CN102181426A - 人乳头瘤病毒16和18型l1蛋白在酵母中的表达及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括下列步骤：优化编码HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列；将优化后的基因序列分别克隆入酵母表达载体以获得重组载体；用所述重组载体分别转化酵母细胞，并诱导酵母细胞高效表达L1蛋白；回收和纯化表达的HPV16和HPV18 L1蛋白，并将其与佐剂混和制备成二价疫苗。本发明还提供了分离的核酸分子，其含有经优化的编码HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列，以及含有此类核酸分子的载体，和含有此类载体的细胞。

Description

人乳头瘤病毒16和18型L1蛋白在酵母中的表达及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，且涉及人乳头瘤病毒16和18型L1蛋白在酵母，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中的表达及其疫苗制备方法。

背景技术

世界卫生组织(WHO)的统计资料表明，宫颈癌是严重危害妇女健康的侵染性疾病，其发病率仅次于乳腺癌，居全世界女性恶性肿瘤第二位，在一些发展中国家甚至居于首位。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年约有50万名妇女罹患宫颈癌，且有将近30万名妇女死于宫颈癌，其中，80％的死亡病例发生在发展中国家。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13.8万，每年约有5万人死于宫颈癌，且发病率呈逐年上升、年轻化的趋势。在1995年，WHO已将人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染确定为宫颈癌的致病病因。几乎所有的宫颈癌都由HPV引起，其中高达99.7％的宫颈癌患者都存在HPV感染，且超过2/3的宫颈癌病例由HPV 16型和18型引起。

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，其具有高度的特异性。HPV是一组病毒的总称，其组成一个科，其中各病毒的形态类似，但DNA限制性内切酶图谱不同，核壳体蛋白质的抗原性不同。目前已经确定的HPV型别大约有160余种，依其感染的上皮所在的部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，其中大约35种型别可感染妇女生殖道，大约20种与肿瘤相关。依据HPV导致肿瘤的危险性的高低，将HPV分为低危险型别HPV和高危险型别HPV。低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，其通常引起外生殖 器湿疣等良性病变，包括宫颈上皮内低度病变(CINI)。高危险型别HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别。高危险型别HPV，特别是HPV16和18型，与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN II/III)的发生相关。

近十几年来，HPV疫苗研究可以分为两类，即预防性疫苗研究和治疗性疫苗研究。预防性疫苗一般以HPV16主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原，其作用在于诱发机体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫应答，以阻止HPV的长期感染和再感染。HPV的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或形成病毒样颗粒(VLP)，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似。VLP能与细胞受体结合并进入细胞，从而有利于抗原的加工呈递以及诱发较强的细胞免疫。治疗性疫苗通常是以经修饰的HPV16早期蛋白(其转化活性被去除，但仍保留抗原性)作为靶抗原，它可诱导特异性的细胞免疫应答，从而可用于控制或消除感染HPV的良性和恶性病灶，并可作为这类疾病的手术后的辅助治疗。在大多数与HPV16相关的宫颈癌及其癌前病变中，HPV16的E6和E7蛋白持续表达，而这种持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，并且正常组织中不存在这两种蛋白。因此，E6和E7蛋白为用于HPV16相关宫颈癌及癌前病变的治疗性疫苗的理想靶抗原。针对中晚期宫颈癌病人手术后残留的肿瘤细胞，可应用这种治疗性疫苗，以通过激发病人的细胞免疫来杀伤、清除这些肿瘤细胞和已感染的上皮细胞，从而防止或限制肿瘤的复发和扩散。预防性和治疗性HPV疫苗的作用也有交叉。例如，在良性疣和轻度CIN病变中存在HPV晚期蛋白的表达，因此，预防性疫苗对这些疾病也有一定治疗作用。近年来研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等，同时具备预防和治疗双重作用。

HPV疫苗在预防导致宫颈癌的持续性感染方面，有效率达到100％，它能将宫颈癌发生率降低75％，安全性好。目前国际上已有多个HPV16候选疫苗进入I/II期临床试验，这种疫苗将会拯救成千上万的妇女的生命，因此对妇女的健康产生重大影响。

