CN101487010A - 用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白的方法，包括将按照优化设计的HPV 18 L1基因装入表达载体，转化毕赤酵母，培养转化体，获得重组的人乳头瘤病毒18型L1蛋白，该蛋白在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒；其中，所述的优化设计的HPV 18 L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。本发明的方法制备的HPV 18 L1蛋白表达量高。本发明还公开了将该重组HPV 18 L1蛋白病毒样颗粒制成抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法。该疫苗具有较佳的活性。

Description

用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白及用该L1蛋白制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。1995年，国际癌症研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。

根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高危型。HPV 6、11、34、40、42等型别多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变中，属HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以HPV 16、18、31、33、35、39、45型感染更为多见，这些亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的HPV 16、18型感染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。因此HPV 16、18型的疫苗的开发将能够有效的预防宫颈癌的发生。

HPV是一种DNA病毒，直径约为45～55nm，呈球形，无包膜，衣壳为由72个壳微粒组成对称偏斜的20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称为病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒与天然病毒有相似的空间构象、免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，因而基于L1衣壳蛋白的VLP预防性疫苗的开发成为目前HPV疫苗研究的主要方向。

目前，Merck公司的预防型HPV四价疫苗(商品名Gardasil)已经上市。该疫苗为酿酒酵母系统表达的HPV 16+18+6+11L1蛋白，临床实验表明：Merck疫苗在预防16型、18型、6型(6a和6b)、11型HPV感染的有效率接近100％。GlaxoSmithKline公司的预防型HPV双价疫苗(商品名为Cervarix，昆虫细胞表达的HPV16+18L1蛋白)也已经进入FDA审批阶段，已获准在澳大利亚、欧盟、菲律宾、阿联酋等地上市。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统具有操作简单、易于培养、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8～14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50～150甘露糖残基要短得多。

专利CN1869215A公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，分别将用PCR扩增宫颈癌病理组织标本得到的编码人乳头瘤病毒晚期蛋白的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒，但该文献未公开该根据毕赤酵母密码子的偏爱性合成的HPV L1基因的核苷酸序列以及重组L1蛋白的活性。

发明内容

因此，本发明要解决的问题就是提供一种表达量高的用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1(HPV 18 L1)蛋白的方法。本发明还要解决的问题是提供用所述重组HPV 18 L1蛋白制备抗HPV 18感染的疫苗的方法，制得的疫苗具有较佳活性。

本发明人经过深入而广泛的研究，成功的建立了用优化密码子的基因在毕赤酵母表达系统中高量表达病毒样颗粒和制备抗人乳头瘤病毒18型疫苗的技术，在此基础上完成了本发明。

首先，本发明人经过仔细的研究，设计了适用毕赤酵母偏好密码子的人乳头瘤病毒18型基因的核苷酸序列。

遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的，每个氨基酸都由一个以上的密码子编码，同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平。由于现有技术中，N端缺失61个氨基酸的编码核苷酸序列的截短型HPV 18 L1基因更有利于在重组载体中进行表达，故本发明人对野生型的全长HPV 18 L1基因(Genebank AAP20601)以及上述截短型HPV 18 L1基因(Genebank AAQ92369)进行改造：对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子。Pichia酵母密码子使用频率见表1，该数据来源为http://www.kazusa.or.jp/codon/。然后在此基础上，又为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶切位点，本发明人对最高频率的密码子进行一定的修正。由此，本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的HPV 18 L1基因的核苷酸序列，按照所述的序列全合成了全长及该基因的截短型HPV 18 L1基因，将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中，通过同源重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株；利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达HPV 18 L1蛋白。从中筛选出6种全新的HPV 18 L1基因的核苷酸序列，可在毕赤酵母中高表达HPV 18 L1蛋白，并在胞内同时形成病毒样颗粒(VLPs)，破菌上清经过层析方法纯化后，纯化的病毒样颗粒纯度大于90％，吸附铝佐剂后，具有极高的免疫原性，可作为人用预防宫颈癌的疫苗。这些优化设计的全长HPV 18 L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，其相应的截短型HPV 18 L1基因的核苷酸序列如SEQID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

表1 Pichia酵母密码子表

然后，本发明利用上述6种全新的适于毕赤酵母表达的全长或截短型HPV 18 L1基因的核苷酸序列，可以采用现有常规的分子生物学技术，构建了基因工程菌，并发酵培养工程菌，分离纯化得到重组的HPV 18 L1蛋白。其中，

