 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
돼지의 써코 바이러스 2형은 (PCV-2; Porcine circovirus 2)는, 이유자돈 전신성소모성증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome; PMWS)의 중요한 원인체로 밝혀진 바이러스이다. 돼지 써코바이러스의 피해를 예방할 수 있는 백신개발이 어려운 이유 중 하나는 동물세포를 이용한 백신생산은 비교적 단가가 비싼 배양배지 및 동물세포배양기 등 생산비가 높으며, 또한 혈청배지에 포함된 다양한 이종단백질로 인하여 백신을 접종 시 이러한 이종단백질들에 의한 부작용 발생이 상존하고 있기 때문이다.
바이러스 서브유닛 재조합 백신의 경우 바이러스 유사입자(Virus-like particle, 바이러스 유사입자) 형성이 항원성을 증가시키는 것으로 알려져 있으며 효모의 경우 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 균주에서 오래 전부터 알려져 온 레트로트랜스포손 구성요소(element)인 Ty1을 이용하는 기술이 개발되어 왔다. Ty1은 레트로바이러스 뉴클레오캡시드/코어(core)와 유전학적, 구조적 및 기능적으로 유사한 점을 특징으로 하며 백신 개발에 대한 응용은 1987년에 보고된 바 있고 백신 후보 유전자를 Ty1 유전자의 3 ' 부분에 융합하여 발현하였을 때 바이러스 유사입자 형성에 지장이 없으며 별다른 다른 인자의 존재를 요구하지 않고 세포 내에서 바이러스 유사입자를 형성하는 커다란 장점을 가진다. 효모에서 백신을 생산하는 경우 효모 세포벽 성분이 항원보조제 역할을 겸할 수 있는 것으로 여러 보고를 통하여 알려지고 있다(Chan GC, Chan WK, Sze DM. 2009, The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. J Hematol Oncol 2: 25.).
효모 세포 내에 발현된 항원을 세포로부터 추출하여 얻기 위해 세포를 파쇄하는 경우, 세포 파쇄액을 제조한 후에 바이러스 유사입자 등의 항원이 안정적으로 용액상으로 유지되기가 어려운 것으로 알려지고 있으며 바이러스 유사입자가 응집체를 형성하여 침전되는 것을 방지하기 위한 여러 가지 첨가제(예, polysorbate 20 등의 계면활성제, sucrose나 trhalose, sorbitol 등의 당류 등)를 첨가하는 등의 방안을 필요로 하게 된다(Lang R, Winter G, Vogt L, Zuercher A, Dorigo B, Schimmele B (2009)). 이러한 단점을 극복하기 위해 개발된 효모 전세포(yeast whole cell)을 사용하는 재조합 백신은 1개 이상의 항원 발현이 가능하며 안전성이 높고 대량생산이 용이한 등 효모의 장점을 취할 수 있는 장점을 가진다.
본 발명에서는 돼지 써코바이러스 항원 ORF2를 발현하는 효모 전세포 백신(yeast whole cell vaccine)의 면역원성이 매우 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 2형 돼지 서코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 ORF2를 포함하는 재조합 벡터를 발현시킨 효모 전세포(yeast whole cell) 또는 이의 파쇄물 및 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신 조성물과 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 2형 돼지 서코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포(Yeast whole cell)를 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1로 표시되는 유전자이고, 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주이며, 상기 균주는 Y2805 균주이며, 상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 효모 전세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 2형 돼지 서코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물을 제공한다. 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1로 표시되는 유전자이고, 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주이며, 상기 균주는 Y2805 균주이며, 상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 효모 전세포이여 이의 파쇄물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 2형 돼지 서코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포 또는 이의 파쇄물을 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 조성물을 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1로 표시되는 유전자인 것을 특징으로 하고, 상기 ORF2는 서열목록 2로 표시되는 폴리펩타이드임을 특징으로 하며, 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하며 상기 균주는 Y2805 균주인 것을 특징으로 하며 상기 균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하며 상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 것을 특징으로 하며 상기 효모 전세포는 2x109세포 이하를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 2형 돼지 서코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 ORF2를 포함하는 재조합 발현 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 재조합 백터를 효모에 형질전환시키는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포 및 이의 파쇄물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1을 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하고, 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하며, 상기 균주는 Y2805인 것을 특징으로 하며, 상기 Y2805 균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하며, 상기 재조합 발현 벡터는 GAL10 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하며 상기 ORF2는 Ty1과 융합하여 발현이 증가되는 것을 특징으로 하며 상기 효모 전세포는 추가로 열-불활성화하는 것을 특징으로 하며 상기 효모 전세포는 추가로 포르말린-불활성화하는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 2형 돼지 서코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 조성물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 백신조성물을 돼지에 투여하여 백신화시키는 방법을 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 ORF2는 서열목록 1로 표시되는 유전자임을 특징으로 하고, 상기 ORF2는 서열목록 2로 표시되는 폴리펩타이드임을 특징으로 하며, 상기 효모는 숙주세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하며, 상기 균주는 Y2805 균주인 것을 특징으로 하며 상기 Y2805 균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하며 상기 재조합 발현 벡터는 GAL10 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하며 상기 ORF2는 Ty1과 융합하여 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백신은 당업자에게 공지된 기술에 따라 불활화 또는 불활성화될 수 있다. 불활성화는, 이에 한정하지 않지만 화학적 루트, 예컨대 항원을 포름알데히드(포르말린), 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤 또는 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시켜 실시한다.
