CN115927426A

CN115927426A - 多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用

Info

Publication number: CN115927426A
Application number: CN202210877323.3A
Authority: CN
Inventors: 江金飞; 陈爱华; 孙娟; 赵一珊; 周梦若; 谢倩梅; 代绘琳; 许斯祺; 冯赛祥
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-07-25
Filing date: 2022-07-25
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-07-25
Also published as: CN115927426B

Abstract

本发明涉及多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用，属于生物技术领域，本发明首先构建含有多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因敲除盒与lacZ基因的重组表达载体，将所述重组表达载体导进改造目的菌株C48‑1株，分别通过利用温度敏感系统与蓝白斑筛选，方便高效地筛选出突变株。该方法实现了多杀性巴氏杆菌基因的成功敲除，并能够大幅度地减少了筛选突变株的时间和精力，达到高效快速地筛选突变株。

Description

多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种外源基因导入多杀性巴氏杆菌快速筛选系统及其构建方法和应用。

背景技术

禽多杀性巴氏杆菌为卵圆或短杆状的革兰氏阴性菌，其所引起的败血性传染病，以发热、腹泻、呼吸困难为特征，最急性病例迅速死亡，禽感染后表现为急性败血过程，因而又被称为禽霍乱。禽霍乱是一种接触性传染病，危害多种家禽、野禽。其特征表现为急性败血过程，发病率和死亡率都很高。低毒感染或急性发病之后，可出现慢性的、局部性的疾病。这是一种尚无很好防治方法而又造成重大经济损失的禽类疾病，在临床上，常用抗生素和疫苗来预防和治疗多杀性巴氏杆菌引起的疾病。然而，在国家禁抗政策下，目前市面上用于预防该病的疫苗仍然以传统的弱毒活疫苗和灭活疫苗为主，但禽多杀性巴氏杆菌抗原结构较为复杂，且易发生变异，导致目前商品化弱毒疫苗的免疫效果并不是特别理想。弱毒活苗还存在免疫期较短、免疫保护力偏低、局部及全身的反应偏大，可能存在散毒危险、残余毒力引起蛋鸡产蛋率下降等问题，而禽霍乱灭活疫苗的保护效果尚不及弱毒活疫苗，应用较少。在禁抗及兽用细菌疫苗存在不同血清型间交叉保护性差两大难关下，开发有效的巴氏杆菌疫苗有重要的现实意义。

关于防控禽多杀性巴氏杆菌病的基因工程疫苗，目前有多种经典遗传操作系统可选择用于构建禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株，如抗生素自杀系统，SacB选择系统，温敏自杀系统，galk选择系统，NgAgo/gDNA系统，CRISPR cas9基因编辑系统，但均敲除效率低或无法敲除。多杀性巴氏杆菌缺乏高效、简便的遗传操作工具是开发基因工程疫苗的重大难题。

发明内容

针对现有技术中多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株敲除效率低、筛选低效等问题，本发明将温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统相结合，建立了高效的巴氏杆菌基因编辑方法，成功构建出了多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因插入突变株，同时对重组菌株筛选方法进行改进与优化，能高效快速地筛选突变株。

本发明的第一方面，是提供一种用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的重组表达载体，所述重组表达载体是将lacZ基因和多杀性巴氏杆菌基因敲除盒整合到温度敏感载体中构建所得；所述多杀性巴氏杆菌基因敲除盒是将与目标基因同源的片段的上下臂与庆大抗性基因连接构成。

优选地，所述目标基因为glgB或opa基因。

更优选地，所述重组表达载体采用以下步骤制备：

步骤一、构建温度敏感载体pJJF01：合成温敏复制子Ts-ori，以pET28载体为模板扩增出卡那霉素抗性基因kan及大肠杆菌ColE1复制子，利用无缝连接的方法进行连接转化及筛选，获得温度敏感载体pJJF01；

