CN101245350A - 密码子优化的轮状病毒蛋白的编码核苷酸序列、其重组体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域。具体而言，本发明涉及密码子优化的轮状病毒VP6或VP7蛋白的编码核苷酸序列、含有该序列的重组载体以及宿主细胞。本发明还涉及通过轮状病毒结构蛋白基因密码子的优化提高蛋白表达量的方法及其在免疫学上的用途。

Description

密码子优化的轮状病毒蛋白的编码核苷酸序列、其重组体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体而言，本发明涉及密码子优化的轮状病毒VP6或VP7蛋白的编码核苷酸序列、含有该序列的重组载体以及宿主细胞。本发明还涉及通过轮状病毒结构蛋白基因密码子的优化提高蛋白表达量的方法及其在免疫学上的用途。

背景技术

轮状病毒

A组轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起全世界婴幼儿严重腹泻的最重要病原(参见Parashar，U.D.，Bresee，J.S.，Gentsch，J.R.& Glass，R.I.Rotavirus.Emerg.Infect.Dis.1998，4：561-570)。在发展中国家，每年约600,000至870,000儿童死于轮状病毒感染。鉴于轮状病毒危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将发展轮状病毒疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。RV属呼肠病毒科(Reoviridae)的RV属，因其在电镜下形态酷似车轮而得名(“rota”来源于拉丁文，意为“车轮”)。1973年，Bishop等首次从腹泻儿童小肠上皮细胞中分离到人RV(参见Bishop RF，Davidson GP，Holmes IH，Ruck BJ.Virus particles in epithelial cells ofduodenal mucosa from children with acute non-bacterial gastroenteritis.Lancet，1973，2：1281-1283)。此后，RV被认为是全世界婴幼儿严重脱水腹泻的主要病因。

根据RV基因组双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)电泳型和血清学反应的不同，可将RV分为7个组(A～G组)，其中A、B、C 3个组既可感染人类也可感染动物，D、E、F、G 4个组迄今为止只在动物中发现。A组RV能引起婴幼儿严重腹泻已经得到公认，2002年Banyai，K等报道在匈牙利G1型A组RV也能感染成年人，引起腹泻暴发(参见Banyai，K.et al.Outbreak of human rotavirus infection in an adultcommunity.Orv.Hetil.2002，143：1347-1352)。B组RV主要在中国引起成人腹泻的大流行(参见Hung，T.et al.Waterborne outbreak ofrotavirus diarrhoea in adults in China caused by a novel rotavirus.Lancet 1，1983，1139-1142)，而C组RV则主要引起散发。

根据RV外壳蛋白VP4和VP7的特性，可将A组RV可分为不同的血清型。VP7是糖蛋白，所以VP7的分型又称为G型，到目前为止，已发现了14个G型。其中最常见的感染婴幼儿的RV为G1～G4型。VP4对蛋白水解酶敏感，因此VP4的分型又称为P型，VP4蛋白的血清型分型系统独立于VP7(G)血清型，不同G血清型的毒株可属于同一P血清型，而一些相同的G血清型的毒株又可属于不同的P血清型(参见Hoshino，Y.&Kapikian，A.Z.Rotavirus antigens.Curr.Top.Microbiol.Immunol.1994，185：179-227；Hoshino，Y.&Kapikian，A.Z.Rotavirusvaccine development for the prevention of severe diarrhea in infants andyoung children.Trends Microbiol.1994，2：242-249.；Kapikian，A.Z.Overview of viral gastroenteritis.Arch.Virol.1996，Suppl 12：7-19)。目前我国流行的轮状病毒主要以G3，G1，G2血清型为主，P血清型以P[8]多见(参见方肇寅.我国轮状病毒腹泻----流行病学和疾病负担估计.第二届轮状病毒疫苗研讨会2005)。

轮状病毒为分节段dsRNA病毒，无包膜，由外层、中间层和内部核心层3层组成二十面体蛋白衣壳，直径约70～75nm，基因组由11个dsRNA节段组成，分别编码病毒的6个结构蛋白和5个非结构蛋白。其中，VP7蛋白是轮状病毒的主要的中和抗原，是位于病毒外层上的一种糖蛋白，VP7蛋白基因全长1062个核苷酸，编码297个氨基酸，对于轮状病毒的分型和抗体的产生有重要的作用。VP6蛋白是位于中间层的主要的蛋白，是轮状病毒的组特异性抗原，基因全长1356个核苷酸，编码397个氨基酸，在轮状病毒的检测和抗体的产生中都有重要的作用(参见金奇.医学分子病毒学，科学出版社，2001)。

在生物界，不同种类生物对同义密码子的使用频率是不同的，优势密码子与基因表达水平呈正相关(参见Ikemura T and Ozeki H.Codonusage and transfer RNA contents：organism-specific codon-choice patternsin reference to the isoaccepor contents.Cold Spring Harb Symp Quant Biol.1983，47Pt2：p1087-97；Bernardi G，et al.Codon usage and genomecomposition.J Mol Evol.1985，22(4)：363-365)。分析表明，野生型轮状病毒蛋白基因密码子与真核细胞密码子使用频率存在差异，AT含量明显偏高，某些氨基酸的同义密码子在真核细胞中使用频率很低，而在轮状病毒中使用频率很高。所以，用哺乳动物细胞等表达未经密码子优化的VP7和VP6蛋白时，蛋白的表达量很低，这在我室的前期工作中已经得到了证明(参见：姜秀丽.表达人轮状病毒VP7基因重组腺病毒的免疫效果研究.中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所博士论文.2003)。这将阻碍其作为疫苗的应用，因为如果想要达到比较好的免疫效果，对于载体疫苗就要加大载体病毒的用量，而轮状病毒疫苗的应用人群为5岁以下的儿童，无疑会增加应用的危险性。为了提高其安全性，提高蛋白的表达量，减少载体病毒的用量是非常必要的。

密码子优化

生物的遗传密码采用61组三连核苷酸(密码子)编码20种氨基酸，并采用3个密码子终止蛋白质的翻译。这20种氨基酸中，除了蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)由一个密码子编码以外，其它氨基酸都由一个以上的同义密码子编码，这种一种氨基酸对应多个密码子的性质，称为“密码子的简并性”。密码子的简并性使得同一种蛋白可以采用多种不同的核苷酸序列编码。然而，同义密码子的使用是存在偏性的，对于两种不同的生物，或者同一种生物的高表达和低表达基因，甚至在同一个操纵子内部，不同密码子的使用频率可能差别很大(参见Gouy，M.andGautier，C.Codon usage in bacteria：correlation with gene expressivity.Nucleic Acids Res，1982，10(22)：7055-7074)。迄今为止，科学家仍在思索是什么进化压力导致了密码子使用偏性。一些研究者认为，每种生物体内同义密码子之间的突变-选择平衡可以部分解释基因组GC含量对密码子分布的影响及密码子使用形式的改变(参见Knight，R.D.et al.Asimple model based on mutation and selection explains trends in codon andamino-acid usage and GC composition within and across genomes.GenomeBiol，2001，2(4)，RESEARCH0010.Epub 2001 Mar 0022)。而另一些研究者认为，密码子的偏性可以减少tRNA的多样性，从而降低新陈代谢负荷，有利于生物在快速生长条件下节约部分能量(参见Andersson，G.E.and Kurland，C.G.An extreme codon preference strategy：codonreassignment.Mol Biol Evol，1991，8(4)：530-544)。不论是什么原因导致了密码子的偏性，已经日益清楚的是密码子的偏性对异源蛋白质的表达存在深远的影响(Kane，J.F.Effects of rare codon clusters onhigh-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.Curr OpinBiotechnol，1995，6(5)，494-500)。通常，如果一个基因包含越多宿主细胞罕用的密码子，就越不可能获得高水平的异源表达。如果稀有密码子出现在或连续出现在基因读码框的5’端，则会导致蛋白表达水平的急剧下降。因此，在异源的宿主细胞中提高目的基因表达量常用的一个策略就是改变目的基因的稀有密码子，在不改变所编码蛋白的氨基酸序列的基础上，使之更接近于宿主细胞的密码子使用方式，这种旨在提高目的基因异源表达量的方法就称为密码子优化。

