CN107746848B - 重组猪瘟病毒e2蛋白及其表达细胞系、制备方法、应用及猪瘟病毒亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了如序列表SEQ ID No.1所示的重组的猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列，以及利用该序列制备高量表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法、利用该方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

Description

重组猪瘟病毒E2蛋白及其表达细胞系、制备方法、应用及猪瘟病毒亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用，属于生物疫苗制备技术领域。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus，CSFV)引起猪的一种急性、热性、接触性传染病。以发病急，高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变为特征，家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。

猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。病毒粒子略呈圆形，有囊膜，病毒粒子表面有纤突构造。CSFV基因组长约12.5kb，含有1个开放性阅读框(ORF)编码约4000个氨基酸残基分子量约438ku的多聚蛋白，在病毒与宿主细胞蛋白酶的作用下将其加工为12种成熟蛋白，其中结构蛋白为C，Ems，E1和E2，非结构蛋白为Npro，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。研究表明，E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击。

控制猪瘟流行的重要手段是疫苗接种。目前我国市场上常用的猪瘟疫苗有3种，即猪瘟脾淋活疫苗(脾淋苗)、猪瘟乳兔组织活疫苗(组织苗)、猪瘟细胞活疫苗(细胞苗)。

组织苗和脾淋苗的免疫原性虽然比较好，但是由于在疫苗制备过程中主要利用攻毒后兔组织来制备，存在的问题比较多，如：过敏反应问题，不同品种、批次实验兔的差异较大，动物福利及生物安全问题、不容易大规模生产等。猪瘟细胞活疫苗(细胞苗)是通过体外培养犊牛睾丸细胞扩增病毒制备而成。猪瘟细胞苗的优点是抗原滴度较高能产生较高的保护性抗体；更易规模化生产，但是，由于在疫苗生产需要使用原代细胞，因此该疫苗也存在较多缺陷，如：原代细胞培养批次差异大且无细胞病变，不易控制病毒滴度；原辅材料涉及犊牛睾丸细胞和牛血清，容易形成BVDV污染的风险(Bovine Viral Diarrhea Virus，牛病毒性腹泻病毒)。

发明内容

本发明的目的在于解决猪瘟病毒疫苗制备批次间稳定性低、不宜规模化生产的问题。

为了实现上述目的，本发明提供一种重组的猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列，所述序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明的另一方面，提供一种制备高量表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，包括以下步骤：

提供重组表达质粒，所述重组表达质粒包含具有信号肽及组氨酸标签的猪瘟病毒E2蛋白编码序列；

通过PEI转染法将所述重组表达质粒转染入真核细胞；

通过抗生素筛选获得表达所述重组表达质粒的单克隆细胞，并对所述单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；

检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，

其中，所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明的另一方面，提供根据上述方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。

本发明的另一方面，提供一种猪瘟病毒亚单位疫苗，包含有效剂量的由上述重组细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白。

本发明的另一方面，提供上述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

本发明的有益效果是：通过重组猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列，获得高表达E2蛋白的重组细胞系，利于疫苗的规模化生产，且批次间稳定性高。

附图说明

图1是重组真核细胞克隆表达的E2蛋白的Western Blot结果，其中，泳道1-5分别为：Marker，大小为43kd；阴性对照；重组序列；重组序列；原始序列；

图2是重组真核细胞培养上清中E2蛋白纯化检测结果，图中M为Marker，大小依次为116、66、45、35、25、18、14KD；泳道1-5分别为：细胞培养上清；纯化后流出液；洗脱峰1；洗脱峰2；洗脱峰3；

图3是重组真核细胞培养上清中E2蛋白免疫实验鼠后鼠抗E2血清抗体效价间接ELISA检测结果；

图4是重组真核细胞培养上清中E2蛋白免疫实验兔后兔抗E2血清抗体效价间接ELISA检测结果；

图5是实验兔经本发明猪瘟E2亚单位疫苗免疫后中和猪瘟疫苗毒效果实验结果；

图6是3-4周龄长白猪经本发明猪瘟E2亚单位疫苗免疫后血清猪瘟病毒ELISA抗体检测结果。

具体实施方式

以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。

本发明提供一种制备高量表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，包括以下步骤：

提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含具有信号肽及组氨酸标签的猪瘟病毒E2蛋白编码序列；

通过PEI转染法将所述重组表达质粒转染入真核细胞；

通过抗生素筛选获得表达所述重组表达质粒的单克隆细胞，并对所述单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；