默克公司于1991年从澳大利亚CSL公司获得专利授权，通过使用酿酒酵母表达，制备了针对HPV 6、11、16和18型的四价HPV疫苗。而葛兰素史克公司的HPV疫苗技术来源于MedImmune公司，该疫苗为2价疫苗，商品名为“Cervarix”(预防16、18型)，其使用昆虫细胞进行表达。这两种疫苗均可以迅速使受试动物产生对HPV病毒的中和抗体，并且对人畜安全，能够有效预防治疗HPV病毒所导致的各种疾病，特别是梅毒和宫颈癌。这些技术已在国际权威专业杂志上公开发表、部分内容已经获得美国等多个国家专利保护。

瑞士洛桑大学研究人员最近研究出一种治疗宫颈癌的喷雾剂疫苗，其效果与注射疫苗相同。通过吸入该喷雾剂疫苗，可以刺激并产生针对这种病毒的抗体，其效果与注射疫苗一样。这种喷雾剂使用方便，疗程短。病人只需使用两次，其间间隔2周，而注射疫苗需要注射3次，并且耗时6个月。

2004年还报道，一种基于7种人乳头瘤病毒(HPV)的有效疫苗可以预防全球的多数宫颈癌。然而，它的费用很高，而且针对一些不太常见的HPV亚型，其提供的保护作用也很难清楚地证实。考虑到成本问题，针对2种(HPV16、18)或3种(HPV16、18和45)最常见亚型的疫苗可能更便宜，也更现实。特别地，抗HPV16和HPV18的疫苗非常有意义，因为其可以预防70％的宫颈癌。

为此，本发明基于我国流行的高致病性HPV16/18型毒株的L1蛋白氨基酸序列，开发了新的HPV16/18二价疫苗的制备方法，其对于大规模生产HPV16/18二价疫苗以及对于我国妇女的宫颈癌预防具有重要的现实意义。

发明内容

人乳头瘤病毒的主要衣壳蛋白L1基因在原核和真核表达后能够自我装配或形成病毒样颗粒(VLP)，从而能与细胞受体结合诱发细胞免疫。因此，L1蛋白是预防宫颈癌的最有价值的靶抗原。本发明以我国流行的高致病性HPV16和18两种亚型的主要衣壳蛋白L1基因作为研 究对象，开发了新的HPV16/18二价疫苗的制备方法。利用该方法，本发明实现了HPV16和HPV18的主要衣壳蛋白L1的高表达，并且获得了生物学性状较好的VLP，其具有优良的抗原性和免疫原性。这对于大规模生产HPV16/18二价疫苗以及对于我国妇女的宫颈癌预防有重要的现实意义。

因此，在一个方面，本发明提供了制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)分别优化编码HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列，以获得经优化的HPV16和HPV18 L1基因序列；

2)将步骤1)中经优化的HPV16和HPV18 L1基因序列分别克隆入酵母表达载体，以获得重组载体；

3)用步骤2)中获得的重组载体分别转化酵母细胞，并诱导酵母细胞表达HPV16和HPV18的L1蛋白；

4)从步骤3)的酵母细胞分别分离和纯化HPV16和HPV18的L1蛋白，并将获得的HPV16和HPV18 L1蛋白与佐剂混合制备成二价疫苗。

在一个优选实施方案中，经优化的HPV16和HPV18的L1基因序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的酵母表达载体是pYES2。

在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的酵母细胞是酿酒酵母，更优选是酿酒酵母INVSc1或H158。

在一个优选实施方案中，本发明的方法将经分离纯化的HPV16和HPV18 L1蛋白吸附至佐剂上，以制备二价疫苗。在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的佐剂是氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂。

在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含经优化的HPV16或HPV18 L1基因序列。优选，本发明的分离的核酸分子包含SEQID NO.1或2所示的序列。