本发明基因工程菌的构建方法

根据毕赤酵母密码子的偏爱性，全基因合成上述优化设计的全长或截短型病毒HPV 18衣壳蛋白L1基因，克隆至毕赤酵母表达载体中，所用的表达载体选自pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pAO815等现有常用的毕赤酵母表达载体，将含HPV 18 L1基因的表达载体转化毕赤酵母宿主菌株，通过筛选获得重组毕赤酵母工程菌，转化方法可用电转化或原生质体转化，所用的宿主酵母菌选自现常用的毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168等菌株。

本发明基因工程菌的发酵方法

将本发明基因工程菌接入活化培养基(YPD或LB或SOC)，25～37℃培养过夜。将镜检合格的活化液接入种子培养基(YPD或LB或SOC)，25～37℃培养过夜。镜检无杂菌污染。按一定比例接种。发酵用基础盐培养基(BSM1或BSM2或BSM3)，发酵温度为20～37℃，初始pH3～8，添加痕量盐类(PTM1、PTM2、PTM3)。初始增殖阶段大约15～30小时，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压等维持溶氧值20～80％。当碳源消耗完毕时，菌体湿重达到约50～150g/L。补加甘油或葡萄糖溶液。维持溶氧值20～80％。补加一定时间，菌体湿重约50～500g/L时，停止补料。同时将pH值控制调为3～8，开始加入甲醇诱导。维持溶氧值高于20～80％，温度维持在20～37℃，pH值控制为3～8。每2～10小时取一次样，WesternBlot检测。诱导5～90小时发酵结束，放出发酵液。用冷冻离心机离心发酵液后收集菌体。收获的菌体在-20℃冻存。诱导表达的HPV 18 L1蛋白，可在在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒(HPV 18 L1 VLPs)。

本发明纯化HPV 18 L1 VLPs的方法

取-20℃冷冻的表达目的蛋白的菌体，通过中性缓冲盐溶液或纯化水解冻并清洗菌体，去除其中的培养基成分(盐、色素等)，减少对后期纯化的影响。经过清洗后的菌体，使用适当的含有一定盐浓度和表面活性剂成分的破菌缓冲液混合：可使用的盐成分有NaCl、KCl等，浓度范围在0.4～0.8mol/l左右；可使用的表面活性剂有Tween-80、Tween-20、Triton-X100等，浓度范围在0.005～0.05％(w/v)左右，可使用的缓冲系统有磷酸盐缓冲、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液等，使用浓度范围在0.02～0.2mol/l左右。混合后的菌体可以通过高压均质机或珠磨匀浆机等设备进行破壁，高压均质机使用破菌的压力范围800～2000Bar左右，破碎循环2～4遍可至破菌率>90％，珠磨匀浆机选用珠体直径0.2～0.4mm，珠体的装量控制在70％～90％左右，循环1～2遍可至破菌率>80％以上。将破碎后的菌液通过高速离心或者切向流微滤的方法分离沉淀和上清，离心机的转速控制在6000～10000rpm(SORVALL、HITACHI等)，离心时间20～60分钟，切向流微滤可使用0.45～0.65um的膜包(Millipore，PALL等)收集上清用于后期纯化。经过澄清后的上清，可以先经过阴离子交换层析柱如：Q Sephrose Flast Flow(GE)或DEAE SephroseFast Flow(GE)去除上清中部分杂质如：DNA、杂蛋白和RNA等，然后再进行后期纯化过程；也可以用澄清细胞上清直接进行后期纯化。后期纯化先将上清样品上样于可吸附HPV 18 L1 VLPs的层析介质上如SP Sepharose FF、Heparin SepharoseCL-6B(GE)、Poros 50HS(Merk)及Fractogel@EMD TMAE-650(Merck)等，HPV 18 L1 VLPs蛋白有效结合于上述层析介质上，并通过一定的盐浓度梯度(如：0.5～1.0M NaCl或KCl缓冲溶液)洗脱，将杂质与HPV 18 L1 VLPs蛋白分离，用含高盐(如：1.0～2.0mol/l NaCl或KCl缓冲溶液)的缓冲溶液洗脱结合的HPV 18 L1 VLPs蛋白，收集洗脱的初步纯化的HPV 18 L1 VLPs蛋白。将初纯的HPV 18 L1VLPs蛋白上样于精细纯化的层析介质上如CHT(BIO-RAD TypeII)，HPV18 L1 VLPs蛋白在一定盐浓度范围(如：0.3～1.5mol/l NaCl或KCl缓冲溶液)能有效结合于CHT(BIO-RAD TypeII)介质上，并通过一定的磷酸盐浓度梯度(如：磷酸盐的浓度可使用20～400mM)洗脱，将杂质与HPV 18 L1 VLPs蛋白分离。经过纯化的样品也可上样与精细纯化的介质如SephacrylS-1000(GE)和HW-75(TSK)，通过凝胶分离将杂质与HPV18L1VLPs蛋白分离。通过精细纯化后收集洗脱的HPV 18 L1 VLPs蛋白即为最后纯化的样品。