步骤二、将步骤一所得温度敏感载体pJJF01线性化，扩增lacZ基因，然后将lacZ基因与线性化的温度敏感载体pJJF01连接，经转化、验证正确后，获得具有lacZ基因的温度敏感质粒pFSX001；

步骤三、扩增庆大霉素基因抗性片段；以多杀性巴氏杆菌基因组为模板，分别扩增包含目标基因上游区域和下游区域的DNA片段；将三个DNA片段通过重叠PCR进行连接，获得多杀性巴氏杆菌基因敲除盒；

步骤四、将步骤二所得具有lacZ基因的温度敏感质粒pFSX001线性化，然后与步骤三所得多杀性巴氏杆菌基因敲除盒DNA片段进行无缝连接，经验证正确后，获得用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的重组表达载体。

本发明的第二方面，是提供一种转化体，所述转化体是将上述重组表达载体转化宿主细胞所得。优选地，所述宿主细胞为多杀性巴氏杆菌。

本发明的第三方面，是提供一种用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的试剂盒，所述试剂盒包含上述的重组表达载体。

本发明的第四方面，是提供一种多杀性巴氏杆菌基因缺失突变体的筛选系统，所述筛选系统是将温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统相结合；所述筛选系统包括以下步骤：

步骤一、构建上述重组表达载体；

步骤二、将步骤一所述重组表达载体通过电击穿孔法导入多杀性巴氏杆菌，经筛选鉴定，获得阳性克隆子；

步骤三、利用温度敏感系统筛选发生第一次同源重组的单交换菌株：将步骤二所得阳性克隆子转接到含有卡那抗生素抗性的TSB培养基中，42℃高温摇菌16h以上后取菌液涂到含有卡那抗生素抗性的TSA平板上；通过鉴定、筛选所述重组表达载体与多杀性巴氏杆菌基因组发生第一次同源重组的单交换菌株；

步骤四、利用蓝白斑筛选原理筛选发生第二次同源重组的双交换菌株：将步骤三所得单交换菌株转接到无抗TSA平板上，置于30度培养箱连续传三代，再将第三代单交换菌株涂到同时含有庆大抗生素和X-Gal的TSA平板上，24小时后从平板上挑选出白色单菌落进行pcr鉴定，筛选发生第二次同源重组的双交换菌株，即突变株。

本发明的第五方面，是提供上述重组表达载体、转化体、试剂盒或筛选系统在多杀性巴氏杆菌基因敲除突变和突变株筛选中的应用。

有益效果：本发明成功构建了含有多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因片段与lacZ基因的重组质粒，将质粒导进改造目的菌株C48-1株，分别通过利用温度敏感系统与蓝白斑筛选，方便高效地筛选出突变株。该方法实现了多杀性巴氏杆菌基因的成功敲除，构建出了多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因插入突变株，并能够大幅度地减少了筛选突变株的时间和精力，达到高效快速地筛选突变株，与现有的对双交换同源重组的筛选对比，本发明能够简化筛选步骤，可以通过直观观察的筛选标记，最大程度地减少筛选工作量的筛选系统。

附图说明

图1是pFSX002质粒图谱；

图2是通过温敏载体敲除opa基因示意图；

图3是通过温敏载体敲除glgB基因示意图；

图4是opa基因两次同源重组核酸电泳鉴定图；其中，M：DL5000核酸Marker；1：opa基因非交换型菌株(野生型)；2：opa基因第一次同源重组型菌株(单交换)；3：opa基因第二次同源重组型菌株(双交换)；

图5是glgB基因两次同源重组核酸电泳鉴定图；其中，M：DL2000核酸Marker；1：glgB基因非交换型菌株(野生型)；2：glgB基因第一次同源重组型菌株(单交换)；3：glgB基因第二次同源重组型菌株(双交换)；