应用密码子优化技术，可以使目的基因的异源表达量得到大幅度的提高。现今应用最为广泛的是利用大肠埃希杆菌细胞(E.coli)表达哺乳动物蛋白。据统计，在E.coli中表达哺乳动物蛋白时，由密码子优化带来的表达量增加通常在5～15倍之间，占E.coli中可溶蛋白的5％(参见：Claes Gustafsson，et al.Codon Bias and Heterologous ProteinExpression.TRENDS in Biotechnology，2004，22(7)：346-353)。另外，密码子优化还有一个成功的范例就是提高病毒基因在哺乳动物细胞系中的表达，这种基因优化的方式一般通过重新合成基因实现。病毒是一种非常特殊的例子，它们的密码子受到完全不同的进化压力约束，所以它们经常通过重叠的读码框来负载高密度的信息，而且很多病毒基因还在编码序列内部编码顺式调控序列。因此，需要在哺乳动物细胞系中表达病毒蛋白时，可以按照宿主密码子偏性重新合成基因，同时破坏病毒基因内部的调控元件，从而使目的蛋白产量得以提高(参见Graf，M.et al.Concerted action of multiple cisacting sequences is required for Revdependence of late human immunodeficiency virus type 1gene expression.JVirol，2000，74(22)：10822-10826)。

然而通过密码子优化，尤其是通过对病毒基因的优化来达到提高基因异源表达量的方法仍然存在诸多不确定的因素，并不是使用某一特定宿主体系喜用密码子就可以实现目的基因的高水平表达。重新设计一个基因序列在具体的操作过程中需要考虑多方面的问题。在不考虑其他限制条件的情况下，编码同一个蛋白质的核苷酸序列可能有很多种。假设每个氨基酸平均可以被3个不同的密码子编码，则一个由100个氨基酸组成的蛋白，大约能够被3¹⁰⁰(～5×10⁴⁷)个核苷酸序列编码产生。这些可能的序列中有哪些可以带来高水平的异源蛋白表达，又如何将这些序列挑选出来是一个繁复的过程。现今优化密码子的方式是将每个氨基酸对应使用的一个密码子更换为被宿主细胞最频繁使用的那个同义密码子。这种“一个氨基酸——一个密码子”的优化方法有几个缺点。首先，相对于一个tRNA库而言，由这种基因转录产生的大量mRNA将会产生一个高的密码子浓度，从而导致tRNA库失去平衡，并造成密码子使用方式的倾斜以及潜在的翻译错误(参见Kurland，C.and Gallant，J.Errorsof eterologous protein expression.Curr Opin Biotechnol.1996，7(5)，489-493)。异源表达的蛋白可能占总细胞质量的60％，因此采用单一的tRNA库将是一个非常严重的问题。有研究发现，在“一个氨基酸——一个密码子”优化的基因中引入同义突变可以提高蛋白质的表达水平(参见Klasen，M.and Wabl，M.Silent point mutation in DsRed resulting inenhanced relative fluorescence intensity.BioTechniques，2004，36(2)：236-237)。第二，在密码子选择上如果没有机动性，则难以避免基因和转录后的mRNA中产生一些重复元件和二级结构，而抑制核糖体的通过，导致翻译过程的阻滞。另外重复元件的存在可能使基因合成的难度增加。过多的重复元件的存在还会影响基因在宿主内的稳定性。第三，优化的基因还经常需要在序列中引入或排除一些序列元件，如限制性内切酶位点，以便于随后的操作。由此可见，一个成功的优化基因，不仅需要消除不利的密码子配对和极端GC含量、消除重复序列、避免不利的mRNA二级结构、避免或引入限制性内切酶位点，还需要避免脆性剪接位点、调控元件、免疫激活或免疫抑制元件(对DNA疫苗而言)、RNA甲基化信号和许多其它与所使用宿主系统相关的特殊因素，才能达到最终提高异源表达量的目的。

发明内容

本发明一方面提供了一种DNA分子，其中含有密码子优化的编码G1型轮状病毒VP7蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，该核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明另一方面提供了一种重组载体，其中含有密码子优化的编码G1型轮状病毒VP7蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，所述密码子优化的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。该重组载体可为病毒、细菌或质粒载体，优选腺病毒载体或杆状病毒载体。在一个优选的实施方案中，腺病毒载体为rvAdG1VP7(opt)(opt指优化后的基因)。在另一个优选的实施方案中，所述杆状病毒载体为rvBacG1VP7(opt)。

本发明另一方面还提供了一种宿主细胞，其中含有本发明的重组载体。该宿主细胞可为原核细胞或者真核细胞。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为草地贪夜蛾细胞(如Sf9细胞)或293细胞。

本发明另一方面还提供了一种提高G1型轮状病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分的表达量的方法，该方法包括在适合表达的条件下培养本发明的宿主细胞并获得G1型轮状病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。

本发明另一方面还提供了本发明的密码子优化的G1型轮状病毒VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重组体作为疫苗的用途。

本发明还提供了一种DNA分子，其中含有密码子优化的编码G2型轮状病毒VP7蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，该核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面提供了一种重组载体，其中含有密码子优化的编码G2型轮状病毒VP7蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，所述密码子优化的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。该重组载体可为病毒、细菌或质粒载体，优选腺病毒载体或杆状病毒载体。在一个优选的实施方案中，腺病毒载体为rvAdG2VP7(opt)。在另一个优选的实施方案中，所述杆状病毒载体为rvBacG2VP7(opt)。

本发明另一方面还提供了一种宿主细胞，其中含有本发明的重组载体。该宿主细胞可为原核细胞或者真核细胞。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为草地贪夜蛾细胞(如Sf9细胞)或293细胞。

本发明另一方面还提供了一种提高G2型轮状病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分的表达量的方法，该方法包括在适合表达的条件下培养本发明的宿主细胞并获得G2型轮状病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。

本发明另一方面还提供了本发明的密码子优化的G2型轮状病毒VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重组体作为疫苗的用途。

本发明还提供了一种DNA分子，其中含有密码子优化的编码G3型轮状病毒VP7蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，该核苷酸序列为SEQ ID NO：6。

本发明另一方面提供了一种重组载体，其中含有密码子优化的编码G3型轮状病毒VP7蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，所述密码子优化的核苷酸序列为SEQ ID NO：6。该重组载体可为病毒、细菌或质粒载体，优选腺病毒载体或杆状病毒载体。在一个优选的实施方案中，腺病毒载体为rvAdG3VP7(opt)。在另一个优选的实施方案中，所述杆状病毒载体为rvBacG3VP7(opt)。

本发明另一方面还提供了一种宿主细胞，其中含有本发明的重组载体。该宿主细胞可为原核细胞或者真核细胞。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为草地贪夜蛾细胞(如Sf9细胞)或293细胞。

本发明另一方面还提供了一种提高G3型轮状病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分的表达量的方法，该方法包括在适合表达的条件下培养本发明的宿主细胞并获得G3型轮状病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。

本发明另一方面还提供了本发明的密码子优化的G3型轮状病毒VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重组体作为疫苗的用途。

