CN107973841A

CN107973841A - Cho细胞表达的重组牛病毒性腹泻病毒e2蛋白及亚单位疫苗的制备方法和应用

Info

Publication number: CN107973841A
Application number: CN201611208261.8A
Authority: CN
Inventors: 钱泓; 吴有强; 卞广林; 张强; 吴素芳; 车影; 宋月鸿; 吕洋萍; 陈滨; 查银河
Original assignee: Novo Biotech Corp
Current assignee: Novo Biotech Corp
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: CN107973841B

Abstract

本发明公开了一种CHO细胞表达的重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及亚单位疫苗的制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。其目的在于提供一种可大规模工业化生产牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗的制备方法。本发明提供的重组亚单位疫苗制备方法包括以下步骤：1)克隆包含E2蛋白编码基因的真核表达载体；2)转染CHO细胞，通过选择、筛选和驯化的方式得到悬浮稳定高效表达E2蛋白的CHO细胞株；3)发酵培养2)中所述的细胞株，纯化后得到重组E2蛋白；4)将重组E2蛋白与ISA 201 VG充分混匀得到重组亚单位疫苗。本发明提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达500mg/L，不仅缩短蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低疫苗生产成本。

Description

CHO细胞表达的重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及亚单位疫苗的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种稳定表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的CHO细胞系及牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗的制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)又称牛黏膜病(Mucosal diaease,MD)是由病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的，临床表现为腹泻、高热、繁殖障碍、免疫抑制、持续性感染和严重的黏膜发炎，糜烂、坏死为特征的疾病。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属。该病最早于1946年发现于美国，后呈爆发式全球流行。在美国、英国、德国、瑞士、澳大利亚、印度、日本等多个养牛大国广泛流行传播。1983年我国首次有报道该病发生，目前在全国已有20多个省、市、自治区存在BVD。2008年，中华人民共和国农业部发布第96号公告，将牛病毒性腹泻定义为三类疫病；世界动物卫生组织也将该病列为法定报告的动物疫病及动物胚胎交流病原名录三类疫病。该病流行范围很广，除牛外，还能感染羊、骆驼、鹿和袋鼠，甚至还有感染人的报道。BVDV主要通过消化道和呼吸道感染动物，既能水平传播也能垂直传播，大多数呈持续性感染(PI)，且免疫抑制容易继发感染黏膜病，死亡率高达100％。这给全世界的养牛业造成了严重的经济损失。

目前，在BVBV的防治上，还未有有效药物和预防措施。在国外，主要使用接种BVDV疫苗，并检测淘汰持续期感染的牛只和处于免疫耐受的动物，再辅助消毒净化的预防措施。有效降低BVDV发病的首要手段是接种安全有效的疫苗，到目前为止，全世界所研制并投入生产的疫苗为灭活苗和弱毒苗，但国内暂无安全有效的BVDV疫苗，虽然有关于疫苗的不少研究，但是都未正式投入生产使用。BVD在我国还没有大规模爆发，各养殖场对该病的防治还没有足够的重视，且从国外进口疫苗成本过高，导致我国各地区BVDV的防治问题越来越严重。因此，研究一个有效安全且成本不高的疫苗是目前的一项重要工作。

BVDV基因组为单股正链RNA，全长约12.5Kb，仅含有一个能编码约4,000个氨基酸多聚蛋白的ORF，多聚蛋白经翻译和加工后，可形成11种成熟的蛋白，其中C、Erns、E1、E2是病毒的结构蛋白。E2是BVDV的囊膜蛋白，免疫原性最强，能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并产生中和抗体，因此是制备检测抗原和疫苗的首选基因，对BVDV E2表达和免疫原性的研究已经进行了很多。Marzocca MP等将E2基因在黑腹果蝇里进行表达，该重组表达的E2蛋白表现出良好的抗原性；Ferrer F等用杆状病毒表达体系获得E2重组蛋白，经实验证明，该重组蛋白可诱导中和抗体的产生，可用于制备疫苗抗原(Induction of virusneutralizing antibodies by immunization with Rachiplusia nuperos infectedwith a recombinant baculovirus expressing the E2glycoprotein of bovine viraldiarrhea virus.J Virol Methods，2007，146(1-2):424-427)。国内已采用了多种方式对其进行表达，如：徐兴然等，牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达；又如：范学政等，牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法(中国发明专利申请公布号：CN 105924506 A)。但原核表达产物为包涵体，无正确结构且活性差；杆状病毒表达虽然可以在一定程度上进行翻译后加工和修饰，但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定的差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统，而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。

CHO细胞是1957年美国科罗拉多大学Theodore T.Puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，CHO细胞有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000L以上，可以大规模生产。