本方法能除去很大部分污染生物分子(包括DNA、脂类和蛋白质)；还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳(Beckman Coulter)检测表明，通过POROS 50HS介质层析纯化的样品纯度在75％～80％；通过羟磷灰石介质纯化的HPV 18 L1 VLPs蛋白最终样品纯度在90％～95％。Western blot(Bio-RAD)检测显示目的蛋白条带可与HPV 18 L1 VLPs的单抗或多抗呈特异性的显色反应；经过动态光散射(MalvernInstruments Zetasizer Nano ZS)的检测，纯化样品颗粒范围在50-80nm左右，经过透射电镜(Philips)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(VLPs)，颗粒直径在50～80nm之间。本实验步骤中的羟磷灰石介质最好使用粒子大小约为20～50um且孔径约为800

陶瓷羟磷灰石填料。在层析过程中，所使用的缓冲液pH范围6～9，优选缓冲系统用50mM MOPS。

因此，本发明利用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白的方法，包括将优化设计的HPV 18 L1基因克隆至表达载体，转化毕赤酵母菌株，培养转化体，获得重组的HPV 18 L1蛋白；其中，所述的优化设计的HPV 18 L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

优选的，所述的表达载体选自市售商品pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pAO815。

优选的，所述的转化用电转化或原生质体转化。

优选的，所述的毕赤酵母选自选自市售商品毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案可以是将本发明上述方法制得的重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白作为抗原，利用现有疫苗的制备方法来制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗。因此，本发明一种制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法，包括采用上述方法制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白病毒样颗粒，然后加入药学上可用的疫苗佐剂。所述的该疫苗佐剂可以是铝佐剂，纯化后的人乳头瘤病毒18型蛋白(HPV 18 L1)形成病毒样颗粒，吸附于佐剂上，可作为预防宫颈癌的疫苗。

本发明除特别说明之处外，所用的百分比都是重量百分比。

相比于现有技术，本发明选用优化设计的HPV 18 L1基因(全长或N端缺失61个氨基酸的编码核苷酸序列的截短型基因)，克隆至毕赤酵母中，使HPV 18 L1蛋白表达量较其他表达系统(如哺乳动物细胞、杆状病毒、酿酒酵母)有明显提高。表达所得病毒样颗粒经纯化后在电镜下观察为50～80nm，与野生型HPV病毒颗粒相似。重组的HPV 18 L1蛋白病毒样颗粒吸附铝佐剂后，免疫小鼠，能产生高效价的抗HPV 18 L1抗体；假病毒中和实验结果表明，该抗体具有较佳的中和活性(即能够阻止假病毒进入细胞)。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和优点。

图1是pPICZA-18 L1’载体构建示意图。

图2是pPICZA-18 L1’载体鉴定图。M，250bp ladder Marker(Takara公司)；1，BstBI+KpnI双酶切pPICZA；2，BstBI+KpnI双酶切pPICZA-18 L1’。

图3是全长HPV 18 L1表达WesternBlot鉴定图。M，预染Marker(NEB公司)；1，表达的阳性对照；2，表达的阴性对照；3，筛选到的全长HPV 18L1表达菌株。箭头所指之处即为表达的全长HPV 18 L1。

图4是截短型HPV 18 L1表达WesternBlot鉴定图。M，彩虹Marker(Fermentas公司)；1，表达的阳性对照；2，筛选到的截短型HPV 18 L1表达菌株；3，表达的阴性对照。箭头所指之处即为表达的截短型HPV 18 L1。

图5是HPV 18 L1层析纯化样品还原性SDS-PAGE电泳图。1)POROS50HS收集峰1；2)POROS 50H收集峰2；3)POROS 50HS收集峰3；4)CHT收集峰1；5)CHT Peak1浓缩样品；6)阳性对照。

