CN114315983B - 猪圆环病毒亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及猪圆环病毒亚单位疫苗。本发明通过点突变获得了猪圆环病毒2型Cap蛋白的突变体，进一步利用翻译增强子构建了高效的杆状病毒Cap蛋白的转录单元。实验结果表明，本发明突变体联合使用Syn21和P10UTR可以显著提高PCV2 Cap蛋白的表达量，而且形成的VLPs产量也提高了约4倍。另外，本发明构建的杆状病毒系统不但可以应用于亚单位疫苗和VLPs疫苗的生产，也为动物疾病的杆状病毒基因工程疫苗的的研究和推广奠定了基础。

Description

猪圆环病毒亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及猪圆环病毒亚单位疫苗。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中严重流行，临床上常与猪高致病性繁殖与呼吸综合征、猪口蹄疫以及猪细小病毒病等混合感染、继发感染给全世界养猪业造成了重大的经济损失。PCV2不仅是引起PMWS的病原体，而且还与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤(CT)、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎及渗出性表皮炎等疾病密切相关，这些与PCV2相关的疾病统称为猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)。PCV2感染可以破坏动物机体的免疫系统，造成严重的免疫抑制，容易诱发多种细菌及病毒的混合感染与继发感染给疾病的诊断和治疗带来巨大的困难。

PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种共价闭合、单股环状负链DNA病毒呈二十面体对称，无囊膜。PCV2病毒粒子直径为17nm，基因组大小约1.7kb，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2的基因组结构存在11个开放阅读框(ORFs),即ORF1～0RF11，ORFs之间大小相差悬殊,所编码的蛋白大小在2～36kDa。ORF1与ORF2是PCV2最大的2个开放阅读框，分别编码与病毒复制相关的蛋白Rep和Rep'以及病毒的结构蛋白Cap。Cap蛋白作为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，是PCV2的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生特异性免疫应答，是研制PCV2基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。ORF3为病毒复制的非必需基因，其编码的蛋白可诱导PCV2感染的细胞发生凋亡。许多学者在PCV2基因组结构与功能方面开展了大量研究，除ORF1、ORF2与ORF3的功能研究较为透彻外，其他ORFs的功能尚不十分清楚。

在我国已报道的PCV2基因亚型有PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e五种。血清学调查发现国内猪群阳性率高达52.8％～100％，发病率高达50％,死亡率因猪场条件、继发感染等情况不同，一般在5％～70％,给养猪业造成巨大经济损失。疫苗免疫对PCV2的预防控制起到关键性作用。

目前，市场上销售的基因工程亚单位疫苗有二种类型：第一类是大肠杆菌表达系统，青岛易邦采用PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV-2Cap蛋白，制备亚单位疫苗，但是原核表达易出现包涵体，包涵体没有活性，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果；第二类是昆虫杆状病毒表达载体系统，勃林格、英特威/先灵葆雅为昆虫杆状病毒表达的基因工程亚单位疫苗，由于该系统所需要的周期远比动物或植物系统短，可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的表达生产，生产的重组蛋白产量高，蛋白翻译后加工比细菌、酵母生产系统完善，然而其昂贵的疫苗价格限制其广泛的应用，国内在这方面虽做了不少研究工作，但并未实现产业化。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高表达量的猪圆环病毒亚单位疫苗。

本发明提供了猪圆环病毒2型Cap蛋白的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的突变体为在野生型Cap蛋白的基础上，132位氨基酸由Asp突变为Leu氨基酸。

研究表明，Cap基因定点突变分析表明氨基酸序列中个别氨基酸突变能够提高Cap蛋白的结构稳定性，提高其蛋白表达能力，并有助于帮助其正确折叠组装成正确的VLP病毒样颗粒。通过筛选，我们发现当132位氨基酸由Asp突变为Leu氨基酸时，Cap蛋白表达能力得到提高，有助于提高Cap蛋白亚单位疫苗的产量。

本发明还提供了编码所述Cap蛋白突变体的核酸。

一些实施例中，所述编码Cap蛋白突变体的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种转录单元，其包括启动子和本发明所述的核酸。

在优化目的蛋白序列的基础上，本发明通过添加相关翻译增强原件，更显著提升了Cap蛋白的表达能力。其中，Syn21是一段21bp的富含AT的合成序列，研究表明，Syn21序列增强外源蛋白在Sf9昆虫细胞中表达量的可能性是极高的。P10UTR是杆状病毒极晚期P10基因的聚腺苷酸信号，对mRNA的稳定性是十分重要的，本发明以P10 UTR替换异源的SV40UTR后可以显著增强异源蛋白的聚腺苷酸化和蛋白表达量。