本发明还提供了一种DNA分子，其中含有密码子优化的编码轮状病毒VP6蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，该核苷酸序列为SEQ ID NO：8。

本发明另一方面提供了一种重组载体，其中含有密码子优化的编码轮状病毒VP6蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具体实施方案中，所述密码子优化的核苷酸序列为SEQ ID NO：8。该重组载体可为病毒、细菌或质粒载体，优选腺病毒载体或杆状病毒载体。在一个优选的实施方案中，腺病毒载体为rvAdVP6(opt)。在另一个优选的实施方案中，所述杆状病毒载体为rvBacVP6(opt)。

本发明另一方面还提供了一种宿主细胞，其中含有本发明的重组载体。该宿主细胞可为原核细胞或者真核细胞。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为草地贪夜蛾细胞(如Sf9细胞)或293细胞。

本发明另一方面还提供了一种提高轮状病毒VP6蛋白或者其免疫原性部分的表达量的方法，该方法包括在适合表达的条件下培养本发明的宿主细胞并获得轮状病毒VP6蛋白或者其免疫原性部分。

本发明另一方面还提供了本发明的密码子优化的轮状病毒VP6蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重组体作为疫苗的用途。

附图说明

现在，参照旨在说明而非限定本发明的优选的实施方案的附图，对本发明的各方面特征进行描述。

图1pShuttle-CI载体构建的酶切鉴定结果(KpnI单酶切鉴定)。

1.DNA分子量标准；2.重组载体pShuttle-CI；3阴性对照pShuttle；

图2目的片段连接到载体pShuttle-CI上的酶切鉴定结果。

1.DNA分子量标准；2.pShuttle-CI/G1VP7(opt)(MluI，SalI)；3.pShuttle-CI/G2VP7(opt)(MluI，SalI)；4.pShuttle-CI/G3VP7(opt)(MluI，SalI)；5.pShuttle-CI(MluI，SalI)；6.pShuttle-CI/VP6(opt)(kpnI)；7.pShuttle-CI/VP6(opt)(XhoI，SalI)；8.DNA分子量标准

图3重组腺病毒质粒的酶切鉴定。

1.DNA分子量标准；2.pShuttle-CI 3.pAdeasy-1/G1VP7(opt)(PacI)；4.pAdeasy-1/G2VP7(opt)(Pac I)；5.pAdeasy-1/G3VP7(opt)(Pac I)；6.pAdeasy-1/VP6(opt)(Pac I)；

图4轮状病毒蛋白基因在293细胞内表达的Western blot分析。

A：1.轮状病毒SA11感染MA104细胞(阳性对照)；2.蛋白分子量标准；3.rvAdG1VP7(opt)；4.rvAdG2VP7(opt)；5.rvAdG3VP7(opt)；6.rvAdVP6(opt)；7.Ad5(空载体对照)；8.293(空细胞对照)；

B：肌动蛋白内参，加样顺序和量同A图

图5轮状病毒蛋白基因在293细胞内表达量差异的Western blot分析。

A：rvAdG3VP7密码子优化前后表达量的差异

第一排：1.rvAdG3VP7优化基因；2.rvAdG3VP7原始基因

第二排：肌动蛋白内参，加样顺序和量同上。

B：rvAdVP6密码子优化前后表达量的差异

第一排：1.rvAdVP6优化基因；2.rvAdVP6原始基因

第二排：肌动蛋白内参，加样顺序和量同上。

图6提取Bacmid DNA的PCR鉴定。

1.DNA分子量标准；2.pFB1/G1VP7(opt)；3.pFB1/G2VP7(opt)；4.pFB1/G3VP7(opt)；5.pFB1/G3VP7；6.λDNA+HindIII marker；7.pFB1/G2VP6(opt)；8.DNA分子量标准；

图7轮状病毒蛋白基因在Sf9细胞内表达及表达量差异的Western blot分析。

A：1.空白Sf9细胞；2.轮状病毒SA11感染的MA`104细胞)；3.rvBacG1VP7(opt)；4.rvBacG2VP7(opt)；5.rvBacG3VP7(opt)；6.rvBac G3VP7；7.rvBac VP6(opt)；其中，3、4、5和7为密码子优化的基因，6为野生型基因

B：肌动蛋白内参，加样顺序和量同A图

具体实施方式

序列说明

SEQ ID NO 1：G1型轮状病毒VP7蛋白基因优化前序列。

SEQ ID NO 2：G1型轮状病毒VP7蛋白基因优化后序列。

SEQ ID NO 3：G2型轮状病毒VP7蛋白基因优化前序列。

SEQ ID NO 4：G2型轮状病毒VP7蛋白基因优化后序列。

SEQ ID NO 5：G3型轮状病毒VP7蛋白基因优化前序列。

SEQ ID NO 6：G3型轮状病毒VP7蛋白基因优化后序列。

SEQ ID NO 7：轮状病毒VP6蛋白基因优化前序列。

SEQ ID NO 8：轮状病毒VP6蛋白基因优化后序列。

密码子优化

由于本发明的密码子优化的基因序列将在来自于人的293细胞中表达，因此，本发明依据人的优选密码，首先选取人使用频率最高的密码子(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝Homo+ssapiens+[gbpri])，再根据总体GC含量在50％～55％和同一密码子连续不超过3个的原则，调整所选密码子，为次选密码子。调整总体GC含量在50％～55％之间是因为该含量范围为哺乳动物细胞中DNA的常见GC含量。而同一密码子连续不超过3个是为了提高RNA的利用率。然后用相关软件分析起始端的RNA的二级结构，防止发夹结构的出现。最后，再在起始端加上KOZAK序列，两端加上下一步连接到载体上所需要的酶切位点，得到上述所列优化序列。

本发明所用优化密码子

Amino Acid	Codon	Amino Acid	Codon
				Ala(A)	GCC/GCT	Asn(N)	AAC/AAT
Cys(C)	TGC	Pro(P)	CCC/CCT
				Asp(D)	GAC/GAT	Gln(Q)	CAG/CAA
Glu(E)	GAG/GAA	Arg(R)	AGA
				Phe(F)	TTC	Ser(S)	AGC/TCC
Gly(G)	GGC/GGA	Thr(T)	ACC/ACA
				His(H)	CAC	Val(V)	GTG/GTC
Ile(I)	ATC/ATT	Trp(W)	TGG
				Lys(K)	AAG/AAA	Tyr(Y)	TAC/TAT
Leu(L)	CTG/CTC	＊	TGA
				Met(M)	ATG

应用

在获得了如前所述的密码子优化基因的基础上，将该基因克隆入合适的载体即可得到有用的重组载体。在该重组载体中，含有本发明的密码子优化的核苷酸序列。具体而言，所述密码子优化的核苷酸序列为SEQ ID NO：2、4、6或8。该重组载体可为任何合适的载体，包括病毒、细菌或质粒载体。其中，病毒载体可为杆状病毒、腺病毒、疱疹病毒、EB病毒、腺病毒伴随病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆转录病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠状病毒、麻疹病毒、乙脑病毒、登革病毒等病毒载体。质粒载体可以是复制型的，也可以是非复制型的。在优选的实施方案中，载体为病毒载体，优选为腺病毒载体或杆状病毒载体。

在一个优选的实施方案中，所述重组载体为重组腺病毒载体rvAdG1VP7(opt)、rvAdG2VP7(opt)、rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)。

在另一个优选的实施方案中，所述所述重组载体为杆状病毒载体rvBacG1VP7(opt)、rvBacG2VP7(opt)、rvBacG3VP7(opt)、rvBacVP6(opt)。