图6是纯化产物HPV 18 L1免疫印迹图。1抗：fitzgerald公司18 L1抗体1：5000稀释；2抗：山羊抗鼠1：250；1：阳性对照；2、3：纯化后的HPV 18 L1蛋白。

图7是HPV 18 L1 VLPs纯化样品透射电镜图(×105000)。

图8a是HPV 18假病毒感染293FT细胞图。

图8b是鼠血清中和HPV 18假病毒图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1  合成全长HPV 18 L1基因

按照毕赤酵母使用的密码子偏爱性设计全长HPV 18 L1基因的核苷酸序列。见序列表中的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

由捷瑞公司分别商业合成上述全长基因，并应用DNA测序仪#3730对HPV 18 L1基因进行测序。

实施例2  全长或截短型HPV 18 L1毕赤酵母表达载体的构建

将实施例1中获得的序列为SEQ ID NO.1的全长HPV 18 L1基因两端以EcoRI和KpnI酶切位点装入pUC18质粒(捷瑞公司)中，命名为pUC-18 L1，送至上海生工生物工程有限公司应用DNA测序仪3730进行DNA测序。

委托上海生工生物工程有限公司合成扩增全长或截短型HPV 18 L1所需的引物三条。两条正向引物包括一个BstBI限制性内切酶位点，并具有如下核苷酸序列：

P1，5’-TCCCAATCTTCGAAACGATGTGTTTGTACACTAGAGTTT-3’(全长型，如SEQ ID NO.7所示)；

P2，5’-TCCCAATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGGA-3’(截短型，如SEQ ID NO.8所示)。

反向引物包括位于终止密码子侧翼的KpnI限制性内切酶位点并具有核苷酸序列：

P3，5’-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3’(如SEQ IDNO.9所示)。

聚合酶链式反应(PCR)以pUC-18 L1为DNA模板，用引物P1、P3扩增出全长HPV 18L1基因，其核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO.1；用引物P2、P3扩增出截短型HPV 18L1基因，其核苷酸序列见序列表中的SEQID NO.4。PCR片段按常规亚克隆方案经限制性内切核酸酶BstBI和KpnI双酶切消化，再与BstBI/KpnI双酶切消化的pPICZA(购自Invitrogen)连接。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α的感受态细胞，铺板于含25μg/ml零霉素(Zeocin)的LB琼脂上。分离已转化细胞的单菌落，制备质粒DNA并经限制性图谱和核苷酸序列分析HPV 18 L1基因和载体序列的存在。分别鉴别出包含全长HPV 18 L1基因的正确构建体(命名为pPICZA-18 L1)和截短型HPV 18 L1基因的正确构建体(命名为pPICZA-18 L1’)。图1是pPICZA-18 L1’载体构建示意图。图2是pPICZA-18 L1’载体的鉴定结果。

实施例3  全长或截短型HPV 18 L1毕赤酵母表达菌株的构建和筛选

为了提高重组质粒在酵母染色体上的整合效率，用SacI限制性内切酶单酶切pPICZA-18 L1质粒和pPICZA-18 L1’质粒使其线性化，对空质粒pPICZA进行同样的酶切作为阴性对照。酶切反应液加入无水乙醇沉淀DNA，用少量双蒸水溶解线性化的DNA片段，按《分子克隆实验指南》(第三版)的步骤电击转化毕赤酵母菌X-33(购自Invitrogen)。电转化条件为：DNA片段5微克，电压1500伏，电阻25欧姆，电击时间为5毫秒。电转化产物铺板于含200μg/ml零霉素的YPDS琼脂上，分离已转化细胞的单菌落，重新接种至含1000μg/ml、1500μg/ml零霉素抗性平板上。高浓度抗性平板上获得的克隆，分别用4ml YPD液体培养基培养，24h后换成BMMY培养基诱导基因表达，表达48h后离心收获菌体。玻璃珠法破菌，WesternBlot检测各个菌株的表达量，筛选后获得全长HPV 18 L1表达量较高的菌株pX226和截短型HPV 18 L1表达量较高的菌株pX123。图3是全长HPV 18 L1表达Western Blot鉴定图。图4是截短型HPV 18 L1表达Western Blot鉴定图。

实施例4  重组截短型HPV 18 L1蛋白的表达

种液制备：从工作种子库取1支菌种甘油冻存管，即实施例3所得的表达截短型HPV 18 L1的基因工程菌pX123，融化后吸取100μL接入5ml YPD培养基，280转/分钟(rpm)，30℃培养20小时。OD₆₀₀在1～2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1ml接入500ml YPD培养基，280rpm，30℃培养20小时。OD₆₀₀在2～6。镜检无杂菌污染。