CHO细胞类型较多，如：DG44、DXB11、CHO K1和CHO-S等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为DG44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)时，二氢叶酸还原酶被抑制，再通过反馈调节，使得该基因进行扩增，且其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是DG44的DHFR体系。GS(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，其以CHO-K1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，它比DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏谷氨酰胺的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要：(1)不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株作为宿主细胞；(2)CHO-K1细胞更强壮，易于培养；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，且有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。

本发明成功构建并筛选了稳定高效分泌表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的CHO细胞株，克服了表达牛病毒性腹泻病毒E2囊膜糖蛋白对细胞毒性作用。该细胞株表达E2蛋白表达量高、易于纯化、易于生产，表达的E2蛋白抗原能对免疫牛诱导产生良好的免疫反应，并且剂量小。该细胞株表达抗原所制备的疫苗可为牛病毒性腹泻病毒的预防提供新型、高效的预防制剂，对我国乃至世界范围内牛病毒性腹泻病毒的预防控制可以发挥重要作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可大规模工业化生产的牛病毒性腹泻病毒的亚单位疫苗的制备方法和应用。

本发明提供了一种CHO细胞分泌表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将牛病毒性腹泻病毒E2蛋白基因克隆到真核表达载体中得到含有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述的CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白。

本发明的技术方案中，优选的，所述含有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因的重组质粒是先将牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因进行密码子优化，然后克隆到真核表达载体中，得到重组质粒。

本发明的技术方案中，优选的，所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因如SEQ IDNO.1所示。

本发明的技术方案中，优选的，所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白为(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的技术方案中，所述含有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白基因的真核表达载体可以为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1，优选的，真核载体为pEE12.4。

本发明的技术方案中，所述CHO细胞可以为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株，优选的，所述高度表达的菌株为悬浮稳定高效表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的CHO-K1细胞株。

本发明的技术方案中，优选的，所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA 201 VG。

本发明的技术方案中，优选的，所述重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白与佐剂ISA 201VG按体积比46:54混合乳化。

本发明还提供了一种重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗在制备及相关诊断试剂中的应用。

本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达E2蛋白产量高、易于纯化、易于大规模生产，且表达的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗原能对牛免疫诱导产生良好的免疫反应；由该重组E2蛋白制备的亚单位疫苗具有以下优点：1.大规模生产、供量充足、质控容易；2.安全性高、免疫原性好；3.批次间稳定；4.生产成本低。

附图说明

图1表示pEE12.4-OPTI-E2质粒图谱。

图2表示pEE12.4-OPTI-E2双酶切鉴定结果。3是DNA Marker：10kb ladder；1、2均是pEE12.4-OPTI-E2双酶切电泳结果。

图3表示细胞摇瓶发酵结果。2是标准E2蛋白(上样量为15μL 1.5mg)，3是GS-4A2株发酵上清(上样量为5μL)，4是GS-4A6株发酵上清(上样量为5μL)。

图4A和4B表示镍柱亲和层析色谱图及SDS-PAGE结果。1是细胞发酵上清，2是flowthrough，3是20mM咪唑洗脱，4是250mM咪唑洗脱，5是500mM咪唑洗脱。

图5表示IDEXX试剂盒检测重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗免疫后抗体效价结果。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基和血清均购自美国gibcom公司；

真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulfoximine，MSX))购于Sigma公司；

BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；

ISA 201 VG购自法国赛比克公司。

实施例1：牛病毒性腹泻病毒E2蛋白密码子优化

通过对牛病毒性腹泻病毒GS5毒株(BVDV 1a)E2蛋白核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-E2序列，如SEQ ID NO.2所示，该工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例2：pEE12.4-OPTI-E2重组质粒构建

2.1PCR扩增目的片段OPTI-E2

2.1.1PCR反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-GCAAGCTTGCCGCCACCATGGGCCAGATCGTGCAGGG-3’下游引物:5’-GCGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGATGGACTCAGCAAAATAATCCCTATGGTG-3’

(2)加样体系50μL，如下表所示：

PCR扩增程序：

2.1.2PCR产物进行胶回收

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.2PCR产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系

(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。

2.3连接反应

(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。

(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。

1.2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

2.5质粒抽提与双酶切鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。

2.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系

(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图2。

(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。

2.6无内毒素质粒大提

2.6.1无内毒素质粒提取

(1)测序正确的克隆接种至100mL含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；

(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50mL离心管中，室温8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；

(3)向步骤(2)的离心管中加入8mL溶液P1，用移液器充分重悬菌体；

(4)向步骤(3)的离心管中加入8mL溶液P2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；

(5)向步骤(4)的离心管中加入8mL溶液P4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；

(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器CS1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50mL离心管中；

