CN110227153A

CN110227153A - 一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110227153A
Application number: CN201910643370.XA
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 易小萍; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Shino Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Shino Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明公开了一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，所述疫苗包括：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪轮状病毒VP7蛋白。该疫苗使用真核表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，保护效果好，对动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。

Description

一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于动物疫苗技术领域，尤其涉及一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PRV)属于呼肠病毒科轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一，主要感染1-4周龄仔猪，具有发病率高、分布广泛的特点。目前预防猪轮状病毒感染的主要方法是疫苗接种，应用疫苗免疫已经成为降低相关发病率、病死率和减轻经济负担的一个重要途径。目前市场上常见疫苗有强毒灭活苗和弱毒活疫苗，但由于轮状病毒的多型性；以及减毒苗与野毒株基因重组,引起回复突变等，这些因素都给该病的防疫造成巨大困难。

猪轮状病毒VP7蛋白是轮状病毒(RV)粒子表面的外壳蛋白，即建立病毒体外层表面的糖蛋白，VP7蛋白被免疫力(immunity)当作是防止感染的途径，也是PRV主要的中和抗原，可以引起机体产生中和抗体，起到免疫保护作用。本发明因此而来。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，以解决现有技术中存在的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种免疫组合物，包含：

采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪轮状病毒VP7蛋白。

本发明一个较佳实施例中，所述猪轮状病毒VP7蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明还公开了所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪轮状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明还公开了所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。

本发明的另一目的在于提供了一种免疫组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将密码子优化后的猪轮状病毒VP7蛋白编码基因克隆到真核表达载体中，得到含有VP7蛋白编码基因的重组质粒；

S2、将步骤S1中所述的重组质粒转染CHO细胞，得到重组CHO细胞株；

S3、通过培养、筛选、驯化步骤S2中所述的重组CHO细胞株，得到稳定且能够高度表达重组猪轮状病毒VP7蛋白的重组CHO细胞株；

S4、对S3步骤中所述的重组CHO细胞株进行发酵培养，纯化后得到重组猪轮状病毒VP7蛋白。

本发明还提供了所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于在受试动物中诱导针对猪轮状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明还提供了所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。

本发明还公开了一种蛋白，其包括以下组成的组：

SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供所述的蛋白用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。

本发明的另一目的在于提供所述的蛋白用于生产用于检测猪轮状病毒相关诊断试剂的用途。

本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明具备以下有益效果：

本发明公开了一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，该疫苗能在动物体内产生较强的体液免疫，能够激发更强更全面的抗体保护；本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达重组猪轮状病毒VP7蛋白的重组CHO细胞株，该细胞株表达VP7蛋白产量高，大大降低了疫苗生产成本；本发明的重组猪轮状病毒VP7蛋白生产过程不涉及全病毒，具有天然安全性，本发明使用的载体有谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)筛选扩增系统，可以增加目的基因拷贝数，通过CHO细胞进行表达，分泌到上清中，易于纯化，哺乳动物细胞真核表达，表达糖基化修饰完善，最接近本身蛋白分子，悬浮培养，易于大规模生产；本发明的猪轮状病毒亚单位疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；

图1为将PRV-VP7基因经PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，可以看到在0.9kbp附近出现条带，其中1为PRV-VP7基因，2为阴性对照，M为分子量标记；

图2为多个PRV-VP7基因转化的菌落样品经PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，在0.9kbp条带附近出现为阳性样品，其中1-5均为PRV-VP7基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；

图3为构建的真核表达载体pCI-VP7-GS图谱；

图4为实施例2中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约34kDa附近出现条带，其中1为实施例2中收获的细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；

图5为实施例3中重组CHO上清样品Western Blot检测结果，其中1为阴性对照，2为重组CHO细胞上清样品，M为分子量标记；

图6为蛋白纯化后的结果，其中1为上样，2为流穿，3为洗脱，4-7为不同浓度洗脱后样品，M为分子量标记；

图7为攻毒后对照组猪解剖结果。

具体实施方式

现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明中VP7蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列，使用载体可以包括但不限于pSV2-GS，pCI-GS，pcDNA4-GS，优选的用pCI-GS。CHO细胞系可以是为DG44，DXB11，CHO-K1，CHO-S细胞株，优选的CHO-S，但不限于此。佐剂优选自MONTANIDE ISA 15、MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE GEL 01的一种或者两种以上的组合。