将本发明的前述重组载体通过合适的方法引入细胞宿主，即可获得一种新的宿主细胞，其中含有本发明的重组载体。该宿主细胞可为原核细胞或者真核细胞。所述原核细胞可以是细菌，例如大肠杆菌等。所述真核细胞可以是毕赤酵母等酵母类细胞、Sf9或Sf21细胞等昆虫细胞、293细胞或中国仓鼠卵巢细胞等哺乳动物细胞系等等。

在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为草地贪夜蛾细胞Sf9或293细胞。

在适合表达的条件下培养本发明的宿主细胞就可以获得本发明的轮状病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分。由于本发明的宿主细胞中，含有经过优化的核苷酸序列，因此，相对于使用含有相应天然序列的同样宿主细胞的情形时，使用本发明的宿主细胞时轮状病毒VP7或VP6蛋白或者其免疫原性部分的表达量更高。因此，本发明提供了提高轮状病毒VP7或VP6蛋白表达量的方法。

适合表达的条件可以根据所使用的宿主细胞确定。宿主细胞生长和进行蛋白表达的条件有可能不同。

使用原核宿主细胞表达外源蛋白基因时，这些重组肽或蛋白经常需要进一步的修饰。它们常常会失去进行折叠的能力，不能形成二硫键。还可能在细菌内源性蛋白酶的作用下表现出不稳定性，并且容易聚集成无活性的复合体。因此，与天然的蛋白相比，重组肽或蛋白常常产量较低，抗原性或免疫原性也降低。而使用真核宿主细胞进行表达时，由于真核细胞具有翻译后的加工修饰体系，表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。因此，在本发明中，使用真核宿主细胞表达轮状病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分。

本发明的密码子优化的轮状病毒VP7或VP6蛋白或者其免疫原性部分的编码核苷酸序列的重组体可以作为疫苗使用。通过注射、口服、滴鼻或者喷雾等方式对宿主进行免疫。由于载体本身就具有良好的免疫刺激作用，因此，本发明的密码子优化的核苷酸序列的重组体作为疫苗时可以不使用免疫佐剂。根据使用的具体情形，也可以添加合适的佐剂，以增强免疫应答。本领域的常规佐剂均可以使用，可以由本领域技术人员根据需要决定添加的量。并且，由于病毒载体疫苗不仅可以直接激发机体的免疫应答，而且，可以通过在机体内持续进行表达，不断产生蛋白或者免疫原性部分，从而进一步引发机体的多种免疫应答。

为了更为清楚地说明本发明，下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook，et al.New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

实施例1 轮状病毒基因的密码子优化及在哺乳动物细胞中表达量的提高

本实施例的内容是将轮状病毒基因进行密码子优化设计，人工合成优化后的基因并以腺病毒为载体，在293细胞中表达密码子优化后的G1、G2、G3型VP7蛋白基因和VP6蛋白基因，并将其表达量与野生型蛋白基因的表达量相比较，对密码子优化的效果进行评价。具体步骤如下：

1.四种轮状病毒蛋白基因密码子的优化

按人类偏爱密码子(参见：http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝Homo+sapiens+[gbpri])进行人工设计，委托上海生工生物工程公司合成了我国当前流行的轮状病毒G1、G2、G3型外壳蛋白VP7的优化基因和内壳蛋白VP6的优化基因，其序列分别见SEQ ID NO：2、4、6或8。为了清楚地显示所做的修改，同时列出了未经优化的原始序列。优化后的序列G+C含量50～55％，被克隆于pUC57(上海生工公司)载体上，分别命名为pUC57/G1VP7(opt)、pUC57/G2VP7(opt)、pUC57/G3VP7(opt)、pUC57/VP6(opt)，所有合成基因经大连宝生物公司和上海博亚生物技术公司测序确证正确后，用于蛋白的表达。

2.重组穿梭载体的构建

(1)穿梭载体pShuttle-CI的构建

将pCI载体(美国Promrga公司)用限制性内切酶BglII单酶切后用Klenow酶(Prome公司)补平，用BamHI酶切；同时将pShuttle载体用NotI酶切，同样方法补平后，再用BglII酶切。利用BamHI和BglII酶切片段末端相互粘合的特点，一平一粘连接两个酶切片段，即将pCI载体上的约1400bp的片段插入pShuttle载体，此时pShuttle载体上原有的酶切位点残余一个KpnI。用KpnI酶切鉴定(有1100bp的片段为连接正确的重组载体pShuttle-CI)(图1)。载体pShuttle-CI总长7900bp左右，多克隆位点中可用的酶有：NheI、XhoI、MluI、XbaI、SalI和NotI。

(2)将密码子优化的蛋白基因克隆入穿梭载体pShuttle-CI

用限制性内切酶Sal I和Mlu I双酶切穿梭质粒pShuttle-CI，体系为pShuttle-CI 10μg，Sal I和Mlu I各2μl，10×缓冲液5μl，H₂O 21μl。置37℃孵育2h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天为时代公司)回收7900bp的载体片段，并用稀释电泳法粗略定量。

用Sal I和Mlu I双酶切含有密码子优化基因的质粒pUC57/G1VP7(opt)、pUC57/G2VP7(opt)、pUC57/G3VP7(opt)和pUC57/VP6(opt)，反应体系为：质粒10μg，Sal I和Mlu I.各2μl，10×缓冲液5μl，H₂O 18μl。置37℃孵育2h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天为时代公司)回收目的片段并对其定量。

将上述载体片段pShuttle-CI分别与目的基因G1VP7(opt)、G2VP7(opt)、G3VP7(opt)和VP6(opt)片段进行连接反应，反应体系为：载体片段pShuttle-CI 1μg，目的片段G1VP7(opt)、G2VP7(opt)、G3VP7(opt)、VP6(opt)各5μg，连接缓冲液2μl；T4DNA连接酶(TAKARA公司产品)1μl；H₂O 7.6μl。置16℃反应16h。取10μl连接产物转化E.coliDH10B感受态细胞。挑取卡那霉素(K⁺)抗性克隆，用含卡那霉素的LB培养液培养12～16h后，以碱裂解法小量制备质粒，用Sal I和MluI双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttle-CI/G1VP7(opt)、pShuttle-CI/G2VP7(opt)、pShuttle-CI/G3VP7(opt)和pShuttle-CI/VP6(opt)(图2)。

3.重组腺病毒的获得

分别取上述四种克隆有外源基因的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CI/G1VP7(opt)、pShuttle-CI/G2VP7(opt)、pShuttle-CI/G3VP7(opt)和pShuttle-CI/VP6(opt)各约500ng，用Pme I(美国New England Biolabs公司)单酶切以线性化质粒，用无水乙醇沉淀后，溶于6μl ddH₂O中备用。

用线性化的重组穿梭质粒与约100ng pAdEasy-1腺病毒骨架质粒(美国Stratagen公司)共同电转化E.coli BJ5183(美国Stratagen公司)感受态细胞(参见He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.Asimplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95：2509-14)，取细菌悬液涂于含50μg/ml卡那霉素的LB培养板中，于37℃培养16～20h，挑选10～20个较小的菌落，接种于3ml含有卡那霉素(25μg/ml)的SOC培养液(美国Invitrogen公司)内，置37℃振摇培养12～16h，用碱裂解法小量提取质粒DNA，获得了重组腺病毒质粒pAdEasyG 1VP7(opt)、pAdEasyG2VP7(opt)、pAdEasyG3VP7(opt)和pAdEasyVP6(opt)，用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析后，用Pac I(美国New England Biolabs公司)酶切进一步鉴定，可产生4.5Kb或3Kb左右的片段。将所得的重组腺病毒质粒转化以氯化钙法制备的宿主菌E.coli DH10B(rec A1，endA1)(美国Invitrogen公司)感受态细胞，在此宿主菌中可产生高拷贝数的质粒，挑取目的克隆，经Pac I酶切鉴定(图3)后，置-70℃保存备用。