본 발명에서, "형질전환체"는 외래 DNA, 예를 들면 플라스미드 또는 하이브리드 DNA를 세포 내로 도입시킨 후에 그 세포 내에서 상기 DNA가 복제되고 발현되는 세포체를 의미한다. 효모에서의 외래 DNA를 포함하는 플라스미드 형질전환은 리튬 아세테이트 방법(Nucleic Acids Research 19,5791(1991))에 따라 실시한다.
본 발명에서, "클로닝"이란 유전자에 제한효소 인식부위를 새로이 형성하기 위한 PCR 기법을 통해 유전자를 플라스미드를 포함하는 전달체에 삽입 또는 제거하는 일련의 과정을 의미한다.
본 발명에서, "백신화"란 특정 질병에 대한 치료제로 사용할 수 있도록, 예를 들어 단백질 또는 항원 같은 유효성분이 체내에 주입되어 면역반응을 유발하여 메모리 B세포를 생성시키고, 추후 동일한 항원에 대하여 신속한 면역반응을 유도하는 과정을 말한다.
본원 발명에서, "세포 파쇄"란 세포 내용물을 방출시키기 위해, 예를 들어 비드와 세포를 교반하는 과정처럼 세포막 또는 세포벽을 파괴하는 과정이고, "세포파쇄물"이란 세포를 파쇄시켜서 세포내 및 세포외 물질이 혼합되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 '이유자돈 전신성소모성증후군(PMWS)'이란, 이유자돈에서의 소모성 증상을 특징으로 하는 돼지의 질병으로, 캐나다, 미국, 북 아일랜드, 유럽, 한국, 일본, 대만 등의 국가에서 보고되고 있다. '이유자돈 전신성소모성증후군(PMWS)'에 걸리면 이유자돈에서 폐사나 위축, 증체량의 감소를 초래하며, 보통 6개월에서 1년간 지속되기 때문에 매우 심각한 경제적 피해를 가져오게 된다. 실제 국내에서는 1997년 첫 발병 보고 후 2007년 연간 약 600만두가 폐사하는 등, 양돈농가가 약 2조원의 손실을 감수하고 있는 것으로 나타났다(한국농촌경제연구원).
PCV2 관련 백신은 PCV2a 바이러스주의 ORF2 항원을 사용하여 4종류가 국제 시장에 출시되어 있다. 국외의 경우 기술적으로 가장 우위에 있는 기업은 프랑스의 메리알로써 PCV에 관련된 많은 특허를 출원 등록한 상태이며 불활성화된 PCV2 whole virus를 사용하고 있다(Circovac). 베링거 인겔하임 사의 경우에는 베큘로바이러스(Baculovirus)에 ORF2를 발현하여 그 재조합 단백질을 이용한 백신(Circumvent PCV 및 Ciroflex)을 상품화하였으며, 정제과정을 거쳐서 1ml씩 1회 접종하는 장점을 가지고 있다. 인터벳사 역시 베큐로바이러스에 ORF2를 발현하여 정제된 재조합단백질을 이용한 백신을 개발하였으며 자돈에 3주 간격으로 2ml 2회 접종하는 접종방법으로 설계되었다. 포트닷지사는 PCV-1 바이러스에 PCV2의 ORF2을 발현하여 키메라 백신(Chimera vaccine)을 개발하였으며, 자돈에 2ml 1회 접종 적용방법으로 상품화 되어있다.
본 발명의 "효모"는 특히 인체에 안전하다고 알려진 GRAS(generally regarded as safe) 균주로써, 효모발현시스템을 이용한 백신생산 시 혈청배지를 사용하지 않아도 되고, 비싼 동물세포배양기 대신 미생물 발효조를 이용할 수 있으며, 동물세포대비 단백질 발현양도 비교적 높은 편이다. 동물세포 대신 효모를 이용한 백신생산 시 균체 성장속도 및 단백질 발현양 증가로 인한 생산성 향상, 값비싼 배지 및 동물세포배양기 미사용으로 인한 생산비 감축 및 혈청배지 미사용으로 인한 백신의 안전성 및 안정성 향상 등의 장점이 있다. 특히, 효모 전세포을 사용하여 추가의 면역반응을 유발할 수 있으며 효모 세포벽이 항원 보조제 역할을 겸함으로써 면역반응 유발을 증진 시킬 수 있다.
본 발명의 효모 전세포는 백신조성물로써 뛰어난 효과가 있을 뿐만 아니라, 효모의 다양한 장점 및 재조합 미생물을 사용한 돼지 써코바이러스 백신 제조 과정에서 피할 수 없었던 세포파쇄나 항원 추출, 정제, 안정화 등 백신 제조 공정을 획기적으로 단순화시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 ADH1 프로모터 또는 GAL10 프로모터를 포함하는 ORF2를 발현하는 재조합 벡터를 나타내고 있다.
도 2는 상기 재조합 벡터에서 Ty1과 ORF2의 융합 발현 벡터를 나타내고 있다.
도 3은 도 3은 도 1 및 도 2의 ORF2 발현 벡터를 효모 숙주 Y2805 내에서의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4는 CBD를 상기의 벡터로 융합시킨 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 도 4의 벡터를 발현시켜 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 6은 도 1 및 도 2의 벡터와 His-tag을 제거한 ORF2를 발현시켜 초원심분리한 분획의 전기영동 및 웨스턴 블롯과 바이러스 유사입자 형성 유무를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 ORF2 또는 NLS를 제거한 ORF2에 사카로마이세스 세레비지애의 MFα를융합시킨 벡터를 나타낸 것이다.
도 8은 도 7의 벡터를 발현시킨 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 9는 숙주세포 Y2805 및 BY4741과 각각의 gal80 결손주를 사용하고 GAL10 프로모터와 ADH1 프로모터를 사용하여 ORF2를 발현시켜 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 10은 표 5를 실험하여 얻은 균체의 성장 결과이다.