发酵工艺：发酵用基础盐培养基BSM₁(K₂SO₄ 273g，MgSO₄ 109g，CaSO₄·2H₂O 17.6g，H₃PO₄ 400.5ml，KOH 62g，甘油600g，PTM₁ 60ml，泡敌1ml，去离子水加至15L)，用去离子水配制，其中不含有抗生素，配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃，30分钟，消后冷至30℃。按1:15接种。发酵温度为30.0±0.5℃，初始pH5.00±0.05，起始转速300rpm培养，通气量0.5vvm，DO100％，添加PTM1(CuSO₄·5H₂O 6.0g，NaI 0.008g，MnSO₄ 3.0g，NaMoO₄ 0.2g，H₃BO₃ 0.02g，ZnSO₄ 20.0g，CoCl₂ 0.5g，FeSO₄.7H₂O 65.0g，biotin 0.2g，H₂SO₄ 5.0ml，去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约20小时左右，维持溶氧值不低于30％，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升，菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200ml/h的速率补加体积百分比50％的甘油溶液(每升添加12ml PTM₁)。补料两小时后改为300ml/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在20％以上。补加约8小时，菌体湿重约350g/L时，停止补料，溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05，开始加入甲醇(每升添加12ml PTM₁)诱导。最初甲醇加入量控制在30ml/h。缓慢增加甲醇的加入量，甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90ml/h。维持溶氧值高于体积百分比20％，温度维持在30℃，pH值控制为6.00±0.05。每8小时取一次样，Western Blot检测。诱导24小时发酵结束时放出发酵液。

菌体收获：用冷冻离心机离心发酵液后收集菌体，称重。标明批号、日期、重量，收获的菌体交付于纯化，或在-20℃冻存。

实施例5  提纯制备截短型HPV 18 L1蛋白病毒样颗粒(VLPs)

清洗：将-20℃冷冻保存的、实施例4制得的表达截短型HPV 18 L1的毕赤酵母细胞，放于室温下解冻，加入清洗缓冲液100mM PB pH7.0、0.15MNaCl或者纯化用水，按比例1：3(g/ml)混合，使用匀浆机(FLUKO)将酵母细胞与清洗缓冲充分打匀，随后通过高速离心(SORVALLRC6PLUS)8000rpm，5min分离细胞和清洗上清。重复以上操作二遍，即完成细胞的清洗。

破碎：将清洗后的细胞加入破菌缓冲液(100mM MOPS，0.75M NaCl，0.05％ Tween-80，pH7.0)，按1：5(g/ml)的比例混合，用匀浆机(FLUKO)将酵母细胞与破菌缓冲液充分混匀。使用高压均质机(ATSAH110B)在压力1200～1300bar的操作压力下破碎以上经过匀浆的细胞悬液，重复4遍，4℃～8℃出口冷却，使90％的细胞破碎。

澄清：将经过高压破碎的破菌液倒入离心杯中，通过高速离心去除细胞碎片，收集离心上清用于随后的柱层析分离。使用的离心机：SORVALLRC6PLUS，转子型号：FIBERLITEF10-6x500y，离心设置：9000rpm，30min，10℃。

初纯：使用层析介质POROS50HS(Applied Biosystems)装柱(直径26mm，高度10，体积50ml)。通过以下步骤进行纯化：清洗消毒：0.5M NaOH清洗2个柱体积；再生平衡：缓冲液B(1.5M NaCl，50mM MOPS pH7.0，0.05％ Tween-80)清洗2个柱体积，缓冲液A(50mM MOPS，0.75M NaCl，0.05％ Tween-80，pH7.0)平衡层析柱；上样：将经过离心澄清的破菌上清，以流速4ml/min的速度上样；淋洗：缓冲液(50mM MOPS，0.75M NaCl，0.05％ Tween-80，pH7.0)淋洗5个柱体积，至基线平稳。洗脱：100％缓冲液A至100％的缓冲液B的线性梯度洗脱。洗脱流速10ml/min，洗脱总体积为6个柱体积。收集电导在70～100ms/cm的层析峰，放在4℃保存收集。