检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。

在本发明一实施例中，真核细胞为哺乳动物293细胞。在该表达载体中瞬时转染重组表达质粒后，确定E2蛋白表达量及反应活性，选择合适的细胞株用于构建稳定表达E2蛋白的293细胞系。

通过高通量筛选获得稳定高表达E2蛋白的细胞系，利用无血清培养基大量培养稳定表达E2蛋白的293F细胞，收集细胞培养上清，即为疫苗制备原料。

将含E2蛋白的细胞上清与佐剂充分混匀后得到猪瘟病毒重组亚单位疫苗。

具体地，为了在293细胞中获得更好的表达量及保持蛋白的活性，通过调整GC含量，消除稀有密码子并考虑密码子的重复、核糖体结合位点、起始密码子环境、终止密码子环境、酶切位点设计、合理的接头设计、融合基因、纯化标签等，通过进一步设计，使CSFV原始基因得到优化，获得重组核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成如序列表SEQID No.1所示的基因并对其添加信号肽及组氨酸标签，连接入真核表达载体pCDNA3.4质粒中，瞬时转染293F细胞。以未经改造的CSFV原始序列作为对照重复上述操作。

转染采用PEI转染，具体步骤如下：

1)培养293F细胞处于对数生长期，活力大于95％，细胞处于1.8-2.2X106cell/ml。

2)PEI需提前37度预热，DNA提前室温预热10min,转染缓冲液37度预热。

3)转染体系如表1所示。

转染体积	摇瓶规格	细胞体积	转染缓冲液	DNA	293(PEI)
						每30ml	125ml	27ml	3ml	30ug	90ug

4)将所需质粒及PEI添加入转染缓冲液里面，将两者混合一起充分摇匀，37℃孵育7min。

5)将孵育好的质粒添加到细胞中，37℃悬浮培养。

6)转染24h以后补充N源和生长因子。

7)第6天计数细胞，观察细胞状态及死亡率，收获细胞。

8)收集细胞上清，12000rpm 15min，弃细胞沉淀，上清用于下游纯化。

通过免疫印迹(Western Blot)检测转染的293F细胞中重组E2蛋白表达量。结果参见图1，重组序列的两次重复样本所表达的E2蛋白量远远高于原始序列的表达量。其中，重组E2蛋白由于表达过程中的糖基化等蛋白质修饰作用，分子量比预期的40KD更大，图1及图2结果均显示约在50KD左右。经肽指纹图谱进一步验证，确定该表达蛋白为目的蛋白。

采用ELISA检测所表达的重组E2蛋白免疫反应性。结果参见表2，重组序列的两次重复样本所表达的E2蛋白免疫反应性比原始序列高出约2倍。

在本发明又一实施例中，对转染后的293F细胞进行抗生素筛选，阳性克隆上清进行WB及SDS-PAGE鉴定,选择表达量高的300个阳性克隆进行亚克隆，对单克隆进行再次鉴定挑选上清表达量最高的10株进行定株，选择稳定性好的2D6为后续生产株。

对该细胞株进行无血清培养，通过镍柱亲和层析纯化1L细胞培养上清，测定E2蛋白产量。无血清培养可以避免疫苗在生产过程中被BVDV污染的风险。

具体的，参考图2，根据镍柱亲和纯化后E2蛋白BCA浓度检测计算得到5号泳道高纯度蛋白总量为280MG/L，流出液中未纯化出蛋白和纯度较低的蛋白合计超过200MG/L。据此确定该细胞株摇瓶小试水平的表达量约为500MG/L以上。

将E2蛋白免疫实验鼠及实验兔，通过间接ELISA检测抗体效价，参考图3及图4，结果显示1免后14天即可获得高效价抗E2的抗体，说明筛选所得细胞株分泌的E2蛋白具备很强的免疫原性。

在本发明又一实施例中，提供一种猪瘟病毒亚单位疫苗，所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA 201VG。