用QIAGEN Plasmid Midi Kit(德国Qiagen公司)提取重组腺病毒质粒，用Pac I酶切后，无水乙醇沉淀回收目的DNA片段，溶于无菌去离子水中。在转染前24h将293细胞(美国Invitrogen公司)接种于T-12.5细胞培养瓶(美国BD公司)中，转染时细胞的丰度为50％～70％。将Pac I酶切线性化后的10μg重组腺病毒DNA及3μl的Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)分别与100μl M液(无抗生素、无血清的含有谷氨酰胺及NaHCO₃的DMEM培养液(美国Invitrogen公司))充分混匀，置室温孵育15min后，混合两种悬液室温继续作用30min。在上述等待的时间里，移去293细胞的原培养液，用2ml M液洗细胞2次。补加800μl M液至Lipofectamine2000-DNA的复合物中，轻轻混匀后加至洗涤过的293细胞上，置37℃，5％CO₂孵育5h，移去含DNA/脂质体复合物的培养液，补加含10％新生牛血清(美国Hyclone公司)的DMEM完全培养液，继续培养，第二天换为含2％新生牛血清的DMEM维持液，继续培养。在转染后6～7天，细胞出现肿胀、变圆等细胞病变(CPE)。收集细胞与上清液一起-70℃、37℃反复冻融3次，取适量的冻融液接种293细胞，用含2％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO₂培养箱中培养，观察细胞病变，按上述方法收病毒传代一次。获得的重组腺病毒命名为rvAdG 1VP7(opt)、rvAdG2VP7(opt)、rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)。分别用rvAdG 1VP7(opt)、rvAdG2VP7(opt)、rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)感染293细胞，待细胞病变完全后，反复冻融3次，13,000rpm离心10min，取上清，磷钨酸负染后在透射电子显微镜下观察，可见呈二十面体结构、直径约为70nm的病毒颗粒，具有典型的腺病毒形态。

4.目的蛋白的表达鉴定及表达量的比较

待293细胞生长至80％～90％丰度时，分别接种重组腺病毒rvAdG1VP7(opt)、rvAdG2VP7(opt)、rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)，感染后48h刮下病变的细胞，于4℃、5000rpm离心10min，收集细胞沉淀，用PBS洗涤细胞3次，每次4℃、5000rpm离心10min，将细胞沉淀用200μl含蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail Tablets，Cat.No.11873580001，美国Roche公司)的RIPA裂解液(50mmol/L PH＝8.0Tris-HCl，150mmol/LNaCl，0.1％SDS，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠)冰上裂解1h，于4℃、12,000rpm离心10min，将上清转移至另一新的eppendorf管中，按说明书所述的方法，用BCA^TM Protein Assay Kit(Pierce公司)对提取的胞浆蛋白进行定量，然后加入5×SDS-PAGE电泳缓冲液，100℃加热变性后，取100μg总蛋白进行12％SDS-PAGE电泳。电泳结束后，转印硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶室温封闭2h后，用羊抗轮状病毒多抗(Biodesign公司)1∶1000稀释，室温孵育2h，用含0.05％Tween-20的TBS缓冲液(TBST)洗涤5～6次后，用辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(中杉金桥公司)1∶2000稀释室温孵育2h。TBST充分洗涤后，用SuperSignal

West Pico化学发光底物(Pierce公司)进行显色。结果显示，在44kD和34kD附近有特异性的条带出现(图4)，说明腺病毒携带的轮状病毒衣壳蛋白基因在293细胞中得到有效表达。用同一张膜重新5％脱脂奶室温封闭2h后，再用兔抗肌动蛋白抗体(中杉金桥公司)1∶1000稀释孵育2h，用TBST洗涤5～6次后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(中杉金桥公司)1∶2000稀释室温孵育1h。TBST充分洗涤后，用SuperSignal

West Pico化学发光底物(Pierce公司)进行显色，用以检测上样量是否一致。由于原始基因在腺病毒中的表达量很低，无法用Western blot检测，因此，将优化基因和原始基因的加样量调整为约1∶3(70μg∶200μg)。G3VP7(opt)和野生型基因G3VP7用同一张膜重新5％脱脂奶室温封闭2h后，VP6(opt)和VP6用另一张膜，其上样量相同。再用抗肌动蛋白抗体孵育2h，用TBST洗涤5～6次后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG室温孵育2h。TBST充分洗涤后，用SuperSignal

West Pico化学发光底物(Pierce公司)进行显色，用以说明上样量的区别。分别用TotalLab软件对Western blot条带进行半定量扫描，结果显示优化基因G3VP7(opt)和VP6(opt)的表达量均为相应野生型基因G3VP7和VP6的表达量的10倍以上(图5)。而优化基因G1VP7(opt)和G2VP7(opt)用Western很容易检测，而对应的野生型基因G1VP7和G2VP7多次用Western检测，由于表达量太低，无法检测到。这说明经过密码子优化的基因序列其表达量在哺乳动物细胞中可以显著提高，由此证明实验设计是成功的。

原始基因和优化基因Western检测结果

基因名称	原始基因结果	优化基因结果	优/原
				G1VP7	检测不到	很容易检测到
G2VP7	检测不到	可检测到
				G3VP7	可检测到，很弱	很容易检测到	＞10
VP6	可检测到，很弱	很容易检测到	＞10

实施例2 密码优化的轮状病毒基因在昆虫细胞中表达量的提高

为了证明按人类细胞偏爱密码子优化的轮状病毒结构蛋白基因其表达量在昆虫细胞中也可以提高，在本实施例中我们以杆状病毒为载体，分别表达了密码子优化的轮状病毒G1VP7(opt)、G2VP7(opt)、G3VP7(opt)、VP6(opt)和野生型G3VP7蛋白基因，在昆虫细胞Sf9中检测基因的表达及其表达量的差异。具体步骤如下：

1.杆状病毒表达载体的构建

用EcoR I和Sal I(TAKARA公司)双酶切杆状病毒表达载体pFastBac 1(以下简称pFB1，美国Invitrogen公司)，体系为：pFB110μgEcoR I和Sal I各2μl，10×缓冲液5μl，H₂O 23μl。置37℃孵育3h，用天为时代公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段，并用稀释电泳法粗略测定其含量。

同时用EcoR I和Sal I双酶切含有优化基因的质粒pShuttle-CI/G1VP7(opt)、pShuttle-CI/G2VP7(opt)、pShuttle-CI/G3VP7(opt)和pShuttle-CI/VP6(opt)。反应体系为：质粒10μg，EcoR I和Sal I各2μl，10×缓冲液5μl，H₂O 16μl。置37℃孵育3h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天为时代公司)分别回收目的片段，并用稀释电泳法粗略测定其含量。

再用Hind III和Xhol I(TAKARA公司)双酶切杆状病毒表达载体pFB1，体系为：pFB1 10μg，EcoR I和Sal I各2μl，10×缓冲液5μl，H₂O31μl。37℃孵育3h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天为时代公司)回收载体片段，用稀释电泳法粗略测定其含量。

同时用Hind III和Xhol I双酶切含有原始基因的质粒pGEM(7zf+)/G3VP7。反应体系为：质粒10μg，Hind III和Xhol I各2μl，10×缓冲液5μl，H₂O 16μl。置37℃孵育3h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天为时代公司)分别回收目的片段，用稀释电泳法粗略测定其含量。