精纯：使用层析介质CHT陶瓷羟磷灰石(BIO-RAD，TypeII，40um)装柱(直径26mm，高度10cm，体积50ml)。通过以下步骤进行纯化：清洗消毒：0.5M NaOH清洗2个柱体积；再生平衡：缓冲液B(50mM MOPS，0.5M NaCl，0.2M NaH₂PO₄，0.05％ Tween-80，pH＝7.0)清洗2个柱体积，缓冲液A(50mM MOPS，0.5M NaCl，0.04M NaH₂PO₄，0.05％ Tween-80，pH7.0)平衡层析柱。上样：将经过初纯后收集的样品加入PB至终浓度为30mM，以流速10ml/min的速度上样；淋洗：缓冲液A淋洗5个柱体积，至基线平稳。洗脱：100％缓冲液A至100％的缓冲液B的线性梯度洗脱。洗脱流速8ml/min。收集：分部收集洗脱组分，将含有截短型HPV 18 L1 VLPs的组分合并，即为最后的纯化样品。经过还原性SDS-PAGE(Bio-RAD)(见图5)，纯度>90％。Western blot(Bio-RAD)检测的电泳目的条带可与HPV 18 L1VLPs的单抗或多抗呈特异性的显色反应(见图6)。经过动态光散射(MalvernInstruments Zetasizer Nano ZS)的检测纯化样品颗粒范围在50～80nm左右，经过电镜(Philips Tecnai-12Biotwin透射电子显微镜，上海中医药大学科技中心电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒，颗粒直径在50～80nm之间，见图7。实施例3中表达的全长HPV 18L1蛋白经过相同方法纯化后也可获得VLPs纯化样品，经过动态光散射和电镜检测，形成的颗粒大小与截短型HPV 18L1蛋白颗粒相同，颗粒直径在50～80nm之间。

实施例6  HPV 18 L1基因的在毕赤酵母中发酵表达量的检测

用纯化的截短型HPV 18 L1蛋白做标准蛋白浓度曲线，以诱导前菌体做阴性对照，采用ELISA夹心法检测截短型HPV 18 L1基因在毕赤酵母中发酵表达量，具体步骤如下：

用包被液2000倍稀释截短型HPV 18 L1蛋白免疫的兔多抗，向酶标板的凹孔中各加入0.1mL稀释后的兔多抗(1:2000，上海普欣生物技术有限公司制备)，于4℃过夜后，移去包被液，并用0.3mL PBST洗涤凹孔，然后用0.3mL封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时，进行封闭。

用稀释液以对倍稀释的方式，将纯化的截短型HPV 18 L1蛋白从浓度2μg/mL梯度稀释到0.0625μg/mL，同时将获得的发酵菌体的破菌上清分别稀释200倍，然后分别向凹孔中加入0.1mL梯度稀释后不同浓度的截短型HPV 18 L1蛋白溶液或稀释后的破菌上清，于37℃保温1小时后，移去抗原液，并用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；然后用稀释缓冲液将MAB885鼠单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中，每孔各0.1mL，37℃保温1小时后，移去单抗溶液后，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；再向凹孔中加入用稀释缓冲液5000倍稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各0.1mL，在37℃保温0.5小时后，移去酶标液，并用0.3mL洗涤液洗涤凹孔后，向凹孔中各加入0.1mL DAB显色液，室温下作用20分钟后，向每个凹孔中加入0.05mL2M H₂SO₄终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定OD₄₅₀值。

利用梯度稀释的截短型HPV 18 L1的OD₄₅₀的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算获得截短型HPV 18 L1蛋白的发酵表达量，结果如表2所示，其中：

用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度，例如：2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，0.125μg/mL，作为标准浓度，通过ELISA检测，用浓度做纵坐标，对应OD₄₅₀检测值做横坐标，建立标准线性回归方程。

发酵破菌液上清稀释一系列倍数，例如50，100，200，400倍。测出的OD₄₅₀值通过标准线性回归方程求得对应浓度(单位为μg/mL)，再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。由于破菌液是由菌体湿重：破菌缓冲液＝1：5配制的，所以发酵菌体的目的蛋白表达量(单位为μg/g菌体)为5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。再乘以发酵液菌体密度(单位为g菌体/L发酵液)，则为发酵目的蛋白表达量浓度(单位为μg/L发酵液)。

发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)＝稀释倍数×标准目的蛋白浓度(μg/mL)×OD₄₅₀(发酵破菌液上清)/OD₄₅₀(标准目的蛋白浓度)；

发酵目的蛋白表达量浓度(μg/L发酵液)＝5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)×发酵液菌体密度(g菌体/L发酵液)。