도 11은 표 6을 실험하여 얻은 T/C value (접종균 평균/대조군 평균)를 나타낸 것이다.
도 12는 표 8을 실험하여 얻은 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 비제한적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
사카로마이세스 세레비지애 균주에서 PCV type -2의 ORF2 발현을 통한 바이러스 유사입자의 제조
1.1 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 PCV type -2의 ORF2 발현을 위한 벡터구축 및 발현 확인
효모 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 ORF2를 효율적으로 발현하기 위해 서열을 효모 코돈에 적합하도록 변경하여 Bioneer사에서 인공합성(서열번호 1) 하였다. 합성한 유전자는 효모 발현 벡터인 YEGα-HIR525에 클로닝 하였다. 프로모터는 GAL10과 ADH1 두 가지를 사용하였고, ORF2가 발현되는 것을 확인하기 위해 C-말단에 6개의 히스티딘 표지를 첨가하였다. GAL10 프로모터의 경우, 5‘과 3’ 말단에 제한효소 Eco RI과 Sal I 인식부위를 가지도록 프라이머(표1)를 제작하고, 동일한 제한효소로 절단한 발현벡터 YEGα-HIR525에 삽입하였다. 이렇게 구축된 벡터를 SmaI과 EcoRI으로 잘라 GAL10 프로모터를 제거하고 이 위치에 ADH1 프로모터를 삽입하였으며, 사용한 프라이머는 하기의 표 1에 표시하였다. 상기 재조합 발현벡터(도 1)를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805균주에 리튬/아세테이트
(lithium/acetate)방법을 이용하여 형질전환 하였고, UD (yeast nitrogen base 6.7g/L, uracil dropout supplement 0.77g/L, 글루코스 20g/L) plate에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체(transformant)를 선별하였다.
EcoRI-ORF2-F aatt gaattc atgacatatccgcgtagacg
SalI-His-ORF2-R atat gtcgac ctagtgatggtgatggtgatg agggttcaaaggt ggatct
SmaI-ADH1-F ggta cccggg tagacttgatagccatcatca
EcoRI-ADH1-R atat gaattc tgtatatgaagttgattgtat
발현 확인을 위한 His tagging 뿐만 아니라, 바이러스 subunit 재조합 백신의 경우 virus-like particle(바이러스 유사입자) 형성이 항원성을 증가시키는 것으로 알려져 있으며 효모의 경우 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 오래 전부터 알려져 온 retrotransposon element인 Ty1을 이용하는 기술이 개발되어 왔다. Ty1은 retroviral nucleocapsid/core와 유전학적, 구조적 및 기능적으로 유사한 점을 특징으로 하며 백신 개발에 대한 응용은 1987년에 보고된 바 있고 백신 후보 유전자를 Ty1 유전자의 3' 말단 부분에 융합하여 발현하였을 때 바이러스 유사입자 형성에 지장이 없으며 별다른 다른 factor의 존재를 요구하지 않고 세포내에서 바이러스 유사입자를 형성하는 커다란 장점을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서 ORF2의 바이러스 유사입자형성을 도와 줄 것으로 예상하고 Ty1과 ORF2를 융합발현하였다. 이 때 ORF2의 NLS(Nuclear Localization Signal) 서열은 제거하고 ORF2를 융합하였다. Y2805 유래의 Ty1와 NLS를 제거한 ORF2를 각각 PCR로 증폭한 뒤 overlap PCR을 통해서 두 fragment를 연결시켜 주었다. PCR에 사용한 프라이머는 하기의 표2와 같고, YEGa-HIR525의 EcoR I, Sal I 위치에 삽입하였다.
Ty1-F atta gaattc aaaa atggaatcccaacaattatctc
Ty1-R tttggttgtattcgtatagcgc
Ty1-PCV2 gcgctatacgaatacaaccaaa agactatcaaggacattcggatac
SalI-ORF2-R aatt gtcgac ctaagggttcaaaggtggatc
또한, 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 균주에 리튬/아세테이트 방법을 이용하여 재조합 발현벡터(도 2)를 형질전환 하였고, UD (Ura-, 글루코스 2%) plate에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체(transformant)를 선별하였다.