本发明中，所述转录单元包括启动子、Syn21片段、Kozak片段、本发明所述核酸、P10UTR元件。

本发明中，所述启动子包括P10启动子和/或Ph启动子。

多角体蛋白(Ph)是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的累积可高达30％～50％，是病毒复制非必需成分，对于病毒粒子却有保护作用，使之保持稳定和感染能力。P10蛋白是高效表达的极晚期蛋白，是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。这两个基因启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统的理想的外源基因插入位点，本发明中，P10启动子或Ph启动子均能够正常启动基因表达。

本发明中，为了方便重组蛋白的表达纯化，所述转录单元中编码突变体的核酸的3’端还包括His标签编码核酸。

本发明实施例中，所述转录单元的核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种表达载体，其包括本发明所述的转录单元。

本发明所述表达载体的骨架载体为杆状病毒穿梭质粒。一些实施例中，所述骨架载体为pFast。

本发明还提供了转化或转染本发明所述表达载体的宿主。

本发明中，所述宿主为DH10Bac细胞、Sf9细胞或High Five细胞。

本实施例发明中，质粒转座用的是DH10Bac细胞，质粒转染及病毒培养用的是贴壁培养的sf9细胞，蛋白最终表达用的是悬浮培养的High Five细胞

将扩繁获得的病毒侵染High Five细胞，用于病毒样颗粒的制备。

本发明还提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其包括培养本发明所述宿主，获得含有猪圆环病毒2型病毒样颗粒的培养物。

所述培养物经纯化获得猪圆环病毒2型病毒样颗粒。

本发明还提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其由本发明所述制备方法制得。

本发明所述突变体、所述核酸、所述的转录单元、所述表达载体、所述宿主、所述猪圆环病毒2型病毒样颗粒，在制备防治猪圆环病毒病的产品中的应用。

本发明还提供了一种防治猪圆环病毒病的产品，其包括本发明所述方法制备获得的猪圆环病毒2型病毒样颗粒。

本发明还提供了一种防治猪圆环病毒病的方法，其为给予本发明所述的产品。所述给予的方法包括注射。所述注射的位置包括颈部肌肉。

本发明通过点突变获得了猪圆环病毒2型Cap蛋白的突变体，进一步利用翻译增强子构建了高效的杆状病毒Cap蛋白的转录单元。实验结果表明，本发明突变体联合使用Syn21和P10UTR可以显著提高PCV2 Cap蛋白的表达量，而且形成的VLPs产量也提高了约4倍。另外，本发明构建的杆状病毒系统不但可以应用于亚单位疫苗和VLPs疫苗的生产，也为动物疾病的杆状病毒基因工程疫苗的的研究和推广奠定了基础。

附图说明

图1示PCV2b种毒的WB检测；

图2示接毒样液SDS-PAGE检测；

图3示圆环Elisa抗体阳性变化，其中*：0.01＜P＜0.05，**：0.001＜P＜0.01，***：0.0001＜P＜0.001，****：＜0.0001(软件：GraphPad Prism9)。

具体实施方式

本发明提供了猪圆环病毒亚单位疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明中，Cap蛋白突变体的氨基酸序列为：

MAYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKKTTVRTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTILYFQPNNKRNQLWLRLQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP*(SEQ ID NO:1)。

编码Cap蛋白突变体的核酸序列为：

atggcctatcctaggcgaagataccggaggcgtcgccatcgcccacggtcccatttgggtcagattctgaggcgccgtccctggctggtccatccgcgacatcgttatagatggagaagaaaaaacggtatcttcaacacccgcctgtcccgcaccttcggttacaccattaagaagaccaccgtgcgcaccccttcctgggctgttgatatgatgcgcttcaacatcaacgacttcctgcctcctggtggtggttccaaccctcgctccgtgccttttgagtactaccgcatccgcaaggtgaaggtggagttctggccttgctcccctatcacccagggcgaccgcggtgtgggttcctccgctgtgattctggatgacaacttcgtgaccaaggctaccgctctgacctacgacccttacgtgaactactcctcccgccacaccatcacccagcctttctcctaccactcccgctacttcacccctaagcctgtgctggactccaccatcctgtacttccagcctaacaacaagcgcaaccagctgtggctgcgcctgcagactactggtaatgtggaccatgtgggtctgggtaccgctttcgagaactccatctacgaccaggagtacaacatccgcgtgaccatgtacgtgcagttccgcgagttcaacctgaaggaccctcctctgaacccttaa(SEQ ID NO:2)。