在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子的载体。优选，本发明的载体是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的 载体适合于在酵母细胞中，特别是酿酒酵母例如酿酒酵母INVSc1或H158细胞等中表达，其优选是酵母表达载体，更优选是pYES2。

在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的细胞。在一个优选实施方案中，本发明的细胞是酵母细胞，优选是酿酒酵母，更优选是酿酒酵母INVSc1或H158。

在一个方面，还提供了本发明的分离的核酸分子用于制备二价疫苗的用途，所述二价疫苗用于预防HPV16和HPV18的感染。

在一个方面，还提供了本发明的分离的核酸分子用于制备HPV16或HPV18的L1蛋白的用途。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)所制备的疫苗针对我国流行的高致病性HPV16/18型毒株，有助于预防我国妇女的宫颈癌；

(2)在疫苗的制备过程中，对编码HPV16/18 L1蛋白的基因序列进行了优化，有助于提高L1蛋白在酵母细胞中的表达水平，从而对于大规模生产HPV16/18二价疫苗以及对于HPV疫苗的临床应用具有重要的现实意义。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图概述

图1显示pYES16-L1和pYES18-L1的双酶切鉴定。其中，泳道1：pYES16-L1的Hind Ⅲ和BamH I双酶切产物；泳道2：pYES18-L1的HindⅢ和BamHI双酶切产物；泳道3：DNA分子量标准。

图2显示酿酒酵母表达的HPV16和HPV18 L1蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：诱导表达0小时的用pYES16-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液；泳道3：诱导表达6小时的用pYES16-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液；泳道4：诱导表达0小时的用pYES18-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液；泳道5：诱导表达6小时的用pYES18-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液。

图3显示酿酒酵母表达的HPV16和HPV18 L1蛋白的蛋白质印迹(Western blot)鉴定。其中，泳道1：诱导表达0小时的用pYES16-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液；泳道2：诱导表达6小时的用pYES16-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液；泳道3：诱导表达0小时的用pYES18-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液；泳道4：诱导表达6小时的用pYES18-L1转化的酿酒酵母的细胞裂解液；泳道5：蛋白质分子量标准，从上到下分别为175kD，83kD和62kD。

图4显示纯化的HPV16和HPV18 L1蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道A1：蛋白分子量标准；泳道A2：纯化的HPV16 L1蛋白；泳道B1：蛋白分子量标准；泳道B2：纯化的HPV18 L1蛋白。

图5是HPV16和HPV18 L1的透射电镜照片。其中，图5A显示HPV16L1的VLP；图5B显示HPV18 L1的VLP。

图6显示制备的假病毒感染293FT细胞后的细胞内荧光。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

实施例1.编码HPV16/18的L1蛋白的基因序列的优化

我国流行的高致病性HPV16和HPV18型毒株的L1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和8所示。

使用市售可得的软件OptimumGene^TM对HPV16和HPV18的L1基因序列进行优化，以提高L1基因在酵母，特别是酿酒酵母中的表达水平。 其中，优化后的HPV16 L1基因序列如SEQ ID NO.1所示；优化后的HPV18 L1基因序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2.pYES16-L1和pYES18-L1重组载体的构建

利用引物对5′-CGCAAGCTTATGCAAGTTACTTTTATTTAT-3′(SEQ ID No.3)和5′-CGCGGATCCTTACAATTTTCTTTTTTTTCTTTTAG-3′(SEQ ID NO.4)；5′-CGCAAGCTTATGTGTTTGTATACTAGAGTTTTG-3′(SEQ ID NO.5)和5′-CGCGGATCCTTATTTTCTAGCTCTAAC-3′(SEQ ID NO.6)，通过PCR分别扩增人工合成的经优化的HPV16和HPV18 L1基因。PCR反应条件为95℃预变性5分钟；30个循环的95℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增后，获得两端分别带有Hind Ⅲ和BamH I限制性内切酶酶切位点的L1基因片段。