Y2805내에서 ORF2가 효율적으로 발현되는지를 확인하기 위해 배양 후 웨스턴 블롯(웨스턴 블롯) 분석을 실시하였다. 대장균은 LB 배지(1% 폡톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였고, 효모는 UD 액체배지 2 ㎖에 단일 집락을 접종하고, 30℃, 180rpm에서 초기배양한 후, 본 배양을 수행하였다. 본 배양은 YPGlu1%Gal1% 배지(2% 펩톤, 1% 효모추출물, 1% 글루코스, 1% 갈락토스)를 250㎖ 배플 플라스크에 25㎖씩 분주한 뒤, 초기 배양한 균주를 OD600가 0.1이 되도록 접종하였고, 30℃, 180rpm에서 교반하면서 48시간 배양하였다. 배양액은 13000rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액은 제거하고, 50mM Tirs-HCl buffer (pH 7.0)를 배양액 부피의 1/4만큼 넣어 세포를 풀어준 뒤 같은 부피의 beads(425-600μm)를 첨가하여 5분간 vortexing함으로써 세포를 파쇄하였다. 세포파쇄 후 13000rpm에서 3분간 원심분리하여 파쇄 되지 않은 세포와 세포파편을 제거하고 상등액에 SDS page loading dye를 첨가하여 100℃에서 5분간 중탕한다. 얼음에 박아 잠시 식힌 후 4-20% gradient gel에 loading하고 80V에서 전기영동을 실시한다. Trans-BoltTM Turbo(Bio-Rad)를 이용하여 나이트로셀룰로스 멤브레인에 반-건조법으로 단백질을 옮기고 TBS-T buffer(20mM Tris-HCl pH8.0, 137mM 염화나트륨, Tween 20 0.1%) 에 탈지 분유를 5%로 첨가하여 1시간동안 blocking하였다. 1차 항체를 1-2시간 정도 반응시키고 TBS-T 완충액으로 멤브레인을 씻은(5-10분씩 3회) 뒤 2차 항체를 넣어 1시간 반응시킨다. 그리고 2차 항체에 결합된 AP(alkaline phosphatase)의 기질로 BCIP/NBT Purple liquid(Sigma)를 첨가하고 5-10 분 정도 반응시켜 항체가 결합된 부위가 보라색 밴드로 나타나는 것을 관찰하였다. 발현 확인을 위해 히스티딘 표지를 붙였으므로, 1차 항체로 anti-His tag rabbit polyclonal IgG(Santa Cruz Biotechnology)와 2차 항체로 goat anti-Rabbit IgG-alkaline phosphatase(Sigma)를 사용하였으며, PCV2에 백신화된 기니피그 혈청을 1차 항체로 하여 ORF2가 검출이 되는지 또한 확인하였다. 이 경우는 2차 항체로 goat anti-guinea pig IgG-AP(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과는 도 3에 나타내었다. 대장균의 경우 GAL10 프로모터를 사용하는 경우 ORF2가 약하게 발현되는 것이 확인되었지만, ADH1의 경우는 발현이 되지 않았다. 반면, Y2805에서는 두 경우 모두 ORF2가 발현되었고 GAL10 프로모터가 ADH1 프로모터보다 발현양이 많은 것을 관찰할 수 있다. 그리고 Ty1과 융합발현한 ORF2의 경우 상당히 많은 양의 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
1.2 Cellulose binding domain 과 ORF2 의 융합발현 및 확인
셀룰로오스 결합 도메인 (Cellulose binding domain, CBD)는 다른 단백질과 융합 발현 하였을 때 세포내에서 불용성의 입자를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있어 이를 이용하여 바이러스 유사입자와 유사한 기능을 기대하고 융합발현을 시도하였다. 셀룰로오스 결합 도메인(CBD)과 융합발현 하는 경우 α-아밀라제의 신호 서열을 가짐으로써 세포 외로 분비되는 경우 (SS-CBD)와 그렇지 않은 경우 (CBD)로 나누어 융합발현을 시도하였다. 이 때 ORF2 유전자는 NLS를 포함하지 않도록 하였다. CBD와 ORF2를 각각 증폭시킨 후 overlap PCR로 연결시키고, YEGa-HIR525의 EcoR I, Sal I 위치에 삽입하였다. 사용한 프라이머는 하기의 표 3과 같으며, 구축된 플라스미드(도 4)는 위에서 언급한 방법으로 Y2805에 형질전환하였다.
ssCBD-EcoRI-F aatt gaattc atgatggttgcatg
CBD-EcoRI-F aatt gaattc atgcaacagacagtctggggtca
CBD-R agaagaaggaggtggagtagc
CBD-BORF2 gctactccacctccttcttctagactatcaaggacattcggatac
SalI-His-ORF2-R atat gtcgac ctagtgatggtgatggtgatg agggttcaaaggt ggatct
GAL10 프로모터를 포함한 플라스미드는 YPGlu 1% Gal 1% 배지에, ADH1 프로모터를 가진 플라스미드는 YPGlu 2% 배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였고, 신호 서열을 가지는 Y2805는 무세포 추출물(cell free extract)와 배양 상등액(supernatant) 또한 웨스턴 블롯을 실시하였다. 항체는 anti-His tag 항체를 사용하였다. 신호 서열을 가지는 경우는 세포 내외에서 모두 발현이 되지 않아 세포내 발현만이 가능함을 알 수 있었다(도5). 반면 신호 서열을 가지지 않는 경우는 GAL10 프로모터와 ADH1 프로모터 모두 발현이 관찰되었으며, GAL10 프로모터가 효모발현에 있어 더 적합한 것으로 나타났다.
1.3 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 발현된 ORF2 의 바이러스 유사입자 형성 관찰
다양하게 제조된 ORF2 발현 카세트 중에서 웨스턴 블롯을 통해 효모발현이 효과적으로 잘되는 것으로 보이는 세 가지 균주를 선별하였다. 또한 His tag를 가지지 않는 ORF2만을 발현하는 플라스미스 pGAL10-ORF2를 실시예 1-1의 방법대로 제조하였다. 이렇게 제조한 네 가지 종류의 pGAL10-ORF2-His, pGAL10-Ty1-ORF2(-NLS), pGAL-CBD-ORF2(-NLS)-His 플라스미드를 갖는 Y2805를 YPDG에서 30℃, 180rpm으로 48시간 배양한다. 13000rpm으로 10분간 원심분리 하여 세포를 회수하고, TEN 완충액(10mM Tris-HCl pH7.4, 2mM EDTA, 140mM 염화나트륨)와 beads를 첨가한 후 약 10분간 vortexing을 통해 cell을 파쇄 하였다. 파쇄액은 13000rpm4℃에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 취하고 이를 초원심분리에 사용하였다. 초원심분리은 TEN buffer에 15, 25, 35, 45, 60%의 수크로즈 용액을 만들고 원심분리 튜브에 낮은 농도의 수크로즈 용액부터 차례로 overlay하여 넣어 줌으로써 수크로즈 농도구배를 만든다. 원심분리 튜브의 상단에 위에서 준비한 무세포 추출물을 넣고, 36000rpm에서 4시간 동안 원심분리 한다. 분리한 샘플은 튜브의 바닥에서부터 1.5ml씩 분획을 나누고 SDS page와 웨스턴 블롯을 실시하였다. 웨스턴 블롯에서 ORF2의 밴드만 관찰된 fraction을 모으고 Amicon Ultra centrifugal filter (Millipore, 10K 멤브레인)를 이용하여 수크로즈를 제거하고 농축하여 전자현미경으로 관찰하였다. ORF2만 발현하는 경우 약 25nm 크기의 바이러스 유사입자가 형성되는 것을 관찰하였다(도6). 반면에 히스티딘 표지가 존재하는 경우는 바이러스 유사입자가 형성되지 않는 것으로 보아 C-말단에 결합된 His tag이 바이러스 유사입자 형성을 방해하는 것으로 추측된다. 바이러스 유사입자 형성에 도움을 줄 것이라 예상했던 Ty1 융합발현은 바이러스 유사입자 형성을 다소 방해하는 것으로 나타났다. CBD와 융합발현한 경우는 히스티딘 표지가 존재하지만 바이러스 유사입자를 잘 형성하는 것으로 관찰되었다.