Syn21片段的核酸序列为aacttaaaaaaaaaaatcaaa

KOZAK片段的核酸序列为gccaccatgg

P10 UTR元件的核酸序列为actagtcgcggccgctttcgaatctagagcctgcagtctcgacaagcttgtcgagaagtactagaggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgtttctagaatgaatcgtttttaaaataacaaatcaattgttttataatattcgtacgattctttgattatgtaataaaatgtgatcattaggaagattacgaaaaatataaaaaatatgagttctgtgtgtataacaaatgctgtaaacgccacaattgtgtttgttgcaaataaacccatgattatttgattaaaattgttgttttctttgttcatagacaatagtgtgttttgcctaaacgtgtactgcataaactccatgcgagtgtatagcgagctagtggctaacgcttgccccaccaaagtagattcgtcaaaatcctcaatttcatcaccctcctccaagtttaacatttggccgtcggaattaacttctaaagatgccacataatctaataaatgaaatagagattcaaacgtggcgtcatcgtccgtttcgaccatttccgaaaagaactcgggcataaactctatgatttctctggacgtggtgttgtcgaaactctcaaagtacgcagtcaggaacgtgcgcgacatgtcgtcgggaaactcgcgcggaaacatgttgttgtaaccgaacgggtcccatagcgccaaaaccaaatctgccagcgtcaatagaatgagcacgatgccgacaatggagctggcttggatagcgattcgagttaacaagctt。

P10启动子的核酸序列为gacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacattttatttacaatc。

Ph启动子的核酸序列为atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaat。

其中，含有pH启动子的核酸序列为(SEQ ID NO:3)：

atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaat(pH)aacttaaaaaaaaaaatcaaa(SYN21)gccaccatgg(kozak)attatcctaggcgaagataccggaggcgtcgccatcgcccacggtcccatttgggtcagattctgaggcgccgtccctggctggtccatccgcgacatcgttatagatggagaagaaaaaacggtatcttcaacacccgcctgtcccgcaccttcggttacaccattaagaagaccaccgtgcgcaccccttcctgggctgttgatatgatgcgcttcaacatcaacgacttcctgcctcctggtggtggttccaaccctcgctccgtgccttttgagtactaccgcatccgcaaggtgaaggtggagttctggccttgctcccctatcacccagggcgaccgcggtgtgggttcctccgctgtgattctggatgacaacttcgtgaccaaggctaccgctctgacctacgacccttacgtgaactactcctcccgccacaccatcacccagcctttctcctaccactcccgctacttcacccctaagcctgtgctggactccaccatcctgtacttccagcctaacaacaagcgcaaccagctgtggctgcgcctgcagactactggtaatgtggaccatgtgggtctgggtaccgctttcgagaactccatctacgaccaggagtacaacatccgcgtgaccatgtacgtgcagttccgcgagttcaacctgaaggaccctcctctgaacccttaa(CAP)caccaccaccaccaccaccaccaccac(9×His)actagtcgcggccgctttcgaatctagagcctgcagtctcgacaagcttgtcgagaagtactagaggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgtttctagaatgaatcgtttttaaaataacaaatcaattgttttataatattcgtacgattctttgattatgtaataaaatgtgatcattaggaagattacgaaaaatataaaaaatatgagttctgtgtgtataacaaatgctgtaaacgccacaattgtgtttgttgcaaataaacccatgattatttgattaaaattgttgttttctttgttcatagacaatagtgtgttttgcctaaacgtgtactgcataaactccatgcgagtgtatagcgagctagtggctaacgcttgccccaccaaagtagattcgtcaaaatcctcaatttcatcaccctcctccaagtttaacatttggccgtcggaattaacttctaaagatgccacataatctaataaatgaaatagagattcaaacgtggcgtcatcgtccgtttcgaccatttccgaaaagaactcgggcataaactctatgatttctctggacgtggtgttgtcgaaactctcaaagtacgcagtcaggaacgtgcgcgacatgtcgtcgggaaactcgcgcggaaacatgttgttgtaaccgaacgggtcccatagcgccaaaaccaaatctgccagcgtcaatagaatgagcacgatgccgacaatggagctggcttggatagcgattcgagttaacaagctt(P10TUR)。