将1ML前述2D6细胞株的培养上清加入到ISA 201VG佐剂中(体积比为46∶54)，30度搅拌乳化10分钟。

使用该疫苗免疫实验兔4只，14天免疫一次，免疫2次，21天开始静脉注射猪瘟疫苗毒1ml，每天测体温3次，与正常未免疫兔接种疫苗毒组的体温进行比较。参考图5，结果显示免疫E2组体温未升高，与对照组有明显差异，确定E2亚单位疫苗具备良好的中和猪瘟疫苗毒的效果。

选3-4周龄长白猪进行试验，每次免疫1ml前述疫苗。初次免疫2周后，加强免疫一次，免疫后每周取血1次，分离血清，用阻断ELISA法测定抗体效价。结果参见图6，本发明的E2亚单位疫苗阻断率明显高于市场上某品牌的成兔脾淋苗。在一次免疫14天时所产生的抗体(阻断率＞70％)理论上已经足以保护猪群免受猪瘟病毒的感染。在二次免疫7天和二次免疫14天时，阻断率＞90％，已经达到试剂盒的检测上限，故没有体现效价的上升。本发明提供的CSFV E2亚单位疫苗，具有表达量高，生产成本低；悬浮培养，易规模化；无血清培养无BVDV污染风险；批次间稳定等诸多优点。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京钟鼎生物技术有限公司

<120> 重组猪瘟病毒E2蛋白及其表达细胞系、制备方法、应用及猪瘟病毒亚单位疫苗

<130> 2017

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> 编码猪瘟病毒E2的基因(Gene encoding swine fever virus E2)

<400> 1

agactggcct gcaaggagga ttacagatac gccctgtcct ccaccaacga gatcggcctg 60

ctgggcgccg gcggactgac aacaacctgg gaggagtact cccacgatct gcagctgaac 120

gacggcacag tgaaggccat ctgcgtggcc ggcagcttca aggtgaccgc cctgaacgtg 180

gtgagcagga ggtacctggc ctccctgcac aagggcgccc tgctgaccag cgtgaccttt 240

gagctgctgt tcgacggcac caaccctagc accgaggaga tgggcgacga tttcggcttt 300

ggcctgtgtc ctttcgatac ctcccccgtg gtgaagggca agtacaacac aacactgctg 360

aacggcagcg ccttctacct ggtgtgccct atcggctgga caggcgtgat cgagtgcaca 420

gccgtgagcc ccacaaccct gaggacagag gtggtgaaga ccttcagaag agagaagcct 480

ttccctcaca ggatggactg cgtgaccacc acagtggaga acgaggacct gttttactgc 540

aagctgggcg gcaactggac ctgcgtgaag ggcgagcctg tggtgtacac cggcggccag 600

gtgaagcagt gcaagtggtg cggctttgat tttaacgagc ctgacggcct gccccactac 660

cccatcggca agtgtatcct ggccaacgag acaggctaca ggatcgtgga tagcacagat 720

tgcaataggg acggcgtggt cattagcgcc gagggcagcc acgagtgcct gatcggcaac 780

accacagtga aggtgcacgc cagcgacgag agactgggcc ccatgccttg cagacccaag 840

gagatcgtgt cctccgccgg ccctgtgaga aagacatcct gtacctttaa ctacgccaag 900

acactgaaga acaagtacta cgagcccagg gactcctact tccagcagta catgctgaag 960

ggcgagtacc agtactggtt tgacctggac gtgaccgata gacactccga ttactttgcc 1020

gagttc 1026

Claims (5)

1.一种编码重组的猪瘟病毒E2蛋白的多核苷酸分子，其特征在于，其序列如序列表SEQID No.1所示。

2.一种制备高量表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供重组表达质粒，所述重组表达质粒包含具有信号肽及组氨酸标签的猪瘟病毒E2蛋白编码序列；

通过PEI转染法将所述重组表达质粒转染入真核细胞；

通过抗生素筛选获得表达所述重组表达质粒的单克隆细胞，并对所述单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；

检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，

其中，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

3.一种根据权利要求2所述的方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。

4.一种猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，包含有效剂量的由权利要求3所述的重组细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白。

5.根据权利要求3所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

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