使用商购可得的Hind Ⅲ和BamH I(例如购自宝生物工程(大连)有限公司)对L1基因片段和酵母载体pYES2(来源于美国Invitrogen公司)分别进行双酶切，于37℃进行3小时(1μg的L1基因片段或pYES2载体，加入10U Hind Ⅲ和10U BamH I)。将酶切后的HPV16和HPV18 L1基因片段分别插入到同样经过Hind Ⅲ和BamH I酶切的酵母载体pYES2中。连接的反应体系为：L1基因片段100μg，载体150g，T4 DNA连接酶1U；反应条件为16℃连接过夜。用连接后的载体分别转化大肠杆菌(E.coli)，然后经克隆筛选、增菌培养和质粒抽提获得包含目的基因片段的重组载体。所获得的重组载体通过Hind Ⅲ和BamH I双酶切进行鉴定。

如图1所示，获得了包含目的基因片段的重组载体HPV 16L1-pYES 2(简称pYES 16-L1)和HPV18L1-pYES 2(简称pYES 18-L1)。

实施例3.HPV16/18L1蛋白在酿酒酵母中的诱导表达及鉴定

将pYES 16-L1和pYES 18-L1重组载体分别电穿孔转化到酿酒酵母I NVSc 1株(来源于美国Inv i t rogen公司)宿主细胞中。简言之，将酿酒酵母I NVSc 1在YPD培养液(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖) 中30℃震荡培养18小时；当OD600约为1.4时，以5000rpm离心培养物5分钟，弃上清，并且沉淀的酵母细胞用预冷的无菌水洗涤2次，再用预冷的1M山梨醇洗涤2次，然后重悬浮于预冷的1M山梨醇中，从而获得酿酒酵母感受态细胞。使用电穿孔仪(BIO-RAD公司的Xcell仪器)，用5μg pYES16-L1或pYES18-L1重组载体转化100μl酿酒酵母感受态细胞。使用的参数为：电压1500v，电容25μF，电阻200Ω，电转杯2mm。转化后，取出电转物，并涂布在SC-U缺陷培养基(参见Invitrogen公司的pYES2产品操作手册)中，30℃培养3天，以获得阳性菌落pYES16-L1/INVSc1和pYES18-L1/INVSc1。将阳性菌落转接到诱导培养基(SC-U培养基加20％半乳糖和10％棉子糖)中，于30℃下培养6小时。之后，5000rpm离心培养物5分钟，收集沉淀的酵母，并用PBS缓冲液清洗和重悬。加入酸洗玻璃珠(sigma公司产品)，剧烈振荡30秒，冰浴30秒，如此重复4次以破碎酿酒酵母细胞。破碎后，12000rmp离心10分钟。取上清，加入10×上样缓冲液，并在沸水浴中温育10分钟。温育后，取10μl样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果显示，重组酵母表达分子量为59.4KD的HPV16L1蛋白和分子量为63.7KD的HPV18 L1蛋白(参见图2)。通过用软件Quatity One分析发现，HPV16 L1蛋白占酵母细胞总蛋白的1.5％，HPV18 L1蛋白占酵母细胞总蛋白的2.0％。

实施例4.通过Western印迹来检测重组HPV16/18 L1蛋白

分别使用抗HPV16 L1抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，sc-18052)和抗HPV18 L1抗体(abcam公司，ab31492)作为一抗，使用HRP-anti-IgG(KPL公司，100366)作为二抗，通过Western印迹来检测表达的HPV16和HPV18 L1蛋白。Western印迹结果显示，分子量为59.4KD的HPV16 L1蛋白和分子量为63.7KD的HPV18 L1蛋白的特异性蛋白带(参见图3)，这表明酿酒酵母表达了HPV16和HPV18L1蛋白，并且所表达的HPV16和HPV18 L1蛋白具有良好的抗原性。