其中，含有P10启动子的核酸序列为(SEQ ID NO:4)：

gacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacattttatttacaatc(P10)aacttaaaaaaaaaaatcaaa(SYN21)gccaccatgg(KOZAK)attatcctaggcgaagataccggaggcgtcgccatcgcccacggtcccatttgggtcagattctgaggcgccgtccctggctggtccatccgcgacatcgttatagatggagaagaaaaaacggtatcttcaacacccgcctgtcccgcaccttcggttacaccattaagaagaccaccgtgcgcaccccttcctgggctgttgatatgatgcgcttcaacatcaacgacttcctgcctcctggtggtggttccaaccctcgctccgtgccttttgagtactaccgcatccgcaaggtgaaggtggagttctggccttgctcccctatcacccagggcgaccgcggtgtgggttcctccgctgtgattctggatgacaacttcgtgaccaaggctaccgctctgacctacgacccttacgtgaactactcctcccgccacaccatcacccagcctttctcctaccactcccgctacttcacccctaagcctgtgctggactccaccatcctgtacttccagcctaacaacaagcgcaaccagctgtggctgcgcctgcagactactggtaatgtggaccatgtgggtctgggtaccgctttcgagaactccatctacgaccaggagtacaacatccgcgtgaccatgtacgtgcagttccgcgagttcaacctgaaggaccctcctctgaacccttaa(CAP)caccaccaccaccaccaccaccaccac(9×His)actagtcgcggccgctttcgaatctagagcctgcagtctcgacaagcttgtcgagaagtactagaggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgtttctagaatgaatcgtttttaaaataacaaatcaattgttttataatattcgtacgattctttgattatgtaataaaatgtgatcattaggaagattacgaaaaatataaaaaatatgagttctgtgtgtataacaaatgctgtaaacgccacaattgtgtttgttgcaaataaacccatgattatttgattaaaattgttgttttctttgttcatagacaatagtgtgttttgcctaaacgtgtactgcataaactccatgcgagtgtatagcgagctagtggctaacgcttgccccaccaaagtagattcgtcaaaatcctcaatttcatcaccctcctccaagtttaacatttggccgtcggaattaacttctaaagatgccacataatctaataaatgaaatagagattcaaacgtggcgtcatcgtccgtttcgaccatttccgaaaagaactcgggcataaactctatgatttctctggacgtggtgttgtcgaaactctcaaagtacgcagtcaggaacgtgcgcgacatgtcgtcgggaaactcgcgcggaaacatgttgttgtaaccgaacgggtcccatagcgccaaaaccaaatctgccagcgtcaatagaatgagcacgatgccgacaatggagctggcttggatagcgattcgagttaacaagctt(P10TUR)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一、实验方法

1、PCV2a/2b表达质粒的构建

根据河南某生猪养殖场分离的的PCV2毒株，进行全病毒测序，确定目的Cap蛋白的表达序列，对编码Cap蛋白的0RF2的进行优化,依据昆虫细胞密码子偏好，及所需突变的位点设计0RF2的编码序列，并交与生物工程有限公司合成并构建pFast-PCV2a/PCV2b蛋白表达质粒。

基因的定点突变-直接以已构建的含目的基因的质粒为模板,通过PCR反应实现基因的定点突变：50μL PCR反应体系中含:Tris-HCl 10mmol/L，模板DNA 10ng，dNTP0.2mmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，上、下游引物各50ng，以上反应液混合均匀后，95℃变性5min，再加入Taq plus DNA聚合酶1.5U。循环反应参数：94℃30秒，55℃30s，72℃10min，共16个循环,反应完成后72℃延伸反应7min

2、重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞

1)-80℃种取出DH10BacE.coli感受态细胞冰上解冻。

2)将200ng的pFastBac1-gene转移载体缓慢加入感受态细胞中，轻轻混匀后冰上放置20min，然后42℃热击90s；

3)迅速冰上静止5min后向EP管里加入1mL无抗培养基37℃，200rpm震荡摇菌2h。

4)取10μL菌液涂于含有50mg/mL卡那霉素，7mg/mL庆大霉素，10mg/mL四环素，100mg/mLx-gal,40mg/mLIPTG的LB平板上，锡纸包裹完全后在37℃，倒置培养2～3天即可。