图6是glgB和opa重组菌株、单交换菌株与突变株在X-Gal板上的生长情况对比图；图中，glgB野生型与单交换菌株，opa野生型与单交换菌株均在含有X-Gal的TSA板上呈现蓝色，而glgB双交换菌株与opa双交换菌株均在含有X-Gal的TSA板上呈现白色。

具体实施方式

本研究通过将温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统结合的方法，构建实现高效、简便地筛选禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株。由于利用温敏自杀系统实现双交换同源重组是一个小概率事件，要随机地从大量克隆子里反复筛选才能筛选到目的菌株，工作量十分大且效率低下。而蓝白斑筛选系统中，lacZ基因的正确表达能够成功分解X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷)产生蓝色产物，使菌落在含有X-Gal的固体培养基上呈蓝色，缺乏lacZ基因正确表达的菌落在含有X-Gal的固体培养基上则呈白色。两种方法的结合后，可以直观、简便且高效地筛选出禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

1.构建温度敏感载体pJJF01。合成温敏复制子Ts-ori(NCBI号ON099569.1，序列具体如SEQ ID NO：27)，以pET28载体为模板扩增出卡那霉素抗性基因kan及大肠杆菌ColE1复制子，利用无缝连接的方法进行连接转化及筛选，最终获得温度敏感载体pJJF01。

2.构建多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因插入突变载体：把lacZ基因，庆大抗生素基因与多杀性巴氏杆菌部分glgB和opa基因同源的DNA分子重组到温敏载体pJJF01上，构建重组载体FSX002和FSX003。以多杀性巴氏杆菌C48-1株为基础菌株，将构建好的重组载体FSX002和FSX003分别导入多杀性巴氏杆菌。

2.1将lacZ全基因序列整合进pJJF01载体上，构建出的阳性克隆子能够成功分解X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷)产生蓝色产物，使菌落在含有X-Gal的固体培养基上呈蓝色。

2.2设计敲除盒及同源臂引物，通过PCR扩增出庆大抗性基因片段以及含有与多杀性巴氏杆菌C48-1株glgB和opa基因同源的片段，并通过重叠PCR实验将glgB和opa基因同源的片段的上下臂与庆大抗性基因连接构成敲除盒，将敲除盒与含有lacZ的pJJF01载体通过无痕重组酶连接，构建出重组质粒。

2.3将重组质粒通过电击穿孔法导入多杀性巴氏杆菌C48-1株，通过PCR筛选鉴定含有重组质粒的阳性克隆子。

3.利用温度敏感质粒系统与基因片段同源重组原理，使C48-1基因组与导入的重组质粒发生第一次同源重组，得到单交换菌株。

把正确的阳性克隆子转接到含有较高卡那抗生素抗性的TSB培养基中，42℃高温摇菌16h以上后取菌液涂到含有卡那抗生素抗性的TSA平板上。通过PCR鉴定菌株，筛选重组质粒与C48-1基因组发生第一次同源重组的单交换菌株。

4.通过蓝白斑筛选原理与庆大抗性标记基因筛出突变株。

将成功筛选出的单交换菌株转接到无抗TSA平板上，置于30度培养箱连续传三代，再将第三代单交换菌株涂到同时含有庆大抗生素和X-Gal的TSA平板上，24小时后从平板上挑选出白色单菌落进行PCR鉴定，筛选发生第二次同源重组的双交换菌株，即突变株。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

1.引物设计与构建合成温度敏感载体。

1.1引物设计与合成。

根据GenBank中发表的C48-1菌株(登录号:MANI0000000)的基因组序列，分别截取glgB和opa基因及其上游和下游同源臂，单侧同源臂长度约600bp，使用SnapGene4.2.4软件设计下列表1中引物，分别用于构建多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因插入突变重组载体的构建，以及鉴定glgB和opa的敲除是否成功。引物由艾基生物技术有限公司合成，引物工作浓度为10nmol/L。引物序列见下表1所示。