实施例5.重组酿酒酵母在发酵罐中的培养和诱导表达

将重组的酿酒酵母菌株pYES16-L1/INVSc1和pYES18-L1/INVSc1分别接种到5ml SC-U培养液中，在30℃，220rpm下振荡培养24小时。然后按1％转接到1000ml的SC-U培养液中，在30℃，220rpm下继续振荡培养约24小时(OD600达到1-3)。然后按10％转接到发酵罐(NBS公司)中，其中10L培养液为SC-U+5％葡萄糖，补料液为2倍浓度的SC-U和10％葡萄糖，补充氨水以将发酵液pH值维持在6.0，发酵温度为30℃，初始转速为300rpm，溶氧控制在40％。当菌体湿重达到50g/L时，停止补加葡萄糖液。当发酵液中的葡萄糖含量为零(用葡萄糖试剂盒测定)时，继续发酵30分钟，然后补加半乳糖。用半乳糖试剂盒测定发酵液中的半乳糖含量，将其维持在2％以进行外源蛋白的诱导表达。诱导24小时后，离心收集重组酵母。

实施例6.HPV16/18 L1蛋白的分离纯化

以1∶5(W/V)比例将酵母细胞重悬浮于PBS中，4℃预冷后混合均匀。采用高压均质机(丹麦APV公司)，在压力为65Mpa的条件下破菌4～6次。破菌结束后，取少量菌液涂片染色，并显微镜观察酵母是否破碎完全。随后以10000g离心40分钟，弃沉淀，收集上清，作为下一步纯化的原料。

向收集的上清液(5ml)中加入5.2克固体CsCl，并用缓冲液A(50mM Tris，pH 8.0；1M NaCl；10mM MgCl₂；10mM CaCl₂；2mM PMSF；10ug/ml Leupeptin)将体积调整到13ml(CsCl终浓度为0.4g/ml)。然后以100000g 4℃离心22小时，从而得到经纯化的HPV16和HPV18 L1蛋白。

也可通过蔗糖密度梯度离心纯化HPV16和HPV18 L1蛋白。重组蛋白带出现在50-60％的蔗糖密度梯度上。具体的纯化方法如下：将上清液铺于30％的蔗糖溶液(溶于TBS中)上，以150000g，4℃离心6小时；获得的沉淀用50mM Tris-100mM NaCl重悬浮，并铺于20％-60％的蔗糖密度梯度溶液(溶于50mM Tris-100mM NaCl中)上，以150000g，4℃ 离心22小时；吸出目的灰白区带，并用PBS稀释，然后通过100000g，4℃离心90分钟来沉淀纯化的HPV16/18 L1蛋白。

实施例7.HPV16/18 L1蛋白的形态观察

取经纯化的HPV16/18 L1蛋白液，滴铜网，用2％磷钨酸染色，并通过透射电镜进行观察。结果表明，HPV16/18 L1蛋白呈现为病毒样颗粒(Virus-like particles，VLP)，其直径约为52nm(参见图5)。

实施例8.用重组HPV16/18 L1蛋白免疫动物

用Bio-Rad Protein Assay试剂盒定量纯化的HPV16和HPV18 L1蛋白。分别将0.1μg、2μg或20μg的HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白吸附至0.5mg Al(OH)₃，以制备成三种剂量的HPV二价疫苗。使用制备的HPV二价疫苗，分别于0、2、4周通过肌肉注射来免疫Balb/c小鼠三次。最后一次免疫后三天，处死小鼠，并收集血清。

实施例9.HPV16/18假病毒颗粒的制备

分别将HPV16和HPV18的L1和L2基因(HPV16 L2基因的GeneBank登录号AF084952，HPV18 L2基因的GeneBank登录号DQ003068)克隆入pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)，以构建pcDNA3.1-16L1、pcDNA3.1-16L2、pcDNA3.1-18L1和pcDNA3.1-18L2重组载体。将pcDNA3.1-16L1和pcDNA3.1-16L2共转染293FT细胞(购买于美国ATCC)；将pcDNA3.1-18L1和pcDNA3.1-18L2共转染293FT细胞。所得的细胞在37℃培养3-5天。收获细胞并反复冻融三次，进行氯仿抽提，并收集上清液。所得的上清液即为HPV16假病毒(pseudovirus 16，psV16)和HPV18假病毒(pseudovirus 18，psV18)颗粒，冻存备用。在96孔板培养的293FT细胞上对制备的假病毒psV16和psV18进行滴度测定。简言之，取假病毒种子液进行10倍系列稀释，每个稀释度接种8个培养孔；接种后的细胞在37℃培养5天，然后于荧光显微镜下观察每个培养孔的细胞内的荧光(参见图6)，计算假病毒的滴度。

