CN108864259A - 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法 - Google Patents

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种操作简单、回收率高的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，具体包括如下步骤：步骤S1，将表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的酵母细胞培养液离心，得到表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒酵母菌的菌泥；步骤S2，加入破菌缓冲液重悬菌体，得到菌体悬液；步骤S3，菌体悬液经低温高压均质机破碎，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的破菌液；步骤S4，将破菌液离心，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒蛋白的溶出液，其中，步骤S2中的破菌缓冲液为含有预定浓度的NaCl以及亲水性表面活性剂的磷酸盐缓冲液。

Description

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及病毒样颗粒的溶出方法，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)是目前已知的最小动物病毒，尽管病毒基因组结构简单，但对畜牧业的危害巨大。在第20届国际猪病大会上，猪圆环病毒疾病被列为当前危害养猪业健康发展的头号疫病；2013年上海市发生的黄浦江死猪漂浮事件，从死猪病料中检测到的病原也主要是圆环病毒。该病毒是引起断奶仔猪多器官衰竭综合症(PMWS)的主要病原，它会破坏猪的免疫系统，引起免疫抑制，从而导致临床免疫失败和疾病爆发。临床上，圆环病毒常常与猪细小、猪繁殖与呼吸综合症、猪瘟等病毒发生混合感染，发病猪群表现出消瘦、皮炎、被毛粗乱、浅表淋巴结肿大等临床症状，发病率和死亡率高，给我国养猪业带来严重的经济损失。
PCV2基因组由有多个阅读框，其中ORF2编码的Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白。研究表明，PCV2Cap蛋白可自组装形成病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)，用其制备的疫苗免疫原性良好。目前大多数商用PCV2亚单位疫苗使用昆虫杆状病毒表达系统表达重组Cap蛋白，但该系统表达时间长且成本昂贵；而大肠杆菌等原核表达系统不能对重组蛋白进行翻译后修饰，且需要考虑内毒素的去除。酵母细胞是比原核生物更好的表达系统，不仅能解决原核系统的内毒素问题，还可对表达的蛋白进行糖基化修饰，表达水平高，易于放大，且相较于其他真核表达系统成本更为低廉。
基于上述原因，本发明的发明人构建了重组表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的马克斯克鲁维酵母，并针对重组获得的菌株申请了发明专利(即CN201610806538.0)。然而，发明人在进行该重组酵母的提取纯化研究时发现，由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁、破碎要求条件高，因此细胞难以完全破碎；并且，重组酵母中的病毒样颗粒表达量极高，导致这些颗粒易聚集，在细胞破碎过程中常常滞留在酵母细胞内部，因此不易溶出。所以，尽管上述重组酵母具有能够糖基化修饰、表达水平高、易于放大等优点，但其实际应用过程中仍存在破菌过程中PCV2VLPs难以溶出、回收率低等问题。
发明内容
为解决上述问题，提供一种操作简单、回收率高的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，用于使表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的酵母细胞中的病毒样颗粒溶出从而得到病毒样颗粒溶出液，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，将表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的酵母细胞培养液离心，得到表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒酵母菌的菌泥；步骤S2，加入破菌缓冲液重悬菌体，得到菌体悬液；步骤S3，菌体悬液经低温高压均质机破碎，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的破菌液；步骤S4，将破菌液离心，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒蛋白的溶出液，其中，步骤S2中的破菌缓冲液为含有预定浓度的NaCl以及亲水性表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，还可以具有这样的技术特征，其中，破菌缓冲液中NaCl的预定浓度为80mM～120mM。
本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，还可以具有这样的技术特征，其中，破菌缓冲液中亲水性表面活性剂为Tween80，其体积百分数为0.08％～0.12％。
本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，还可以具有这样的技术特征，其中，磷酸盐缓冲液为20mM～30mM磷酸盐缓冲液，其pH为6.8。
本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S2中，菌体悬液的酵母细胞密度为100OD600nm。
本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S3中的低温高压均质机破碎的条件设为均质压力1000bar以上、均质温度4℃，破碎2次。
本发明提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，还可以具有这样的技术特征，其中，均质压力为1300bar。
发明作用与效果
根据本实施例提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，由于采用了磷酸盐缓冲液且其含有预定浓度的NaCl和亲水性表面活性剂，因此能够提升病毒样颗粒的溶解性，从而提高病毒样颗粒的溶出效果，提高回收率。
附图说明
图1为本发明实施例中的不同破菌缓冲液对溶出的影响结果电泳图；
图2为本发明实施例中不同均质机压力与破碎次数对对溶出的影响结果电泳图。
具体实施方式
本发明所采用的猪圆环病毒2型病毒样颗粒(以下称病毒样颗粒)的溶出方法主要包括以下步骤：
步骤S1，将表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的酵母细胞培养液离心，得到表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒酵母菌的菌泥；