3、重组Bacmid质粒的筛选与鉴定

1)涂板后12～24h观察菌落疏密程度，根据结果适当调整涂板菌液量，重新涂板备用。

2)涂板后48～60h可以对准白板进行挑点验证，纯白色菌落为理论已重组菌株。此时可以根据菌落颜色挑取3～5个白色单克隆菌落接种分别接种于5mL含有50mg/mL卡那霉素，7mg/mL庆大霉素，10mg/mL四环素，37℃摇菌10～12h菌液完全浑浊即可。

3)菌液PCR初步筛选阳性克隆菌，使用M13引物初步筛选出条带单一的重组杆状病毒菌液。

4、重组BacmindDNA提取与鉴定

1)取鉴定正确很纯的菌液，加入到3～5mL的三抗培养基中(卡钠、庆大、四环素)37℃摇12～15小时。

2)收取菌液、4000rpm离心5～10min，完全弃干净上清。

3)用300μL质粒提取试剂盒中的bufferP1完全重悬菌体。

4)加入300μL质粒提取试剂盒中的bufferP2轻柔混匀，充分裂解。

5)加入300μL质粒提取试剂盒中的bufferP3轻柔混匀，完全中和。

6)12000rpm离心10min，将上清转移到含600μL预冷异丙醇的1.5mL无菌离心管中，混匀后在-20℃冰箱中冷冻30min。

7)12000rpm，4℃离心10min，弃上清，此时可见小白点依附于管底。

8)加入1mL预冷的75％的乙醇，冲洗，12000rpm离心10min，小心弃上清。

9)加入1mL预冷的100％的乙醇，冲洗，12000rpm离心10min，小心弃上清，放置在超净中晾干20～30min，直至小白点完全消失。

10)加入30μL无菌水，轻柔弹起管底，溶解DNA静置20～30min后，使用M13引物鉴定，理论上若目的基因成功转座至Bacmid中，那扩增产物的大小应为(2300bp+目的基因长度)。

11)提取的DNA可以用于转染或者-20℃保存备用。

5.cellfectinII方法转染穿梭质粒

1)在六孔板中接种0.6×10⁶～0.8×10⁶个Sf9细胞/2mL/孔于27℃培养30min～60min，使细胞贴壁完全，整体贴壁为70～80％左右，更换培养基，换成Grace’s medium培养基2mL；

2)在这期间制备Bacmid与CellfectinII Reagent复合物：

A.用100μl不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)轻柔稀释1μg重组Bacmid(约10μl)；

B.在使用前将CellfectinII Reagent轻柔倒置5～10次，使其充分混匀，取6μLCellfectinII Reagent用100μL不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)轻柔稀释；

C.将上述两种稀释液合并(总体积约210μL),轻柔混匀，室温孵育30～45min；

3)在制备Bacmid与CellfectinII Reagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2mL不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)洗涤一次，去掉原培养基，换成Grance’smedium培养基2mL；

4)将含有210μL的复合物轻轻混匀后，温柔加到每个孔中，轻柔混匀；

5)将六孔板用保鲜膜包被后在27℃恒温培养箱中孵育100～120h直到细胞出现典型病毒感染迹象表明病毒已经增殖，转染成功，P0代已经包被完成。

6、P1病毒液的收集

当细胞出现感染迹象时，将细胞上清转移至15mL离心管中，1000g离心10min以去除细胞及大的碎片，亦可用蛋白结合率低的0.2μm的滤膜过滤，滴度损失小于10％；将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中,将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱(短期)。若长期保存，进行1mL分装，避光储存于-80℃。

7、P2及P3代病毒扩增及收获

原代病毒滴度(P1)较低，在1×10⁵pfu/mL左右，扩增后滴度可达1×10⁷～1×10⁸pfu/mL。15cm Dish(共需1.6×10⁷个)中加入适量的P1代病毒。扩增病毒时可用下列公式进行计算：MOI在0.01～0.1之间，接种量(感染细胞72h收集的病毒扩增的将近100倍，超过120h收集的病毒质量较低。每种病毒的收集时间都有一定的差别，如在72h收集，但是随着细胞的裂解，对病毒的增殖会有影响。

8、蛋白纯化

1)按照优化后的最佳表达MOI值，将P3代重组杆状病毒以MOI＝2的比例感染处于对数生长中期、密度为3×10⁶/mL的High Five细胞,115rpm、27℃培养120h。

2)收获细胞混合物，在4℃，3800rpm离心40min，离心后的上清液经0.22μm滤膜过滤后经截留值为30kDa的切向流超滤膜包VIVAFLOW200浓缩至50mL；