实施例10.HPV16/18 L1蛋白的免疫原性分析

用纯化的HPV16/18 L1蛋白(于碳酸盐缓冲液中)过夜4℃包被96孔板。然后用PBST溶液(PBS溶液+0.5％ Tween-20)洗涤板三次，加入PBS稀释的小鼠血清，37℃孵育1小时。孵育后，用PBST溶液洗涤板三次，加入HRP标记的抗小鼠IgG抗体(购买于KPL公司)，37℃孵育1小时。孵育后，用PBST溶液洗涤板三次，加入OPD底物显色液(柠檬酸0.51％，Na₂HPO₄·12H₂O 1.84％，邻苯二胺(OPD)0.05％，H₂O₂50μl)，避光显色10分钟。之后用2N H₂SO₄终止反应，并用酶标仪(BIO-RAD公司)测定492nm处的OD值。结果显示，HPV16/18L1蛋白可以诱导机体产生特异性抗体，这表明重组HPV16/18L1蛋白具有良好的免疫原性(参见表1和2)。

将小鼠血清按1∶500稀释，将稀释液分别与100 PFU的假病毒psV16和psV18混和，并在37℃温育1小时。温育后，将假病毒加入到单层的293FT细胞上，并在37℃吸附1小时。吸附后，于37℃继续培养细胞7天。最后，通过荧光显微镜观察293FT细胞内的荧光。结果显示，抗HPV16/18 L1蛋白的小鼠血清可以与假病毒psV16和psV18结合，并抑制假病毒进入293FT细胞内产生荧光，这表明小鼠血清中含有抗HPV16/18 L1蛋白的中和抗体，其能够保护机体免受HPV16/18型病毒的感染(参见表1和2)。

表1.HPV16 L1疫苗的免疫原性测定

表2.HPV18 L1疫苗的免疫原性测定

Claims (8)

1.制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)分别优化编码HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列，以获得经优化的HPV16和HPV18 L1基因序列，优选经优化的HPV16和HPV18的L1基因序列分别如SEQ ID NO.1和2所示；

2)将步骤1)中经优化的HPV16和HPV18 L1基因序列分别克隆入酵母表达载体，以获得重组载体，优选所述酵母表达载体是pYES2；

3)用步骤2)中获得的重组载体分别转化酵母细胞，并诱导酵母细胞表达HPV16和HPV18的L1蛋白，所述酵母细胞优选是酿酒酵母，更优选是酿酒酵母INVSc1或H158；

4)从步骤3)的酵母细胞分别分离和纯化HPV16和HPV18的L1蛋白，并将获得的HPV16和HPV18 L1蛋白与佐剂混合制备成二价疫苗，所述佐剂优选是氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂。

2.分离的核酸分子，其序列如SEQ ID NO.1所示。

3.分离的核酸分子，其序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3的核酸分子的载体，所述载体优选是表达载体，更优选是酵母表达载体，更优选是pYES2。

5.含有权利要求2或3的核酸分子或权利要求4的载体的细胞，所述细胞优选是酵母细胞，更优选是酿酒酵母，更优选是酿酒酵母INVSc1或H158。

6.权利要求2和/或3的核酸分子用于制备二价疫苗的用途，所述二价疫苗用于预防HPV16和HPV18的感染。

7.权利要求2的核酸分子用于制备HPV16的L1蛋白的用途。

8.权利要求3的核酸分子用于制备HPV18的L1蛋白的用途。

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