将上述线性化的载体pFB1分别与目的基因G1VP7(opt)、G2VP7(opt)、G3VP7(opt)和VP6(opt)及野生型G3VP7进行连接反应，反应体系为：载体pFB1 1μl、目的片段G1VP7(opt)、G2VP7(opt)、G3VP7(opt)、VP6(opt)及野生型G3VP7各10μg，连接缓冲液2μl；T4DNA连接酶(TAKARA公司)1μl；补H₂O至20μl，16℃连接16h。取10μl连接产物分别转化E.coli DH10B感受态细胞。挑取Amp抗性克隆，用含Amp的LB培养液培养12～16h后，以碱裂解法小量制备质粒，用EcoR I和Sal I分别对pFB1/G1VP7(opt)、pFB1/G2VP7(opt)、pFB1/G3VP7(opt)和pFB1/VP6(opt)进行双酶切鉴定，用EcoR I对pFB 1/G3VP7进行单酶切鉴定并用Hind III和Xhol I对pFB 1/G3VP7进行双酶切鉴定，得到重组杆状病毒表达载体pFB1/G1VP7(opt)、pFB1/G2VP7(opt)、pFB1/G3VP7(opt)、pFB1/VP6(opt)和pFB1/G3VP7。

2.重组杆状病毒表达载体的转座反应

(1)Luria Agar选择性培养基的制备

称取40g Luria Agar(美国Invitrogen公司)固体培养基溶于1L超纯水，分装至三角瓶中，10磅高压20min，待冷却至50℃左右，迅速加入卡那霉素(美国Sigma公司)、庆大霉素(美国Sigma公司)、四环素(美国Sigma公司)、Bluo-gal(美国Invitrogen公司)和ITPG(美国Invitrogen公司)的贮存液，使其终浓度分别为：50μg/ml、7μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和40μg/ml。

(2)转座反应

从-80℃冰箱取出E.coli DH10Bac感受态细胞(美国Invitrogen公司)置于冰上解冻，分别加入100ng重组表达载体质粒pFB 1/G1VP7(opt)、pFB1/G2VP7(opt)、pFB1/G3VP7(opt)、pFB 1/VP6(opt)、和pFB1/G3VP7，轻弹eppendorf管，混匀，置冰浴30min后于42℃热休克90sec，置于冰浴稳定5min。加入900μl SOC培养液(美国Invitrogen公司)，置37℃缓慢振摇4-6h。分别取200μl菌液涂布Luria Agar选择性培养平板，37℃避光培养至少48h，观察蓝白斑生长情况。

3.重组Bacmid DNA的分离

从上述平板上分别挑取3～4个白色菌落，再分别在Luria Agar平板上划线培养过夜，挑取仍为白色的单菌落，转至3ml LB(卡那霉素50μg/ml，庆大霉素7μg/ml，四环素10μg/ml)培养液中，于37℃振摇培养24h。取1.0ml培养物，15000rpm瞬时离心收集菌体，加入0.3ml溶液I[15mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/LEDTA，100μg/ml RNase A(美国Sigma公司产品)]重悬菌体，加入0.3ml溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)混匀，室温放置5min，加入0.3ml 3mol/L的乙酸钾(pH5.5)，混匀，置冰浴5～10min。13,000rpm离心10min，取上清，加入0.8ml异丙醇，混匀后，置冰浴5～10min，13,000rpm离心15min，沉淀用70％乙醇洗涤，置室温干燥，溶于50μlTE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)中，进行PCR鉴定。PCR反应体系为：重组Bacmid质粒模板按1∶25稀释后取1μl；M13正链引物_{[GTTTTCCCAGTCACGAC]}0.5μl(TAKARA公司合成)；M13负链引物(_{CAGGAAACAGCTATGAC)}0.5μl(TAKARA公司合成)；La Tag PCR Buffer2.5μl；dNTP(TAKARA公司)2μl；La Tag酶(TAKARA公司)0.5μl；补H₂O至25μl。设置PCR反应进程如下：94.0℃5min后，进行如下30个循环：94.0℃45s；55.0℃45s；72.0℃5min，然后72.0℃10min；共30个循环。PCR结束后，取5μl PCR产物行0.7％琼脂糖电泳，结果发现在2500bp和4000bp之间有很明亮的条带，说明目的片断成功插入了(图6)。

4.重组杆状病毒的获得

昆虫细胞Sf9的培养液为含10％胎牛血清(杭州四季青公司)和P.S.(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，华北制药厂)的Grace培养基(美国Invitrogen公司)。在转染前24h，将细胞传至T12.5细胞培养瓶(美国BD公司)中，待细胞长至约30～40％丰度时进行转染。转染时准备下列溶液：溶液A：2μg重组Bacmid DNA与95μl无血清无抗生素的Grace培养基混合，溶液B：10μl Cellfectin

转染试剂(美国Invitrogen公司)与90μl无血清、无抗生素的Grace培养基(美国Invitrogen公司)混合；将上述溶液A与溶液B混合，轻弹管壁混匀，室温孵育30min。在等待的时间内，用2ml无血清无抗生素的Grace培养基洗细胞2次，每瓶加入2ml无血清、无抗生素的Grace培养基，在转染混合物孵育结束后，将转染复合物逐滴加入细胞中。置27℃孵育5h后，去除转染液，换为含10％胎牛血清的细胞培养液继续于27℃培养过夜。次日换为含2％胎牛血清的维持液，置27℃培养。转染48h后，Sf9细胞出现CPE后，收获转染上清，分装至无菌冻存管中，此即为含重组病毒的原代毒种，置4℃或-80℃保存。将此病毒感染Sf9细胞进行扩增传代。电镜下可见典型的杆状病毒形态。

5.目的蛋白的表达鉴定及表达量的比较

待Sf9细胞生长至30％～40％丰度时，分别接种等量(MOI＝5)重组杆状病毒rvBacG1VP7(opt)、rvBacG2VP7(opt)、rvBacG3VP7(opt)、rvBacVP6(opt)和rvBacG3VP7。感染48h后用细胞刮子刮下病变的Sf9细胞，用PBS洗涤后，将细胞沉淀用200μl含蛋白酶抑制剂(Protease InhibitorCocktail Tablets，Cat.No.11873580001，美国Roche公司)的RIPA裂解液(50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，0.1％SDS，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠)置冰上裂解1h，于4℃12,000rpm离心10min，将上清转移至另一新的eppendorf管中，按照说明书所述的方法，用BCA^TM ProteinAssay Kit(Pierce公司)对提取的胞浆蛋白进行定量后，加入5×SDS-PAGE电泳缓冲液，煮沸5min后，取100μg总蛋白行12％SDS-PAGE电泳。电泳结束后，转印硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶室温封闭2h后，加入羊抗轮状病毒蛋白抗体(Biodesign公司)1∶1000稀释于4℃孵育过夜。用含0.05％Tween-20的TBS缓冲液(TBST)洗涤5～6次后，用辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(中杉金桥公司)1∶2000稀释于室温孵育2h。经TBST充分洗涤后，用SuperSignalWest Pico化学发光底物(Pierce公司)进行显色。结果显示，在44kD和34kD附近有浓集的特异性条带出现(图7)，说明杆状病毒携带的轮状病毒衣壳蛋白基因在昆虫细胞中得到高效表达。用同一张膜重新5％脱脂奶室温封闭2h后，再用兔抗肌动蛋白(actin)抗体(中杉金桥公司)1∶1000稀释孵育2h，用TBST洗涤5～6次后，用辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(中杉金桥公司)1∶2000稀释室温孵育2h。经TBST充分洗涤后，用SuperSignal