ORF2 의 분비 발현 및 확인
재조합 서브유닛 백신의 경우 세포외 분비발현이 가능하다면 세포파쇄가 필요 없고 정제가 용이한 장점이 있다. 전통적으로 대장균에 비하여 효모는 안전성 등 다른 여러 장점과 더불어 단백질 분비기구가 발달되어 있어 분비발현에 적합하다. 따라서 ORF2를 효모 균주에서 분비발현을 시도하였다.
대장균에서는 전체 유전자를 사용하여 발현시켰을 경우 발현율이 매우 저조하였으나 아미노 말단에 위치한 NLS 구역 47개 아미노산 서열이 입체배좌 에피토프 형성에 특별히 필요하지 않은 점을 이용하여 NLS-결핍 클론을 발현함으로써 발현율을 증진시키는 연구가 보고된 바 있다. ORF2의 분비를 위해 사카로마이세스 세레비지에의 교배 인자 알파(MFα)의 신호 서열을 이용하였고, ORF2 전체서열을 발현하는 경우와 NLS를 제거한 경우로 벡터를 구축하였다. 사용한 프라이머는 하기 표 4와 같고, 효모 코돈으로 최적화한 합성서열을 주형으로 하여 PCR로 증폭한 후 XbaI과 SalI으로 절단하여 YEGα-HIR525의 XbaI, SalI 위치에 삽입하였다. 구축된 벡터의 모식도는 도 7에 나타내었으며, 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 균주에 리튬/아세테이트방법을 이용하여 형질전환하였고, UD(Ura-, 글루코스 2%) 플레이트에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체를 선별하였다.
Xba1-ORF2 aatt tctaga taagagaatgacatatccgcgtagacgtt
XbaI-ORF2-NLS aaaa tctaga taagagaagactatcaaggacattcggatac
SalI-His-ORF2-R atat gtcgac ctagtgatggtgatggtgatg agggttcaaaggt ggatct
UD 액체배지에서 초기배양한 뒤 YP Glu1% Gal1% 배지에서 48시간 본 배양을 하고, anti-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. MFα 분비 시그널이 존재하는 경우에는 NLS 존재 유무와 상관없이 배지로 분비되지 않을 뿐만 아니라 세포 내부에서도 발현되지 않았다(도8). 그리고 NLS가 없는 경우 ORF2의 발현양이 상당히 증가한다는 사실을 확인할 수 있다.
사카로마이세스 세레비지에 균주에서 ORF2 발현을 위한 균주 선별
상기 실시예에서 발현율이 우수하였던 GAL10 프로모터의 경우 갈락토스 유발 프로모터로서 최적발현을 위해서는 배지 내에 글루코스가 존재하지 않아야 하는 조건과 갈락토즈가 존재하여야 하는 조건을 모두 만족시켜야 하는데 갈락토즈는 글루코스에 비하여 매우 비싼 탄소원이다. 본 발명자들은 값 비싼 갈락토즈의 첨가 없이 글루코스만 사용하여도 GAL10 프로모터를 발현시킬 수 있는 사카로마이세스 세레비지에 gal80 결손주를 이용하여 재조합 단백질을 경제적으로 생산할 수 있는 방법을 개발한바 있다(효모 GAL80 결핍주를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 국내등록 특허 제10-0947376호 (2010. 3. 5.)).
재조합 발현벡터(도 1)의 최적의 발현이 가능한 균주를 선발하기 위해 사카로마이세스 세레비지에 Y2805, Y2805 △gal80, BY4741, 그리고 BY4741 △gal80 균주에 리튬/아세테이트 방법을 이용하여 형질전환 하였고, UD(Ura-, 글루코스 2%) 플레이트에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체를 선별하였다. 효모는 UD 액체배지 2㎖에 단일집락을 접종하고, 30℃, 180rpm에서 초기배양한 후, 본 배양을 수행하였다. 본 배양은 Y2805와 BY4741의 경우는 YPGlu1%Gal1% 배지(2% 펩톤, 1% 효모추출물, 1% 글루코스, 1% 갈락토즈), Y2805 △gal80, BY4741 △gal80의 경우는 YPGlu2%를 250㎖ 배플 플라스크에 25㎖씩 분주한 뒤, 초기 배양한 균주를 OD600가 0.1이 되도록 접종하였고, 30℃, 180rpm에서 교반하면서 48시간 배양하였다. 웨스턴 블롯 방법은 상기 기술한 것과 동일하며, 분석 결과는 도 9와 같다. 네 균주의 경우 모두 ORF2가 발현되었지만 BY4741균주보다는 Y2805균주에서, 그리고 ADH1 프로모터보다 GAL10 프로모터가 ORF2 발현양이 월등히 많은 것을 관찰할 수 있다(도9).