(7)柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP6重新放入同一个收集管中；

(9)向步骤(8)吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(10)重复操作步骤(9)一次；

(11)向步骤(10)吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；

(12)将步骤(11)吸附柱CP6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟晾干；

(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入1-2mL缓冲液TB，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，测浓度，-20℃保存。

(14)取1-2μL所得到的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。

实施例3：pEE12.4-OPTI-E2重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立

3.1CHO-K1细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至2×10⁵个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜。

(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。

(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μL plus，混匀，室温静置5min。

(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min。

(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。

(12)将六孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4-6h。

(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3.2加压筛选

转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mLDMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。

3.3单克隆筛选

(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。

(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(4)用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。

(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。

(6)记录单个细胞的孔。

(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。

实施例4：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。

(6)用100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(9)每隔24h计数细胞密度及活力。

(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。

(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO₂细胞培养箱中预热至37℃。

(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。

(13)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合同时加入对应浓度嘌呤霉素后混匀，重新悬浮细胞，计数。

(14)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(16)每隔24h计数细胞密度及活力。

(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×10⁶个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×10⁵个/mL。

(18)经驯化，GS-4A2株、GS-4A6株都满足要求，这表明GS-4A2株、GS-4A6株都驯化成功。

实施例5：细胞摇瓶发酵

(1)传代培养基的配制：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

(3)稀释细胞至2.5-3.5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

(5)补料(约第四天)：补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。

(6)第5天开始，将CO2培养箱温度调整至32℃。

(7)第九天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。

(8)第十二天，收获细胞。

(9)如图3所示，经SDS-PAGE检测，GS-4A2株、GS-4A6株表达产量都能达到约500mg/L，适合大规模生产所需。

实施例6：蛋白纯化

收集细胞培养液，4℃，8,000g离心30min，取上清，过0.8μm滤膜，上样，预留80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用BufferA(20mM NaH₂PO₄(pH 7.4)，500mM NaCl)平衡2～3CV，4～7mL/min。

上样：若5mL预装柱一个，1mL/min进行上样(根据预装柱体积调节上样流速，保留时间5min)，收集Flow through(FT)，取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

洗涤：用4％bufferB(20mM NaH₂PO₄(pH 7.4)，500mM NaCl，20mM imidazole)洗柱，流速为4mL/min，把未结合上柱的蛋白和结合能力较弱的杂蛋白冲洗干净，至OD280nm基线平稳为止。

洗脱：50％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，250mM imidazole)洗脱目的蛋白，至基线洗平，2mL/min,收集：10mL/管；收集样品混合后(Elutethrough-ET)取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。见图4A和4B所示。

洗涤：100％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，500mM imidazole)，4mL/min，不收集，冲洗2-3个柱体积，至UV基线洗平。超纯水平衡2～3CV。保存HisTrapexcel柱可用20％乙醇保存液平衡2～3CV。

透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1,000倍，取80μl留样检测。

除菌过滤：在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。

蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，GS-4A2株、GS-4A6株蛋白得率都约为500mg/L；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到95％以上。

实施例7：疫苗制备与免疫实验

7.1疫苗制备

将适量CHO细胞表达的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白加入到ISA 201VG佐剂中(体积比为46:54)，使蛋白终浓度为100μg/mL，乳化、质检合格后置于4℃保存。

将适量昆虫杆状病毒表达的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白加入到ISA201VG佐剂中(体积比为46:54)，使蛋白终浓度为100μg/ml，乳化、质检合格后置于4℃保存。

7.2免疫实验

筛选4-5月龄小牛15头(BVDV抗原抗体阴性)，随机分成3组，每组5头，其中一组作为空白对照组，其他2组作为免疫组，分别免疫杆状病毒表达的E2蛋白制备的疫苗和CHO细胞表达的E2制备的疫苗。每次肌肉注射1ml CHO细胞表达的E2蛋白亚单位疫苗(100μg/ml)和昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗(100μg/ml)，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前和二免后14天及21天采集血清，用IDXEE试剂盒测定抗体效价。结果如图5所示，CHO细胞的E2蛋白制备疫苗免疫后S/P值较高于杆状病毒表达E2蛋白制备的疫苗。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110> 浙江海隆生物科技有限公司

<120> CHO细胞分泌表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及其亚单位疫苗的制备和应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1132