表1：引物序列表。

1.2构建合成温度敏感载体。

以pET28载体为模板，用引物Pts01和Pts02扩增出卡那霉素抗性基因kan及大肠杆菌ColE1复制子。合成温敏复制子Ts-ori，由通用生物公司合成基因并克隆于pACYC质粒，使用引物对Pts03和Pts04，将温敏复制子Ts-ori DNA片段从pACYC质粒通过PCR扩增下来，使用无缝克隆试剂盒(上海生工生物公司产品)将两个DNA片段连接，热激转化及筛选，最终获得pJJF01。

2.多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因插入突变重组载体的构建。

2.1构建基础质粒。

参考NCBI基因库中lacZ全基因序列(NCBI序列号：NC_000913.3)，由通用生物公司合成基因并克隆于pACYC质粒，构建质粒pACYC-lacZ。使用引物对p1和p2，将lacZ基因片段从质粒pACYC-lacZ通过PCR扩增下来，使用引物对p3和P4将温敏载体pJJF线性化。使用无缝克隆试剂盒(上海生工生物公司产品)将lacZ基因与线性化载体pJJF连接，通过热激转化将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(通用公司)后通过PCR鉴定筛选阳性克隆子，使用质粒小量提取试剂盒(Omega公司产品，美国)从菌株中抽提质粒，获得具有lacZ基因的温度敏感质粒pFSX001。

2.2构建多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因敲除盒。

以p34S为模板，使用引物P5和P6扩增出庆大基因抗性片段，同时以多杀性巴氏杆菌C48-1基因组为PCR扩增模板，使用引物对p7和p8扩增包含glgB上游区域的DNA片段，使用引物对p9和p10扩增包含glgB下游区域的DNA片段，以上三个DNA片段用引物p7和p10通过重叠PCR进行连接，纯化回收PCR产物，获得glgB的庆大抗性基因敲除盒。分别用引物对p11和p12扩增包含opa上游区域的DNA片段，使用引物对p13和p14扩增包含opa下游区域的DNA片段，以相同的方式获得opa的庆大抗性基因敲除盒。以上PCR反应所采用的体系配置、程序设置如表2、3、4所示。

表2：PCR反应体系表。

成分	用量(μL)
		2×Master Mix酶	25
模板	1
		上游引物	2
下游引物	2
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	20

表3：程序设置表。

表4：扩增体系表。

成分	用量(μL)
		2×Master Mix酶	27
上游引物	6
		下游引物	6
抗性片段	3
		上游模板	0.5
下游模板	0.5
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	7

2.3构建重组质粒

以上述步骤2.1构建的基础质粒pFSX001为模板，用引物对p15和p16扩增线性化载体。通过无缝连接酶将线性化载体和glgB的庆大抗性基因敲除盒DNA片段进行无缝连接，再将连接产物热激转化进入到DH5α感受态细胞中。PCR鉴定筛选出正确的阳性转化子，使用质粒小量提取试剂盒(omiga)从正确的阳性转化子中抽提质粒(试剂盒)，得到多杀性巴氏杆菌glgB基因插入突变重组质粒FSX002。以相同的方式获得多杀性巴氏杆菌opa基因插入突变重组质粒FSX003。无缝连接体系如表5所示。

表5：无缝连接体系。

2.4制备多杀性巴氏杆菌C48-1感受态。

(1)用移液枪吸取巴氏杆菌C48-1株的单个菌落溶解于无菌水中，取适量进行聚合酶链式反应鉴定，鉴定正确后将剩余部分菌液接种到6mL TSB液体培养基，37度培养12小时；(2)用移液枪吸取1mL C48-1株菌液到100mL新鲜的TSB液体培养基中，放入摇床后，恒温培养约6小时，培养期间不时吸取1mL菌液进行测量，观察OD600值约0.5时，加入透明质酸酶，继续放回摇床，37度恒温条件下培养30分钟；