3)取1mL悬浊均一的镍离子亲和层析介质加入到重力流动层析聚丙烯空柱中，待溶液缓慢流出后加入10mL Binding Buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCI，pH＝7.5)自然流穿平衡柱子；

4)在4℃层析柜将步骤1中浓缩的蛋白溶液沿管壁缓慢加入到层析柱中，同时收集流穿液再次进行挂柱，反复3次；

5)待3次挂柱完成后，分别向层析柱中加入含有5mM、10mM、20mM咪唑的WashBuffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH＝7.5)冲洗介质，同时用G250染液监测流穿液，直到检测不到蛋白；

6)用含250mM咪唑的Elution Buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl,pH＝7.5)将介质上的目的蛋白洗脱下来，直到洗脱液用G250染液检测不到蛋白；

7)将各组分取样变性后经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染液染色分析；

8)将步骤6中洗脱的蛋白浓缩至500μL，4℃、13300rpm高速离心15min去除沉淀；

9)选取GE公司生产的Superdex 200凝胶过滤层析柱，在AKTA Purifier纯化仪上用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH＝7.5)平衡一个柱体体积；

10)将步骤8中的蛋白进行凝胶过滤层析，收集分离组分经WB验证及分析。

9、蛋白表达验证

1)跑电泳：组装电泳槽，向槽中加1×Running buffer至胶孔液面之上，缓慢加样后恒压60V，2h。

2)转膜：裁剪好合适大小的PVDF膜，并用甲醇激活，将激活好的膜压在跑好的胶块上，处理好后将其放入含有转膜液的电泳槽内，电泳槽冰上低温处理，恒压100V，2h。

3)丽春红处理：跑完电泳后将膜放入丽春红溶液中处理，裁剪待测蛋白的条带，优化表达后的Cap蛋白在25KDa。

4)将待测蛋白条带放入5％脱脂奶粉中，在水平摇床上低速处理1-1.5h。

5)封闭完成后，抽掉5％脱脂奶粉，加入1×TBST溶液，在水平摇床上处理10min。

6)目的条带与一抗反应：将一抗(鼠抗和兔抗)用5％脱脂奶粉稀释，hTERT稀释比例1:100，α-Tublin稀释比例1:2000，GAPDH稀释比例1:2000。

7)收集一抗：将孵好的内参条带和待测蛋白条带用1×TBST洗2-3次，每次摇洗10-15min。

8)孵二抗：二抗(羊抗鼠和羊抗兔)1:2000稀释，孵育2.5h左右。

9)收集敷完的二抗后，使用水平摇床将内参条带和待测蛋白条带用1×TBST洗2-3次，每次摇洗10-15min。

10)蛋白成像：制备超敏发光液，并用制备好的发光液处理待测条带，曝光成像。

10.疫苗制备

将纯化的重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后制备而成，4℃保存备用。

11.猪免疫保护实验

40头21日龄的健康仔猪，随机分为4组，第1组和第2组分别为阴性对照组和空白对照组，颈部肌肉均接种灭菌的0.01mol/L pH 7.2PBS溶液。第3组和第4组分别为国药动保组(阳性对照)和兴华生物组(即本发明的疫苗)，颈部肌肉接种,首免后21d,加强免疫一次。首免后35d，除空白对照组外，其余3组均进行PCV2攻毒。

攻毒后，每天测量猪体温、观察临床症状并打分，攻毒后的第0、7、14和28天采血并分离血清，用于病毒含量及抗原检出率的检测；在第16天和第28天进行腹股沟淋巴抗原检测。

二、实验结果

(1)PCV2b种毒的WB检测

以Cap蛋白作为单抗特异性对种毒进行WB检测(图1)，结果表明该种毒可正确表达2b-Cap蛋白。

(2)接毒样液SDS-PAGE检测

将优化后的种毒接在High Five细胞上，SDS-PAGE检测结果表明(图2)，该种毒可高效表达Cap蛋白，蛋白表达成功，表达量在100mg/L～150mg/L；

(3)动物实验评估

①血液抗原检出率和病毒载量对比

a.攻毒对照组整体血液中的圆环抗原检出率和病毒载量最高，持续期最长；

b.兴华生物组的圆环抗原检出率低，病毒载量少，且持续期长，优于国药动保组；

②腹股沟淋巴病毒载量检测

a.阴性对照组血液中圆环抗原检出率最高，病毒载量最高；

b.从腹股沟淋巴检测整体来看，本发明的兴华生物组的病毒载量最低，效果最佳。

③圆环Elisa抗体阳性变化(图3)

a.阴性对照组和空白对照组未免疫疫苗，抗体值整体出现下降；

b.国药动保组和兴华生物组二免后抗体水平整体上升，与阴性对照组和空白对照组相比，产生了极显著的差异(p<0.0001)，且本发明的兴华生物组优于国药动保组，抗体效果更好。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南兴华生物技术有限公司