实施例1重组真核表达载体pCI-VP7-GS的构建

1.1、pUC-VP7质粒载体的构建

密码子优化的VP7基因来自南京金斯瑞生物科技有限公司，并克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-VP7质粒载体。优化后的VP7基因序列如SEQ ID NO.1所示。

1.2、VP7基因扩增

以pUC-VP7作为模板，VP7-F、VP7-R作为引物进行PCR扩增(VP7-F的基因序列如SEQID NO.3所示；VP7-R的基因序列如SEQ ID NO.4所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 VP7基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在0.9kbp的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

1.3、酶切

本实施例采用的真核表达载体为pCI-GS，将pCI-GS质粒和纯化后的VP7基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 VP7基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

1.4、连接

将酶切过的pCI-GS质粒和VP7基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 VP7基因与pCI-GS质粒连接体系

1.5、转化

取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

1.6、菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VP7-F和VP7-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小。如图2所示，出现0.9kbp条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定正确的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存，得到真核表达载体pCI-VP7-GS。构建好的载体图谱如图3所示。

实施例2重组CHO细胞的构建与筛选

1.细胞转染

1.1准备细胞本实施例采用的CHO细胞为CHO-S细胞，取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/ml。

1.2质粒与细胞混合取实施例1中pCI-VP7-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3电转280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/ml时，添加50μM MSX(L-methionine sulphoximine)加压筛选。

2.单克隆筛选

2.1用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2铺板稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。

2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基(含10％FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3.细胞摇瓶发酵

3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅中预热至37℃。

3.2从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

实施例3 SDS-PAGE检测

将实施例2中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，同时使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图4所示，在分子量约34kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例4 Western Blot检测

将实施例3中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，猪源抗PRV多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图5所示，重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例5蛋白纯化

目的蛋白含有his标签，使用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。

1.Ni柱的再生和平衡：

1.1、0.5mol/L的NaOH反向冲洗Ni柱10min，冲洗结束后，用超纯水正向冲洗。

1.2、50mol/L的NiSO4冲洗5柱体积。结束后，用超纯水正向冲洗。

1.3、用含有300mM咪唑PBS(pH＝7.4)缓冲液冲洗3个柱体积后继续用PBS缓冲液冲洗平衡5个柱体积。

2.Ni纯化过程:

PBS平衡Ni柱后，取培养的上清上样，上样结束后用PBS洗涤5个柱体积至基线平衡。然后分别使用含有30mM，150mM，300mM以及500mM咪唑的PBS进行洗脱。结果如图6所示。在150mM咪唑浓度的PBS溶液中洗脱出目的蛋白。

实施例6疫苗制备

本实施例采用的药学上可接受的佐剂为MONTANIDE ISA 206 VG佐剂，亚单位疫苗的制备过程为：将适量CHO-S细胞表达的猪轮状病毒VP7蛋白加入到MONTANIDE ISA 206 VG佐剂中(蛋白与佐剂体积比为1:1)，使蛋白终浓度为100μg/mL，乳化，质检合格后置于4℃保存。

实施例7安全性实验

取3-7日龄健康新生仔猪14只，将实施例6中制备好的猪轮状病毒灭活疫苗分别以3.0ml肌肉注射实验组仔猪7只,另设不免疫对照组仔猪7只，对照组肌肉注射等量灭菌白油佐剂3.0ml。每日观察各组动物精神状态，连续观察28日，观察期内免疫猪健康良好，没有出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。分别在免疫后7日、14日、21日、28日采血、分离血清，进行中和抗体检测并统计检测结果。

实验结果表明，该疫苗具有很好的免疫原性，能有效激发血清中和抗体。实验组与对照组动物均生长发育正常，精神状态良好。说明本发明制备的灭活疫苗安全性好，对动物生长无影响。