ORF2 를 발현하는 재조합 사카로마이세스 세레비지에 균주의 발효조를 사용한 발효 배양
써코바이러스 백신의 목적 동물인 돼지를 사용한 동물시험을 위해 ORF2를 발현하는 재조합 효모균주를 발효 배양하였다. 위의 실시 예에서 가장 우수한 것으로 나타난 유전자발현 플라스미드/효모숙주세포 조합인 pGAL10-ORF2 / Y2805 ?gal80 균주를 사용하여 5L 발효기에서 유가식 배양을 하였다. 하기 표 5는 상기 유가식 배양 시 사용된 배지 조성을 나타낸 것이다.
전 배양배지 본 배양배지 공급 배지
성분 농도(g / L) 성분 농도(g / L) 성분 농도(g / L)
포도당 20 포도당 15 포도당 600
효모추출액 10 황산마그네슘 2 - -
펩톤 20 효모추출액 20 - -
- - 펩톤 10 - -
- - 황산암모늄 20 - -
- - 인산이수소칼륨 7 - -
유가식 배양은 24% 암모니아수를 이용하여 pH를 6.0으로, 배양 중에 온도는 30?로 유지시켰다. 균체의 성장은 점차적으로 증가하여 OD60071까지 도달하였다(도 10). 배양 후 세포를 회수한 후 Homogenizer를 이용하여, 1,000 bar에서 4회 세포파쇄를 수행하였고 실시예 1에 기술한 방법에 준하여 세포파쇄액을 준비하였다.
면역원성 조사
5.1 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 발현된 ORF2 의 다양한 제제 형태 시험백신 제조 및 기니피그를 이용한 면역원성 조사
사카로마이세스 세레비지에 균주에서 발현시킨 ORF2가 항원으로서 역할을 할 수 있는지 평가하기 위하여 기니피그에 접종하여 항체가 생성되는지를 확인하였다. 이 때 세포파쇄 유무, 정제를 위한 His tag의 유무 또는 NLS 포함 여부 등 유전자 조작에 따른 비교 평가를 하였다. 특히 세포벽 파쇄가 어려운 효모의 단점을 극복하기 위해서, 재조합 단백질을 발현하는 효모 균주를 파쇄하지 않고 효모 전세포 (whole yeast)를 항원으로 바로 사용가능한지 알아보기 위하여 ORF2가 발현되는 것을 확인한 효모 균주를 파쇄하지 않고 전세포를 열-불활성화 처리구와 포르말린-불활성화 처리구로 나누어 시험백신을 제조하였다.
ORF2를 발현하는 Y2805 △gal80 균주를 실시예 1에서 서술한 바와 같이 배양하고 원심분리 후 얻은 균체 (whole yeast cell)를 OD600 값을 토대로 균수를 추정 (1 OD = 2x107/ml)하여 2x109/ml이 접종될 수 있도록 균체 농도를 맞추어 시험백신을 제작하였으며 효모 균체의 불활화를 위하여 두 가지 방법을 사용하였다. 먼저 열-불활성화의 경우 균체를 60℃에서 2 시간 처리 후 -20℃에서 보관하며 사용하였고 포르말린-불활성화의 경우 0.2% 포르말린 농도로 실온에서 72시간 처리 후 균체를 배지에 도말하여 효모가 자라지 않는 것을 확인한 후 사용하였다.
또한, 세포 내에 발현된 ORF2를 균체로부터 얻기 위하여 실시예 1에서 기술한 바와 같은 방법으로 세포를 파쇄하여 세포파쇄액을 제조하였다. ORF2 세포파쇄액(PCV2-ORF2 세포파쇄물), 세포파쇄액을 0.2 마이크론 멤브레인 필터로 세포 찌꺼기를 제거한 경우 (ORF2 (MF)), ORF2의 아미노말단 47개 아미노산 NLS 서열을 제거한 경우 (ORF2(-NLS)), 그리고 ORF2의 카복시 말단에 히스티딘-표지되어 있는 경우 (ORF2(+His))의 4가지 시험백신도 제조하였다.
제조한 시험 백신의 종류와 접종량 및 항원보조제를 포함하는 백신 조성 등 시험백신 생산내역은 하기의 표 6에 표시하였다.

 시험백신1 시험백신2 시험백신3 시험백신4 시험백신5 시험백신6 시험백신7
ORF2
효모
(열-사멸화)		 ORF2
효모
(포르말린-불활성화)		 ORF2
효모
(세포파쇄물)		 ORF2
(MF)		 ORF2
(-NLS)		 ORF2
(+His)		 양성대조군
조 성 2x109
cells/ml		 2x109
cells/ml		 2 mg/ml 0.6mg/ml 2 mg/ml 2 mg/ml -
보조제 수산화 알루미늄 젤 -
비고 열-사멸된 효모 전세포 포르말린-사멸된 효모 전세포 세포 파쇄물 MF- 처리
세포 파쇄물		 NLS-결핍
ORF2
세포파쇄물		 히스티딘-표시된
ORF2
세포 파쇄물		 Circoflex
해당 항원 후보들을 이용하여 상업적으로 사용되고 있는 PCV2 백신 (Circoflex)를 양성대조군으로 하여 면역원성을 조사하였다. 시험백신은 양성대조군 조성과 동일하게 조합하여 시험백신을 제작하였고, 제작한 시험백신으로 기니피그에 접종 후 채혈하여 혈청을 분리, 얻어진 혈청에 대하여 ELISA를 실시하여 면역원성을 비교하였다.