<120> 猪圆环病毒亚单位疫苗

<130> MP21035082

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Leu Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcctatc ctaggcgaag ataccggagg cgtcgccatc gcccacggtc ccatttgggt 60

cagattctga ggcgccgtcc ctggctggtc catccgcgac atcgttatag atggagaaga 120

aaaaacggta tcttcaacac ccgcctgtcc cgcaccttcg gttacaccat taagaagacc 180

accgtgcgca ccccttcctg ggctgttgat atgatgcgct tcaacatcaa cgacttcctg 240

cctcctggtg gtggttccaa ccctcgctcc gtgccttttg agtactaccg catccgcaag 300

gtgaaggtgg agttctggcc ttgctcccct atcacccagg gcgaccgcgg tgtgggttcc 360

tccgctgtga ttctggatga caacttcgtg accaaggcta ccgctctgac ctacgaccct 420

tacgtgaact actcctcccg ccacaccatc acccagcctt tctcctacca ctcccgctac 480

ttcaccccta agcctgtgct ggactccacc atcctgtact tccagcctaa caacaagcgc 540

aaccagctgt ggctgcgcct gcagactact ggtaatgtgg accatgtggg tctgggtacc 600

gctttcgaga actccatcta cgaccaggag tacaacatcc gcgtgaccat gtacgtgcag 660

ttccgcgagt tcaacctgaa ggaccctcct ctgaaccctt aa 702

<210> 3

<211> 1698

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60

gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa ataacttaaa aaaaaaaatc aaagccacca 120

tggattatcc taggcgaaga taccggaggc gtcgccatcg cccacggtcc catttgggtc 180

agattctgag gcgccgtccc tggctggtcc atccgcgaca tcgttataga tggagaagaa 240

aaaacggtat cttcaacacc cgcctgtccc gcaccttcgg ttacaccatt aagaagacca 300

ccgtgcgcac cccttcctgg gctgttgata tgatgcgctt caacatcaac gacttcctgc 360

ctcctggtgg tggttccaac cctcgctccg tgccttttga gtactaccgc atccgcaagg 420

tgaaggtgga gttctggcct tgctccccta tcacccaggg cgaccgcggt gtgggttcct 480

ccgctgtgat tctggatgac aacttcgtga ccaaggctac cgctctgacc tacgaccctt 540

acgtgaacta ctcctcccgc cacaccatca cccagccttt ctcctaccac tcccgctact 600

tcacccctaa gcctgtgctg gactccacca tcctgtactt ccagcctaac aacaagcgca 660

accagctgtg gctgcgcctg cagactactg gtaatgtgga ccatgtgggt ctgggtaccg 720

ctttcgagaa ctccatctac gaccaggagt acaacatccg cgtgaccatg tacgtgcagt 780

tccgcgagtt caacctgaag gaccctcctc tgaaccctta acaccaccac caccaccacc 840

accaccacac tagtcgcggc cgctttcgaa tctagagcct gcagtctcga caagcttgtc 900

gagaagtact agaggatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 960

aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt 1020

tctagaatga atcgttttta aaataacaaa tcaattgttt tataatattc gtacgattct 1080

ttgattatgt aataaaatgt gatcattagg aagattacga aaaatataaa aaatatgagt 1140

tctgtgtgta taacaaatgc tgtaaacgcc acaattgtgt ttgttgcaaa taaacccatg 1200

attatttgat taaaattgtt gttttctttg ttcatagaca atagtgtgtt ttgcctaaac 1260

gtgtactgca taaactccat gcgagtgtat agcgagctag tggctaacgc ttgccccacc 1320

aaagtagatt cgtcaaaatc ctcaatttca tcaccctcct ccaagtttaa catttggccg 1380

tcggaattaa cttctaaaga tgccacataa tctaataaat gaaatagaga ttcaaacgtg 1440

gcgtcatcgt ccgtttcgac catttccgaa aagaactcgg gcataaactc tatgatttct 1500

ctggacgtgg tgttgtcgaa actctcaaag tacgcagtca ggaacgtgcg cgacatgtcg 1560

tcgggaaact cgcgcggaaa catgttgttg taaccgaacg ggtcccatag cgccaaaacc 1620

aaatctgcca gcgtcaatag aatgagcacg atgccgacaa tggagctggc ttggatagcg 1680

attcgagtta acaagctt 1698

<210> 4

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacctttaat tcaacccaac acaatatatt atagttaaat aagaattatt atcaaatcat 60