步骤S2，加入破菌缓冲液重悬菌体，得到菌体悬液；
步骤S3，菌体悬液经低温高压均质机破碎，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的破菌液；
步骤S4，将破菌液离心，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒蛋白的溶出液。
以下结合附图以及实施例来说明本发明的具体实施方式。下述实施例中，低温高压均质机为广东聚能JN3000高压均质机，试剂如无特殊说明均从一般商业途径获得，未注明的实验条件均参照常规实验条件或遵照供应商建议的条件。
<实施例>
1.获得重组酵母菌体
将马克斯克鲁维酵母表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的重组酵母菌株进行平板划线活化，挑取活化后的单克隆接种于150ml发酵种子培养基中，30度220rpm培养18h后导入到5L发酵罐中，使用流加补料方式进行发酵，60-72h后结束发酵，倒出发酵液，测定发酵菌体的OD600nm值。
取300mL发酵液8000g，15min，4℃离心菌体，弃去上清，收集菌体(即菌泥)。4℃保存收集的菌体。
2.缓冲液配制
配制不同的破菌缓冲液(即步骤S2中所采用的破菌缓冲液)，其组分如下：
破菌缓冲液A1：磷酸二氢钠50mmol/L；氯化钠100mmol/L；吐温80 1mL/L。
破菌缓冲液A2：磷酸二氢钠20mmol/L；氯化钠100mmol/L；吐温80 1mL/L。
破菌缓冲液A3：磷酸二氢钠50mmol/L；氯化钠0mmol/L；吐温80 1mL/L。
破菌缓冲液A4：磷酸二氢钠25mmol/L；磷酸氢二钾25mmol/L；氯化钠100mmol/L；吐温80 1mL/L。
配制完成后，各缓冲液均调节pH至6.8。
3.菌体破碎实验
首先设定不同的酵母细胞高压均质破碎参数，具体如下：
均质破碎参数B1：破菌压力1300bar，破菌次数2次，温度4℃。
均质破碎参数B2：破菌压力1300bar，破菌次数1次，温度4℃。
均质破碎参数B3：破菌压力1000bar，破菌次数3次，温度4℃。
均质破碎参数B4：破菌压力1000bar，破菌次数2次，温度4℃。
均质破碎参数B5：破菌压力800bar，破菌次数3次，温度4℃。
均质破碎参数B6：破菌压力800bar，破菌次数2次，温度4℃。
然后，将不同的破菌缓冲液(即破菌缓冲液A1～A4)和上述高压均质破碎参数(即均质破碎参数B1～B6)进行组合，得出九个组合作为不同的实验组，以测试不同组合条件下的溶出效果。各实验组所采用的破菌缓冲液与均质破碎参数组合设置如下表1所示：
表1：破菌缓冲液和高压均质破碎参数的组合
实验组编号 破菌缓冲液编号 均质破碎参数设定编号
1 A1 B1
2 A2 B1
3 A3 B1
4 A4 B1
5 A1 B2
6 A1 B3
7 A1 B4
8 A1 B5
9 A1 B6
各实验组的菌体重悬和均质破碎过程如下：
将收集的菌体用表1中的对应破菌缓冲液进行重悬(即，将50ml菌液离心后，菌体沉淀用200ml破菌缓冲液重悬)，混合均匀后，使用低温高压均质机按照表1中的对应参数设置并进行破碎。破碎结束后，将破菌液进行离心(条件为10000g、4℃，离心30min)，收集的上清液即为溶出液。
4.实验结果分析
将各实验组中收集到的溶出液以及实验组1～4的破菌沉淀(即破菌后的离心沉淀)取样进行SDS-PAGE电泳，以分析不同的破菌条件对溶出结果带来的影响。
各样品取200μl，加入50μl 5*SDS Loading buffer，混合均匀后沸水中煮10分钟后离心，用SDS-PAGE电泳检测猪圆环病毒2型病毒样颗粒溶出效果。
SDS-PAGE电泳结束后，用G250染色液将SDS-PAGE胶染色8h后脱色，至染色液完全脱净，使用扫描仪进行扫描。
图1为本发明实施例中的不同破菌缓冲液对溶出的影响结果电泳图，其中各泳道的样品如下：
M为预染蛋白Marker；泳道1-4分别为实验组1～4重悬菌体后的破菌上清取样；泳道5-8分别为实验组1～4重悬菌体后的破菌沉淀取样。
图2为本发明实施例中不同均质机压力与破碎次数对对溶出的影响结果电泳图，其中各泳道的样品如下：
M为预染蛋白Marker；泳道6-1分别为实验组4～9重悬菌体后的破菌上清取样(即，泳道6对应于实验组4，泳道5对应于实验组5，以此类推，泳道1对应于实验组9)。
根据图1可知，当不向破菌缓冲液中添加NaCl时，病毒样颗粒的溶出效果较差(即，如实验组3的结果所示，大部分仍残留在沉淀内)；当向破菌缓冲液中添加一定量的NaCl时，则病毒样颗粒的溶出效果普遍较好(即，如实验组1、2、4的结果所示，其上清中的病毒样颗粒相对于未添加NaCl的实验组3均有提高)。
因此，当采用马克斯克鲁维酵母作为表达体系来表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒时，NaCl是有利于菌体破碎过程中的病毒样颗粒溶出的，其原因可能是NaCl能够提高病毒样颗粒的溶解性。
另外，根据图1可知，破菌缓冲液中磷酸二氢钠的浓度较低时，病毒样颗粒的溶出更好(即，如实验组1、2所示，磷酸二氢钠含量低时上清中病毒样颗粒溶出增多)，向破菌缓冲液中添加其他类型的缓冲盐(如实验组4)则对溶出效果基本无影响，说明对溶出效果的影响较大的缓冲盐为磷酸二氢钠。因此，在配制破菌缓冲液不需要添加过多种类的缓冲盐，且缓冲盐的浓度需要控制在合适范围内。
根据图2可知，均质时压力越大、均质次数越多，则上清液中的病毒样颗粒含量越高，说明均质越充分则病毒样颗粒溶出越多，且在一般的均质条件范围内，压力增大、次数增多不会造成病毒样颗粒变性或解离等负面影响。
综合上述各实验组的结果分析可以得出，病毒样颗粒溶出的最佳方法是采用磷酸二氢钠作为破菌缓冲液中的缓冲盐，同时破菌缓冲液中应当适量添加NaCl；另外，病毒样颗粒可以耐受高压多次均质，因此均质条件可以设置为高压力下的多次均质。即，最有利于病毒样颗粒溶出的条件为：步骤S2中的破菌缓冲液中为25mM的磷酸盐缓冲液，其含有100mM的NaCl和体积百分数0.1％的Tween80；步骤S3中的均质机破碎的条件设为1300bar、4℃，破碎2次。
实施例作用与效果
根据本实施例提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，由于采用了25mM的磷酸盐缓冲液且其含有100mM的NaCl和体积百分数0.1％的Tween80，因此能够提升病毒样颗粒的溶解性，从而提高病毒样颗粒的溶出效果，提高回收率；由于采用了1300bar、4℃、破碎2次的均质条件，因此能够让菌体细胞充分破碎，进一步提高溶出效果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
例如，实施例中所采用的破菌缓冲液为25mM的磷酸盐缓冲液，且其含有100mM的NaCl和体积百分数0.1％的Tween80，但在本发明中，磷酸盐的浓度也可以是20mM～30mM之间的任意浓度，NaCl含量也可以是80mM～120mM之间的任意含量，Tween80也可以是0.08％～0.12％之间的任意百分数。
实施例中，均质压力为1300bar，均质次数为2次，但在本发明中，均质压力也可以是1000bar以上的其他压力，均质次数也可以是3次以上的次数。