West Pico化学发光底物(Pierce公司)进行显色。所有样品肌动蛋白的蛋白条带粗细基本一致，说明上样量的一致。重复3次实验，分别用TotalLab软件进行半定量扫描，结果显示密码子优化基因G3VP7(opt)的表达量明显高于野生型基因(G3VP7)，是后者表达量的5～10倍。这说明密码子经过优化的基因序列在昆虫细胞中也可以显著提高表达量，说明实验设计是成功的。

序列表

<110>王健伟

<120>密码子优化的轮状病毒蛋白的编码核苷酸序列、其重组体及其应用

<130>CP1060594BC

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>894

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

atggactaca ttatatatag atttttgtta atttctgtag cattatttgc cttaactaaa     60

gctcagaact atggacttaa tataccaata acaggatcaa tggatactgt atactccaat    120

tctactcaag aaggagtatt tctaacatcc acattatgtt tgtattatcc aactgaagca    180

agtaatcaaa tcagtgatgg tgaatggaaa gactcattat cgcaaatgtt tcttacaaaa    240

ggttggccaa caggatcagt ctattttaaa gagtactcaa atattgttga tttttccgtt    300

gatccacaat tatattgtga ttataactta gtactaatga agtatgatca aaatcttgaa    360

ttagatatgt cagaattagc tgatttgata ttgaatgaat ggttatgtaa tccaatggat    420

ataacattat attattacca acaatcggga gaatcaaata agtggatatc aatgggatca    480

tcgtgtactg tgaaagtgtg tccactgaat acacaaacgt tgggaatagg ttgtcaaaca    540

acgaatgtag actcatttga aacagttgct gagaatgaaa aattagctat agtggatgtc    600

gttgatggga taaatcataa aataaatttg acaactacga catgtactat tcgaaattgt    660

aagaagttag gtccaagaga gaatgtagct gtaatacaag ttggtggctc taatatatta    720

gacataacag cggatccaac gactaatcca caaattgaga gaatgatgag agtgaattgg    780

aaaagatggt ggcaagtatt ttatactata gtagattata ttaatcagat tgtacaggtt    840

atgtccaaaa gatcaagatc attaaattct gctgcgtttt attatagagt atag          894

<210>2

<211>894

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atggactaca tcatttacag attcctgctc atcagcgtgg ccctgttcgc cctgaccaag     60

gcccagaact acggcctgaa catccccatt accggcagca tggacaccgt gtacagcaac    120

agcacccagg agggcgtgtt cctgaccagc accctgtgcc tgtactatcc taccgaggcc    180

agcaaccaga tcagcgacgg cgagtggaag gacagcctga gccagatgtt cctgaccaag    240

ggctggccca ccggcagcgt gtacttcaag gagtacagca acatcgtgga cttcagcgtg    300

gaccctcagc tgtactgcga ctacaatctg gtgctgatga agtacgacca gaacctggag   360

ctggacatga gcgagctggc cgacctgatt ctgaacgagt ggctgtgcaa ccccatggac   420

atcaccctgt attactatca acagagcggc gagagcaaca agtggatcag catgggcagc   480

tcctgcaccg tgaaggtgtg ccctctgaac acccagaccc tgggcattgg ctgccagaca   540

accaacgtgg acagcttcga gaccgtggcc gagaatgaga agctggccat cgtggacgtc   600

gtggacggca ttaaccacaa gatcaacctg acaaccacaa cctgcaccat cagaaactgc   660

aagaaactgg gccccagaga gaacgtggcc gtgatccagg tgggcggaag caacatcctg   720

gacatcaccg ccgaccctac cacaaatcct cagatcgaga gaatgatgag agtgaactgg   780

aagagatggt ggcaggtgtt ctacaccatc gtggactaca tcaaccagat cgtgcaggtg   840

atgagcaaga gaagcagaag cctgaatagc gctgccttct actatagagt gtga         894

<210>3

<211>894

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

atggactaca taatttttag atttttacta ctcatcgctc tgatgtcacc atttgtgagg     60

acgcaaaatt acggcatgta tttaccaata acgggatcac tagacgatgt atacacaaat    120

tcaactagtg gagaatcatt tctaacttca acgctatgtt tatattatcc aacagaagct    180

aaaaatgaga tttcagataa tgaatgggaa aatactctat cacaattatt tttaactaaa    240

ggatggccga ctgggtcagt ttattttaaa gactacaatg atattactac attttctatg    300

aatccacaac tgtattgtga ttataatgta gtattgatga gatatgataa tacatctgaa    360

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gactgcacgg taaaagtttg tccactcaat acacaaactt taggaattgg atgcaaaact    540

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atgtccaaac ggtcaagatc attagacacg gctgcttttt attatagaat ttag          894

<210>4

<211>894

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atggactaca ttatcttcag attcctgctc ctgatcgccc  tgatgagccc cttcgtgaga    60

acccagaact acggcatgta cctgcccatc accggcagcc tggatgacgt gtacaccaac    120

agcaccagcg gcgagagctt cctgaccagc accctgtgcc tgtactatcc caccgaggcc    180

aagaacgaga tcagcgacaa tgagtgggag aacaccctga gccagctgtt cctgaccaag    240

ggctggccca ccggcagcgt gtacttcaag gactacaacg acatcacaac cttcagcatg    300

aaccctcagc tgtactgcga ctacaacgtc gtgctgatga gatacgacaa caccagcgag    360

ctggacgcca gcgagctggc cgacctgatc ctgaacgagt ggctgtgcaa tcccatggac    420

atcagcctgt attactatca acagaacagc gagagcaaca agtggatcag catgggcacc    480

gactgcaccg tgaaggtgtg ccctctgaac acccagaccc tgggcatcgg ctgcaagaca    540

accgatgtgg acaccttcga gatcgtggcc agcagcgaga agctggtgat caccgacgtc    600

gtgaatggcg tgaaccacaa gatcaacatc agcatcaaca cctgcaccat cagaaactgc    660

aacaagctgg gccccagaga gaatgtggcc atcatccagg tgggaggccc cgacgccctg    720

gacatcaccg ctgatcccac aaccgtgcct caggtgcaga gaatcatgag agtgaactgg    780

aagaaatggt ggcaggtgtt ctacaccgtc gtggactaca tcaaccagat cattcaggtg    840

atgagcaaga gaagcagaag cctggacacc gctgccttct actatagaat ctga          894

<210>5

<211>894

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>5

atggacttta ttatttacag atttcttttg attatagtta tattatcacc actccttaat     60

gcacaaaatt atggaatgaa tcttccgatc actggctcaa tggacacacc atatacgaac    120

tcaacgcgag aggaagtatt cctaacttcg actttatgtt tgtattaccc aactgaagca    180

gcaacagaaa taaatgataa ttcatggaag gatacacttt ctcagctatt tttaatcaaa    240

ggatggccaa caggatctat ttattttaaa gattatactg atattgcctc gttttcagtc    300

gatccacaac tgtattgtga ttataatttg gtattaatga aatacgacgc tacactgcaa    360

ctggacatgt ccgaactagc agatttgtta cttaatgagt ggttatgtaa tcctatggat    420

atcactttgt attattatca acaaactgat gaggcaaata aatggatttc aatgggatca    480

tcttgtacta taaaggtatg tccactaaat acgcaaacat taggaattgg gtgcctaaca    540

actgatacaa acacgtttga agaagttgca acagctgaaa aattagtgat tactgacgtt    600

gtagatggcg tcaatcataa attgaacgtg acgacaaaca cttgtacgat tagaaattgt    660

aaaaaattag gaccaaggga aaacgtagca gttatacagg ttggtggccc agatgtgctt    720

gacataacag ctgatccaac gacaatgcca caaacagaaa gaatgatgcg agtgaattgg    780

aagaaatggt ggcaagtgtt ttatacaata gttgactacg tgaatcaaat tgtgcaagca    840

atgtccaaaa gatcgagatc attaaattct gctgcattct actacagagt atag          894

<210>6

<211>894

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atggacttca ttatctacag attcctgctc atcattgtga tcctgagccc tctgctcaat     60