(3)将透明质酸处理好的菌液分装到50ml离心管，设置4度，5000r/min离心约15分钟；

(4)弃去上清的培养基，保留剩余底部菌体。加入10％甘油到菌体沉淀中，使菌体充分重悬后放入离心机，设置4℃，4000r/min，离心后弃上清，重复4次；

(5)加入5mL10％甘油到洗涤好的菌体沉淀中，使其充分悬浮，用移液枪吸90μL到1.5mL离心管中，离心管应提前冰浴，保证全程低温，分装后放置在-80℃冰箱中保存。

2.5重组菌株的构建及鉴定。

在生物安全柜中，分别加入5μL步骤1.3中构建出的重组质粒FSX002和FSX003到步骤1.4所制备好的多杀性巴氏杆菌C48-1感受态中，轻轻吹打混匀，将全部液体转移至0.1cm的金属电转杯中，冰上静置30min，随后电转。电转参数：电压1800V，电容25，电阻200Ω，电击完成后迅速加入1mL TSB培养基，轻轻吹打混匀并转移至2mL离心管内，置于180rpm/min的30℃摇床复苏3小时，随后4000r/min离心5min后弃900ul上清，将剩余菌体与培养基吹打混匀后均匀涂到含有30ug/ml卡那抗生素的TSA培养板上，随后置于30℃培养箱中培养24h。使用引物对p17和p18进行PCR反应鉴定菌株，扩增glgB和opa重组菌株大小均约为1500bp左右，多杀性巴氏杆菌C48-1空菌无条带。

3.利用温度敏感系统筛选发生第一次同源重组的单交换菌株。

分别挑选三颗经PCR鉴定正确的glgB重组菌株混合加入到含有30ug/ml Kan抗生素的5ml液体TSB培养基中，置于180rpm/min的42℃摇床震荡培养。16小时后取100ul菌液涂到含有30ug/ml Kan抗生素的TSA平板上，置于37度培养箱培养24小时以上。从TSA平板上随机挑选6颗菌株，使用引物对p19和p20对菌株进行PCR鉴定，扩增到glgB同源片段单交换菌株条带为1500bp-2200bp之间的双带，如图4中第2列所示，非交换菌株条带为约1500bp的单一条带，如图4中第1列所示。使用同样的方法处理经PCR鉴定正确的opa重组菌株，使用引物对p21和p22对高温后涂板的单菌落进行PCR鉴定，扩增到opa同源片段单交换菌株条带为2300-2600bp之间的双带，如图5中第2列所示，非交换菌株条带为约2300bp的单一条带，如图5中第1列所示。

4.利用蓝白斑筛选原理筛选发生第二次同源重组的双交换菌株。

将PCR鉴定为正确的glgB单交换的菌株，在不含抗生素的TSA板上连续传代培养三代后，刮取少量菌落悬浮，取100ul悬浮液加入到5ml不含抗生素的TSB培养液里，置于42℃摇床以180rpm/min高温震荡培养16小时。16小时后分别取100ul高温处理后的菌液均匀涂到含有30ug/ml庆大抗生素和20ug/ml的X-gal TSA平板上，37度培养箱培养24小时以上。从培养板上随机挑选10颗白色菌落，使用引物对p21和p22对菌株进行PCR鉴定，扩增到glgB同源片段双交换菌株条带为约2200bp单一条带，如图4中第3列所示，非双交换菌株条带为约1500bp的单一条带或1500bp-2200bp之间的双条带，如图4中第1列和第2列所示。使用同样的方法处理经PCR鉴定为正确的opa第一次同源重组菌株，使用引物对p21和p22对在含有30ug/ml庆大抗生素和20ug/ml的X-gal TSA平板上的单菌落进行PCR鉴定，最后扩增到opa同源片段双交换菌株条带为约2600bp的双带，如图5中第3列所示。非双交换菌株条带为约2300bp的单一条带或为2300-2600bp之间的双条带，如图5中第1列和第3列所示。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。