表2 截短型HPV 18 L1基因的在毕赤酵母中发酵表达量的检测

实施例7  重组全长或截短型HPV 18 L1VLPs的免疫原性ELISA间接法检测

HPV 18 L1疫苗的制备：参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法，将实施例5中纯化获得的截短型HPV 18 L1 VLPs吸附铝佐剂，获得具有免疫原性的截短型HPV 18 L1疫苗。同时，将实施例4中表达的全长HPV 18L1蛋白纯化后吸附铝佐剂，获得具有免疫原型的全长HPV 18L1疫苗。

免疫程序：选取6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，合格证号：SCXK(沪)2003-0003，分为4组，每组6只小鼠。第1组小鼠均用含有铝佐剂的缓冲液进行免疫，其它3组分别免疫0.1ml浓度为5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml的吸附铝佐剂的实施例5制得的HPV 18 L1VLPs，采用皮下注射免疫，第0、7、21天免疫三次，免疫后两周采血。将采集的血液置37℃放置2h，4000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，存放于-20℃。

鼠血清阳转率：用包被液稀释抗原(即实施例5制得的纯化的毕赤酵母表达的HPV 18 L1 VLPs)至最适浓度1μg/ml各0.1ml加于酶标板每个凹孔中，4℃过夜。移去包被液，凹孔用0.3ml洗涤液PBST洗涤。用封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)0.3ml封闭，37℃保温2小时。每凹孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以1：400稀释的被检血清(免疫过HPV 18 L1和铝佐剂的鼠血清)各0.1ml，37℃保温1小时。移去血清液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。每凹孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的酶标抗(HRP标记的羊抗小鼠IgG)0.1ml，37℃保温0.5小时。移去酶标液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。加入0.1mlDAB显色液于每个凹孔，室温避光作用20分钟。每凹孔加2M H₂SO₄ 0.05ml终止。用酶标比色仪测定OD₄₅₀值。cutoff值为检测阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的OD₄₅₀值的平均值加上3倍标准差。根据cutoff值判断鼠血清抗体阳转率。采用终点滴度法计算血清的滴度值，其见表3，表4。

表3 截短型HPV 18L1鼠血清阳转率

 

	5μg免疫组	0.5μg免疫组	0.05μg免疫组
				阳转率	100％	100％	100％

表4 全长HPV 18L1鼠血清阳转率

 

	5μg免疫组	0.5μg免疫组	0.05μg免疫组
				阳转率	100％	100％	100％

鼠血清滴度测定：用包被液稀释抗原(本发明中纯化的毕赤酵母表达的截短型或全长的HPV18 L1蛋白)至最适浓度1μg/ml各0.1ml加于酶标板每个凹孔中，4℃过夜。移去包被液，凹孔用0.3ml洗涤液PBST洗涤。用封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)0.3ml封闭，37℃保温2小时。被检血清(免疫过本发明截短型或全长HPV 18L1的鼠血清)用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)从1：500稀释到1：32000，阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)以1：10000稀释，每凹孔分别加入0.1ml，37℃保温1小时。移去血清液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。每凹孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的酶标抗(辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG)0.1ml，37℃保温0.5小时。移去酶标液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。加入0.1ml DAB显色液于每个凹孔，室温作用20分钟。每凹孔加2M H₂SO₄0.05ml终止。用酶标比色仪测定OD₄₅₀值。cutoff值为检测阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的OD₄₅₀值的平均值加上3倍标准差。表5，表6是该测定值。其中的结果可见本发明制得的截短型或全长HPV 18 L1蛋白病毒样颗粒吸附铝佐剂后，免疫小鼠，能产生高效价的抗HPV L1抗体，本发明HPV 18 L1蛋白具有高免疫原性。

表5 截短型HPV 18L1鼠血清滴度测定值

表6 全长HPV 18L1鼠血清滴度测定值

实施例8  假病毒中和实验检测小鼠截短型HPV 18 L1抗体的中和活性

小鼠免疫程序同实施例7，免疫后两周采血。将采集的血液置37℃放置2h，4000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，存放于-20℃。

将293FT细胞(Invitrogen)预先铺于15cm细胞培养皿(1.1×10⁷细胞/dish)，24h后将质粒p18L1h，p18L2h(Buck CB，Pastrana DV，Lowy DR et al.Efficient Intracellular Assembly of Papillomaviral Vectors.J Virol，2004，78(2)：751-757)和带绿色荧光基因的pIRES2-EGFP(购自BD BiosciencesClontech)用磷酸钙方法进行共转染，用量分别为20μg、10μg、10μg。48h后进行观察并收集和裂解细胞，将收集的细胞裂解上清立即用于纯化或置-80℃保存。