gctcagaact acggcatgaa cctgcccatt accggcagca tggatacacc ctacaccaac    120

agcaccagag aagaggtgtt cctgaccagc accctgtgcc tgtattaccc caccgaggct    180

gccaccgaga tcaatgacaa cagctggaag gataccctga gccagctgtt cctgatcaaa    240

ggctggccca ccggcagcat ctacttcaag gactacaccg acatcgccag cttcagcgtg    300

gatcctcagc tgtattgcga ctacaacctg gtgctgatga agtatgatgc caccctgcag    360

ctggacatga gcgagctggc cgacctgctc ctgaacgagt ggctgtgcaa tcccatggac    420

atcaccctgt attactatca acagaccgac gaggccaaca agtggatcag catgggctcc    480

agctgcacca tcaaggtgtg ccctctgaac acccagaccc tgggcatcgg ctgcctgaca    540

accgacacca acaccttcga agaggtggcc accgccgaga agctggtgat caccgacgtc    600

gtggatggcg tgaaccacaa gctgaacgtg acaaccaaca cctgcaccat cagaaactgc    660

aagaaactgg gccccagaga gaatgtggcc gtgatccagg tgggcggacc cgacgtgctg    720

gatatcaccg ctgaccccac aaccatgccc cagaccgaga gaatgatgag agtgaactgg    780

aagaaatggt ggcaggtgtt ctacaccatt gtggactacg tgaaccagat tgtgcaggcc    840

atgagcaaga gaagcagaag cctgaacagc gctgccttct attacagagt gtga          894

<210>7

<211>1194

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

atggaggttc tgtactcatt gtcaaaaact cttaaagatg ctagagataa aattgttgaa     60

ggtacattat attccaatgt tagcgatctc attcaacaat ttaatcaaat gataatgact    120

atgaatggaa atgactttca aactggagga attggtaatt taccagttag aaattggatt    180

tttgattttg gtctattagg tacaacactt ttaaatttgg atgctaatta tgttgaaaat    240

gcaagaacta cgattgaata tttcattgat tttattgata atgtatgtat ggatgaaatg    300

gcaagagagt ctcaaagaaa tggagtagct ccacaatctg aagcgttgag gaaattatca    360

ggcattaaat ttaagaggat aaattttgat aattcatcag aatatataga aaattggaat    420

ctacaaaata gaagacagcg tactggattt gtctttcata aacctaatat atttccatac    480

tcagcttcgt tcactttgaa tagatctcaa ccaatgcatg ataatttgat gggaactatg    540

tggcttaatg ctggatcgga gatacaagta gctggttttg attattcatg tgctataaac    600

gcaccagcaa atatacagca gtttgaacat attgtacagc ttagacgtgc actaaccaca    660

gctactataa ctttgttacc tgatgcagaa agatttagtt ttccaagagt tatcaattcg    720

gctgacggcg caactacatg gttttttaat ccagtcattc taagaccaaa taatgtagaa    780

gtagaatttt tgttgaatgg acaaattatt aacacatatc aggctagatt tggtactatt    840

atcgcaggaa attttgatac aattcgattg tcatttcagt taatgcgtcc accaaatatg    900

acaccagctg ttaacgcatt atttccgcaa gcgcaacctt ttcaacacca tgcaacagtt    960

ggactcacat tacgcattga atctgctgtc tgtgaatcag tgcttgcgga tgcgaatgaa   1020

actctgttag cgaatgtgac cgcagtgcgt caagaatatg ctataccagt tggaccggtt   1080

tttccaccag gcatgaattg gactgagcta attactaact attcaccatc gagagaagat   1140

aacctgcaac gtgtctttac agtagcttcc attagaagca tgttgattaa gtga         1194

<210>8

<211>1194

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

atggaggtgc tgtactctct ctccaagacc ctgaaagatg ccagggacaa gatcgtcgag     60

ggcaccctgt acagcaacgt gtccgacctg atccagcaat tcaaccagat gattatgacc    120

atgaacggca atgacttcca gaccggtggc atcggtaacc tgcccgtgag gaattggatt    180

ttcgactttg gcctgctcgg taccactctg ctcaacctgg atgccaatta cgtggagaac    240

gccagaacca ctatcgagta cttcattgat tttatcgaca acgtgtgcat ggatgaaatg    300

gccagggagt cccagagaaa cggcgtggct ccccagtccg aggccctgag gaagctctct    360

ggcatcaaat tcaagagaat taactttgac aattccagcg agtacatcga aaactggaat    420

ctgcagaaca gaaggcagag aaccggcttc gtgtttcaca agcccaacat cttcccttac    480

tctgcctcct tcaccctgaa cagaagccag cccatgcacg acaacctgat gggcaccatg    540

tggctgaacg ccggcagcga gatccaggtg gctggtttcg actactcctg cgccattaac    600

gctcccgcca atatccagca attcgagcac attgtgcagc tgagaagggc cctcaccact    660

gctaccatca ctctgctccc cgacgccgag aggttctctt ttcctagagt gatcaactcc    720

gccgacggcg ctaccacttg gttctttaac cccgtgatcc tgaggcctaa caatgtcgag    780

gtggaattcc tgctcaacgg ccagatcatt aatacctacc aggccagatt cggtactatt    840

atcgccggca acttcgacac catcaggctg agcttccagc tcatgaggcc ccctaacatg    900

acccccgccg tgaacgctct gttccctcag gcccaaccct ttcagcacca tgctaccgtc    960

ggcctgactc tcagaatcga gtccgccgtg tgcgaatccg tcctggctga cgccaacgag   1020

actctgctcg ccaacgtgac cgctgtcagg caggagtacg ccatccccgt gggccctgtc   1080

ttcccccctg gtatgaactg gaccgagctg atcactaact actctccctc cagagaagac   1140

aacctgcaga gggtgttcac cgtcgcctcc atcagaagca tgctgattaa gtga         1194

Claims (9)

1. 一种DNA分子，其中含有密码子优化的编码轮状病毒VP7蛋白或VP6蛋白的全长蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。

2. 权利要求1的DNA分子，其中所述核苷酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8。

3. 一种重组载体，其中含有权利要求1或2的核苷酸序列。

4. 权利要求3的重组载体，其中所述载体为腺病毒载体或杆状病毒载体。

5. 权利要求3的重组载体，其为rvAdG1VP7(opt)、rvAdG2VP7(opt)、rvAdG3VP7(opt)、rvAdVP6(opt)、rvBacG1VP7(opt)、rvBacG2VP7(opt)、rvBacG3VP7(opt)或rvBacVP6(opt)。

6. 一种宿主细胞，其中含有权利要求3-5之一的重组载体。

7. 权利要求6的宿主细胞，其为Sf9细胞或293细胞。

8. 一种提高轮状病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分的表达量的方法，该方法包括在适合表达的条件下培养权利要求6或7的宿主细胞并获得轮状病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分。

9. 权利要求1或2的DNA分子和权利要求5中的重组载体作为疫苗的用途。

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