ttgtatatta attaaaatac tatactgtaa attacatttt atttacaatc aacttaaaaa 120

aaaaaatcaa agccaccatg gattatccta ggcgaagata ccggaggcgt cgccatcgcc 180

cacggtccca tttgggtcag attctgaggc gccgtccctg gctggtccat ccgcgacatc 240

gttatagatg gagaagaaaa aacggtatct tcaacacccg cctgtcccgc accttcggtt 300

acaccattaa gaagaccacc gtgcgcaccc cttcctgggc tgttgatatg atgcgcttca 360

acatcaacga cttcctgcct cctggtggtg gttccaaccc tcgctccgtg ccttttgagt 420

actaccgcat ccgcaaggtg aaggtggagt tctggccttg ctcccctatc acccagggcg 480

accgcggtgt gggttcctcc gctgtgattc tggatgacaa cttcgtgacc aaggctaccg 540

ctctgaccta cgacccttac gtgaactact cctcccgcca caccatcacc cagcctttct 600

cctaccactc ccgctacttc acccctaagc ctgtgctgga ctccaccatc ctgtacttcc 660

agcctaacaa caagcgcaac cagctgtggc tgcgcctgca gactactggt aatgtggacc 720

atgtgggtct gggtaccgct ttcgagaact ccatctacga ccaggagtac aacatccgcg 780

tgaccatgta cgtgcagttc cgcgagttca acctgaagga ccctcctctg aacccttaac 840

accaccacca ccaccaccac caccacacta gtcgcggccg ctttcgaatc tagagcctgc 900

agtctcgaca agcttgtcga gaagtactag aggatcataa tcagccatac cacatttgta 960

gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1020

aatgcaattg ttgttgtttc tagaatgaat cgtttttaaa ataacaaatc aattgtttta 1080

taatattcgt acgattcttt gattatgtaa taaaatgtga tcattaggaa gattacgaaa 1140

aatataaaaa atatgagttc tgtgtgtata acaaatgctg taaacgccac aattgtgttt 1200

gttgcaaata aacccatgat tatttgatta aaattgttgt tttctttgtt catagacaat 1260

agtgtgtttt gcctaaacgt gtactgcata aactccatgc gagtgtatag cgagctagtg 1320

gctaacgctt gccccaccaa agtagattcg tcaaaatcct caatttcatc accctcctcc 1380

aagtttaaca tttggccgtc ggaattaact tctaaagatg ccacataatc taataaatga 1440

aatagagatt caaacgtggc gtcatcgtcc gtttcgacca tttccgaaaa gaactcgggc 1500

ataaactcta tgatttctct ggacgtggtg ttgtcgaaac tctcaaagta cgcagtcagg 1560

aacgtgcgcg acatgtcgtc gggaaactcg cgcggaaaca tgttgttgta accgaacggg 1620

tcccatagcg ccaaaaccaa atctgccagc gtcaatagaa tgagcacgat gccgacaatg 1680

gagctggctt ggatagcgat tcgagttaac aagctt 1716

Claims (11)

1.猪圆环病毒2型Cap蛋白的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述突变体的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.转录单元，其特征在于，包括启动子和权利要求2或3所述的核酸。

5.根据权利要求4所述的转录单元，其特征在于，包括启动子、Syn21片段、Kozak片段、权利要求2或3所述的核酸、P10 UTR元件。

6.根据权利要求4或5所述的转录单元，其特征在于，所述启动子包括P10启动子和/或Ph启动子。

7.根据权利要求4~6任一项所述的转录单元，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

8.表达载体，其特征在于，包括权利要求4~7任一项所述的转录单元。

9.向宿主中转化或转染了权利要求8所述表达载体的工程化细胞。

10.根据权利要求9所述的工程化细胞，其特征在于，所述宿主为Sf9细胞。

11.权利要求1所述突变体、权利要求2或3所述核酸、权利要求4~7任一项所述的转录单元、权利要求8所述表达载体、权利要求9或10所述工程化细胞，在制备防治猪圆环病毒病的产品中的应用。