실험동물은 기니피그이며, 기니피그 당 1회 접종량은 1ml으로 조절하여 6종 시험백신 외에 베링거 인겔하임사의 Circoflex를 양성대조군으로, PBS를 음성대조군으로 추가적으로 실험하였다. 주입은 피하 주입으로 각 그룹당 8마리씩 접종하여 3주 후 혈액을 채혈하여 혈청 분리 및 56℃에서 30분간 비동화하여 ELISA를 수행하였다. ELISA는 Ab detection Sandwich indirect ELISA로서 JBT사에서 구입한 단일클론 항체를 1ug/ml로 맞추어 사용하였고 PCV2 ORF2 항원은 베링거 인겔하임사에서 구입한 원액을 20배 희석하여 사용하였고 혈청 시료는 50배 희석하여 사용하였다. PCV2 특이 항체 코팅은 37℃에서 2시간, blocking은 37℃에서 2시간, PCV2 항원 코팅은 37℃에서 1시간, 검체 반응은 37℃에서 1시간, conjugate 반응은 37℃에서 1시간, Substrate는 실온 암소 조건에서 10분간 반응시켰고 Stop Solution을 가한 후 O.D450 값을 측정하였다 (표 7).

 시험백신1 시험백신2 시험백신3 시험백신4 시험백신5 시험백신6 시험백신7 음성대조군
ORF2
효모
(열-사멸)		 ORF2
효모
(포르말린-불활성화)		 ORF2
효모
(세포 파쇄물)		 ORF2
(MF)		 ORF2
(-NLS)		 ORF2
+His		 Circoflecx -
시료 1 2.36 2.37 2.09 1.58 0.44 1.72 1.96 0.34
시료 2 2.23 2.22 2.33 2.53 0.89 1.02 2.31 0.48
시료 3 1.96 2.32 2.39 2.37 0.66 1.59 2.24
시료 4 1.94 2.59 1.84 1.46 0.73 2.63 2.34
시료 5 2.01 2.09 2.40 2.55 0.87 1.15 2.47
시료 6 1.96 2.56 2.53 1.22 0.86 2.45 2.52
시료 7 2.32 2.23 2.02 0.61 2.16 2.10
시료 8 2.18 1.19 0.56 1.28 2.36
평균 2.11 2.36 2.25 1.87 0.70 1.75 2.29 0.41
T / C 5.15 5.76 5.49 4.55 1.71 4.28 5.58
표6의 실험에서 얻은 결과인 T/C value (접종군 평균/대조군 평균)을 도 10에 나타내었다. T/C 값이 2.0 이상일 때 양성 판정을 하게 되며 평균값을 비교한 결과 효모 전세포를 사용한 시험백신 1과 2 그리고 효모 균체 파쇄 후 얻은 세포 벽을 포함하는 세포파쇄액인 시험백신 3이 양성대조군과 거의 유사한 결과를 보여 재조합 백신 항원으로서 긍정적인 결과를 얻었다. 이러한 결과는 효모 전세포 성분이 항원보조제와 같은 역할을 한다는 선행 연구 결과와도 일치한다. 전세포를 사용하는 경우 열-불활성화, 포르말린-불활성화 등 전처리 방법에 따른 면역원성 차이는 보이지 않았다. 멤브레인 필터로 세포찌꺼기를 제거한 ORF2(MF)의 경우 다소 낮은 면역원성은 접종량이 다소 낮은데 기인하는 것으로 보이며 히스티딘 표지된 융합 단백질을 항원으로 하는 시험백신의 경우 히스티딘-표지 융합에 따른 입체 장애에 의한 항체의 결합에 대한 영향이 있을 것으로 추정되었다. 한편 아미노말단 NLS가 결여된 ORF2(-NLS)경우는 면역원성에 커다란 영향을 미치지 않는다는 보고와 달리 음성의 결과값을 보여 백신후보로서 적합하지 않은 것으로 나타났다.
5.2 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 발현된 ORF2 의 목적동물 돼지 자돈을 사용한 면역원성 조사
써코바이러스 백신의 실제 목적동물인 돼지를 실험동물로 사용하여 PCV2 ORF2의 3가지 형태의 시험백신을 제조하여 면역원성을 조사하였다. 시험백신은 실시예 5-2에 기술한 방법으로 준비한 재조합 효모 균체, 세포파쇄액 및 멤브레인 여과를 거친 세포파쇄액 (MF)을 하기 표 8에 표시한 바와 같이 준비하여 접종하였다.
조성 백신 1 백신 2 백신 3 vac 4
효모 발현
PCV ORF2
 효모 균체 세포 파쇄액 MF treated
양성대조군
(Circoflex)
효모 균체
흡광도 기준		 전체 단백질
기준		 전체 단백질
기준
접종량 2x109cells/㎖ 2.2 ㎎/㎖ 1.0 ㎎/㎖
항원보조제 수산화 알루미늄 젤
동물시험은 그룹별로 3두의 10~12주령 육성돈에 2㎖씩 근육접종 하여 6주간 실험하였고 양성대조군으로 Circoflex 사용하여 1㎖ 근육접종 하였다. Synbiotics mono blocking ELISA 방법으로 면역원성을 나타내는 S/P 값의 변화의 추이 결과는 표 9에 표시하였고 그 평균값을 도 12에 나타내었다. Circo-flex와 유사한 추이를 보이고 있어 효모 발현 PCV ORF2는 백신으로서의 효력이 있다고 판단된다. 특히 MF를 처리를 거친 시험백신, 세포파쇄액, 전세포의 순서대로 항체가가 높아짐을 보였고 특히 전세포 백신의 경우에 가장 높은 항체가를 보였다.