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，用于使表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的酵母细胞中的病毒样颗粒溶出从而得到病毒样颗粒溶出液，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，将表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的酵母细胞培养液离心，得到表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒酵母菌的菌泥；
步骤S2，加入破菌缓冲液重悬菌体，得到菌体悬液；
步骤S3，菌体悬液经低温高压均质机破碎，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的破菌液；
步骤S4，将破菌液离心，得到含猪圆环病毒2型病毒样颗粒蛋白的溶出液，
其中，步骤S2中的所述破菌缓冲液为含有预定浓度的NaCl以及亲水性表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，其特征在于：
其中，所述破菌缓冲液中NaCl的所述预定浓度为80mM～120mM。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，其特征在于：
其中，所述破菌缓冲液中所述亲水性表面活性剂为Tween80，其体积百分数为0.08％～0.12％。
4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，其特征在于：
其中，所述磷酸盐缓冲液为20mM～30mM磷酸盐缓冲液，其pH为6.8。
5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，其特征在于：
其中，步骤S2中，所述菌体悬液的酵母细胞密度为100OD600nm。
6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，其特征在于：
其中，步骤S3中的所述低温高压均质机破碎的条件设为均质压力1000bar以上、均质温度4℃，破碎2次。
7.根据权利要求6所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的溶出方法，其特征在于：
其中，所述均质压力为1300bar。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006024542A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-09 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
CN101487010A (zh) * 2008-01-15 2009-07-22 上海泽润生物科技有限公司 用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法
CN102634525A (zh) * 2012-04-27 2012-08-15 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒ii型衣壳蛋白基因、表达载体的构建及其蛋白高效表达的方法
CN104651316A (zh) * 2015-02-28 2015-05-27 上海海利生物技术股份有限公司 一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法
CN106399138A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 猪圆环病毒ii型口服病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN106399350A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 一种猪圆环病毒ii型病毒样颗粒疫苗及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006024542A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-09 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
CN101487010A (zh) * 2008-01-15 2009-07-22 上海泽润生物科技有限公司 用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法
CN102634525A (zh) * 2012-04-27 2012-08-15 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒ii型衣壳蛋白基因、表达载体的构建及其蛋白高效表达的方法
CN104651316A (zh) * 2015-02-28 2015-05-27 上海海利生物技术股份有限公司 一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法
CN106399138A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 猪圆环病毒ii型口服病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN106399350A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 一种猪圆环病毒ii型病毒样颗粒疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张德华: "《蛋白质与酶工程》", 30 September 2015, 合肥工业大学出版社 *
谢晋等: "酵母重组表达ＰＣＶ２病毒样颗粒的纯化工艺", 《复旦大学（自然科学版）》 *
高田等: "PCV2病毒样颗粒疫苗的研究进展", 《生命的化学》 *

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