在5ml离心管(Beckman)中用30％O pti Prep密度梯度离心纯化收集的细胞裂解液，16℃下100,000g离心4h(MLS-50转头，Beckman超速离心机)，分部收集离心组分，每份约500μl，以蛋白印迹实验方法检测各组分中的HPV 18 L1蛋白含量，将L1蛋白浓度最高的组分合并，作为假病毒液，分装后-80℃保存。

将293FT细胞铺于24孔细胞培养板中(1.5×10⁵细胞/well)。24h后进行中和实验，将不同的血清样本分别用DMEM培养基从100倍起进行连续倍比稀释，然后取50μl分别与50μl稀释于DMEM培养基的假病毒液混合，4℃孵育1h后分别加入预铺有293FT细胞的24孔细胞培养板中，37℃培养48h后用OLUMPUSCKX41F32FL倒置荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞并采集荧光图像，见图8a和图8b。图8a有荧光，表明HPV18假病毒感染了293FT细胞。图8b只剩极少荧光，表明鼠血清中和了HPV18假病毒，降低了293FT细胞的感染。由此可见小鼠重组HPV18L1抗体具有中和活性，能够阻止假病毒进入细胞。

本发明也可以将核苷酸序列SEQ ID NO.2～3替换实施例2中的SEQ IDNO.1，按照实施例2～5的制备过程制备本发明的HPV 18 L1蛋白；也可以将上述基因克隆至现有其它毕赤酵母表达载体，如pPIC6、pGAPZ或pAO815，并选择与之相应的克隆方式，然后将重组表达载体转化其它毕赤酵母细胞，如Pichia pastoris GS115、KM71或SMD1168菌株，构建基因工程菌，按照常规技术培养发酵、分离纯化得到本发明的HPV 18 L1蛋白(HPV18L1VLPs)，这些技术为本领域技术人员所知，在此不详述。制得的HPV 18L1蛋白也具有与上述实施例5制得HPV 18 L1蛋白相类似的免疫原性。

序列表

<110>上海泽润生物科技有限公司

<120>用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法

<130>P4-071431C

<160>9

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1707

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>适用毕赤酵母偏好密码子的全长HPV 18 L1蛋白基因的核苷酸序列

<400>1

<210>2

<211>1707

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>适用毕赤酵母偏好密码子的全长HPV 18 L1蛋白基因的核苷酸序列

<400>2

<210>3

<211>1707

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>适用毕赤酵母偏好密码子的全长HPV 18 L1蛋白基因的核苷酸序列

<400>3

<210>4

<211>1524

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>适用毕赤酵母偏好密码子的N端缺失61个氨基酸的截短型HPV 18L1蛋白基因的核苷酸序列

<400>4

<210>5

<211>1524

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>适用毕赤酵母偏好密码子的N端缺失61个氨基酸的截短型HPV 18L1蛋白基因的核苷酸序列

<400>5

<210>6

<211>1524

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>适用毕赤酵母偏好密码子的N端缺失61个氨基酸的截短型HPV 18L1蛋白基因的核苷酸序列

<400>6

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>引物

<400>8

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>引物

<400>9

Claims (9)

1、一种利用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白的方法，其包括将优化设计的HPV 18 L1基因克隆至表达载体，转化毕赤酵母菌株，培养转化体，获得重组的HPV 18 L1蛋白；其中，所述的优化设计的HPV 18 L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的表达载体选自质粒pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pAO815。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的转化用电转化或原生质体转化。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的毕赤酵母菌株选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征是，将所述的优化设计的HPV 18L1基因克隆至质粒pPICZ，得到重组表达质粒，然后电转化毕赤酵母X-33株，筛选得到基因工程菌，经发酵培养，破菌、离心、柱层析纯化得到重组的HPV18L1蛋白。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的柱纯化包括采用POROS50HS柱层析初纯，再经过CHT柱层析精纯。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的重组的HPV 18 L1蛋白能在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒。

8、一种制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法，其特征是，包括采用权利要求1～7任一项所述的方法制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白病毒样颗粒，然后加入药学上可用的疫苗佐剂。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述的药学上可用的疫苗佐剂为铝佐剂。

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