<212> DNA

<213> 密码子优化后的BVDV E2基因序列

<400> 1

gaagcttgcc gccaccatgg gccagatcgt gcagggcatc ctgtggctgc tgctgatcac 60

aggcgtgcag ggcgacctga actgtaagcc agattacagc tatgccatcg ctaggtctga 120

caggatcgga ctgctgggag ctgaggatct gacaaccgac tggaaggatt acagccacga 180

gatgatgctg gtggacacca tggtcatcgc ctggtgcaga gatggcaagt tcgtgtacca 240

ctctagatgt acacgcgaga ccaggtatct ggctacactg cattcccggg ccctgcccac 300

ctccgccgtg ttcgagaagc tgtttgacgg ccagagacag gaggataccg tggagatgga 360

cgataacttc gagtttggcc tgtgcccatg tgacgccaag cccatcgtga gaggccgcta 420

caacacaacc ctgctgaatg gccctgcttt ccagatggtg tgcccaatcg gctggacagg 480

caccgtgtct tgtatgctgg ccaatggcga cacactggat accgctgtgg tgcgcacata 540

caggcggtcc aagccctttc cttataggca gggctgcatc acacagaaga ccctgggcga 600

ggacctgtac aactgcgatc tgggcggcaa ttggacatgc gtgaccggcg acaggctgca 660

gtataccgga ggctctatcg agtcctgcaa gtggtgtggc ttcaagtttc agaagtctga 720

gggcctgcct cattacccaa tcggcaagtg taagctgaag aacgagacag gctatcggtt 780

cgtggattcc accagctgca atagagaggg agtggctatc gtgccaaccg gactggtgaa 840

gtgtaagatc ggcgacacaa tcgtgcaggt catcgccctg gataccaagc tgggcccaat 900

gccctgcaag ccttacgaga tcatcccctc cgagggccct gtggagaaga cagcctgtac 960

ctttaactac acaaagaccc tgaagaataa gtatttcgag ccccgcgaca gctactttca 1020

gcagtatatg ctgaagggcg agtaccagta ttggttcgat ctggaggtga ccgaccacca 1080

tagggattat tttgctgagt ccatccatca ccatcaccat cactaagaat tc 1132

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> BVDV E2蛋白序列

<400> 1

Asp Leu Asn Cys Lys Pro Asp Tyr Ser Tyr Ala Ile Ala Arg Ser Asp Arg Ile Gly Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15 20

Glu Asp Leu Thr Thr Asp Trp Lys Asp Tyr Ser His Glu Met Met Leu Val Asp Thr Met Val Ile Ala

25 30 35 40 45

Trp Cys Arg Asp Gly Lys Phe Val Tyr His Ser Arg Cys Thr Arg Glu Thr Arg Tyr Leu Ala Thr Leu

50 55 60 65

His Ser Arg Ala Leu Pro Thr Ser Ala Val Phe Glu Lys Leu Phe Asp Gly Gln Arg Gln Glu Asp Thr

70 75 80 85 90

Val Glu Met Asp Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro Ile Val Arg Gly Arg

95 100 105 110 115

Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val

120 125 130 135

Ser Cys Met Leu Ala Asn Gly Asp Thr Leu Asp Thr Ala Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg Ser Lys Pro

140 145 150 155 160

Phe Pro Tyr Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Thr Leu Gly Glu Asp Leu Tyr Asn Cys Asp Leu Gly

165 170 175 180

Gly Asn Trp Thr Cys Val Thr Gly Asp Arg Leu Gln Tyr Thr Gly Gly Ser Ile Glu Ser Cys Lys Trp

185 190 195 200 205

Cys Gly Phe Lys Phe Gln Lys Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Lys Leu Lys Asn

210 215 220 225 230

Glu Thr Gly Tyr Arg Phe Val Asp Ser Thr Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Gly

235 240 245 250

Leu Val Lys Cys Lys Ile Gly Asp Thr Ile Val Gln Val Ile Ala Leu Asp Thr Lys Leu Gly Pro Met

255 260 265 270 275

Pro Cys Lys Pro Tyr Glu Ile Ile Pro Ser Glu Gly Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr

280 285 290 295 300

Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu

305 310 315 320

Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp His His Arg Asp Tyr Phe Ala Glu Ser Ile His His

325 330 335 340 345

His His His His

350

Claims

1.一种重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1)将牛病毒性腹泻病毒E2蛋白基因克隆到真核表达载体中得到含有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因的重组质粒；

2)再将含有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；

3)通过培养、筛选、驯化2)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；

4)发酵培养3)中所述细胞株，纯化后得到重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因的重组质粒是先将牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因进行密码子优化，然后克隆到真核表达载体中，得到重组质粒。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码基因如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEE12.4。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。

6.一种含有重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，将根据权利要求1所述的制备方法得到的重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀，得到牛病毒性腹泻病毒E2重组亚单位疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA201VG。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白与佐剂ISA 201VG按体积比46:54混合乳化。

9.一种根据权利要求1～8任一所述的重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗在制备及相关诊断试剂中的应用。