그룹
 개체번호 접종 1주 전 접종 2주 후 접종 4주 후 접종 6주 후
S/P S/P S/P S/P

시험백신1
전 세포		 1 0.94 0.55 0.59 0.41
2 0.88 1.01 0.5 0.32
3 0.82 0.75 0.66 0.52
평균 0.88 0.75 0.58 0.42

시험백신2
세포 파쇄물		 1 1.05 0.84 0.84 0.67
2 0.96 0.91 0.8 0.5
3 1.03 0.8 0.34 0.33
평균 1.01 0.85 0.66 0.5
시험백신3
MF 처리된
세포 파쇄물		 1 0.65 0.71 0.81 0.7
2 0.96 0.92 0.73 0.54
3 0.91 0.87 0.95 0.95
평균 0.84 0.83 0.83 0.73

양성대조군
(Circoflex)		 1 1.04 0.76 0.7 0.5
2 1 0.75 0.67 0.48
3 0.86 0.72 0.71 0.54
평균 0.97 0.74 0.69 0.51
음성대조군 1 0.95 0.98 0.96 0.97
한국생명공학연구원 KCTC12373BP 20130220 한국생명공학연구원 KCTC12372BP 20120220
<110> Choon Ang Vaccine Lab. Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> PORCINE CIRCOVIRUS2 VACCINE USING RECOMBINANT YEAST WHOLE CELL AND MANUFACTURING THEREOF <130> IPDB49709 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 702 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 atgacatatc cgcgtagacg ttacagaaga cgtagacaca gaccaaggtc gcatctgggc 60 caaatcctac gccgaagacc ttggcttgta caccccagac acagatacag atggcgtagg 120 aagaatggaa tattcaacac tagactatca aggacattcg gatacacaat aaaacggact 180 actgtgaaaa cgccctcttg ggctgttgat atgatgaggt ttaatataaa tgacttccta 240 cccccaggtg gaggttctaa cccaagaagt gttccatttg agtattatag aattagaaaa 300 gtcaaggttg agttctggcc ttgttcccca ataacgcaag gagatagagg tgtgggttct 360 tctgctgtaa ttttggacga caactttgtc actaaggcca cagctctcac ttatgaccct 420 tatgttaact actcctcaag acatactatc actcagccat tttcttacca tagcagatat 480 ttcaccccaa agcctgtctt agactccact attgattact ttcagcctaa taataaaaga 540 aatcaacttt ggctgcgatt gcaaaccact ggtaatgttg accatgttgg gttgggtacc 600 gcatttgaaa actctatata cgatcaagaa tacaacatta gggttacaat gtatgttcag 660 ttcagagaat ttaatttaaa agatccacct ttgaaccctt ag 702 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro 225 230

Claims (38)

  1. 서열번호 1의 2형 돼지 써코바이러스(porcine circovirus type II) 캡시드 Orf2 유전자를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포(Yeast whole cell).


  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 효모는 숙주 세포로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 효모 전세포.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCTC12372BP 또는 KCTC12373BP로 기탁된 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 효모 전세포.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 것을 특징으로 하는, 효모 전세포.
  7. 서열번호 1의 2형 돼지 써코바이러스 캡시드 Orf2 유전자를 포함하는 돼지 서코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물.



  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 효모는 숙주 세포로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 파쇄물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCTC12372BP 또는 KCTC12373BP로 기탁된 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 파쇄물.
  12. 서열번호 1의 유전자로 암호화되는 2형 돼지 써코바이러스 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포 또는 이의 파쇄물을 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.




  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 효모는 숙주 세포로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCTC12372BP 또는 KCTC12373BP로 기탁된 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 Y2805균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
  18. 제 12항에 있어서,
    상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
  19. 제 12항에 있어서,
    상기 효모 전세포는 2x109세포/ml 이하를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
  20. 2형 돼지 서코바이러스(porcine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 Orf2 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 준비하는 단계; 및
    상기 재조합 발현 벡터를 효모에 형질전환시키는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.




  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 20항에 있어서,
    상기 효모는 숙주 세포로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 제조방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCTC12372BP 또는 KCTC12373BP로 기탁된 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 제조방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 Y2805 균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 제조방법.
  26. 제 20항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는 GAL10 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 제조방법.
  27. 제 20항에 있어서,
    상기 Orf2 유전자는 Ty1과 융합하여 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 제조방법.
  28. 제 20항에 있어서,
    상기 효모 전세포는 추가로 열-불활성화하는 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 제조방법.
  29. 제 20항에 있어서,
    상기 효모 전세포는 추가로 포르말린-불활성화하는 것을 특징으로 하는, 효모 전세포의 제조방법.
  30. 2형 돼지 서코바이러스(porcine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 Orf2 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 준비하는 단계;
    상기 재조합 발현 벡터를 효모에 형질전환시켜서 형질전환체를 준비하는 단계; 및
    상기 형질전환체를 파쇄시키는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 파쇄물 제조방법.
  31. 2형 돼지 서코바이러스(porcine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포 또는 이의 파쇄물을 포함하는 백신조성물을 돼지에 투여하여 백신화시키는 방법.




  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 제 31항에 있어서,
    상기 효모는 숙주 세포로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCTC12372BP 또는 KCTC12373BP로 기탁된 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 Y2805 균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.


  37. 삭제
  38. 제 31항에 있어서,
    상기 ORF2는 Ty1과 융합하여 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
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