实施例8免疫实验

取实施例7的实验组和对照组新生仔猪，于免疫后28日,各组试验猪均用猪轮状病毒强毒SN03株肌肉注射攻毒,隔离饲养。连续观察15日，观察各组动物情况。

试验结果显示,免疫组仔猪均未表现出任何轮状病毒的症状，免疫保护率为100％，对照组均出现明显腹泻、呕吐、脱水等症状。将对照组猪处死后解剖，如图7所示，出现小肠肠壁透明菲薄、水样内容物、小肠绒毛萎缩等病理变化。实验结果表明，本发明制备的灭活疫苗免疫效力合格。

以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

<130> 11

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 1

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggacagaa ctatggcatc aatctgccaa tcaccggctc tatggataca 120

ccctacatga acagcaccac atctgagacc ttcctgacct ccacactgtg cctgtactat 180

cccaatgagg ccgctaccga gatcgccgac acaaagtgga ccgagacact gtcccagctg 240

tttctgacca agggctggcc cacaggcagc gtgtatttca agggctacgc cgatatcgct 300

tcctttagcg tggagcctca gctgtattgc gactacaaca tcgtgctgat gaagtatgac 360

ggcaatctgc agctggatat gagcgagctg gccgacctga tcctgaacga gtggctgtgc 420

aatccaatgg atatcatgct gtactattac cagcagaccg acgaggctaa caagtggatc 480

tccatgggca ccagctgcac aatcaaggtg tgccccctga atacccagac actgggcatc 540

ggctgttcta ccacagatat caactccttc gagaccgtgg ccaatgctga gaagctggcc 600

atcacagacg tggtggatgg cgtgaaccac aagctggacg tgaccacatc tacctgcaca 660

atcaggaact gtaagaagct gggccctcgg gagaatgtgg ctgtgatcca agtgggcggc 720

ccaaatatcc tggacatcac cgccgatccc accacagctc ctcagacaga gagaatgatg 780

cgcatcaact ggaagagatg gtggcaggtg ttctatacca tcgtggatta cgtgaatcag 840

atcgtgcagg tcatgagcaa gaggtctcgg tccctggact ctgccgcttt ttattaccgc 900

gtgcatcacc atcaccatca ctgataagaa ttc 933

<210> 2

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser

20 25 30

Met Asp Thr Pro Tyr Met Asn Ser Thr Thr Ser Glu Thr Phe Leu Thr

35 40 45

Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Asn Glu Ala Ala Thr Glu Ile Ala

50 55 60

Asp Thr Lys Trp Thr Glu Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly

65 70 75 80

Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Gly Tyr Ala Asp Ile Ala Ser

85 90 95

Phe Ser Val Glu Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Leu Met

100 105 110

Lys Tyr Asp Gly Asn Leu Gln Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu

115 120 125

Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Met Leu Tyr Tyr

130 135 140

Tyr Gln Gln Thr Asp Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Thr Ser

145 150 155 160

Cys Thr Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Cys Ser Thr Thr Asp Ile Asn Ser Phe Glu Thr Val Ala Asn Ala Glu

180 185 190

Lys Leu Ala Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp

195 200 205

Val Thr Thr Ser Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro

210 215 220

Arg Glu Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Pro Asn Ile Leu Asp

225 230 235 240

Ile Thr Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg

245 250 255

Ile Asn Trp Lys Arg Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr

260 265 270

Val Asn Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asp

275 280 285

Ser Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Val His His His His His His

290 295 300

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 3

ataaagcttg ccgccaccat ggaaacagat ac 32

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 4

atagaattct tatcagtgat ggtgatggtg atgcac 36

Claims

1.一种免疫组合物，其特征在于：包含：

2.根据权利要求1所述的一种免疫组合物，其特征在于，所述猪轮状病毒VP7蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪轮状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

4.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。

5.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于在受试动物中诱导针对猪轮状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

7.根据权利要求5所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。

8.一种蛋白，其包括以下组成的组：

9.根据权利要求8所述的蛋白用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。

10.根据权利要求8所述的蛋白用于生产用于检测猪轮状病毒相关诊断试剂的用途。